CN102321591A

CN102321591A - 戊型肝炎病毒的病毒样颗粒的组装机制及其制备方法

Info

Publication number: CN102321591A
Application number: CN201110234805A
Authority: CN
Inventors: 夏宁邵; 李少伟; 杨春燕; 鲜阳凌; 杜海莲; 张军
Original assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Current assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Priority date: 2011-08-17
Filing date: 2011-08-17
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-08-17
Also published as: CN102321591B

Abstract

本发明阐明了戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)的病毒样颗粒(virus-like particleVLP)的组装机制，并提供了一种用于将HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法。此外，本发明还提供了用于控制HEV VLP的组装的方法，其通过控制盐浓度和/或温度来控制HEV衣壳蛋白或其变体或片段至VLP的组装。

Description

戊型肝炎病毒的病毒样颗粒的组装机制及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和病毒学领域。特别地，本发明阐明了戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)的病毒样颗粒(virus-likeparticle，VLP)的组装机制，并提供了一种用于将HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法。此外，本发明还提供了用于控制HEVVLP的组装的方法，其通过控制盐浓度和/或温度来控制HEV衣壳蛋白或其变体或片段至VLP的组装。

背景技术

戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)感染导致的，其是主要的病毒性肝炎之一，并且多数呈自限性。戊型病毒性肝炎的症状与甲型肝炎类似，但病死率更高，症状更重：孕妇病死率可高达20％，并且慢性肝病患者合并HEV感染易引发肝衰竭，死亡率达70％。

HEV主要通过肠道传播，但亦可通过输血或垂直途径传播，常常导致大规模的爆发流行。近半个世纪以来，文献记载了万例以上的戊型肝炎大爆发近十起，其中规模最大的一次发生于1986-1988年的中国新疆，共发病119,280例，死亡707人，其中包括414名孕妇。由于人们对HEV的研究很有限，因此长期以来戊型肝炎处于一种被忽视的状态。进入21世纪以来，随着戊型肝炎诊断试剂的灵敏度和特异性的大幅度提高，越来越多的戊型肝炎病例被确诊。据统计，全球大约有三分之一的人口曾感染过HEV。

越来越多的证据显示，戊型肝炎是一种人兽共患疾病。猪是HEV的最主要动物宿主，并且是人类戊型肝炎的重要传染源。我国学者对全国20个省市120个养猪场以及进口检疫的9,055只猪的HEV感染情况进行了血清学调查，结果证实我国商品猪中的HEV感染极其常见，总感染率高达83％，并且从国内多个地区的猪中分离到了HEV病毒株。

戊型肝炎病毒(HEV)是一种单股正链的RNA病毒，其衣壳是由单一结构蛋白组装成的T＝3的二十面体对称结构，包裹约7.2kb的基因组。HEV病毒颗粒的直径为约27～34nm，无包膜。HEV基因组包含5′端帽状结构和多聚A尾，并且包含三个相互重叠的开放性读码框(ORF：ORF1，ORF2和ORF3)，其两侧分别为一个短的5′端非编码区(5′UTR)和一个由多聚腺苷酸终止的短的3′端非编码区(3′UTR)。ORF1长约5kb，位于编码区的5′末端，是HEV最大的开放读码框，其主要作用为：在RNA合成酶的参与下，编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白(pORF1)。ORF2长约2kb，位于编码区的3′末端，为HEV的主要结构基因编码区，其主要作用为：编码病毒衣壳蛋白pORF2——一种含660个氨基酸的糖基化蛋白。近来还针对ORF2蛋白与HEV基因组5′末端的特异RNA结合活性进行了研究，结果显示，两者的相互作用可能有助于病毒衣壳的形成。ORF 3是一个小的开放读码框，功能尚未被阐明。目前有研究提示，HEV ORF3蛋白可能在细胞信号转导、HEV颗粒组装、释放及免疫等方面起着重要的作用。

