CN112724205B - C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用 - Google Patents

C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属分子生物学和病毒学技术领域，提供C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用。239蛋白包涵体用4M尿素稀释至1mg/ml，透析至含有(NH4)2SO4、Na2SO4或NH4Cl盐离子、pH4.5‑7.5的50mM PB组装缓冲液中；透析温度为4‑37℃；搅拌30min‑12h。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，用于预防或治疗HEV‑C感染及由HEV‑C感染所导致的疾病如戊型肝炎等。可应用于大规模生产HEV‑C疫苗的病毒样颗粒。该病毒样颗粒具有良好免疫原性和免疫反应性，由重组HEV‑C E2s 239‑aa结构蛋白在体外制备而成，且制备方法简便高效。

Description

C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学和病毒学技术领域，具体涉及C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用。该蛋白质能够在体外组装成C种戊型肝炎（HEV-C）病毒样颗粒，具体涉及能够在体外组装成HEV-C病毒样颗粒的蛋白质，其编码序列和制备方法，以及包含该蛋白质的病毒样颗粒的组装方法；所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防或治疗HEV-C感染及由HEV-C感染所导致的疾病。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV-C感染及由HEV-C感染所导致的疾病如戊型肝炎等。此外，本发明还提供了制备HEV-C病毒样颗粒的方法。
背景技术
戊型病毒性肝炎（简称戊肝）由戊肝病毒（HEV）引起，以肝脏炎症和坏死性病变为主的急性病毒性肝炎。HEV主要流行于大多数热带和一些发展中国家，受HEV感染威胁的人口约占世界人口的2/3，每年约有2000万人新发感染HEV，每年约7万人死于HEV相关症状，戊肝已成为一个重要的公共卫生问题。近十年我国约有25万戊肝病例，且呈逐年增高的趋势。世界卫生组织（WHO）宣布将于2030年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁的总体目标。戊肝是一种自限性疾病，一般情况下预后良好，但在老年人、免疫低下人群、慢性肝病病人及孕妇中可能产生严重的后果。目前尚无有效的药物能改变急性戊肝的病程，通常是对症治疗，接种疫苗是预防控制戊肝的最有效的办法。
HEV病毒颗粒为正二十面体，直径约27-35nm，无囊膜。HEV基因组由单股正链RNA组成，全长约7.2kb。5’末端含有甲基鸟嘌呤帽子结构，3’末端带有poly A尾部。国际病毒分类委员将戊肝病毒科分为2个属：正戊肝病毒属和鱼戊肝属。鱼戊肝属只包含一个A种，主要感染鲑鱼。正戊肝病毒属包含了A、B、C、D，4个种。其中C种病毒（HEV-C）划分为感染啮齿动物的HEV-C1(大鼠HEV)，感染雪貂和貂的HEV-C2，以及最近在中国的高山姬鼠和黑腹绒鼠中检测到的HEV-C3和HEV-C4。在欧洲和美国的黑鼠(家鼠)和挪威鼠(褐家鼠)，以及亚洲国家的黄胸家鼠、黄毛家鼠中均发现了属于HEV-C的病毒株。对挪威大鼠和黑鼠进行HEV-C的IgG和IgM检测，结果显示血清阳性率在24%至37%之间，表明HEV-C在与人类活动密切相关动物大鼠中广泛传播。有研究报道德国健康的林业工作者体内存在HEV‐C抗体，有些急性肝炎患者的血清中也存在抗HEV‐C的IgG和IgM，推测HEV‐C可感染人类。
近期发现一例肝移植病例因感染HEV-C而导致戊型肝炎，在该病人体内检测到了HEV-C的RNA和HEV-C抗体，证实HEV-C可感染人类并引起临床疾病。虽然该肝移植病人体内已有HEV-A抗体，但仍能被HEV-C感染，表明针对HEV-A的抗体并不能有效保护机体免受HEV-C感染。一系列的研究结果表明有必要重新评价HEV-C作为一种人畜共患肝炎病毒的潜在威胁。目前有关HEV病毒样颗粒的专利中所记载的蛋白质为HEV 1-4型病毒结构蛋白，根据ICTV分类，HEV基因型1、2、3、4都属于HEV-A，因此现有关于HEV病毒样颗粒及疫苗的研究仍然是针对HEV-A进行的优化设计，并没有特定针对HEV-C病毒样颗粒及疫苗的设计。
