CN101962411B

CN101962411B - 登革病毒血清学早期诊断试剂

Info

Publication number: CN101962411B
Application number: CN200910090011A
Authority: CN
Inventors: 李德新; 梁米芳; 张全福; 陆鹏; 李建东; 王晓芳
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2029-07-24
Also published as: CN101962411A

Abstract

本发明提供了登革病毒血清学诊断试剂，具体地是将登革病毒1、2、3和4型的EIII结构域串联得到重组融合蛋白rEIII，用于登革病毒感染的血清学诊断。此外，本发明还提供了适用于登革病毒感染的早期诊断试剂盒。本发明为登革病毒感染的血清学检测提供了新的思路，利用本发明诊断试剂可以对登革病毒感染进行有效的诊断，特别的是通过本发明提供的Mac-ELISA诊断试剂盒可以有效用于登革病毒感染的早期血清学诊断，该诊断试剂具有良好的特异性和灵敏度，操作简单，适合广泛推广使用。

Description

登革病毒血清学早期诊断试剂

技术领域

本发明涉及登革病毒血清学检测，特别涉及登革病毒血清学早期诊断试剂。

背景技术

登革病毒(dengue virus，DV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，分为4个血清型，即登革1、2、3、4型病毒。它可引起登革热(dengue fever，DF)，登革出血热(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome，DSS)，其中以登革热最为常见。主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播，近几十年来，全球登革病毒的流行区域不断扩大。据世界卫生组织估计全球约有2.5亿人口的健康受到登革热威胁，每年约有5100万人感染登革病毒，其中约50万人为登革出血热，约2.5万例死亡，在流行区域其发病率和病死率均较高。1873年，Monson最早报告我国厦门曾发生DF感染，其后1～4型DV在我国均发生过流行，流行区域主要集中在广东、广西、云南、福建、海南等南方地区，在一个地区往往存在不同血清型病毒的交替流行。

目前对于登革热的严重临床病例尚无有效的特异性治疗方法，也没有商品化的疫苗可以应用，但研究表明及早的临床处理可以减少DHF的发病率和病死率。由于多数登革病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、寒战等流感样症状，难以和其它发热疾病区分，必须依赖实验室的诊断加以确认。因此加强对登革热病毒感染早期诊断的研究，对于该病的治疗和控制有相当重要的意义。目前DV感染的实验室诊断，主要有病毒分离、抗体和抗原检测、基因诊断等。

病毒分离仍然是登革热感染诊断的“金标准”，但登革热的病毒血症期很短，因此病毒分离受到标本采集时间的限制，耗时较长、操作复杂且灵敏度低，达不到快速诊断的目的。传统的血清学方法主要包括血凝抑制实验、补体结合实验和中和实验，但这些方法大多敏感性或特异性不高，且操作繁烦，不适用于快速诊断。快速诊断方法包括间接免疫荧光(IFA)、ELISA、PCR等方法，敏感、特异、快速，适于大量标本的检测。间接免疫荧光法需要经验丰富的专业人员操作且需配备荧光显微镜，难以在基层推广。PCR技术有较好的敏感性和特异性，可以用于登革病毒感染的型别鉴别，缺点是登革病毒基因在退烧后一般检测不到，扩增过程中可能出现污染且需要一定的仪器设备和实验条件，目前难以在基层推广。ELISA法由于具有敏感性高、快速简便等优点，因而被认为是登革病毒感染的诊断较佳的方案。然而国外试剂盒价格昂贵，难以在基层普及应用。特别是目前还没有适用于登革病毒感染早期诊断的试剂盒。

DV基因组长约11kb，病毒RNA的5’端和3’端各有一段非编码区，中间是一个开放读码框架ORF。该开放读码框架包括3种结构蛋白(核衣壳蛋白C、膜蛋白前体PrM和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，5’端有I型帽子结构，3’端未发现ployA结构。编码E蛋白的E基因由1484个碱基组成，编码大约489～495个氨基酸，其相对分子质量(Mr)约60kD。E蛋白是DV最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白，构成病毒颗粒表面的突起。E蛋白在病毒颗粒感染细胞过程中起重要作用，在中性和微碱性条件下，成熟病毒表面的E蛋白以同源二聚体的形式存在，病毒与细胞膜表面受体结合后，以内吞途径入胞，吞噬体所处的内环境的p H值下降，E蛋白构象由同源二聚体变为三聚体结构。E蛋白构象的变化引起宿主细胞膜和病毒膜的融合，使得病毒基因组进入胞浆。此外，E蛋白还是影响病毒毒力、引起保护性免疫反应和免疫病理损伤的重要结构蛋白。Rey等通过X线衍射研究表明E蛋白有三个结构域，即结构域I、II和III。结构域I含有约120个氨基酸残基，分为1～51aa、137～189aa和285～302aa 3个片段，由8个β折叠形成，大致与病毒的膜平行。结构域II形成指状结构，由52～135aa和190～284aa组成，与蛋白的二聚体形成及病毒和细胞膜的融合相关。结构域III(EIII)为IgG免疫球蛋白样折叠，包括E蛋白303-395aa，在介导病毒与宿主受体结合中具有重要的作用。

发明人利用大肠杆菌表达系统表达了1-4型DV的EIII蛋白，进行了纯化，并将1-4型DV的EIII蛋白基因串联后融合表达纯化，制备了1-4型抗EIII蛋白的抗血清，并以重组EIII抗原和rEIII融合重组蛋白为基础，研究了上述重组蛋白在登革热血清学早期诊断中的应用，以期探索一种较好的Mac-ELISA方法用于登革病毒感染的早期诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于登革病毒感染的血清学诊断试剂。

为实现上述目的，本发明首先利用大肠杆菌表达系统制备了1-4型DV的E蛋白第三结构域(EIII)蛋白，并将1-4型DV的EIII蛋白基因串联后融合表达纯化，将得到的EIII蛋白和融合蛋白rEIII用于血清学检验，发现其具有良好的抗原性，特别是融合蛋白rEIII，其免疫原性显著高于其它重组蛋白。

具体地，本发明通过提取登革病毒RNA并逆转录获得1-4型DV的EIII基因，通过融合PCR的方法将DV1-4型的EIII基因片段连接后获得融合基因rEIII，分别将1-4型登革病毒的EIII基因编码序列及rEIII融合基因克隆至原核表达载体pET30a。

