CN111848748A

CN111848748A - 一种非洲猪瘟病毒截短蛋白及其在制备elisa检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN111848748A
Application number: CN202010700335.XA
Authority: CN
Inventors: 金梅林; 杨永; 张强; 赵亚; 孙小美; 吕长杰; 杨丽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111848748B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种非洲猪瘟病毒截短蛋白及其在制备ELISA检测试剂盒中的应用，所述的截短蛋白为SEQ ID NO.1所示。以该蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA试剂盒，在检测非洲猪瘟病毒时，试剂盒符合率相当，但本发明试剂盒的敏感性大于西班牙检测试剂盒，且缩短了试验时间，操作步骤更简单。因此，以本发明提供的截短蛋白制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

Description

一种非洲猪瘟病毒截短蛋白及其在制备ELISA检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒截短蛋白及其在制备ELISA检测试剂盒中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African SwineFeverVirus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性和高度接触性的烈性动物传染病，临床症状主要表现为皮肤充血发绀、内脏器官严重出血、发病率高、死亡率高、病程短。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物A类动物疫病，我国将此病规定为一类动物传染病。

非洲猪瘟病毒是一种具有20面体结构，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，有囊膜的双股线性DNA病毒。非洲猪瘟可编码150～200种蛋白，目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP72、p54、p30等。p72蛋白表达于ASFV感染晚期,位于病毒衣壳的表面,具有良好的反应原性和抗原性。p72蛋白也是西班牙(Ingezim)试剂盒的包被抗原，该试剂盒也是OIE推荐使用检测非洲猪瘟抗体试剂盒。p30蛋白作为非洲猪瘟病毒结构蛋白之一，表达于非洲猪瘟病毒早期，法国ID VET公司的非洲猪瘟抗体检测试剂盒的包被抗原即为非洲猪瘟病毒p30蛋白，可用于ASFV特异性抗体的早期检测。非洲猪瘟病毒蛋白p54是由E183L基因编码，是一种重要的结构蛋白，位于病毒粒子内层囊膜，分子量约为29kDa。由于p54蛋白含有一段跨膜区域，因此全长无法在大肠杆菌中表达。p54蛋白在病毒感染过程中发挥重要作用，尤其在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时发挥着非常重要的作用。p54蛋白基因的转录发生在病毒感染后期，是ASFV晚期病毒蛋白，相关报道表明p54蛋白主要参与病毒的吸附与进入，因此可作为非洲猪瘟病毒抗体的检测抗原。本发明中所用的美国Biostone非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的包被抗原即为p54蛋白，所用方法为间接Elisa检测方法。

从2018年非洲猪瘟爆发至今，国内尚无国家批准的ASFV抗体检测试剂盒。因此，本发明人在前期工作中，分别选取常用检测抗原蛋白p30、p54、p72进行Elisa检测方法的建立，而后发现，p30蛋白主要检测早期感染抗体，而晚期感染产生的抗体能否检测到尚未可知，并且所建立的检测方法的灵敏度不高；p72蛋白在病毒感染后的晚期进行表达，保守性较强且免疫原性好，但其非特异性强，不利于弱阳性的检测；而p54蛋白是ASFV较为保守的结构性蛋白，经验证具有灵敏度高、特异性强等特点，最终确定以非洲猪瘟病毒蛋白p54作为检测抗原建立Elisa检测方法。虽然目前关于p54蛋白的相关研究有很多：曹琛福等建立了基于非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位的ELISA方法，表明了p54蛋白具有建立检测方法的潜力；冯春燕等参考Gen Bank序列号ASFV(FN557520.1)毒株的p54基因序列，原核表达p54蛋白并成功制备p54单克隆抗体，进一步为ASFV ELISA诊断技术的开发奠定了基础。董志珍等针对ASFV p54蛋白建立了单克隆抗体竞争法ELISA并构建了检测试剂盒；梁云皓等利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达ASFV p54蛋白，并通过Western Blot证明其具有良好的抗原性；官丽娟等根据Gen Bank序列号ASFV(MK128995)通过密码子优化后，将E183L基因的CDS区进行克隆表达，通过密码子优化，表达了非洲猪瘟病毒p54蛋白并鉴定了其反应原性，但上述方法并未进行大型临床样本的检测，难免对于其检测的准确率有所疑虑。