HEV包括ORF1、ORF2、ORF3，3个非连续及部分重叠的开放阅读框。其中ORF2编码的病毒衣壳蛋白通过二聚化形成病毒衣壳，其外表面是病毒优势中和表位聚集区，也是识别宿主的关键部位。因此，ORF2编码的衣壳蛋白成为研发戊肝疫苗的理想选择。为了寻找ORF2蛋白免疫原性位点从而优化疫苗设计，前期研究主要集中在以下几个方面：（1）利用HEV感染患者的血清对ORF2蛋白进行多肽扫描发现394-470aa和546-580aa区段存在2个免疫显性区。（2）黑猩猩来源的HEV中和抗体可以识别位于ORF2上587-607aa的线性表位；（3）用ORF2系列（221-600aa）来源的30aa或者100aa不同肽段免疫小鼠后产生的血清不能中和HEV感染，提示大部分HEV中和抗体可能识别特定的构象表位；（4）大肠杆菌表达的ORF2的重组蛋白1（394-660）的免疫原性优于全长蛋白，并表明394-578是诱导产生中和抗体的主要区域；（5）在大肠杆菌中表达的ORF2394-660段（E2）能形成二聚体，该二聚体能与HEV感染病人血清反应且该反应依赖于二聚化形成的构象型表位；（6）HEV E2免疫可以使食蟹猕猴产生高滴度的抗体，从而建立对HEV的免疫保护。根据获得的E2蛋白二聚化结构域（ORF2 aa 455-602 E2s）的晶体结构和一系列中和抗体对不同突变体蛋白的结合差异推断E2s的二聚化是病毒与受体结合的先决条件，二聚化形成的沟槽结构区可能是主要的中和表位。进一步的研究发现aa368-606可以形成病毒样颗粒。
与E2蛋白相比，P239在N末端多出的26个氨基酸使得二聚体蛋白形成直径为23nm的颗粒结构，显著增强了该抗原的免疫活性，该区段序列在大多数HEV分离株中有很高的保守性，使其很适合用于疫苗研究。
发明内容
本发明为了解决目前存在的问题，提供了C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用。该蛋白质能够在体外组装成HEV-C病毒样颗粒，具体涉及该能够在体外组装成HEV-C病毒样颗粒的蛋白质，其编码序列和制备方法，以及包含该蛋白质的病毒样颗粒；所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防或治疗HEV-C感染及由HEV-C感染所导致的疾病。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV-C感染及由HEV-C感染所导致的疾病如戊型肝炎等。此外，本发明还提供了制备HEV-C病毒样颗粒的方法。
本发明由如下技术方案实现的：C种戊型肝炎病毒239蛋白即HEV-C 239蛋白制备病毒样颗粒的方法，具体步骤为：239蛋白包涵体用4M尿素稀释至1mg/ml，将其透析至含有0.3-0.8M的(NH4)2SO4、Na2SO4或NH4Cl盐离子、pH 4.5-7.5的50mM PB组装缓冲液中；透析温度为4-37℃；搅拌30min-12h。
优选：所述PB组装缓冲液中：盐离子为0.5M的Na2SO4溶液；pH值为7.5；透析温度为37℃；透析处理30min。
所述239蛋白的编码基因为HEV-CH 239，该基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了利用上述方法制备的病毒样颗粒。
本发明还提供了所述病毒样颗粒在制备预防或治疗HEV-C感染所致疾病的药物中的应用。
所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV-C感染、由HEV-C感染所致疾病。
所述HEV-C感染所致疾病为戊型肝炎。
现有关于HEV病毒样颗粒及疫苗的研究仍然是针对HEV-A进行的优化设计，并没有特定针对HEV-C病毒样颗粒及疫苗的设计。最新研究表明HEV-C可感染人类并引起临床疾病，因此有必要对HEV-C疫苗进行研究以应对新发HEV-C的爆发，本发明提供了一种HEV-C蛋白体外组装成的病毒样颗粒。
在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量高等优点。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白往往失去正确的天然构象，以包涵体形式存在。以包涵体形式存在的蛋白质复性是一个世界性难题。在很多情况下，难以在体外有效地对包涵体进行复性，恢复其天然构象。HEV-C P239在大肠杆菌表达系统中可实现大量表达，但主要以包涵体形式存在，本发明直接将HEV-C P239包涵体组装成具有良好免疫原性和免疫反应性的HEV-C病毒样颗粒。
该HEV-C P239病毒样颗粒具有良好免疫原性和免疫反应性，由重组HEV-C E2s239-aa结构蛋白在体外制备而成，且制备方法简便高效。
附图说明
图1为239蛋白SDS-PAGE分析图；图中：泳道1为蛋白分子量标记；泳道2、3为2M尿素透析后的P239；泳道4、5为4M尿素透析后的P239；泳道6、7为8M尿素透析后的P239；泳道8、9为菌体破碎液上清中的P239；
图2中：A为239蛋白的构象SDS-PAGE分析，泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，未经变性的P239；泳道3，经变性处理的P239。B为P239的透射电镜图示；
图3中：A为病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的(NH4)2SO4溶液中的组装情况；B为病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的NH4Cl溶液中的组装情况；C为病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的Na2SO4溶液中的组装情况；
