CN105785037B - 猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法 - Google Patents

猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒优势抗原表位肽建立快速检测层析试纸条及制备方法，可用于快速检测猪血液或血清中的抗体。试纸条包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的重组G蛋白，检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG。本发明的试纸条操作简单、重复性好、灵敏度高，结果快速直观、工艺简单可大量制备，成本低廉，适合基层大批量现场检测并可用于猪群PCV2感染的早期快速诊断。

Description

猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及制备方法
技术领域
本发明涉及一种兽医生物技术领域，具体地说是猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，重点用于猪圆环病的抗体监测。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)有2个血清型：PCV1和PCV2，其中PCV1对猪的致病性较低，广泛存在于正常猪群和猪源细胞中；而PCV2对猪的危害性极大，能引起多种疾病综合征，如猪断奶后多系统衰竭综合征、皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等。此外，该病能对养猪业产生多系统、多阶段、全方位的危害，造成直接或间接的损失。为了更好的控制猪圆环病，就必须及时了解并掌握猪场PCV2(猪圆环病毒2型)的感染情况，而且，新型疫苗的效力检测，也需要简单快速的测定方法作为配套检测技术。
目前，常见的PCV2抗体检测方法有间接免疫荧光(IIF)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ELISA包括竞争ELISA、间接ELISA、抗原捕获ELISA等。IIF和IPMA较为经典，但对操作要求很高，不便于大量样品检测，ELISA操作简单可靠，特异性好，但需要借助昂贵的仪器。
表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，也是T细胞受体/B细胞受体和抗体特异结合的基本单位，在抗原中起着关键性作用。在机体的免疫系统中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个蛋白质分子，仅识别抗原分子上的抗原决定簇，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位而不是针对完整的抗原分子的。抗原表位是免疫原抗原性的物质基础，抗原表位的研究对病原的诊断具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条及其制备方法，实现快速有效地对猪群PCV2血清抗体进行检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。
上述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法包括如下步骤：
S1制备所述优势抗原表位肽；
S2制备ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；
S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃膜吸附，得到金标蛋白释放垫；
S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG分别用硝酸纤维膜包被并分别得到检测带和质控带，构成检测层；
S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层设于支撑层上。
需要说明的是，所述步骤S1的方法具体为：
1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：
ORF2-EF：5’-GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’
ORF2-ER：5’-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’；
引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；
1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；
1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；
1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；
1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C，即得优势抗原表位肽。
进一步需要说明的是，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
进一步需要说明的是，步骤1.3)具体方法为：
DNA快速连接酶连接，连接体系为：10×ligase buffer 1μl，酶切纯化的目的基因片段5μl，载体pGEX-4T-11μl，T4DNA快速连接酶1μl，双蒸水补足10μl，室温连接15min；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺LB平板于37℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并测序正确，阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C。
进一步需要说明的是，步骤1.4)中，诱导表达的条件为：在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养携带重组质粒pGEX-ORF2-C的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，直至菌液的OD600值介于0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀；用pH7.4的PBS洗涤，用80μlPBS悬浮菌体，与20μl的5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟；利用蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色；最终得到GST-ORF2-C，即优势抗原表位肽。