自2018年非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成了严重威胁，造成了巨大的经济损失，并严重影响生猪产业相关的国际贸易，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展至关重要。迄今为止，尚无有效的疫苗用于预防，因此，不存在ASFV疫苗抗体的干扰，建立非洲猪瘟ELISA抗体诊断方法，研制非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒，用于非洲猪瘟临床检测，对非洲猪瘟的防控具有重要意义。ELISA方法操作简单，整个试验时程短，是目前血清学检测的最主要方法，适合大量的血清学筛查。ELISA方法是国际贸易中检测ASFV的标准方法，OIE将ELISA方法作为诊断ASFV的首选血清学方法。

本发明选取的P54蛋白与上述不同，是参考Gen Bank序列号ASFV(AM712239.1)，同时进行了有效截短。对于截短蛋白来说，即使是截短同一蛋白的不同区域对形成的检测抗原是不同的，继而对最终制备的Elisa检测试剂盒的检测效果也是不同的。利用本发明的截短蛋白制备出的ELISA试剂盒，灵敏度高，阳性率高，操作简便，检测时间短，与现有的检测ASFV的检测试剂盒相比，具有明显的优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原是由非洲猪瘟病毒蛋白p54截短后获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，对应的优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供一种包含上述可溶性抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要为非洲猪瘟病毒抗体的检测，用于猪群抗体水平的监测。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

根据非洲猪瘟Benin 97/1毒株(GenBank登录号：AM712239.1)发布的p54基因序列，分析了序列的基本特征，进行截短，并进行了原核密码子优化，优化后的序列为SEQ IDNO.2所示，嵌入pET32a质粒中、合成了pET32a-p54原核表达质粒，并将pET32a-p54质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，使其在E.coliBL21(DE3)菌株中高效表达并纯化，最后获得纯化的p54重组蛋白。

一种可溶性抗原的应用主要为制备间接ELISA抗体检测试剂盒，鉴定猪群是否感染非洲猪瘟病毒或者检测猪血清中是否含有非洲猪瘟抗体。p54重组蛋白作为包被抗原，通过条件优化，建立了检测ASFV间接ELISA抗体检测方法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明使用的抗原为非洲猪瘟病毒蛋白p54截短蛋白，优化密码子后，嵌入到原核载体pet32a的重组抗原pET32a-p54，该抗原为可溶性抗原并且经诱导表达纯化后，具有灵敏度高，特异性好以及纯度高等特点。同时，pET32a-p54具有免疫原性，因此是可作为检测试剂盒的包被抗原。

2、本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒能够准确检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体，同时与OIE推荐的西班牙检测试剂盒相比，本发明的ELISA试剂盒的特异性与其相当，敏感性优于西班牙检测试剂盒。该试剂盒检测了大量猪血清，并用样品OD_630nm/阳性对照OD_630nm(S/P)来判定样品是否为阳性，最终确定：当待检样品的S/P大于或等于0.25，则判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；当S/P<0.25，则判为非洲猪瘟病毒抗体阴性。本方法与西班牙检测试剂盒符合率相当，敏感性大于西班牙检测试剂盒，此外，本发明相对于西班牙试剂盒，缩短了试验时间，操作步骤更简单。

3、截短后p54蛋白表达于上清且表达量高以及临床实用性强。

附图说明

图1为p54基因氨基酸截短位点示意图。

图2为重组质粒pET32a-p54基因扩增产物。

图3为纯化后重组蛋白SDS-PAGE电泳结果。

图4为重组蛋白的Western-blot图。

具体实施方式

实施例1：

非洲猪瘟病毒截短蛋白的获得：

1、重组质粒的获得与鉴定

对非洲猪瘟Benin 97/1毒株(GenBank登录号：AM712239.1)的p54基因序列截短并进行密码子优化，然后委托武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成p54基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，同时将合成的p54基因嵌入pET32a载体中，获得重组质粒pET32a-p54。将重组质粒pET32a-p54转化至E.coliBL21(DE3)感受态中，获得重组菌pET32a-p54/BL21(DE3)。随机挑取3个单菌落各加入100μl超纯水中，煮沸10分钟后取上清作为模板，按下述反应体系和扩增程序进行PCR扩增。

引物序列：

上游引物P1：5'-GGCTGATATCGGATCCAA-3'