使用大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白，成功表达了1-4型EIII重组蛋白及rEIII融合蛋白，SDS-PAGE可溶性分析结果显示表达形式为包涵体。通过稀释复性的方法在蛋白复性液中加入精氨酸和谷胱甘肽氧化还原体系促进蛋白复性，在使用金属螯合层析及弱阴离子交换纯化了表达的重组蛋白。SDS-PAGE结果显示纯化后的蛋白有较高的纯度，Western blot结果显示表达的重组蛋白均能于登革热感染病人血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。

进一步，本发明用标记酶标记1-4型DV的EIII重组蛋白及rEIII融合蛋白作为标记抗原，用抗IgM抗体作为捕获抗体，建立Mac-ELISA检测法，用于登革热感染病人血清检测，结果显示该方法具有良好的特异性和较高的准确率。

在本发明实施例中，采用改良过碘酸盐氧化法分别将1-4型DV的EIII重组蛋白及rEIII融合蛋白进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，酶标抗原经分子筛纯化。以HRP标记的1-4型重组EIII蛋白为检测抗原的EIII-ELISA法和以rEIII融合蛋白为检测抗原的rEIII-ELISA法。通过棋盘法确定最佳的酶标抗原稀释度和血清稀释度后，以IFA和panbio试剂盒串联检测的结果为参照，EIII-ELISA的灵敏度、特异度、约登指数、阳性预测和阴性预测值分别为86.21％，98.21％，0.8442，96.15％和93.22％，rEIII-ELISA法分别为93.10％，100％，0.9310，100％，96.55％，可见rEIII在灵敏度、特异性等方面显著高于其它EIII重组蛋白。

EIII-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为91.95％和88.50％，rEIII-ELISA法与IFA和panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果的符合率分别为95.40％和90.80％。

用本发明方法检测5份乙脑IgM阳性血清、20份流行出血热病人及70份健康人血清结果均为阴性，说明本发明试剂盒的特异性均较好。

基于此，本发明将rEIII融合蛋白应用于登革病毒感染的血清诊断，制备登革病毒感染的免疫诊断试剂。

本发明中所述的免疫诊断试剂是以rEIII重组融合蛋白为基础，包括但不限于用于胶体金免疫层析法、化学发光酶联免疫分析、Luminex液相芯片的试剂。

此外，可以进一步将上述试剂与适当的其它辅助试剂组装成试剂盒，以方便使用。

优选，本发明提供一种ELISA检测试剂盒，其是以IgM-μ链抗体作为捕获抗体，以重组融合蛋白rEIII为标记抗原的Mac-ELISA检测试剂盒。

本发明还提供一种制备上述重组融合蛋白的方法，包括通构建表达rEIII的重组表达载体，将所述载体导入宿主，培养宿主表达rEIII重组蛋白。

具体地，本发明的rEIII重组融合蛋白，其是将DV病毒1～4型EIII结构域通过柔性linker串联起来得到的融合蛋白。这种linker通常选用G和/或S组成的氨基酸链，也可以连用几个G。G的侧链比较小，不会形成空间阻碍。在本发明实施例中柔性linker采用的是GGGGSGGGG氨基酸链，融合蛋白rEIII的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本领域技术人员可以根据上述氨基酸序列，根据宿主的密码子偏爱性设计恰当的基因序列，在本发明实施例中，根据大肠杆菌密码子的偏爱性设计合成了如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，用于融合蛋白rEIII的重组表达。

通过上述技术方案，本发明为登革病毒感染的血清学检测提供了新的思路，利用本发明诊断试剂可以对登革病毒感染进行有效的诊断，特别的是通过本发明提供的Mac-ELISA诊断试剂盒可以有效用于登革病毒感染的早期血清学诊断，该诊断试剂具有良好的特异性和灵敏度，操作简单，适合广泛推广使用。

附图说明

图1显示的是PCR扩增DV EIII基因的凝胶电泳图，其中M：DNA Marker(DL2000)；1：DV1-GZ01/95 EIII基因；2：DV2-ZS01/01 EIII基因；3：DV3-H87 EIII基因；4：DV4-H241 EIII基因。

图2显示的是双酶切鉴定DV EIII-pET30a重组质粒，其中M：DNA Marker(DL2000)；1：DV1-GZ01/95 EIII pET30a；2：DV2-ZS01/01 EIII pET30a；3：DV3-H87 EIIIpET30a；4：DV4-H241 EIII pET30a。

图3显示的是SDS-PAGE分析1～4型重组EIII蛋白在大肠杆菌中的表达情况，其中M：分子量标准；1：DV1-GZ01/95 EIII蛋白；2：DV2-ZS01/01 EIII蛋白；3：DV3-H87EIII蛋白；4：DV4-H241 EIII蛋白；5.阴性对照。

图4显示的是DV2-ZS01/01-EIII-pET30a重组蛋白的可溶性检测，其中M：蛋白分子量标准1：超声破碎的裂解液沉淀，2：超声破碎的裂解液上清。

图5显示的是重组EIII蛋白经亲和层析(a)和弱阴离子交换纯化(b)SDS-PAGE结果，其中M：分子重量标准；1：DV1-GZ01/95 EIII蛋白；2：DV2-ZS01/01 EIII蛋白；3：DV3-H87 EIII蛋白；4：DV4-H241 EIII蛋白。

图6显示的是Western Blot分析登革1～4型重组EIII蛋白，其中M：分子重量标准；1：DV1-GZ01/95 EIII蛋白；2：DV2-ZS01/01 EIII蛋白；3：DV3-H87 EIII蛋白；4：DV4-H241EIII蛋白；5.阴性对照。

图7显示的是融合PCR扩增rEIII基因的凝胶电泳图，其中，M：DNA Marker(DL2000)1：DV1-GZ01/95 EIII基因；2：DV2-ZS01/01 EIII基因；3：DV3-H87 EIII基因；4：DV4-H241 EIII基因5：DV1/3 EIII基因6：DV4/2 EIII基因7.rEIII基因。

图8显示的是酶切鉴定重组rEIII表达质粒，其中M：DNA Marker(DL2000)1：rEIII-pET30a。

图9显示的是SDS-PAGE分析重组融合rEIII蛋白在大肠杆菌中的表达，其中M：分子重量标准；1.阴性对照2.rEIII蛋白

图10显示的是重组rEIII蛋白经亲和层析和弱阴离子交换纯化SDS-PAGE结果，其中M：分子重量标准；1：经Ni-NTA纯化后的rEIII蛋白；2：经ANX弱阴离子交换纯化后的rEIII蛋白。