进一步需要说明的是，步骤1.5)具体步骤为：用1×PBS悬浮细菌沉淀并超声处理10min，每超声10s就间歇10s，离心取上清，与经1×PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶在室温振荡混合30min，将混合物转移至层析柱中，用1×PBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。
需要说明的是，步骤S2的具体为：
2.1)用proteinG采用多点注射法免疫阴性家兔2只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血；
2.2)将4℃过夜沉淀的全血4000r/min离心10min，取上清即为血清；将20ml血清中加入20ml生理盐水，再加入10ml的饱和(NH4)2SO4溶液，使之成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃去沉淀除去纤维蛋白；
在上清中加入30ml(NH4)2SO4饱和溶液，使成50％的(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃上清；
于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；
2.3)重复步骤2.2)2-3次；
2.4)用10ml生理盐水溶解经步骤2.3)后最终得到的沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 +，直至无SO4 2-或NH4 +出现为止；离心去沉淀，去除杂蛋白，上清液即为粗提IgG，纯化后得ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述以纳氏试剂检查NH4 +的方法为取3-4ml透析液，加试剂1-2滴，出现砖红色即认为有NH4 +存在。
需要说明的是，步骤S3的方法具体如下：
3.1)胶体金颗粒的制备
100ml水中加入1ml 1％的氯金酸水溶液，加热至沸，边搅拌边逐滴加入1.7ml 1％的柠檬酸钠三钠水溶液，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复原体积，置4℃保存；
3.2)确定重组蛋白G的最小蛋白用量：
取96孔板，每孔加入100μL的胶体金，将1-20μL 0.05mg/ml的重组蛋白G分别加入每孔并混匀，静置15min，每孔加入10％NaCl 20μL，放置10min，颜色仍保持红色的为最小蛋白用量，在此基础上加30％为最佳标记量；
3.3)确定重组蛋白G的最小蛋白用量后，用0.1M K2CO3调至所需PH值，将相应的重组蛋白G溶液加入步骤3.1)制得的胶体金颗粒放置30min 10000r/min 4℃离心30min；
3.4)将沉淀溶于重悬液中，混合液用玻璃膜吸附后室温晾干，吸附比例为10～50μL/cm2。
需要说明的是，所述步骤S4中，所述优势抗原表位肽的包被浓度为0.8mg/ml，ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG的包被浓度为1mg/ml。
本发明的有益效果在于：
1、重组蛋白G(protein G)是微生物来源的天然蛋白质，可特异性与哺乳动物的免疫球蛋白分子的Fc段结合而不影响Fab段与抗原分子结合，基于这一特性，本发明选取重组蛋白G(protein G)标记的胶体金作为探针，可捕获猪圆环病毒的抗体，从而与相应的抗原结合来达到检测该疫病的目的，又可继续与质控带上的IgG结合达到对照的目的；
2、本发明选用的表位肽序列为ORF2中高度保守的一段，并且具有良好的亲水性和免疫原性，是经筛选后获得的优势抗原表位。
本发明的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条可以用来监测猪圆环病的抗体，只需获得相应的纯化抗原即可，方便制作，检测快捷有效。
附图说明
图1为本发明猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的结构示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
如图1所示，猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层1，所述支撑层1、加样层2、检测层4和吸收层5；另外还包括金标蛋白释放垫3，所述金标蛋白释放垫3包括玻璃纤维膜以及包埋在玻璃纤维膜中的胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层4上设置有检测带6和质控带7，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。
所述检测层4设于所述支撑层1(可采用PVC板)的中部，所述金标蛋白释放垫3和吸收层5则设于所述检测层4的顶部两侧；而所述加样层2则设于所述金标蛋白释放垫3的顶部。
上述猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法包括如下步骤：
S1制备所述优势抗原表位肽；
S2制备ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG；
S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃膜吸附，得到金标蛋白释放垫；
S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG分别有硝酸纤维膜包被并分别得到检测带和质控带，构成检测层；
S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层依次设于支撑层上。
需要说明的是，所述步骤S1的方法具体为：
1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：
ORF2-EF：5’-GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’
ORF2-ER：5’-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’；
引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；
1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；
1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，将得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；
1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；
1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C。
进一步需要说明的是，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