图4中：A为在终浓度为0.5M Na2SO4 pH4.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；B为在终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；C为在终浓度为0.5M Na2SO4pH8.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；
图5中：A为在温度为4 ℃的终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；B为在温度为15℃的终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；C为在温度为37℃的终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；
图6中：A为P239颗粒的电镜观察结果。B为P239颗粒的分子筛层析结果；
图7为P239颗粒与新发HEV-C感染病人血清的ELISA结果；图中：LCK：病人姓名缩写；05\17、10\17：血清收集时间；
图8为P239颗粒的免疫原性ELISA结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：重组质粒pet21a-239的构建及239蛋白的获得
将人感染HEV-C的239-aa E2s结构编码序列(E2s，GenBank登录号MG813927，c-末端6His-tag)克隆到pet21a载体中获得HEV-C 239蛋白的表达质粒，将其命名为pet21a-239。
1μL pet21a-239质粒转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，将其涂布于含卡那霉素（终浓度100mg/ml，下同）的固体LB培养基（成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同），并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃、180rpm/min下振荡培养10h，取1mL菌液于-70℃保存。
从-70℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃ 250rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右。然后转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养4-5h。当OD600达1.0左右时，加入IPTG至终浓度0.2nmol/L，在250rpm下，分别在25℃下振荡诱导10h。4℃ 10000g离心4min收集菌体，以培养液体积的1/50量的裂解液冰浴悬浮菌体沉淀，用超声破碎仪或高压均质机破碎菌体（超声条件为：输出功率70%，作用2sec，间歇4sec，为一个脉冲，共作用时间累计30min/100ml裂解液）。菌体破碎液于4℃ 12000g离心10min。
将菌体破碎离心后的沉淀以裂解液等体积的2% Triton-X-100/Buffer I重悬，37℃震荡30min，4℃ 12000g离心10min；沉淀以10ml的2% Triton-X-100/Buffer I重悬，37℃，震荡30min，4℃ 12000g离心10min；得到沉淀；
沉淀以10ml的2% Triton-X-100/Buffer I重悬，37℃，震荡30min，4℃ 12000g离心10min继续获得沉淀；沉淀用2mol/L的尿素溶解，室温搅拌30min，4℃ 12000g离心10min，上清液为239蛋白的2M尿素样品；沉淀用4mol/L的尿素溶解，室温搅拌30min，4℃ 12000g离心10min，上清为239蛋白的4M尿素样品；沉淀用8mol/L的尿素溶解，室温搅拌30min，4℃12000g离心10min，上清为239蛋白的8M尿素样品；
取菌体破碎上清及2M、4M、8M尿素样品进行SDS-PAGE分析。结果如图1所示：泳道1为蛋白分子量标记；泳道2、3为2M尿素透析后的P239；泳道4、5为4M尿素透析后的P239；泳道6、7为8M尿素透析后的P239；泳道8、9为菌体破碎液上清中的P239。
结果显示P239可溶性表达很少，主要以包涵体的形式存在。经洗涤纯化后，包涵体中大部分P239溶解于4M尿素中。
实施例2：239蛋白的性质验证：利用SDS-PAGE及透射电镜分析239蛋白在溶液中的状态。
结果如图2A、B所示。A：P239的SDS-PAGE分析，泳道1，蛋白分子量标记；泳道2，未经变性的P239；泳道3，经变性处理的P239。B：P239的透射电镜结果。结果显示，P239在溶液中主要以二聚体形式存在。
实施例3：239蛋白颗粒组装：在本实施例中，研究了尿素存在的情况下P239组装HEV-C病毒样颗粒的最佳条件。