图11显示的是Western Blot分析重组rEIII融合蛋白，其中M：分子重量标准；1.rEIII蛋白；5.阴性对照。

图12显示的是使用不同酶标抗原对DV感染病人血清IgM抗体检测结果。

图13显示的是EIII-ELISA法血清和酶标抗原稀释浓度棋盘滴定结果分析。

图14显示的是rEIII-ELISA法血清和酶标抗原稀释浓度棋盘滴定结果分析。

图15显示的是EIII-ELISA法(A)与rEIII-ELISA法(B)检测登革血清ROC曲线图。

在上述附图中Mr表示相对分子量，具体是指分子的平均原子质量与核素¹²C原子质量的1/12之比。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1重组登革病毒E蛋白结构域III以及rEIII的表达

材料和方法

1.DV1～4型EIII结构域以及rEIII融合重组表达载体的构建

1.1DV1-4型EIII区基因片段以及rEIII编码基因片段的获得

本例中通过提取登革病毒RNA并逆转录获得1-4型DV的EIII基因，当然，本领域技术人员可以通过公开的EIII结构域序列人工合成DV1～4型的EIII区基因片段以及rEIII编码基因片段。

1.1.1cDNA的获得

C6/36细胞使用1640生长液培养(含有30％eagle’s，10％胎牛血清，1％双抗，1％谷氨酰胺)，于28℃，5％CO2条件培养待细胞长成单层时，分别接种1-4型标准株登革病毒(四型登革病毒标准株1型GZ01/95株、2型ZS01/01株、3型H87株、4型H241，中国疾病预防控制中心病毒病所)。静置吸附lh，吸去上清，加入1640维持培养液(30％eagle’s，1％双抗，1％谷氨酰胺)，继续培养4-5天。

用

LS Reagent(Invitrogen)参照说明书分别提取DV1-4型RNA，使用Invitrogen公司的SuperScript^TM III第一链合成试剂盒进行RT反应，具体过程如下：在0.2ml PCR管中加入细胞总RNA(10pg-5μg，8μl)、Random hexamers(50ng/μl，1μl)以及dNTPs Mix(10mM，1μl)65℃温育5分钟，迅速放至冰浴至少1分钟，加入10μlcDNA Synthesis Mix(10×RT Buffer 2μl、0.1M DTT 2μl、40U/μl RNaseOUT 1μl、25mMMgCl2 4μl以及SuperScript IIIRT 1μl)25℃温育10分钟，在50℃反应50分钟，最后85℃处理5分钟终止反应，加入1μl RNase H，轻柔混匀，37℃温育20分钟，得到cDNA。

1.1.2DV1-4型EIII结构域基因片段的扩增

分别设计4对引物用于扩增DV标准株1-4型E基因的第三结构域片段，引物设计如表1所示。

表1 扩增1-4型登革EIII所用引物

分别以上述获得的DV1～4型cDNA为模板，以相应的表1中的引物扩增DV标准株1-4型E基因的第三结构域片段。反应体系如下：

10mM dNTP 1.5μl

上游引物，10μM 1.5μl

下游引物，10μM 1.5μl

cDNA模板 2μl

10×Buffer 5μl

Pfx DNA聚合酶 0.5μl

MgSO₄ 50mM 1μl

双蒸水 37μl

总体积 50μl

反应程序为：94℃30sec；94℃15sec，55℃30sec，68℃3min，30个循环；最后68℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

1.1.3rEIII融合蛋白基因片段的获得

根据融合PCR引物设计原则，设计4对可将DV1-4型EIII基因融合扩增的引物，具体引物序列如表2所示。

表2 DV1-4型EIII结构域蛋白的融合表达所用引物

按照与上述扩增DV1-4型EIII结构域相同的方法，首选用表2中的引物以获得的cDNA为模板(登革1型GZ01/95株、2型ZS01/01株、3型H87株、4型H241株，)分别扩增得到DV1-4型EIII结构域序列，接着采用重叠PCR(overlapping PCR)方法将DV1 EIII片段与DV3 EIII片段连接的DV1-DV3片段，将DV2 EIII片段与DV4 EIII片段连接得DV2-DV4片段，最后再通过重叠PCR将DV1-DV3片段与DV2-D4片段连接，最终得到DV1～4EIII结构域串联的重组基因片段。

具体步骤如下：以DV1 EIII基因与DV3 EIII基因融合为例叙述融合PCR的具体实施。扩增采用美国Invitrogen公司Platinum Pfx DNA聚合酶，基因的融合PCR扩增分两步进行：1)不加引物，低复性温度下进行10个循环。反应体系为：10×Buffer 5ul、10mM dNTP 1.5ul、MgSO₄50mM 1ul、Pfx DNA polymerase 0.5ul、DV1 EIII片段1ul、DV3 EIII片段1ul、加ddH2O补足至50ul。反应条件为：94℃预变性30s，94℃15s，42℃30s，68℃1min，共10个循环，4℃保存。2)加入引物，以第一步扩增产物为模板扩增融合基因。扩增上游引物D1rEIII-F为GGAATTCCATATGTCATATGTAATGTGCAC，扩增下游引物D2rEIII-R为CCGCTCGAGTTAATGGTGATGGTGATGGTGTTGGCCAATAGAGCT。反应体系为：10×Buffer 5ul、10mM dNTP1.5ul、MgSO₄50mM 1ul、Pfx DNApolymerase 0.5ul、上游引物1ul、下游引物1ul、第一步扩增产物2ul、加ddH₂O补足至50ul。扩增条件为：94℃预变性30s，94℃15s，52℃30s，68℃1min，共25个循环，68℃延伸10min，4℃保存。第二步PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收。

