CN114409742B - 非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位及其应用，属于基因工程领域，以非洲猪瘟病毒p49(pB438L)蛋白衣壳蛋白的氨基酸序列为材料，通过抗原表位数据库，预测其抗原表位并根据其氨基酸序列合成相应短肽。利用非洲猪瘟病毒感染猪阳性血清筛选能与病毒阳性血清发生特异性反应的合成肽，通过将抗原表位与GST融合表达重组蛋白、噬菌体展示多表位抗原(病毒样颗粒展示表位，VLP)，确定优势抗原表位。通过预测、免疫学筛选和鉴定，首次确定非洲猪瘟病毒p49蛋白有13个抗原表位。这些抗原表位的获得为以抗原表位为材料研发非洲猪瘟检测试剂及其试剂盒、单抗制备和安全、可鉴别诊断表位疫苗等急需战略防控产品奠定了基础。不仅将产生巨大的经济效益，而且具有重要的社会效益。

Description

非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位及其应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪发病的一种急性烈性传染病，死亡率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报动物疫病，我国列为重点防范的一类动物传染病。自2018年8月传入我国以来，不到一年的时间，疫情遍及全国，至今疫情还未消除，给我国养猪业造成重大的经济损失。疫情对环境造成了极为严重的污染，截止2021年初，已从田间分离到22个毒株，其中包括大片段基因缺失的弱毒株，这说明环境污染严重、毒株复杂，防控困难。我国作为全球最大的养猪大国，猪肉供应超过50%，非洲猪瘟对养猪的打击，不仅威胁养猪业的健康可持续发展，而且关乎民生、食品安全和生物安全等一系列社会和政治问题，已成为国家急需解决的重大动物疫病之一。
非洲猪瘟病毒作为一个有百年历史的重要动物病毒，基因组庞大、结构复杂，保护抗原，免疫和感染机理不清楚，以致无法解释非洲猪瘟灭活疫苗不能提供免疫保护；减毒活疫苗的生物安全；基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和活载体疫苗保护效果差的等制约疫苗研发的理论问题，导致至今无安全有效的疫苗。而国家急需安全、有效、可鉴别诊断的疫苗用于非洲猪瘟疫情防控和净化，保障养猪业的健康可持续发展，保障生物安全。
基于此，针对非洲猪瘟病毒及其复杂，疫苗研究缓慢，缺乏安全、有效、可鉴别诊断的疫苗，而国家急需防控产品的现状。须采用全新思路、另辟蹊径开展非洲猪瘟病毒保护抗原筛选和鉴定，即保护抗原表位筛选与鉴定，以解决非洲猪瘟病毒基因组庞大复杂、保护抗原不清导致基因工程疫苗研究缺乏关键材料的困境。
发明内容
针对上述问题，本发明以非洲猪瘟病毒p49(pB438L)蛋白衣壳蛋白的氨基酸序列为材料，预测并确定了非洲猪瘟病毒p49蛋白的13个抗原表位（肽），这些抗原表位的获得为以抗原表位为材料研发非洲猪瘟检测试剂及其试剂盒、单抗制备和安全、可鉴别诊断表位疫苗等急需战略防控产品奠定了基础。
本发明的目的一是提供非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位，所述抗原表位为单抗原表位或多抗原表位；所述单抗原表位为氨基酸序列如SEQ ID NO：1~13任意一种所示的抗原表位肽；所述多抗原表位是由氨基酸序列如SEQ ID NO：1~15中任意两个或两个以上的抗原表位肽串联形成。
所述单抗原表位优选SEQ ID NO：2所示的p49b、SEQ ID NO：5所示的p49f或SEQ IDNO：7所示的p49h。所述多抗原表位优选p49abc、p49ghi或p49de，所述p49abc是将SEQ IDNO：1所示的p49a、SEQ ID NO：2所示的p49b和SEQ ID NO：3所示的p49c通过linker（GS）依次串联形成；所述p49ghi是将SEQ ID NO：8所示的p49i、SEQ ID NO：6所示的p49g和SEQ IDNO：7所示的p49h通过linker（GS）依次串联形成；所述p49de是将SEQ ID NO：14所示的p49d和SEQ ID NO：4所示的p49e通过linker（GS）依次串联形成。
本发明的目的二是提供一种多表位VLP重组抗原，是将上述的多抗原表位通过GGGGS依次与SpyCatcher、噬菌体AP205顺序连接形成。
所述多表位VLP重组抗原优选为p49ABC、p49GHI或p49DE；所述p49ABC的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述p49GHI的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述p49DE的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
本发明的目的三是提供一种多表位VLP融合基因，编码上述的多表位VLP重组抗原。
本发明的目的四是提供一种重组蛋白，所述重组蛋白是将上述抗原表位与表达载体连接后经表达、纯化获得。
本发明的目的五是提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述的抗原表位或融合蛋白。
本发明的目的六是提供一种表达载体，所述表达载体含有上述的多核苷酸。
本发明的目的七是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体或在基因组中整合有上述的多核苷酸。
本发明的目的八是提供上述的抗原表位、融合蛋白、多表位VLP、多核苷酸、表达载体或宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒检测药物、抗非洲猪瘟疫苗中的应用。
有益效果：
本发明首次以非洲猪瘟病毒p49(pB438L)蛋白衣壳蛋白的氨基酸序列为材料，利用生物信息学和免疫信息学方法预测抗原表位，筛选到具有免疫活性的抗原表位13个，其中6个为优势抗原表位，以p49b（41aa~56aa）的免疫原性最强、其次为p49f（195aa~210aa）和p49h（252aa~267aa）（表2）。这些抗原表位的获得丰富了非洲猪瘟病毒抗原表位数据库，为以抗原表位为材料研发非洲猪瘟检测试剂及其试剂盒、单抗制备和安全、可鉴别诊断表位疫苗等急需战略防控产品奠定了基础。