进一步需要说明的是，步骤1.3)具体为：
DNA快速连接酶连接，连接体系为：10×ligase buffer 1μl，酶切纯化的目的基因片段5μl，载体pGEX-4T-11μl，T4 DNA快速连接酶1μl，双蒸水补足10μl，室温连接15min；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺LB平板于37℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并测序正确，阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C。
进一步需要说明的是，步骤1.4)中，诱导表达的条件为：在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养携带重组质粒pGEX-ORF2-C的大肠杆菌BL21，直至菌液的OD600值介于0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.1mM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀；用pH7.4的PBS洗涤，用80μl PBS悬浮菌体，与20μl的5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟；利用BioRAD公司的蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色。
进一步需要说明的是，步骤1.5)具体步骤为：
用1×PBS悬浮细菌沉淀并超声处理10min，每超声10s就间歇10s，离心取上清，与经1×PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione Sepharosw 4B)在室温振荡混合30min，将混合物转移至层析柱中，用1×PBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blotting结果显示，融合蛋白的大小约29KDa；在超声并离心之后的菌液上清和沉淀中都有融合蛋白存在，在上清液中融合蛋白GST-ORF2-C的量要比在沉淀中的多，这说明表达的融合蛋白GST-ORF2-C大部分是可溶的，这有利于蛋白纯化并最大可能的保证了蛋白的自然活性；用GST单抗做的Western-blotting也进一步证实融合蛋白GST-ORF2-C在细菌中正确表达；为了证实融合蛋白GST-ORF2-C的抗原性，用抗PCV2猪血清作为一抗进行western-blotting；结果显示阳性血清有显著的特异条带而阴性血清无条带出现；同样，纯化后的蛋白在western-blotting中，可以用抗GST的单抗和猪血清检测到；经BCA蛋白浓度测定试剂盒检测，纯化后的抗原浓度为5μg/mL。
需要说明的是，步骤S2的具体为：
2.1)用proteinG采用多点注射法免疫阴性家兔2只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血；
2.2)将4℃过夜沉淀的全血4000r/min离心10min，取上清即为血清。将20ml血清中加入20ml生理盐水，再加入10ml的饱和(NH4)2SO4溶液，使成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃去沉淀除去纤维蛋白；
在上清中加入30ml(NH4)2SO4饱和溶液，使成50％的(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃上清；
于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；
2.3)重复步骤2.2)2-3次；
2.4)将最终得到产物用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 +，直至无SO4 2-或NH4 +出现为止；离心去沉淀，去除杂蛋白，上清液即为粗提IgG，纯化后得兔抗ProteinG IgG；所述以纳氏试剂检查NH4 +即取3-4ml透析液，加试剂1-2滴，出现砖红色即认为有NH4 +存在。
需要说明的是，步骤S3的方法具体如下：
3.1)胶体金颗粒的制备
100ml水中加入1ml 1％的氯金酸水溶液，加热至沸，边搅拌边逐滴加入1.7ml 1％的柠檬酸钠三钠水溶液，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复原体积，置4℃保存；
3.2)确定重组蛋白G(proteinG)的最小蛋白用量：
取96孔板，每孔加入100μL的胶体金，将1-20μL 0.05mg/ml的proteinG分别加入每孔并混匀，静置15min，每孔加入10％NaCl 20μL，放置10min，颜色仍保持红色的为最小蛋白用量，在此基础上加30％为最佳标记量；
3.3)确定proteinG的最小用量后，用0.1M K2CO3调至所需PH值，将相应的proteinG溶液加入步骤3.1)制得的胶体金颗粒放置30min 10000r/min 4℃离心30min；
3.4)将沉淀溶于重悬液中，混合液用玻璃膜吸附后室温晾干，吸附比例为10～50μL/cm2。
需要说明的是，所述步骤S4的具体方法如下：
选定纯化的GST-ORF2-C蛋白三个包被浓度为0.5、0.8和1mg/mL，选定ProteinG免疫兔血清纯化后的IgG的三个包被浓度为0.5、1和2mg/mL，按1μL/cm的速度将两种蛋白喷于硝酸纤维素膜上，通过交叉试验，结果显示表位肽的包被浓度为0.8mg/ml、纯化IgG包被浓度为1mg/ml时，效果最佳。
使用方法：
如果血液样品中含有PCV2抗体，将该血清适度稀释后加在本试纸条的加样层2上，该液体随后沿着试纸条进入试纸条上金标蛋白释放垫中时，血液样品中含有的PCV2抗体与金标蛋白释放垫上的玻璃纤维膜中的胶体金标记的Protein G结合形成相应的复合物，前行与包被检测层4上的PCV2优势抗原表位肽形成紫红色线条，即在检测带6处形成紫红色条带，继续前行，未与抗原结合的抗体携带重组蛋白G与包被检测层4中沉淀兔的IgG抗体形成紫红色线条，即在质控带7处形成紫红色条带。如果质控带7不出现紫红条带则说明该试纸条失效。如果检测血液样品中不含有PCV2相关抗体，则检测带6处不会出现紫红色条带，而质控带7处必定仍出现紫红色条带。
本发明的试纸条可以用来监测猪圆环病的抗体，只需获得相应的纯化抗原即可，方便制作，检测快捷有效。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条，包括支撑层、加样层、检测层和吸收层；其特征在于，还包括金标蛋白释放垫，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的重组蛋白G；所述检测层上设置有检测带和质控带，检测带固定有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白上的优势抗原表位肽，质控带固定有兔ProteinG高免血清纯化后的IgG；所述优势抗原表位肽序列为ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段。