1.2表达载体构建

将PCR产物及pET30a均采用NdeI和XhoI双酶切，反应体系如下：

10×NEB buffer 4 5μL

10×BSA 5μL

NdeI 1μL

XhoI 1μL

DNA 30μL

ddH₂O至 50μL

37℃酶切反应3h，酶切产物进行胶回收并纯化。T4DNA连接酶4℃连接过夜。反应体系如下：

10×buffer 1μL

PCR products 3μL

Plasmid 1μL

T4 DNA ligase 1μL

dd H₂O至 10μL

小量制备重组质粒，经NdeI和XhoI双酶切鉴定后，进一步测序鉴定。挑取序列正确的克隆进行后续实验。

2.DV EIII蛋白以及rEIII蛋白的表达及纯化

将鉴定正确的重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，初步筛选阳性菌落，并进行酶切验证，将经鉴定的重组菌用于蛋白的表达盒纯化。

2.1重组蛋白的小量诱导表达及SDS-PAGE分析

将鉴定正确的重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。

从平板上挑取单菌落接种3ml含有30μg/ml卡那霉素的2×YT培养基，37℃剧烈振荡培养至O.D.值为0.6。

加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续震荡培养4h。

取1ml菌液于1.5ml的EP管中，12000rpm，离心1min，弃上清。

于菌体沉淀中加入40ulPBS重悬，加10ul5×loading Buffer，混匀。沸水浴中煮10min。

12000rpm，离心10min。

取上清10ul进行SDS-PAGE电泳。

凝胶配制：分离胶15％，浓缩胶3％。电泳时首先用低电压(8V/cm)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电压(15V/cm)电泳.直至溴酚蓝跑出胶外。电泳结束后，将凝胶浸于考马斯亮蓝G250染色液中，染色2h。加入脱色液至背景无色。

2.2重组蛋白可溶性分析

将鉴定正确的重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞。

加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续震荡培养4h。

取10ml菌液于离心管中，4000rpm，离心10min。

收集沉淀，用PBS重悬，置冰浴上超声粉碎15min(超声15sec，间隔15sec)。

4℃，4000rpm离心10min；上清移至新管中。

沉淀用适量的PBS重悬。

上清和沉淀分别行SDS-PAGE电泳分析。

2.3重组蛋白的诱导表达及纯化

2.3.1蛋白的诱导表达及包涵体溶解

将经鉴定的重组蛋白表达菌种按1∶100接种至100ml含有30μg/ml卡那霉素2×YT培养基中，37℃震荡培养过夜。

将上述菌液按1∶20转接至1000mlk卡那抗性的2×YT培养基中，37℃剧烈震荡培养至OD值为0.6时加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续震荡培养4h。

收集菌液，8000rpm离心20min，收获细菌沉淀。

于沉淀中加入适量PBS重悬，8000rpm离心20min，收获沉淀并称湿重。

以20ml/g湿菌重量加入细菌裂解液重悬细菌，反复冻融3次。

超声裂解细菌细胞15min(超声15sec，间隔15sec)。油镜检查超声裂解情况，以每个视野中完整细胞不超过2个为裂解完全。10000rpm离心30min，收获细菌沉淀。

沉淀用含6M盐酸胍的缓冲液30ml重悬，室温温和搅拌，使包涵体充分溶解；10000rpm离心30min去除不溶物；上清即为初步纯化的蛋白溶液。

2.3.2重组蛋白的复性

将上述变性蛋白分次加入预冷的1000ml蛋白复性液中：每次加入量不超过5ml，间隔12h加一次。全部加完后，置于4℃放置48h。

2.3.3复性蛋白的透析

透析袋的处理：将透析袋浸泡于2％(w/v)NaHCO3和1mMEDTA(pH8.0)的液体中著沸10min，用ddH2O彻底清洗后置于1mM EDTA(pH8.0)中煮沸10min，再用ddH2O彻底清洗后即可使用。

透析：将上述蛋白复性液分装于透析袋中，浸泡于Binding Buffer中，并置于4℃。每6～8h换一次液，共换液5次。

2.3.4亲和层析纯化蛋白

使用AKTA Prime蛋白纯化仪纯化。

Ni+亲和柱的准备：依次用下列液体洗柱3倍柱床体积ddH2O、5倍柱床体积的1×Charge Buffer、3倍柱床体积ddH2O、5倍柱床体积起始缓冲液平衡树脂。并调整记录基线至0。

上样：上述经复性及透析处理的蛋白溶液使用0.45um滤膜过滤后上样，流速为1ml/min。

洗柱：待样品上完之后，用5倍以上柱床体积的起始缓冲液洗注至基线回到起始值。

洗脱：分别用含5、10、20、50、100、200、300、500mM咪唑的elution buffer洗脱，收集相应洗脱峰的洗脱液。

取收集峰的样品行SDS-PAGE电泳分析。

2.3.5弱阴离子交换纯化蛋白

使用ANX弱阴离子交换柱及AKTA Prime蛋白纯化仪纯化。

配制如下溶液

Start buffer：50mMTris-HCl，pH8.0

Elution buffer：50mMTris-HCl，1M NaCl，pH8.0

start buffer和elution buffer使用前以0.45微米滤膜过滤

ANX弱阴离子交换柱的准备

依次用下列液体洗柱：100ml start buffer、100ml elution buffer以、100ml start buffer，各液体流速均为5ml/min。

上样：将上述经亲和层析纯化并经SDS-PAGE电泳鉴定的蛋白样品以2ml/min流速上样4ml。

洗脱：用0-100％Elution buffer梯度洗脱，体积400ml，流速5ml/min。

收集洗脱液，SDS-PAGE分析

3.Weston-blotting检测表达蛋白

取上述纯化的蛋白行SDS-PAGE：

采用Bio-Rad公司的Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell进行半干法蛋白质电转移实验；

取合适大小的PVDF膜，以45°角轻轻放入甲醇溶液中，利用毛细作用使PVDF膜被甲醇浸透，至少浸泡平衡30min，将甲醇平衡好的PVDF膜转移到电转缓冲液中平衡至少15min；