下游引物P2：5'-TTACAGAGAGTTTTCCAGGTCT-3'

PCR扩增程序：95℃预变性10分钟；变性95℃30秒，退火54℃30秒，72℃1分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。经紫外凝胶成像仪鉴定琼脂糖凝胶电泳产物的分子量大小，结果显示，分子量为403bp。

2、重组蛋白的表达与纯化

挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养8～10小时。再按1％的比例将菌液接种于400ml含50μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养至菌液OD 600值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，诱导表达3小时，离心收集菌体。收集的菌体，用原培养基1/10体积的BindingBuffer重悬菌体，在低温高压破碎仪中破碎菌体，重复破碎3次，菌体裂解液10000r/min，离心15分钟，收集上清。用0.22μm滤器过滤收集的上清，2～8℃保存备用。

亲和层析纯化具体步骤为：首先，用5个柱体积的Binding Buffer平衡层析柱，然后上样，上样结束后再用10个柱体积的Binding Buffer平衡层析柱。然后，用ElutionBuffer进行洗脱，观察仪器屏幕上出现蛋白峰时开始收集，直至峰结束后停止收集，整个过程保持液体流速为1.0ml/min，收集的蛋白用TE缓冲液透析36小时，每隔12小时换1次透析液，透析完成后收集重组蛋白，并进行SDS-PAGE分析，同时经Image J软件计算分析蛋白纯度，所得蛋白纯度约为95％，蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；超微量核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，所得蛋白浓度约为1.88mg/mL。

利用上述方法，申请人将非洲猪瘟病毒蛋白p54全长蛋白进行诱导表达纯化，结果发现，全长p54蛋白表达于包涵体中。将该包涵体作为包被抗原去检测临床上已知背景血清，结果显示，表达于包涵体的全长p54蛋白较截短p54蛋白的阳性OD630nm值低且符合率低。

3、重组蛋白pET32a-p54的免疫原性检测

为了进一步验证所得的截短的p54蛋白的免疫原性，进行Western-blot检测，利用阳性对照(1:100)作为一抗，羊抗猪lgG-HRP(1:5000)作为二抗，检验抗原抗体的特异性反应，结果在37kDa处出现特异性反应条带。由此可以表明p54重组蛋白具有生物学活性。

实施例2：

非洲猪瘟病毒截短蛋白间接ELISA检测试剂盒的构建：

1.阳性对照的制备：

选用7～8周龄健康阴性猪，要求血清经美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测为阴性，且以PCR或RT-PCR方法检测ASFV、CSFV、PRV、PPV、JEV核酸均为阴性。将本发明获得的截短p54重组蛋白与佐剂1:1混合，颈部肌肉注射1ml/每头(蛋白含量1.0mg)，连续免疫2次，每次间隔14日。第2次免疫14天后开始采血检测，用美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测血清ELISA效价不低于1:8。采集血液，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟，加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。将制备的血清用保护剂稀释10倍，0.22μm滤器过滤除菌，即为阳性对照。

2.阴性对照的制备：

选用7～8周龄健康阴性猪，要求血清经美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测为阴性，且以PCR或RT-PCR方法检测ASFV、CSFV、PRV、PPV、JEV核酸均为阴性。采集血液，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟。加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。将制备的血清用保护剂稀释10倍，0.22μm滤器过滤除菌，即为阴性对照。

3.酶标板的制备

通过方阵法确定重组抗原的包被浓度为1:5000，在2-8℃包被14小时。弃去包被液，加入1％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液37℃封闭2小时。弃去封闭液，自然风干后抽真空包装成成品试剂盒酶标板。

4.试剂盒其他组分的配制

包被液：碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，加注射用水至1000ml，调pH值至9.6，置2～8℃保存备用。

封闭液：牛血清白蛋白(BSA)5.0g、蔗糖10.0g、氯化钠(NaCl)8.5g、Tween-200.5ml、硫柳汞钠0.10g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

保护剂：取氯化钾(KCl)0.2g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)1.42g、牛血清白蛋白(BSA)5.0g、硫柳汞钠0.1g、吐温20(Tween-20)0.5ml、蔗糖2.0g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

酶标记物：将商品化羊抗猪IgG-HRP酶标抗体5000倍稀释成工作浓度，经0.22μm滤器过滤除菌，置2～8℃保存备用。

样品稀释液：氯化钠(NaCl)8.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g、氯化钾(KCl)0.2g、硫柳汞钠0.1g，加注射用水至1000ml。