1、不同盐离子和不同盐浓度对P239颗粒组装的影响：在本实验中考察了不同盐(NH4)2SO4、Na2SO4、NH4Cl和不同盐浓度（0.3M、0.5M、0.8M）对P239组装病毒样颗粒的影响。将P239（在4M尿素溶液中）稀释至1mg/ml，将其透析至含有不同浓度的(NH4)2SO4、Na2SO4、NH4Cl的pH4.5的50mM PB组装缓冲液中。透析后通过透射电镜分析各个239蛋白样品在各组装溶液中的状态。
结果如图3所示，图中：A：病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的(NH4)2SO4溶液中的组装情况；B：病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的NH4Cl溶液中的组装情况；C：病毒颗粒分别在0.3M、0.5M、0.8M的Na2SO4溶液中的组装情况。
结果显示，不同种类的盐离子均能促进P239在尿素中组装，但需要达到的离子浓度各不相同。同样，不同种类盐离子在相同浓度下病毒颗粒组装效率各不相同，在浓度为0.5M的Na2SO4溶液中，组装效果最佳。
2、不同pH缓冲液对239蛋白的颗粒组装的影响
将P239（在4M尿素溶液中）稀释至1mg/ml，将其透析至含有终浓度为0.5M Na2SO4的pH为4.5、7.5、8.5的50mM PB组装缓冲液中。
结果如图4所示：A：在终浓度为0.5M Na2SO4 pH4.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；B：在终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；C：在终浓度为0.5M Na2SO4 pH8.5的50mM PB组装缓冲液中病毒样颗粒组装情况；结果显示，pH7.5时，P239病毒样颗粒组装效果较好。
3、不同温度对239蛋白的颗粒组装的影响
将P239（在4M尿素溶液中）稀释至1mg/ml，将其透析至温度为4℃、15℃、37℃含有终浓度为0.5M Na2SO4 pH为7.5的50mM PB组装缓冲液中。
结果如图5所示：A：在温度为4℃的终浓度为0.5M、Na2SO4、pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；B：在温度为15℃的终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；C：在温度为37℃的终浓度为0.5M Na2SO4 pH7.5的50mM PB组装缓冲液中的组装情况；结果显示，在供试的各温度下，239蛋白均能发生组装，在37℃ P239组装成病毒样颗粒的效果最佳。
实施例4：由239蛋白组装的病毒样颗粒的最终状态
在本实施例中，使用实施例3描述的最佳颗粒组装条件，将经纯化的239蛋白在37℃透析至含有终浓度为0.5M Na2SO4 、pH7.5的50mM PB组装缓冲液中装得到HEV-C病毒样颗粒（下文简称为P239病毒样颗粒或P239颗粒）。使用透射电镜观察和分子筛层析对P239颗粒的最终状态进行研究。
1、透射电镜观察：使用的仪器为日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为25,000倍。将获得的P239颗粒用2%磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。电镜结果见图6中A。结果显示，样品大部分呈现直径为30-45nm左右、大小均匀的病毒样颗粒。
2、分子筛分析：采Superose 6柱子进行分子筛层析分析，以2倍柱体积的缓冲液20mM pH 6.5的PB+0.5M NaCl预先平衡层析柱，直至280波长吸收值无明显变化，将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进行并进行分析，结果如图6中B所示，可以获得较高浓度的P239颗粒。
实施例5：通过ELISA分析P239颗粒与HEV-C感染病人血清反应
预先将重组239蛋白作为抗原包被聚苯乙烯微孔条（20ng/孔），4℃过夜，次日PBST洗液洗板3次，用封闭液封闭预包被微孔板，37℃ 1h，PBST洗涤2次，密封，4℃储存备用。设置RVFV-Gn蛋白作为阴性对照，分两次收集HEV-C感染病人血清样本，分别按1:1000、1:5000、1:20000的比例稀释。每孔加入5μL样本，轻拍混匀。置于37℃温育30min；弃去孔中液体，PBST洗涤5次；除空白对照孔外，每孔加入100μL工作浓度的HRP标记羊抗人IgG，置于37℃温育30min；弃去孔中液体，PBST洗涤5次，37℃避光显色10min。使用酶标仪在波长450nm处检测，以空白对照孔调零，测定各孔OD值。
结果如图7显示由P239组装的HEV-C病毒样颗粒保留了239蛋白的免疫反应性，可以被HEV-C感染病人血清中的抗体识别。
实施例6：P239颗粒对大鼠的免疫原性研究
将P239病毒样颗粒用生理盐水稀释至蛋白质量浓度为50mg/L，加入等量MONTANIDETM ISA 201佐剂，制备疫苗。选体温稳定的健康易感SD大鼠15只，随机分为3组，每组5只。第1组不免疫作为对照组，各皮下注射生理盐水0.1mL；第2组作为免疫阴性对照组，各皮下注射RVFV-Gn蛋白液50mg/L，0.1mL；第3组为免疫组，各皮下注射HEV-C病毒样颗粒液所制备的疫苗0.1mL。免疫后21d采血，用HEV-C E2s检测血清抗体。