根据ORF2结构蛋白基因的同源性，HEV至少可分为4个主要的基因型。分子流行病学研究表明，HEV基因1型和2型主要感染人类，常导致爆发流行；基因3型和4型可同时感染动物和人类，呈散发性流行。四种型别的HEV代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株和中国变异株。目前，将鸡HEV归为基因5型。各型HEV在ORF2氨基酸序列上具有较高的同源性，这导致在HEV血清学上世界各地的HEV均为同一血清型。各基因型病毒间的可交叉保护，大大简化了疫苗研制的难度。

目前，HEV的细胞培养和组织培养均未能获得成功。然而，由于HEV的病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)具有良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制重组戊型肝炎疫苗。因此，国内外戊型肝炎疫苗的研制主要如下：通过各种表达系统获得结构蛋白，然后在体内或体外将结构蛋白组装成为病毒样颗粒(VLP)，从而制备获得VLP疫苗。目前，关于HEV VLP用于疫苗研究的报道包括如下：(1)通过利用杆状病毒/昆虫细胞表达HEV ORF2片段aa112-aa 07，可在细胞裂解物中获得体内自组装的HEV VLP(Robinson等，Protein ExprPurif.1998，12(1)：75-84)；(2)利用大肠杆菌表达HEV ORF2片段aa368-aa606，其可在体外自组装成为HEV VLP(Li等，Vaccine.2005，23：2893-2901；Li等，JBC.2005，28(5)：3400-3406)。

迄今为止，世界上进入临床试验的戊型肝炎疫苗有两种：一种是由GSK公司研制的包含杆状病毒/昆虫细胞表达的HEV ORF2片段aa112-606的VLP疫苗，其在尼迫尔进入了II期临床试验，显示了良好的免疫原性，然而由于各种原因，该研究被中断；另一种是包含大肠杆菌表达的HEV ORF2片段aa368-aa606的VLP疫苗，其已经完成III期临床试验，显示了良好的安全性和保护性(Zhu等，Lancet，2010)。由此可见，HEV VLP具有良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制戊型肝炎疫苗，是戊型肝炎疫苗的理想形式。

因此，HEV VLP的组装和调控机制对于戊型肝炎病毒的相关研究和戊型肝炎疫苗的生产具有重要的理论和实际指导意义。本发明通过实验阐明了HEV VLP的组装机制，并在此基础上提供了一种用于将HEV衣壳蛋白或其变体组装成VLP的方法，提供了新的制备HEV VLP的方法。

发明内容

本发明中的相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分析化学、生物化学、细胞培养、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“HEV ORF2”是指戊型肝炎病毒(HEV)基因组的ORF2，其序列是本领域公知的(参见，例如DDBJ数据登录号：D11092)，并且编码HEV的衣壳蛋白。在本发明中，当涉及HEV ORF2的序列时，其使用DDBJ数据登录号：D11092所示的序列来进行描述。例如，表述“HEV ORF2编码的多肽的第368-606位氨基酸残基”(在本文中也简写为，HEV ORF2片段aa 368-aa 606或HEV ORF2aa 368-aa 606)中的第368-606位氨基酸残基是指，D11092编码的多肽的第368-606位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HEV ORF2或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能(在本发明中即，编码能够形成HEV VLP的衣壳蛋白)。因此，在本发明中，术语“HEV ORF2”应包括所有此类序列，包括例如D11092所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HEV ORF2(或其编码的多肽)的序列片段时，其不仅包括D11092(或其编码的多肽)的序列片段，还包括D11092(或其编码的多肽)的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HEVORF2编码的多肽的第368-606位氨基酸残基”包括，D11092编码的多肽的第368-606位氨基酸残基，以及D11092编码的多肽的变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

根据本发明，术语“HEV衣壳蛋白”是指，由HEV ORF2编码的蛋白，其能够组装成HEV病毒样颗粒。

根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的HEV衣壳蛋白)的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，蛋白/多肽(例如，本发明的HEV衣壳蛋白)的必要特性可以指，具有组装成HEV病毒样颗粒的能力。

根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4：11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学功能的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94：412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