附图说明
图1是非洲猪瘟病毒阳性血清筛选P49蛋白抗原表位（合成肽）结果图；
图2是抗原表位完全抗原化和多表位串联后免疫反应性评价图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
抗原表位预测与筛选。
以非洲猪瘟病毒的p49蛋白的氨基酸序列为材料，利用IEDB Analysis Resource、ABCpred和Scratch Protein Predictor在线数据库预测其抗原表位，以上述4个数据库中全部得分值不低于0.6的标准，确定了15个抗原表位为p49蛋白的抗原表位（表1）。
表1 利用生物信息学和免疫信息学技术预测的p49（P49）蛋白的抗原表位。
命名 位置（氨基酸） 序列 序列表中的位置序号
p49a 19~34 LWESDLPRHNRYSDNI SEQ ID NO：1
p49b 41~56 GNKNGAAPVYNEYTNS SEQ ID NO：2
p49c 80~95 HKNIGYGDAQDLEPYS SEQ ID NO：3
p49d 148~163 TQPSSLPSLKNPKNSS SEQ ID NO：14
p49e 167~182 TRFSEHTKFFSYEDLP SEQ ID NO：4
p49f 195~210 HLGDQMPGQHYNGYIP SEQ ID NO：5
p49g 231~246 GIAGRGIPLGNPHVKP SEQ ID NO：6
p49h 252~267 LIKSTSTYTDVPMLG SEQ ID NO：7
p49I 273~288 SQHGREYQEFSANRH SEQ ID NO：8
p49K 312~327 IPVLNAQLTSIKPVSP SEQ ID NO：9
p49M 331~339 KAYQTHYME SEQ ID NO：10
p49N 355~370 SSPIPNYSKRNSGQAE SEQ ID NO：15
p49O 376~391 KQTISRHNNYIPKYTG SEQ ID NO：11
p49P 397~412 KLDSTFPKDFNASSVP SEQ ID NO：12
p49T 415~426 SAEKDHSLRGDN SEQ ID NO：13
抗原表位（肽）的合成。
根据表1中相应抗原表位氨基酸序列委托“金斯瑞生物科技公司”合成与之相对应的肽，纯度不低于95%。
、间接ELISA方法的建立。
随机选取3个合成肽，按1μg/ml浓度，100μl/孔，包被ELISA96孔板，4℃过夜；甩干板子，用含有5% BSA的PBST于37℃封闭2小时，200μl/孔；甩干板子，用PBST（pH7.4）充分洗涤4-5次；按列（1-12）倍比稀释SPF猪阴性血清/ASFV标准阳性血清，起始浓度为1:25，8孔重复（1A-1H），100μl/孔，37℃反应1小时；弃掉液体，用PBST（pH7.4）充分洗涤4-5次；然后按行（A-H）倍比稀释HRP标记的兔抗IgG，起始浓度为1:2500，12孔重复（A1-A12），37℃反应1小时；用PBST充分洗涤4-5次，加入显色底物作用10-15分钟，测定OD450nm吸光度值。确定最佳阴性血清和阳性血清使用浓度。根据实验结果，最终将血清按1:50稀释，酶标抗体1:20000稀释作为间接ELISA鉴定抗原表位（合成肽）和检测血清样品最佳浓度。
结果判定标准：样品OD450nm值(S)/阴性对照(N)的比值，大于或等于2.1为阳性，小于2.1为阴性。
非洲猪瘟病毒血清筛选、鉴定抗原表位。
本实验利用建立的ELISA方法，利用非洲猪瘟阳性血清筛选和鉴定出了具有免疫功能的p49蛋白的抗原表位。结果发现，预测的15个抗原表位（肽）除了148aa~163aa（p49d）和355aa~370aa（p49N）为阴性外，其余13个均能与阳性血清发生免疫反应（图1），其中6个抗原表位为优势抗原表位（OD450nm值>2.5），以p49b（41aa~56aa）的免疫原性最强、其次为p49f（195aa~210aa）和p49h（252aa~267aa）（表2）。
表2 ASFV感染猪康复血清筛选、鉴定抗原表位结果。
命名 S/N值 位置（氨基酸） 序列（5＇-3＇）
p49b 3.05 41~56 GNKNGAAPVYNEYTNS
p49f 2.68 195~210 HLGDQMPGQHYNGYIP
p49h 2.67 252~267 LIKSTSTYTDVPMLG
p49K 2.57 312~327 IPVLNAQLTSIKPVSP
p49c 2.52 80~95 HKNIGYGDAQDLEPYS
p49P 2.51 397~412 KLDSTFPKDFNASSVP
p49I 2.5 273~288 SQHGREYQEFSANRH
p49 2.46 19~34 LWESDLPRHNRYSDNI
p49g 2.4 231~246 GIAGRGIPLGNPHVKP
p49M 2.37 331~339 KAYQTHYME
p49T 2.24 415~426 SAEKDHSLRGDN
p49e 2.22 167~182 TRFSEHTKFFSYEDLP
p49O 2.15 376~391 KQTISRHNNYIPKYTG
p49d 2.09 148~163 TQPSSLPSLKNPKNSS
p49N 1.94 355~370 SSPIPNYSKRNSGQAE
抗原表位完全抗原化和噬菌体展示多表位抗原免疫反应性评价。
单抗原表位和噬菌体展示多表位抗原重组表达质粒的构建、蛋白表达及纯化。
为了进一步确定抗原表位的免疫反应性，提高抗原表位的分子量使其完全抗原化，将上述筛选到的抗原表位p49a、p49b和p49c的DNA分别克隆到pGEX-4T-1表达载体构建重组表达质粒，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达、纯化重组蛋白，依次命名为GST-p49a、GST-p49b和GST-p49c。将上述3个抗原表位进行依次顺序串联，然后将其与噬菌体基因分别克隆到pET-28a（+）表达载体，构建噬菌体展示串联抗原表位的重组表达质粒pET-28/p49abc，通过大肠杆菌BL21（DE3）表达噬菌体展示多表位抗原的病毒样颗粒（VLP），命名为p49ABC。采用同样的方法分别构建了p49g、p49h和p49I串联、p49d和p49e串联的噬菌体展示抗原表位重组表达质粒pET-28/p49ghi和pET-28/p49de，表达纯化了重组蛋白分别命名为p49GHI和p49DE。