将SDS-PAGE之后的胶放置在电转缓冲液中平衡至少15min，剪取合适大小的3M滤纸6张，放入电转缓冲液中浸泡平衡至少15min，使之饱和；

在阳极板上放置3层使用电转缓冲液预先饱和的3M滤纸，注意精确对齐，每一层都需要使用试管来回滚动赶走气泡；

将用电转缓冲液预平衡好的PVDF膜放置到3层3M滤纸上面，使用试管来回滚动赶走气泡；

将用电转缓冲液预平衡好的胶放置到PVDF膜上，注意不要让胶超过PVDF膜的大小，以免蛋白转移不完全，使用试管来回滚动赶走气泡；

在胶上放置3层使用电转缓冲液预先饱和的3M滤纸，注意精确对齐，每一层都需要使用试管来回滚动赶走气泡；

小心放置阴极板，注意使插销锁闭，不要移动滤纸，盖好安全罩，接通电源，注意不要接反了极性，在15V恒压条件下电转30min；

电转结束后，对胶进行考马思亮蓝染色检查蛋白转移是否完全；PVDF膜进行下一步实验。

封闭：将电转实验之后的PVDF膜浸泡于用TBS配制的5％(W/V)脱脂奶中，室温封闭2小时；

用TBS配制的5％(W/V)脱脂奶稀释登革病人血清作为第一抗体，将PVDF膜与第一抗体室温作用2小时，然后用1×TBS洗涤3次；

用TBS配制的5％(W/V)脱脂奶稀释HRP标记的羊抗人IgG作为第二抗体，将洗涤后的PVDF膜与第二抗体室温下作用1小时，用1×TBS洗涤3次；

显色：将PVDF膜放入DAB底物显色液中，至棕色阳性条带出现时终止反应。照相后避光保存。

结果

1.1PCR扩增EIII基因

扩增的1-4型标准株登革病毒E蛋白结构域III基因片段，片段大小为321bp，PCR结果如图1所示，扩增的EIII基因片段均与目标相符。

1.2EIII-pET30a重组质粒的酶切鉴定及测序

1-4型标准株的EIII区片段用NdeI和XhoI双酶切后，与相应内切酶处理的pET30a连接，转化感受态DH5α，提取质粒，重组质粒用NdeI和XhoI酶切鉴定，结果如图2所示。重组质粒在250bp到500bp之间均切出明显条带。将阳性克隆用ABI 3700型DNA测序仪测序并比对测序结果，结果均为目的序列。

2.EIII蛋白在大肠杆菌表达系统的表达纯化

2.1SDS-PAGE检测表达蛋白

含有1-4型标准株EIII基因的pET30a重组质粒及pET30a空质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，诱导表达5h后，收集菌体，用15％的SDS-PAGE分析表达情况，结果如图3所示，与阴性对照相比，1-4型重组质粒在相对分子量6.5×10³与16.5×10³之间出现明显蛋白表达带，同预测的14型EIII蛋白相对分子量大小12×10³相符。

2.2重组蛋白可溶性检测

1-4型重组EIII-pET30a质粒表达后的菌体超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明DV1-4型重组蛋白均以包涵体形式存在于沉淀中。如图4所示为DV2型ZS01/01株EIII重组蛋白可溶性检测的结果，其目的蛋白带存在于沉淀中，其余型别的结果略。

2.3重组蛋白的纯化

表达的EIII重组蛋白C端均带有6个组氨酸标签，包涵体沉淀经6M盐酸胍溶解并稀释复性后，使用HiTrap Chelating HP柱金属螯合层析纯化蛋白，SDS-PAGE分析纯化结果，如图5a所示，分离出的目的蛋白泳道中有杂蛋白带。进一步用ANX弱阴离子交换纯化后分析纯化结果，蛋白纯度明显提高，如图5b所示。

2.4重组蛋白的Western bolt分析

1-4型登革重组EIII蛋白经纯化后，Western Bolt结果显示，重组抗原与登革病人阳性血清反应，在相应位置出现条带，而与正常人血清不反应，如图6所示。

3.DV EIII融合蛋白重组表达质粒的构建

3.1融合PCR扩增EIII基因

PCR扩增DV1-GZ01/95株EIII基因、DV2-ZS01/01株EIII基因、DV3-H87株EIII基因及DV4-H241株EIII基因，扩增EIII基因片段长度均为315bp，如图7A所示，在500bp和250bp之间有明显条带。将DV1-GZ01/95株和DV3-H87株EIII基因PCR融合，融合片段长度为705bp；将DV2-ZS01/01株和D4-H241株EIII基因PCR融合，融合片段长度为690bp，电泳结果如图7B所示。将上述的两个已融合片段再次PCR融合连接成一个片段，融合片段大小为1342bp，电泳结果如图7C所示。

3.2rEIII融合蛋白pET30a重组表达质粒的构建及鉴定

rEIII融合片段PCR纯化产物用NdeI和XhoI双酶切后，与相应内切酶处理的pET30a连接，转化感受态DH5α，提取质粒，重组质粒用NdeI和XhoI酶切鉴定，结果如图8。重组质粒在2000bp到1000bp之间均切出明显条带。将阳性克隆用ABI 3700型DNA测序仪测序并比对测序结果，结果均为目的序列。

4.rEIII重组融合蛋白的表达和纯化

4.1SDS-PAGE检测表达蛋白

含有rEIII基因的pET30a重组质粒及pET30a空质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，诱导表达5h后，收集菌体，用15％的SDS-PAGE分析表达情况，结果如图9所示，与阴性对照相比，重组质粒在相对分子量43×10³附近出现明显蛋白表达带。

4.2rEIII重组融合蛋白的纯化

rEIII重组融合蛋白C端均带有6个组氨酸标签，包涵体沉淀经6M盐酸胍溶解并稀释复性后，使用HiTrap Chelating HP柱金属螯合层析纯化蛋白，进一步用ANX弱阴离子交换纯化后分析纯化结果，SDS-PAGE分析纯化结果。如图10所示，Ni²⁺螯合柱层析纯化出的目的蛋白泳道中仍有杂蛋白带。离子纯化交换后蛋白纯度明显提高。

4.3重组rEIII融合蛋白的Western bolt分析

登革病毒重组rEIII融合蛋白经纯化后，Western Bolt结果显示，重组抗原与登革病人阳性血清反应，在相应位置出现条带，而与正常人血清不反应，如图11所示。

实施例2重组登革病毒EIII蛋白及rEIII在登革病毒热血清检测中的应用

本例利用实施例1已经制备的登革病毒1-4型EIII重组蛋白及rEIII融合蛋白建立Mac-ELISA方法，以探讨重组登革病毒EIII蛋白及rEIII在登革病毒热血清检测中的应用。

实验材料

1.包被抗体：羊抗人IgM-μ链抗体(美国SIGMA)。

2.待检血清：登革热监测血清(采自广东、广西和福建等地)，健康人血清、流行性出血热病人血清(中国疾病预防控制中心病毒病所)，乙脑病人IgM阳性血清(中国预防医学科学院病毒学研究所)。