20倍浓缩洗涤液：吐温20(Tween-20)10.0ml，氯化钠(NaCl)160.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)58.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4.0g、氯化钾(KCl)4.0g，加注射用水至1000ml。

底物显色液：柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)配制0.1mol/L柠檬酸盐(C₆H₈O₇·H₂O)和0.2mol/L磷酸盐(Na₂HPO₄·12H₂O)按6.1ml:6.4ml混合配制而成。TMB贮存液配制TMB溶于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为32mmol/L。取TMB贮存液用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液作1:20倍稀释，再加入终浓度7.5mmol/L聚乙二醇(PEG)、100mmol/L葡萄糖和2.94mmol/L H₂O₂，完全溶解后，避光保存，置2～8℃保存备用。

终止液：2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml去离子水中，定容至1000ml，分装，10ml/瓶，2～8℃保存备用。

实施例3：

非洲猪瘟病毒截短蛋白制备的间接ELISA检测试剂盒的使用方法：

样品处理：取猪全血，待血液凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液配制：使用前，将浓缩的洗涤液从试剂盒中取出，平衡至室温(20～25℃)，并摇动，使沉淀溶解(最好在37℃水浴中加热5～10分钟)，然后用蒸馏水作20倍稀释(例如：每两块板用30ml的20倍浓缩洗涤液加上570ml蒸馏水)，混匀，稀释好的洗涤液在2～8℃可以存放7日。

样品初步稀释：将待检血清样品在血清稀释板中按1:40的比例稀释(例如：在血清稀释板中先加入195μl样品稀释液，再加5μl待检血清)，阳性对照和阴性对照在血清稀释板中按1:4倍稀释(如：180μl样品稀释液中加60μl阳性对照或阴性对照)，不同的样品要注意换吸头。样品在稀释过程中要充分混匀。

【操作步骤】

1.取适量的抗原包被板，每孔加入200μl洗涤液，洗涤1次，拍干。再将稀释好的待检血清、阳性对照和阴性对照各取100μl加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阳性对照和阴性对照各设2孔，置37℃温育30分钟。

2.弃去孔中液体，每孔加入200μl洗涤液，重复洗涤5次，最后一次拍干。

3.每孔加入100μl酶标记物，置37℃温育30分钟。

4.弃去孔中液体，洗涤方法同步骤2。

5.每孔加入100μl底物显色液，置20～25℃避光显色10分钟。

6.每孔加入50μl终止液，10分钟内读取OD_630nm值。

【结果判定】

试验成立条件是：阳性对照OD_630nm平均值与阴性对照OD_630nm平均值之差≥0.8。S为样品OD_630nm值，P为阳性对照OD_630nm平均值，N为阴性对照OD_630nm平均值。若S/P值≥0.25，样品判定为阳性；若S/P值<0.25，样品判定为阴性。

实施例4：

ASFV蛋白p54间接ELISA抗体检测试剂盒与西班牙阻断检测试剂盒对比

1.敏感性比较

本发明的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒进行以下三个方面的研究。

首先，已知阴性样品的阳性检出率研究。用本发明试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒分别检测20份来自临床的已知阴性样品，两者的阳性检出率均为0.00％。

其次，已知阳性样品的阳性检出率研究。用两种试剂盒分别检测20份已知阳性样品，两者的阳性检出率均为100％。

最后，最低检出量研究。

Y02、Y15血清的制备：已知阳性样品中随机抽取2份，分别为Y02，Y15，凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清所得。

敏感性质控品：将本发明获得的截短p54重组蛋白与佐剂1:1混合，猪颈部肌肉注射1ml/每头(蛋白含量1.0mg)，连续免疫3次，每次间隔14日。第3次免疫14天后开始采血检测，用美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测ELISA效价不低于1:16。之后进行颈动脉无菌采血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟，加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。

本发明检测敏感性质控品(免疫P54蛋白后的猪血清)、Y02、Y15的ELISA效价分别为1:32、1:64、1:64，美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒检测敏感性质控品、Y02、Y15的ELISA效价分别为1:16、1:16、1:16，由于英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒的包被抗原为p72，而敏感性质控品为免疫P54蛋白后的猪血清，因此对于敏感性质控品，英吉纳检测试剂盒不做检测，而检测Y02、Y15的ELISA效价分别为1:16、1:64。