将p49a、p49b和p49c依次串联形成p49abc，基因序列如SEQ ID NO：16所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示；表达的噬菌体展示多表位抗原（VLP）的p49ABC基因序列如SEQID NO：18所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
将p49i、p49g和p49h依次串联形成p49ghi，基因序列如SEQ ID NO：20所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；表达的噬菌体展示多表位抗原（VLP）的p49GHI基因序列如SEQID NO：22所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
将p49d和p49e依次串联形成p49de，基因序列如SEQ ID NO：24所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；表达的噬菌体展示多表位抗原（VLP）的p49DE基因序列如SEQ ID NO：26所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
SDS-PAGE结果显示，所有上述重组蛋白均以可溶性形式表达，用于包被抗原的重组蛋白均采用亲和层析法获得。
重组蛋白的免疫反应性评价。
用建立的ELISA测定上述抗原表位(合成肽)、单抗原表位重组蛋白GST- p49a、GST- p49b和GST-p49c、噬菌体展示多表位串联重组蛋白（VLP）免疫反应性。结果显示，抗原表位完全抗原化后免疫反应性增强（p<0.05），多表位VLP的免疫反应性显著增强，显著优于合成肽和单抗原表位完全抗原化（图2）。结果充分说明载体蛋白能加强但抗原表位的免疫活性，噬菌体展示多表位抗原（VLP）免疫反应性明显优于单个抗原表位，提示抗原表位间发生了协同效益。值得一提的是，p49a、p49b和p49c三个抗原表位串联表达的VLP重组蛋白（p49ABC）与p49d和p49e两个抗原表位串联表达的VLP重组蛋白（p49DE）的免疫反应性没有显著性差异，而显著高于p49g、p49h和p49I三个抗原表位串联表达的重组蛋白（p49GHI），提示多表位重组抗原的免疫活性与抗原表位数量多少不成正相关，与串联方式、表位顺序、表位暴露程度和表位自身特性等有关，需要对抗原表位组合、串联方式进行优化，才能设计出强免疫活性的以VLP形式表达的多表位重组抗原，为研究特异性检测试剂、研发多表位疫苗提供了理论依据和技术支撑。
抗原表位的用途。
针对p49蛋白首次获得的具有免疫活性的上述抗原表位（合成肽）、单抗原表位重组蛋白、多表位串联重组蛋白是利用全新技术手段，结合传统方法成功发掘非洲猪瘟病毒重要免疫功能抗原表位、设计新型免疫功能抗原的重要成果之一，获得抗原表位、设计的重组抗原不仅可用于非洲猪瘟病毒感染血清学的检测试剂及其试剂盒（ELISA，WB、胶体金层析试纸条等）的研制，而且有助于非洲猪瘟表位疫苗及其与该表位相关任何疫苗的研制（表位单价/多价疫苗，合成肽疫苗，与其他病原抗原表位或抗原串联等），也为制备非洲猪瘟抗原表位特异性单抗奠定了物质基础；此外，该研究成果也可以用于病毒免疫机理研究，探索和解析病毒感染与疫苗免疫机理。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位及其应用
<130> 1
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Leu Trp Glu Ser Asp Leu Pro Arg His Asn Arg Tyr Ser Asp Asn Ile
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Asn Lys Asn Gly Ala Ala Pro Val Tyr Asn Glu Tyr Thr Asn Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
His Lys Asn Ile Gly Tyr Gly Asp Ala Gln Asp Leu Glu Pro Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Thr Arg Phe Ser Glu His Thr Lys Phe Phe Ser Tyr Glu Asp Leu Pro
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
His Leu Gly Asp Gln Met Pro Gly Gln His Tyr Asn Gly Tyr Ile Pro
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Gly Ile Ala Gly Arg Gly Ile Pro Leu Gly Asn Pro His Val Lys Pro
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Leu Ile Lys Ser Thr Ser Thr Tyr Thr Asp Val Pro Met Leu Gly
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Ser Gln His Gly Arg Glu Tyr Gln Glu Phe Ser Ala Asn Arg His
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Ile Pro Val Leu Asn Ala Gln Leu Thr Ser Ile Lys Pro Val Ser Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Lys Ala Tyr Gln Thr His Tyr Met Glu