3.酶标抗原：HRP标记的上述纯化的1-4型DV病毒重组EIII蛋白及重组融合rEIII蛋白。

4.对照ELISA试剂盒(Mac-ELISA，澳大利亚PanBio，Cat.No.E-DEN01M)

5.ELISA相关试剂

1)ELISA包被液：30mMNaHCO₃，10mM Na₂CO₃，pH9.6

2)ELISA封闭液：5％脱脂奶，1X PBS，pH7.4

3)ELISA洗涤液(PBST)：0.05％Tween20，1X PBS，pH7.4

4)HRP的底物：

A液：5mg四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)按I∶4溶于醋酸盐缓冲液(0.2mol/L.pH 5.8-6.0)；

B液：0.03％H₂O₂

5)ELISA反应终止液：2moI/L H₂SO₄

6.改良过碘酸盐氧化法所用试剂：

HRP(Bio-Laboratories公司)；0.1M NaIO₄溶液；1mM醋酸盐缓冲液，PH 4.4；0.2M碳酸盐缓冲液(Na₂CO₃0.32克，NaHCO₃0.586克加蒸馏水至50ml)，PH 9.5；固体硼氢化钠；0.02M PBS，pH 7.2；

7.FITC标记的抗人IgMμ链抗体(sigma)

实验方法

1.酶标抗原的制备

采用改良过碘酸盐氧化法用辣根过氧化物酶(HRP)对重组蛋白进行标记。步骤如下：

1)称取1mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟。

3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入2mg重组蛋白(溶于0.01M碳酸盐缓冲液中)，室温避光轻轻搅拌2小时。

5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，再置4℃2小时。

6)将上述液装入透析袋中，用1X PBS+0.15M NaCl PH7.4透析，4℃过夜。

2.分子筛纯化酶标抗原

采用通用公司的Superdex 200预装柱纯化，结合AKTA Prime蛋白纯化系统进行蛋白回收。上样Buffer和洗脱Buffer为1X PBS+0.15M NaCl。

1)50ml去离子水0.5ml/min，洗柱；

2)50ml上样buffer0.5ml/min，平衡层析柱

3)使用上样环上样；

4)洗脱buffer，0.5ml/min洗脱根据监测到的紫外吸收信号收集产物；

3.PanBio公司Mac-ELISA试剂盒检测登革热监测血清

按照PanBio公司说明书操作

1)在2.5ml的抗原稀释液(Antigen-Diluent)加入10μl的混合抗原

2)将等量的上述液体和MAbTracer混合后置于室温。

3)样本血清用血清稀释液(Serum diluent)1∶100稀释后加入酶标板内，每孔加100μl。37℃孵育1小时。

4)用稀释的WashBuffer洗板6次。

5)加入步骤2中液体于酶标板内，每孔100μl，37℃孵育1小时。

6)用稀释的WashBuffer洗板6次。

7)加入100μl的TMB室温显色10分钟后加入100μl终止液，于450nm波长下读取OD值

4.间接免疫荧光检测登革热监测血清

除血清浓度为1∶20稀释，二抗选择FITC标记的抗人IgMμ链抗体外操作步骤同上。

5.重组蛋白应用于的Mac-ELISA法的初步研究

将以EIII重组蛋白为酶标抗原的Mac-ELISA简称为EIII-ELISA，将以rEIII融合重组蛋白为酶标抗原的Mac-ELISA简称为rEIII-ELISA。

5.1确定EIII-ELISA法的酶标抗原

将1、2、3、4型DV的重组EIII酶标抗原及1-4型重组酶标抗原等量混合检测5份登革热阳性血清和1份阴性血清，检测结果显示1-4型酶标抗原和混合抗原均能同病人血清发生反应(图11)，为防止漏检选用1-4型酶标抗原等量混合物用为EIII-ELISA法的酶标抗原。

5.2棋盘法确定酶标抗原浓度和血清稀释度

包被的抗人IgM-μ链抗体稀释度固定在1∶2000(2.5μg/ml)，登革热阳性血清从1∶5开始2倍系列稀释8个稀释度，酶标抗原从1∶50开始2倍系列稀释5个稀释度。检测结果如图12和图13所示，血清1∶10稀释，酶标抗原1∶100稀释时EIII-ELISA法(酶标抗原浓度0.45μg/ml)和rEIII-ELISA(酶标抗原浓度0.30μg/ml)法的阳性血清OD值比阴性血清OD值(P/N值)最高。

5.3捕获法检测IgM抗体的实验方法

1)羊抗人IgM-μ链抗体，1∶2000稀释，浓度为5.0μg/ml(pH 9.6，0.1M，碳酸盐缓冲液)，加入酶联板条，100μl/孔，4℃包被过夜；

2)用洗涤液洗板3次。加入封闭液250μl/孔，4℃过夜，或37℃2小时；

3)用洗涤液洗板3次，用封闭液1∶10稀释待检血清及正常人血清，100μl/孔；

4)洗涤液洗板6次。加入酶标抗原，(用封闭液1∶100稀释酶标抗原)，100μl/孔，37℃1小时；

5)用洗涤液洗板6次后显色，显色底物为TMB，A、B液各50μl，37℃10分钟后，加入50μl的终止液。450nm波长下检测OD值。

5.4阴性和阳性血清临界值的确定

以IFA和Panbio公司Mac-ELISA试剂检测的串联结果作为“金标准”，即将两种方法检测结果均为阳性的血清才定为阳性血清，两种方法均判读为阴性的血清才定为阴性血清。取经上述方法确定的阳性血清29份，阴性血清56份，分别以EIII-ELISA和rEIII-ELISA检测。利用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve，简称ROC曲线)来决定最佳临界值。

5.5本发明方法和IFA及Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果比较

选取87份登革热监测血清分别以IFA、panbio试剂盒及本发明的两种Mac-ELISA方法检测，将检测结果进行比较。

5.6检测方法特异性分析

以EIII-Mac-ELISA和rEIII-Mac-ELISA检测70份健康人血清，20份流行性出血热及5份乙脑IgM阳性血清。

实验结果

1.EIII-ELISA法及rEIII-ELISA法cut off值的确定

选取以IFA和Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果一致的登革热阳性血清29份，阴性血清56份，分别以本例的两种方法检测后读取OD值，利用ROC曲线法确定阴阳性血清临界值，取敏感度和特异度之和最大的点定为临界点，EIII-ELISA法cutoff值为0.072，rEIII-ELISA法cutoff值为0.130。两种自研方法的统计学相关指标如表3所示。