综上研究数据表明，本发明提供的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的敏感性明显优于美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，由此表明试制的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的敏感性良好，可用于临床检测。

2.特异性比较

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒从以下两个方面进行研究：首先，已知未感染动物样品的阳性检出率研究。用本发明和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒分别检测50份阴性样品，结果均为阴性。其次，交叉反应研究。用两种试剂盒分别检测CSFV抗体阳性血清、PRV抗体阳性血清、PPV抗体阳性血清、PRRSV抗体阳性血清、JEV抗体阳性血清、pET32a空载阳性血清、4份ASFV抗体阴性血清，结果均为阴性。综上研究结果表明本发明具有良好的特异性。

实施例5：

山东省动物疫病预防与控制中心对非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒效果比对：

在本实施例及以下实施例中，非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒即为本发明提供的试剂盒；非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒为世界动物卫生组织(OIE)推荐的西班牙(Ingezim)非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒。

具体如下：

山东省动物疫病预防与控制中心针对本发明提供的试剂盒的比对过程和结果如下：

1试验材料

1.1非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒3批，批号分别为20190601，20190602，20190703。

1.2 30份样品盘血清(已设盲)，1份敏感性质控品(免疫截短P54蛋白后的猪血清)，10份特异性质控品以及阴阳性对照(阴阳性对照血清的制备见实施例2)；20份临床样品，由山东省动物疫病预防与控制中心提供。

1.3非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号210818。

1.4其它器材0.5～10μl，20-200μl,30-300μl微量移液器、温箱、计时器、酶标仪等。

2试验方法

2.1敏感性试验通过检测敏感性质控品来判定试剂盒的敏感性,用样品稀释液将敏感性质控品稀释4倍、16倍、64倍后作为待检血清，其余步骤按“具体步骤”进行操作。

2.2特异性试验通过检测特异性质控品来判定试剂盆的特异性，特异性质控品分别为：CSFV抗体阳性血清、PRV抗体阳性血清、PPV抗体阳性血清、PRRSV抗体阳性血清、JEV抗体阳性血清、pET32a空载阳性血清、4份ASFV抗体阴性血清，对10份特异性质控品进行检测，按“具体步骤”进行操作。

2.3重复性试验

2.3.1批向重复性用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(共3批，批号分别为20190601，20190602，20190703)，检测样品盘中的30份样品，按该试剂盒说明书进行，计算不同批次试剂盒变异系数。

2.3.2批内重复性用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(20190601)，检测样品盘中的30份样品，重复3次，按该试剂盒说明书进行，计算相同批次试剂盒变异系数。

2.4符合率试验用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(批号为20190601)与英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒同时检测临床样品20份，按各自试剂盒说明书进行。

3试验结果

3.1敏感性试验结果3批试剂盒检测不同稀释倍数的敏感性质控品，结果符合非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒质量标准。具体结果见表1。

表1敏感性试验结果

注：

表示阳性对照平均值；

表示阴性对照平均值。

3.2特异性试验结果用3批试剂盒同时检测10份特异性质控品，结果均为阴性，具体结果见表2。

表2特异性试验结果

3.3重复性试验结果

3.3.1批间重复性试验用3批试剂盒同时检测样品盘中的30份样品，结果显示：不同批次试剂盒的变异系数小于15％，表明试剂盒的批间重复性良好，具体结果见表3。

表3批间重复性结果

3.3.2批内重复性试验用同一批次试剂盒检测样品盘中的30份样品，结果显示：批内变异系数均小于10％，表明试剂盒的批内重复性良好，具体结果见表4。

表4批内重复性试验结果

3.4临床样品检测用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒检测由山东省动物疫病预防与控制中心提供的20份临床样品。由结果可知，两者检测结果一致，具体结果见表5。

表5临床样品检测结果

实施例6：

山西省动物疫病预防控制中心对非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒效果比对：

1试验材料

1.2 30份样品盘血清(已设盲)，1份敏感性质控品(敏感性质控品的制备见实施例4)和10份特异性质控品以及阴阳性对照(阴阳性对照血清的制备见实施例2)；20份临床样品，由山西省动物疫病预防与控制中心提供。