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Lys Gln Thr Ile Ser Arg His Asn Asn Tyr Ile Pro Lys Tyr Thr Gly
1 5 10 15
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Lys Leu Asp Ser Thr Phe Pro Lys Asp Phe Asn Ala Ser Ser Val Pro
1 5 10 15
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Ser Ala Glu Lys Asp His Ser Leu Arg Gly Asp Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Thr Gln Pro Ser Ser Leu Pro Ser Leu Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Ser Ser Pro Ile Pro Asn Tyr Ser Lys Arg Asn Ser Gly Gln Ala Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
ctttgggaaa gcgatttgcc gcgtcataac cggtattctg ataatatagg tggttcaggc 60
aacaaaaatg gagctgcgcc tgtatacaat gaatacacta atagtggttc ccacaaaaac 120
attggttacg gcgatgcgca agatctggag ccgtacagc 159
<210> 17
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
Leu Trp Glu Ser Asp Leu Pro Arg His Asn Arg Tyr Ser Asp Asn Ile
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Asn Lys Asn Gly Ala Ala Pro Val Tyr Asn Glu Tyr
20 25 30
Thr Asn Ser Gly Ser His Lys Asn Ile Gly Tyr Gly Asp Ala Gln Asp
35 40 45
Leu Glu Pro Tyr Ser
50
<210> 18
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
atgggcagca gcctttggga aagcgatttg ccgcgtcata accggtattc tgataatata 60
ggtggttcag gcaacaaaaa tggagctgcg cctgtataca atgaatacac taatagtggt 120
tcccacaaaa acattggtta cggcgatgcg caagatctgg agccgtacag cggtggtggc 180
ggctccgcta tggtagatac actatcagga ttaagttcgg aacaaggtca gagcggcgac 240
atgaccattg aagaggatag cgctactcac atcaaattca gtaagcgcga tgaagatggt 300
aaggaactgg cgggtgcaac aatggagctg cgtgatagca gcggcaagac catctctacg 360
tggatttctg acggccaagt taaagatttc tatctgtatc cgggtaaata cacctttgtt 420
gaaaccgcgg cgccagatgg ttatgaagtt gcaactgcga tcaccttcac cgttaatgag 480
cagggtcaag tgacggttaa tggcaaggct accaaaggtg acgcgcatat cggtggtggc 540
ggctctatgg cgaacaaacc gatgcagccg attaccagca cggcgaataa gatcgtgtgg 600
tcagacccaa cgcgtctgtc caccaccttc tctgctagct tactgcgtca gcgtgttaag 660
gtgggtattg ccgagttgaa taacgtgtcc ggccaatatg ttagcgtgta taaacgtccg 720
gcaccgaaac cggaagggtg cgcagatgca tgtgttatta tgccgaacga gaaccagagc 780
attcgcaccg tcatcagcgg cagcgcggag aacctggcga ccctcaaagc tgagtgggaa 840
acccacaaac gcaacgtgga taccctgttt gcgagcggca atgcagggct gggttttctg 900
gacccgaccg ctgccatcgt gtctagcgac accacagcgg gttcactcga g 951
<210> 19
<211> 317
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 19
Met Gly Ser Ser Leu Trp Glu Ser Asp Leu Pro Arg His Asn Arg Tyr
1 5 10 15
Ser Asp Asn Ile Gly Gly Ser Gly Asn Lys Asn Gly Ala Ala Pro Val
20 25 30
Tyr Asn Glu Tyr Thr Asn Ser Gly Ser His Lys Asn Ile Gly Tyr Gly
35 40 45
Asp Ala Gln Asp Leu Glu Pro Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met
50 55 60
Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg
85 90 95
Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp
100 105 110
Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys
115 120 125
Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala
130 135 140
Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu
145 150 155 160
Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His
165 170 175
Ile Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr
180 185 190
Ser Thr Ala Asn Lys Ile Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr
195 200 205
Thr Phe Ser Ala Ser Leu Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala
210 215 220
Glu Leu Asn Asn Val Ser Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro
225 230 235 240
Ala Pro Lys Pro Glu Gly Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn
245 250 255
Glu Asn Gln Ser Ile Arg Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu
260 265 270
Ala Thr Leu Lys Ala Glu Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr
275 280 285
Leu Phe Ala Ser Gly Asn Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala
290 295 300
Ala Ile Val Ser Ser Asp Thr Thr Ala Gly Ser Leu Glu
305 310 315
<210> 20
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
tcgcaacacg gcagagaata ccaggaattt tccgcaaata gacatggttc cgggattgca 60
ggtagaggta ttcctttagg aaatccacat gtcaaaccgg gttccctcat aaaatccacc 120
agtacctaca cggacgtgcc gatgcttggt ccc 153
<210> 21
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 21
Ser Gln His Gly Arg Glu Tyr Gln Glu Phe Ser Ala Asn Arg His Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ile Ala Gly Arg Gly Ile Pro Leu Gly Asn Pro His Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ser Leu Ile Lys Ser Thr Ser Thr Tyr Thr Asp Val Pro Met
35 40 45
Leu Gly Pro
50
<210> 22
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
atgggcagca gctcgcaaca cggcagagaa taccaggaat tttccgcaaa tagacatggt 60
tccgggattg caggtagagg tattccttta ggaaatccac atgtcaaacc gggttccctc 120
ataaaatcca ccagtaccta cacggacgtg ccgatgcttg gtcccggtgg tggcggctcc 180
gctatggtag atacactatc aggattaagt tcggaacaag gtcagagcgg cgacatgacc 240
attgaagagg atagcgctac tcacatcaaa ttcagtaagc gcgatgaaga tggtaaggaa 300
ctggcgggtg caacaatgga gctgcgtgat agcagcggca agaccatctc tacgtggatt 360
tctgacggcc aagttaaaga tttctatctg tatccgggta aatacacctt tgttgaaacc 420
gcggcgccag atggttatga agttgcaact gcgatcacct tcaccgttaa tgagcagggt 480
caagtgacgg ttaatggcaa ggctaccaaa ggtgacgcgc atatcggtgg tggcggctct 540
atggcgaaca aaccgatgca gccgattacc agcacggcga ataagatcgt gtggtcagac 600
ccaacgcgtc tgtccaccac cttctctgct agcttactgc gtcagcgtgt taaggtgggt 660
attgccgagt tgaataacgt gtccggccaa tatgttagcg tgtataaacg tccggcaccg 720
aaaccggaag ggtgcgcaga tgcatgtgtt attatgccga acgagaacca gagcattcgc 780
accgtcatca gcggcagcgc ggagaacctg gcgaccctca aagctgagtg ggaaacccac 840