表3.EIII-ELISA法和rEIII-ELISA法的比较

EIII-ELISA法ROC曲线如图15A所示，曲线下面积0.905，与曲线下面积为0.5比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，rEIII-ELISA法ROC曲线如图15B所示，曲线下面积为0.968，与曲线下面积为0.5比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明这两种诊断方法的准确性均较高。

2.EIII-ELISA法及rEIII-ELISA法与IFA及Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果分析

选取87份临床诊断登革热病人血清分别以IFA、panbio试剂盒及自研的两种Mac-ELISA方法检测。EIII-ELISA法与IFA检测结果如表4所示，检测符合率为91.95％(χ²＝2.28，P＞0.05)，以IFA为参照，EIII-ELISA法的灵敏度为81.25％，特异度为98.18％，阳性预测值为96.30％，阴性预测值为90％。rEIII-ELISA法与IFA检测结果如表5所示，检测符合率为95.40％(χ²＝0.25，P＞0.05)，以IFA为参照，rEIII-ELISA法的灵敏度为90.63％，特异度为98.18％，阳性预测值为96.67％，阴性预测值为94.74％。EIII-ELISA法与Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果如表6所示，检测符合率为88.50％(χ²＝2.50，P＞0.05)，以Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果为参照，EIII-ELISA法的灵敏度为76.47％，特异度为96.23％，阳性预测值为92.86％，阴性预测值为86.44％。rEIII-ELISA法与Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果如表7所示，检测符合率为90.80％(χ²＝1.13，P＞0.05)，以Panbio公司Mac-ELISA试剂盒检测结果为参照，EIII-ELISA法的灵敏度为82.35％，特异度为96.23％，阳性预测值为93.33％，阴性预测值为89.47％。

表4 EIII-ELISA与IFA对登革热可疑标本IgM检测结果分析

表5 rEIII-ELISA与IFA对登革热可疑标本IgM检测结果分析

表6 EIII-ELISA与Panbio对登革热可疑标本IgM检测结果分析

表7 rEIII-ELISA与Panbio对登革热可疑标本IgM检测结果分析

3.本发明方法特异性检测

选取70份健康人血清，20份流行性出血热病人血清，及5份乙脑病人IgM阳性血清，以EIII-ELISA和rEIII-ELISA检测，ELISA结果均为阴性。

实施例3登革病毒感染早期诊断试剂盒的组成

依据实施例2本例提供一种用于登革病毒感染早期诊断的检测试剂盒。该试剂盒由如下部分组成：

1)包被羊抗人IgM-μ链抗体的酶标板；

2)HRP标记rEIII抗原；

3)ELISA洗涤液(PBST)：0.05％Tween20，1X PBS，pH7.4；

4)HRP的底物：

A液：5mg四甲基联苯胺(TMB)溶于5mL二甲基亚砜(DMSO).按I∶4溶于醋酸盐缓冲液(0.2mol/L.pH 5.8-6.0)；

B液：0.03％H₂O₂

5)ELISA反应终止液：2moI/L H₂SO₄。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病所

<120>登革病毒血清学早期诊断试剂

<130>KHP09112371.4

<160>26

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>312

<212>DNA

<213>dengue virus gz01/95

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(312)

<400>1

atgtcatatg taatgtgcac aggcccattt aagttagaga aggaagtggc tgagacccag 60

catggaactg ttctagtaca ggttaaatac gaaggaacag atgcaccatg caagatcccc 120

ttttcgtccc aagatgagaa gggagtaacc cagaatggga gattggtaac agccaacccc 180

atagtcactg acaaagaaaa accagtcagc attgaggcgg aaccaccttt tggtgagagc 240

tacatcgtgg taggagcagg tgaaaaagcc ttgaaactaa gctggttcaa gaagggaagc 300

agtataggga aa 312

<210>2

<211>103

<212>PRT

<213>dengue virus gz01/95

<400>2

Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Pro Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala

1 5 10 15

Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr

20 25 30

Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val

35 40 45

Thr Gln Asn Gly Arg Leu Val Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys

50 55 60

Glu Lys Pro Val Ser Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr

65 70 75 80

Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys

85 90 95

Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys

100

<210>3

<211>312

<212>DNA

<213>dengue virus ZS01/01

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(312)

<400>3

atgtcatatt ctatgtgtac aggaaagttt aaagttgtga aggaaatagc agaaacacaa 60

catggaacaa tagttatcag agtacaatat gaaggggacg gttctccgtg caagatccct 120

tttgaaataa tggatttgga aaaaagacat gtcttaggtc gcttgatcac agtcaaccca 180

attgttacag aaaaagacag cccagtcaac atagaagcag aacctccatt cggagacagt 240

tacatcatta taggagtaga accgggacaa ctgaagctca gctggtttaa gaaaggaagc 300

tctattggcc aa 312

<210>4

<211>104

<212>PRT

<213>dengue virus ZS01/01

<400>4

Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile

1 5 10 15

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly

20 25 30

Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys

35 40 45

Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu

50 55 60

Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser

65 70 75 80

Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Ser Trp Phe

85 90 95

Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln

100

<210>5

<211>312

<212>DNA

<213>dengue virus H87

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(312)

<400>5

atgagctatg caatgtgctt gaataccttt gtgttgaaga aagaagtctc cgaaacgcag 60

catgggacaa tactcattaa ggttgagtac aaagggaaag atgcaccctg caagattcct 120

ttctccacgg aggatggaca agggaaagct cacaatggca gactgatcac agccaatcca 180

gtggtgacca agaaggagga gcctgtcaac attgaggctg aacctccttt tggggaaagt 240

aatatagtaa ttggaattgg agacaaagcc ctgaaaatca actggtacag gaagggaagc 300

tcgattggga ag 312

<210>6

<211>104

<212>PRT

<213>dengue virus H87

<400>6

Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val

1 5 10 15

Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly

20 25 30

Lys Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly

35 40 45

Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys

50 55 60

Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser

65 70 75 80

Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr

85 90 95

Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys

100

<210>7

<211>312

<212>DNA

<213>dengue virus H241

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(312)