结果如图8显示：P239颗粒具有HEV-C相似的免疫原性，能够引发机体产生抗HEV-C抗体。
本发明获得的HEV-C P239病毒样颗粒可应用于大规模生产HEV-C疫苗的病毒样颗粒。该HEV-C P239病毒样颗粒具有良好免疫原性和免疫反应性，由重组HEV-C E2s 239-aa结构蛋白在体外制备而成，且制备方法简便高效。
序列表
<110> 山西省中医药研究院（山西中医院）、山西白求恩医院（山西医学科学院）
<120> C种戊型肝炎病毒239蛋白制备病毒样颗粒的方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgctgggtg gtctgccaac cgatctggtg agcaacgccg gcggccaact cttctatggc 60
cgtccgcaag ttagcgaaaa cggcgaaccg agcgtgaaac tgtacaccag tgtggaggcc 120
gcgcagctgg atcatggcgt gacgatccca cacgacattg atctgggcgt tagcgccatt 180
acgctgcaag atttcgacaa ccagcatctg caagatcgcc caacgccaag cccagcgcca 240
gcgcgtccaa tcaccaattg gcgcagcggc gatgttgttt gggttacgct gccgagcgcc 300
gaatatgcgc agagccagag cgcgatgggt agccacccag cctactggag cgaggaagcc 360
acgatcatca atgttgccac cggtcagcgt gcggcggtta gcagcatcaa atgggatcaa 420
gttacgctga acggcaaagc gctgcacaaa gagacccata gcggtctggt gtactaccag 480
ctgccgctga tgggcaaaat caacttctgg cagcaaggca cgacgaaggc cggctacacg 540
tacaactaca acacgaccga cagcgatagt ctgtgggttt ggtgggatgg cggcagcaaa 600
gcctatctgt acatcagcac ctacaccacc atgctgggtg cgggcccagt taatatcacg 660
ggtctgggcg ccgttggtcc gaatccggtt gatcaagcca gcgccgcggt tccaatg 717
<210> 2
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Asp Leu Val Ser Asn Ala Gly Gly Gln
1               5                   10                  15
Leu Phe Tyr Gly Arg Pro Gln Val Ser Glu Asn Gly Glu Pro Ser Val
            20                  25                  30
Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Ala Ala Gln Leu Asp His Gly Val Thr
        35                  40                  45
Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Val Ser Ala Ile Thr Leu Gln Asp
    50                  55                  60
Phe Asp Asn Gln His Leu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro
65                  70                  75                  80
Ala Arg Pro Ile Thr Asn Trp Arg Ser Gly Asp Val Val Trp Val Thr
                85                  90                  95
Leu Pro Ser Ala Glu Tyr Ala Gln Ser Gln Ser Ala Met Gly Ser His
            100                 105                 110
Pro Ala Tyr Trp Ser Glu Glu Ala Thr Ile Ile Asn Val Ala Thr Gly
        115                 120                 125