aaacgcaacg tggataccct gtttgcgagc ggcaatgcag ggctgggttt tctggacccg 900
accgctgcca tcgtgtctag cgacaccaca gcgggctccc tcgag 945
<210> 23
<211> 315
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 23
Met Gly Ser Ser Ser Gln His Gly Arg Glu Tyr Gln Glu Phe Ser Ala
1 5 10 15
Asn Arg His Gly Ser Gly Ile Ala Gly Arg Gly Ile Pro Leu Gly Asn
20 25 30
Pro His Val Lys Pro Gly Ser Leu Ile Lys Ser Thr Ser Thr Tyr Thr
35 40 45
Asp Val Pro Met Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Asp
50 55 60
Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr
65 70 75 80
Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu
85 90 95
Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe
115 120 125
Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp
130 135 140
Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly
145 150 155 160
Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr
180 185 190
Ala Asn Lys Ile Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe
195 200 205
Ser Ala Ser Leu Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu
210 215 220
Asn Asn Val Ser Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro
225 230 235 240
Lys Pro Glu Gly Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn
245 250 255
Gln Ser Ile Arg Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr
260 265 270
Leu Lys Ala Glu Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe
275 280 285
Ala Ser Gly Asn Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile
290 295 300
Val Ser Ser Asp Thr Thr Ala Gly Ser Leu Glu
305 310 315
<210> 24
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
acccagcctt cctcattgcc ttccttaaaa aacccaaaaa atagttcggg tggttcaacg 60
aggttcagcg agcacacaaa atttttttcg tacgaggatc ttcct 105
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 25
Thr Gln Pro Ser Ser Leu Pro Ser Leu Lys Asn Pro Lys Asn Ser Ser
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Arg Phe Ser Glu His Thr Lys Phe Phe Ser Tyr Glu
20 25 30
Asp Leu Pro
35
<210> 26
<211> 897
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
atgggcagca gcacccagcc ttcctcattg ccttccttaa aaaacccaaa aaatagttcg 60
ggtggttcaa cgaggttcag cgagcacaca aaattttttt cgtacgagga tcttcctggt 120
ggtggcggct ccgctatggt agatacacta tcaggattaa gttcggaaca aggtcagagc 180
ggcgacatga ccattgaaga ggatagcgct actcacatca aattcagtaa gcgcgatgaa 240
gatggtaagg aactggcggg tgcaacaatg gagctgcgtg atagcagcgg caagaccatc 300
tctacgtgga tttctgacgg ccaagttaaa gatttctatc tgtatccggg taaatacacc 360
tttgttgaaa ccgcggcgcc agatggttat gaagttgcaa ctgcgatcac cttcaccgtt 420
aatgagcagg gtcaagtgac ggttaatggc aaggctacca aaggtgacgc gcatatcggt 480
ggtggcggct ctatggcgaa caaaccgatg cagccgatta ccagcacggc gaataagatc 540
gtgtggtcag acccaacgcg tctgtccacc accttctctg ctagcttact gcgtcagcgt 600