<400>7

atgtcataca cgatgtgctc aggaaagttc tcaattgaca aagagatggc agaaacacag 60

catgggacaa cagtggtaaa agtcaagtat gagggtgctg gagctccatg taaagttccc 120

atagagataa gagatgtgaa caaggaaaaa gtggtagggc gcatcatctc atctacccct 180

tttgctgagt ataccaacag tgtaaccaac atagaattag aacccccctt tggggacagc 240

tacatagtaa taggtgttgg agacagtgca ttaacactcc attggttcag gaaagggagt 300

tccattggca ag 312

<210>8

<211>104

<212>PRT

<213>dengue virus H241

<400>8

Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met

1 5 10 15

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly

20 25 30

Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys

35 40 45

Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr

50 55 60

Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser

65 70 75 80

Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asp Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe

85 90 95

Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys

100

<210>9

<211>1323

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1323)

<400>9

atgtcatatg taatgtgcac aggcccattt aagttagaga aggaagtggc tgagacccag 60

catggaactg ttctagtaca ggttaaatac gaaggaacag atgcaccatg caagatcccc 120

ttttcgtccc aagatgagaa gggagtaacc cagaatggga gattggtaac agccaacccc 180

atagtcactg acaaagaaaa accagtcagc attgaggcgg aaccaccttt tggtgagagc 240

tacatcgtgg taggagcagg tgaaaaagcc ttgaaactaa gctggttcaa gaagggaagc 300

agtataggga aaggcggtgg cggtagcggc ggtggcggta tgagctatgc aatgtgcttg 360

aatacctttg tgttgaagaa agaagtctcc gaaacgcagc atgggacaat actcattaag 420

gttgagtaca aagggaaaga tgcaccctgc aagattcctt tctccacgga ggatggacaa 480

gggaaagctc acaatggcag actgatcaca gccaatccag tggtgaccaa gaaggaggag 540

cctgtcaaca ttgaggctga acctcctttt ggggaaagta atatagtaat tggaattgga 600

gacaaagccc tgaaaatcaa ctggtacagg aagggaagct cgattgggaa gatgtcatac 660

acgatgtgct caggaaagtt ctcaattgac aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca 720

acagtggtaa aagtcaagta tgagggtgct ggagctccat gtaaagttcc catagagata 780

agagatgtga acaaggaaaa agtggtaggg cgcatcatct catctacccc ttttgctgag 840

tataccaaca gtgtaaccaa catagaatta gaacccccct ttggggacag ctacatagta 900

ataggtgttg gagacagtgc attaacactc cattggttca ggaaagggag ttccattggc 960

aagggcggtg gcggtagcgg cggtggcggt atgtcatatt ctatgtgtac aggaaagttt 1020

aaagttgtga aggaaatagc agaaacacaa catggaacaa tagttatcag agtacaatat 1080

gaaggggacg gttctccgtg caagatccct tttgaaataa tggatttgga aaaaagacat 1140

gtcttaggtc gcttgatcac agtcaaccca attgttaeag aaaaagacag cccagtcaac 1200

atagaagcag aacctccatt cggagacagt tacatcatta taggagtaga accgggacaa 1260

ctgaagctca gctggtttaa gaaaggaagc tctattggcc aacaccatca ccatcaccat 1320

taa 1323

<210>10

<211>440

<212>PRT

<213>人工序列

<400>10

Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Pro Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val

1 5 10 15

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly

20 25 30

Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly

35 40 45

Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Val Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp

50 55 60

Lys Glu Lys Pro Val Ser Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser

65 70 75 80

Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe

85 90 95

Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu

115 120 125

Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys

130 135 140

Gly Lys Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln

145 150 155 160

Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr

165 170 175

Lvs Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu

180 185 190

Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp

195 200 205

Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser

210 215 220

Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val

245 250 255

Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile

260 265 270

Ile Ser Ser Thr Pro Phe Ala Glu Tyr Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile

275 280 285

Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly

290 295 300

Asp Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly

305 310 315 320

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys

325 330 335

Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly

340 345 350

Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys

355 360 365

Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg

370 375 380

Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn

385 390 395 400

Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val

405 410 415

Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile

420 425 430

Gly Gln His His His His His His

435 440

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ggaattccat atgtcatatg taatgtgcac 30

<210>12

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cattgcatag ctcataccgc caccgccgct accgccaccg cctttcccta tactgct 57

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

atgtcatatt ctatg 15

<210>14

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ccgctcgagt taatggtgat ggtgatggtg ttggccaata gagct 45

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ggaattccat atgtgcttga atacctttgt gt 32

<210>16

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

ccgctcgagt taatggtgat ggtgatggtg cttcccaatc gagcttccc 49

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ggaattccat atgtgctcag gaaagttctc aa 32

<210>18

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ccgctcgagt taatggtgat ggtgatggtg cttgccaatg gaactccct 49

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ggaattccat atgtcatatg taatgtgcac 30

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

cattgcatag ctcataccgc caccgccgct accgccaccg cctttc 46

<210>21

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

atgtcatatt ctatg 15

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ccgctcgagt taatggtgat ggtgatggtg ttggccaata gagct 45

<210>23

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

atgagctatg caatg 15

<210>24

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

catcgtgtat gacataccgc caccgccgct accgccaccg cccttcccaa tcgagct 57

<210>25

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

atgtcataca cgatg 15

<210>26

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

catagaatat gacataccgc caccgccgct accgccaccg cccttgccaa tggaact 57

Claims

1.一种重组融合蛋白rEIII，其包括登革病毒1、2、3和4型的EIII结构域，该结构域由柔性接头连接，该蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.10所示。

2.权利要求1所述重组融合蛋白rEIII在制备登革病毒感染诊断试剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂为登革病毒感染早期诊断试剂。

4.编码权利要求1所述重组融合蛋白rEIII的核苷酸。

5.含有权利要求1所述重组融合蛋白rEIII的免疫诊断试剂。

6.登革病毒感染诊断试剂盒，其为以IgM-μ链抗体作为捕获抗体，以权利要求1所述重组融合蛋白rEIII为标记抗原的Mac-ELISA检测试剂盒。

7.如权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述标记抗原为HRP标记抗原。

8.权利要求1所述重组融合蛋白rEIII的重组表达方法，包括构建表达rEIII的重组表达载体，将所述载体导入宿主，培养宿主表达rEIII重组蛋白。