Gln Arg Ala Ala Val Ser Ser Ile Lys Trp Asp Gln Val Thr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Lys Ala Leu His Lys Glu Thr His Ser Gly Leu Val Tyr Tyr Gln
145                 150                 155                 160
Leu Pro Leu Met Gly Lys Ile Asn Phe Trp Gln Gln Gly Thr Thr Lys
                165                 170                 175
Ala Gly Tyr Thr Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Asp Ser Asp Ser Leu Trp
            180                 185                 190
Val Trp Trp Asp Gly Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Tyr Ile Ser Thr Tyr
        195                 200                 205
Thr Thr Met Leu Gly Ala Gly Pro Val Asn Ile Thr Gly Leu Gly Ala
    210                 215                 220
Val Gly Pro Asn Pro Val Asp Gln Ala Ser Ala Ala Val Pro Met
225                 230                 235

Claims (6)

1.C种戊型肝炎病毒239蛋白即HEV-C 239蛋白制备病毒样颗粒的方法，其特征在于：具体步骤为：239蛋白包涵体用4M尿素稀释至1mg/ml，将其透析至含有0.3-0.8M的(NH4)2SO4、Na2SO4或NH4Cl盐离子、pH 4.5-7.5的50mM PB组装缓冲液中；透析温度为4-37℃；搅拌30min-12h；
所述239蛋白的编码基因为HEV-CH239，该基因序列如SEQ ID NO：1所示，该基因名称为HEV-CH 239，载体为pet21a，抗性为抗卡那霉素；酶切位点为XhoI，NdeI，末端不加终止密码，与his标签融合；所述239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的C种戊型肝炎病毒239蛋白即HEV-C 239蛋白制备病毒样颗粒的方法，其特征在于：所述PB组装缓冲液中：盐离子为0.5M的Na2SO4溶液；pH值为7.5；透析温度为37℃；透析处理30min。
3.利用权利要求1或2所述方法制备的病毒样颗粒。
4.权利要求3所述病毒样颗粒在制备预防或治疗HEV-C感染所致疾病的药物中的应用。
5.权利要求3所述病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的应用，其特征在于：所述药物组合物或疫苗用于预防或治疗HEV-C感染、由HEV-C感染所致疾病。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述HEV-C感染所致疾病为戊型肝炎。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114957411B (zh) * 2022-05-25 2023-08-18 徐州医科大学 一种正戊型肝病毒属基因c1型病毒orf2重组蛋白及其制备方法和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2201588A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 Sergei A. Tsarev Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines
CN1391579A (zh) * 1999-09-30 2003-01-15 养生堂有限公司 新的hev抗原肽及方法
CN101062941A (zh) * 2007-04-27 2007-10-31 东南大学 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途
WO2010099547A1 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 The Regents Of The University Of California Multiple antigen delivery system using hepatitis e virus-like particle
CN102321591A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 厦门大学 戊型肝炎病毒的病毒样颗粒的组装机制及其制备方法