2.一种权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1制备所述优势抗原表位肽；
S2制备兔ProteinG高免血清，并纯化血清中的IgG；
S3胶体金颗粒的制备，并采用胶体金标记重组蛋白G并用玻璃纤维吸附，得到金标蛋白释放垫；
S4制备检测层，步骤S1制备得到的优势抗原表位肽和步骤S2制备得到的兔ProteinG高免血清纯化后的IgG分别包被于硝酸纤维膜上得到检测带和质控带，构成检测层；
S5将加样层、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层设于支撑层上。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的方法具体为：
1.1)根据ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段，设计并合成1对引物：
ORF2-EF：5’-GC GGA TCC CAG GGT GAC AGG GGA GTG GGC T-3’
ORF2-ER：5’-GC CTC GAG TTA GCG GGA GGA GTA GTT TAC A-3’；
引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；
1.2)以ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段为模板，利用步骤1.1)设计得到的引物对进行PCR处理；
1.3)将ORF2上的氨基酸区段113-147aa的基因片段在pGEX-4T-1中进行克隆，得到的阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C；
1.4)将步骤1.3)得到的重组质粒pGEX-ORF2-C转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达，将表达后的蛋白命名为GST-ORF2-C；
1.5)谷胱甘肽亲和层析柱层析法纯化GST-ORF2-C，即得优势抗原表位肽。
4.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.2)中，PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，60℃20s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；16℃保存。
5.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.3)具体方法为：
DNA快速连接酶连接，连接体系为：10×ligase buffer 1μl，酶切纯化的目的基因片段5μl，载体pGEX-4T-1 1μl，T4DNA快速连接酶1μl，双蒸水补足10μl，室温连接15min；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺LB平板于37℃培养过夜，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，并测序正确，阳性重组质粒命名为pGEX-ORF2-C。
6.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.4)中，诱导表达的条件为：在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，250rpm培养携带重组质粒pGEX-ORF2-C的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，直至菌液的OD600值介于0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续培养3小时，离心收集细菌沉淀；用pH7.4的PBS洗涤，用80μlPBS悬浮菌体，与20μl的5×SDS裂解缓冲液混合，煮沸变性5分钟；利用蛋白质电泳装置进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离胶的丙烯酰胺浓度为10％，将只含载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株同样诱导做阴性对照，0.25％考马斯亮兰染色；最终得到GST-ORF2-C，即所述优势抗原表位肽。
7.根据权利要求3所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤1.5)具体步骤为：用1×PBS悬浮细菌沉淀并超声处理10min，每超声10s就间歇10s，离心取上清，与经1×PBS平衡的谷胱甘肽琼脂糖凝胶在室温振荡混合30min，将混合物转移至层析柱中，用1×PBS清洗柱子，用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。
8.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型抗体快速检测层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体为：
2.1)用proteinG采用多点注射法免疫阴性家兔2只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血；
2.2)将4℃过夜沉淀的全血4000r/min离心10min，取上清即为血清；将20ml血清中加入20ml生理盐水，再加入10ml的饱和(NH4)2SO4溶液，使之成20％(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃去沉淀除去纤维蛋白；
在上清中加入30ml(NH4)2SO4饱和溶液，使成50％的(NH4)2SO4溶液，充分混合，静置30min；
3000r/min离心20min，弃上清；
于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml，充分混合，静置30min；3000r/min离心20min，弃上清；
2.3)重复步骤2.2)2-3次；
2.4)用10ml生理盐水溶解经步骤2.3)后最终得到的沉淀，装入透析袋；透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次；以1％BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 +，直至无SO4 2-或NH4 +出现为止；离心去沉淀，去除杂蛋白，上清液即为兔ProteinG高免血清纯化后的IgG；所述以纳氏试剂检查NH4 +的方法为取3～4ml透析液，加试剂1～2滴，出现砖红色即认为有NH4 +存在。
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