1.3非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号210818。

1.4其它器材0.5～10μl，20-200μl，30-300μl微量移液器、温箱、计时器、酶标仪等。

2试验方法

2.3重复性试验

3试验结果

3.1敏感性试验结果3批试剂盒检测不同稀释倍数的敏感性质控品，结果符合非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒质量标准。具体结果见表6。

表6敏感性试验结果

注：

表示阳性对照平均值：

表示阴性对照平均值。

3.2特异性试验结果用3批试剂盒同时检测10份特异性质控品，结果均为阴性，具体结果见表7。

表7特异性试验结果

3.3重复性试验结果

3.3.1批间重复性试验用3批试剂盒同时检测样品盘中的30份样品，结果显示：不同批次试剂盒的变异系数小于15％，表明试剂盒的批间重复性良好，具体结果见表8。

表8批间重复性结果

3.3.2批内重复性试验用同一批次试剂盒检测样品盘中的30份样品，结果显示：批内变异系数均小于10％，表明试剂盒的批内重复性良好，具体结果见表9。

表9批内重复性试验结果

3.4符合率试验用非洲猪瘟病毒间按ELISA抗体检测试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒检测由山西省动物疫病预防控制中心提供的20份临床样品。由结果可知，两者检测结果一致，具体结果见表10。

表10临床样品检测结果

实施例7：

中国科学院武汉病毒研究所对非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒效果比对：

1试验材料

1.2 30份样品盘血清(已设盲)，1份敏感性质控品(敏感性质控品的制备见实施例4)和10份特异性质控品以及阴阳性对照(阴阳性对照血清的制备见实施例2)；20份临床样品，由中科院武汉病毒研究所提供。

1.3非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，批号210818。

2试验方法

2.3重复性试验

3试验结果

3.1敏感性试验结果3批试剂盒检测不同稀释倍数的敏感性质控品，结果符合非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒质量标准。具体结果见表11

表11敏感性试验结果

注：

表示阳性对照平均值：

表示阴性对照平均值。

3.2特异性试验结果用3批试剂盒同时检测10份特异性质控品，结果均为阴性，具体结果见表12

表12特异性试验结果

3.3重复性试验结果

3.3.1批间重复性试验用3批试剂盒同时检测样品盘中的30份样品，结果显示：不同批次试剂盒的变异系数小于15％，表明试剂盒的批间重复性良好，具体结果见表13

表13批间重复性结果

3.3.2批内重复性试验用同一批次试剂盒检测样品盘中的30份样品，结果显示：批内变异系数均小于10％，表明试剂盒的批内重复性良好，具体结果见表14

表14批内重复性试验结果

3.4符合率试验用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒检测由中国科学院武汉病毒研究所提供的20份临床样品。由结果可知，两者检测结果一致，具体结果见表15

表15临床样品检测结果

综上，三家比对试验的结果表明，本发明的敏感性、特异性均符合试剂盒质量标准，与英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒检测结果相比，本发明的敏感性高于英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，此外，西班牙检测试剂盒所需检测时间为105分钟，本发明所需检测时间为70分钟，相比而言，更加快速。，综上说明，试制的试剂盒具有良好的适应性。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种非洲猪瘟病毒截短蛋白及其在制备ELISA检测试剂盒中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile

1 5 10 15

Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly

20 25 30

Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Ala Gly Lys Pro Val

35 40 45

Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr

50 55 60

Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala

65 70 75 80

Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala His Pro Thr Glu Pro Tyr Thr Thr

85 90 95

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn

100 105 110

Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

115 120 125

<210> 2

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaaaaaag ctgctgctgc tatcgaagaa gaagacatcc agttcatcaa cccgtaccag 60

gaccagcagt gggttgaagt taccccgcag ccgggtacct ctaaaccggc tggtgctacc 120

accgcttctg ctggtaaacc ggttaccggt cgtccggcta ccaaccgtcc ggctaccaac 180

aaaccggtta ccgacaaccc ggttaccgac cgtctggtta tggctaccgg tggtccggct 240

gctgctccgg ctgctgcttc tgctcacccg accgaaccgt acaccaccgt taccacccag 300

aacaccgctt ctcagaccat gtctgctatc gaaaacctgc gtcagcgtaa cacctacacc 360

cacaaagacc tggaaaactc tctgtaa 387

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒截短蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的截短蛋白在制备非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒中的应用。