gttaaggtgg gtattgccga gttgaataac gtgtccggcc aatatgttag cgtgtataaa 660
cgtccggcac cgaaaccgga agggtgcgca gatgcatgtg ttattatgcc gaacgagaac 720
cagagcattc gcaccgtcat cagcggcagc gcggagaacc tggcgaccct caaagctgag 780
tgggaaaccc acaaacgcaa cgtggatacc ctgtttgcga gcggcaatgc agggctgggt 840
tttctggacc cgaccgctgc catcgtgtct agcgacacca cagcgggttc actcgag 897
<210> 27
<211> 299
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 27
Met Gly Ser Ser Thr Gln Pro Ser Ser Leu Pro Ser Leu Lys Asn Pro
1 5 10 15
Lys Asn Ser Ser Gly Gly Ser Thr Arg Phe Ser Glu His Thr Lys Phe
20 25 30
Phe Ser Tyr Glu Asp Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ala Met Val Asp
35 40 45
Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met Thr
50 55 60
Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe
100 105 110
Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp
115 120 125
Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly
130 135 140
Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr
165 170 175
Ala Asn Lys Ile Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe
180 185 190
Ser Ala Ser Leu Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu
195 200 205
Asn Asn Val Ser Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro
210 215 220
Lys Pro Glu Gly Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn
225 230 235 240
Gln Ser Ile Arg Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr
245 250 255
Leu Lys Ala Glu Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe
260 265 270
Ala Ser Gly Asn Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile
275 280 285
Val Ser Ser Asp Thr Thr Ala Gly Ser Leu Glu
290 295

Claims (10)

1.非洲猪瘟病毒p49蛋白抗原表位肽，其特征在于：所述抗原表位肽为单抗原表位肽或多抗原表位肽；所述单抗原表位肽为氨基酸序列如SEQ ID NO：1~13任意一种所示的抗原表位肽；所述多抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：25所示。
2.根据权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于：所述单抗原表位肽为SEQ ID NO：2所示的p49b、SEQ ID NO：5所示的p49f或SEQ ID NO：7所示的p49h；所述多抗原表位肽为氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示的p49abc或SEQ ID NO：25所示的p49de。
3.一种多表位VLP重组抗原，是将权利要求2中所述的多抗原表位肽通过GGGGS依次与SpyCatcher、噬菌体AP205顺序连接形成。
4.根据权利要求3所述的多表位VLP重组抗原，其特征在于：所述多表位VLP重组抗原为p49ABC、p49GHI或p49DE；所述p49ABC的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，所述p49GHI的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，所述p49DE的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
5.一种多表位VLP融合基因，编码如权利要求4所述的多表位VLP重组抗原。
6.一种重组蛋白，所述重组蛋白是将编码如权利要求1所述的抗原表位肽的基因与表达载体连接后经表达、纯化获得。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种表达载体，所述表达载体含有如权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求8所述的表达载体或在基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.根据权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求3所述的多表位VLP重组抗原在制备非洲猪瘟病毒检测药物中的应用。
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