CN104211784A (zh) * 2013-06-04 2014-12-17 厦门大学 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
GB201503218D0 (en) * 2015-02-26 2015-04-15 Native Antigen The Company Particles comprising fusion proteins
CN104862287A (zh) * 2015-05-21 2015-08-26 中国医学科学院医学生物学研究所 一种基因工程重组甲戊肝炎联合疫苗的制备方法
CN108752435A (zh) * 2018-06-07 2018-11-06 中国食品药品检定研究院 乙酰化戊型肝炎病毒衣壳蛋白orf2及其用途
CN110652558A (zh) * 2019-11-06 2020-01-07 山西省中医药研究院 一种治疗化疗性静脉炎的中药水凝胶贴剂及其制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2201588A1 (en) * 1994-10-03 1996-04-11 Sergei A. Tsarev Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines
CN1391579A (zh) * 1999-09-30 2003-01-15 养生堂有限公司 新的hev抗原肽及方法
CN101062941A (zh) * 2007-04-27 2007-10-31 东南大学 一种重组戊型肝炎病毒蛋白、其制备方法及用途
WO2010099547A1 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 The Regents Of The University Of California Multiple antigen delivery system using hepatitis e virus-like particle
CN102321591A (zh) * 2011-08-17 2012-01-18 厦门大学 戊型肝炎病毒的病毒样颗粒的组装机制及其制备方法
CN104211784A (zh) * 2013-06-04 2014-12-17 厦门大学 用于制备戊型肝炎病毒样颗粒的蛋白质和方法
GB201503218D0 (en) * 2015-02-26 2015-04-15 Native Antigen The Company Particles comprising fusion proteins
CN104862287A (zh) * 2015-05-21 2015-08-26 中国医学科学院医学生物学研究所 一种基因工程重组甲戊肝炎联合疫苗的制备方法
CN108752435A (zh) * 2018-06-07 2018-11-06 中国食品药品检定研究院 乙酰化戊型肝炎病毒衣壳蛋白orf2及其用途
CN110652558A (zh) * 2019-11-06 2020-01-07 山西省中医药研究院 一种治疗化疗性静脉炎的中药水凝胶贴剂及其制备方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A bacterially expressed particulate hepatitis E vaccine: antigenicity,immunogenicity and protectivity on primates;Shao W. Li等;《Vaccine 》;ELSEVIER;20041224;第23卷;第2893-2901页 *
Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes;Minxi Wei等;《Vaccine》;ELSEVIER;20140322;第32卷;第2859-2865页 *
Chain A, Protein ORF2;GenBank DataBase;《GenBank DataBase》;GenBank DataBase;20201201;Accession NO：7BV0_A *
Hepeviridae strain LCK-3110，complete genome;GenBank DataBase;《GenBank DataBase》;GenBank DataBase;20181121;Accession NO：MG813927 *
戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究;吴婷等;《病毒学报》;CNKI;20051130;第21卷(第6期);第428-433页 *
颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性;何志强等;《生物工程学报》;CNKI;20040331;第20卷(第2期);第262-268页 *

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