根据本发明，术语“p239”是指HEV ORF2片段aa368-aa606(其在aa368之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸)，其具有组装成为HEV VLP的能力，可用于制备戊型肝炎疫苗，并且可用于研究HEV VLP的组装机制。p239多肽的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其示例性编码序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明，术语“E2”是指，HEV ORF2片段aa394-aa606(其在aa394之前还包含由起始密码子编码的甲硫氨酸)，其不具有组装成为HEV VLP的能力。E2多肽的示例性氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，其示例性编码序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明，术语“病毒样颗粒(VLP)”是指不含病毒核酸的、在结构上与天然的病毒颗粒相似的空壳结构，其通常由病毒衣壳蛋白或其变体或片段组成。由于VLP在结构上与天然的病毒颗粒十分相似，因此，其具有很强的免疫原性和免疫反应性。同时，由于VLP不含病毒的遗传物质，因此，其不具有感染性。由于上述优点，VLP已被开发用作疫苗，其中一些VLP疫苗已经成功应用于临床，举例但不限于：Merck的四价VLP Gardasil疫苗，p239VLP疫苗等等。VLP在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLP，并且能够将外源性抗原展示在其表面。此外，大部分VLP还具有包裹核酸或其他小分子的能力，因此，其还可作为基因或药物的运载工具。病毒样颗粒在本申请中也简称为颗粒。如本发明中使用的，当蛋白质在不存在变性因素的条件下能够组装成病毒样颗粒时，该蛋白质被称为“具有组装成病毒样颗粒的能力”。在本发明中，“变性因素”是指，能够使蛋白质发生变性的因素，其包括但不限于，高温(例如，加热)，变性剂(例如尿素)等等。

许多病毒衣壳蛋白或其变体或片段都具有组装成病毒样颗粒的能力。然而，并非所有的衣壳蛋白或其变体或片段都能够组装成病毒样颗粒，例如E2蛋白。可通过本领域已知的方法来鉴定具有组装成病毒样颗粒的能力的衣壳蛋白或其变体或片段。例如，可通过下述步骤来确定衣壳蛋白或其变体或片段是否具有组装成病毒样颗粒的能力：在室温下将衣壳蛋白或其变体或片段置于不含变性剂的溶液中，然后检测病毒样颗粒的存在。

根据本发明，术语“疏水相互作用”是指，非极性分子(例如，疏水氨基酸残基)之间的一种弱的、非共价的相互作用。这些非极性分子在水相环境中具有避开水而相互聚集的倾向。疏水相互作用是通过疏水分子与水的相互排斥作用而发生的。这种作用使得疏水分子相互靠拢，同时使水相互集中，从而更大程度地结构化。疏水相互作用对大多数蛋白质的结构和性质非常关键。例如，蛋白质通过疏水相互作用使大部分疏水氨基酸残基相互聚集。

根据本发明，术语“组装”是指病毒的结构蛋白(例如衣壳蛋白)之间或结构蛋白与核酸之间通过各种相互作用，形成有规则的颗粒状结构的过程，其包括天然病毒颗粒的组装和病毒样颗粒的组装。

根据本发明，术语“蛋白质变性(denaturation)”是指，蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是引起二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。

如果变性条件剧烈持久，导致蛋白质的空间构象和生物学活性不可逆地被破坏，那么蛋白质的变性是不可逆的(即，不可逆变性)。如果变性条件不剧烈，变性蛋白在一定条件下可恢复其天然构象和生物学活性，那么蛋白质的变性是可逆的(即，可逆变性)。在可逆变性的情况下，蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果去除变性因素，那么变性蛋白质将恢复其天然构象和生物学活性，这种现象称为蛋白质复性(renaturation)。蛋白质可逆变性和复性的实例举例如下：当将胃蛋白酶加热至80-90℃时，其失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，然而如果将温度再降低到37℃，则其又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。

根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。

根据本发明，各种缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，磷酸盐缓冲液等等。

可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄中的一种或几种。根据本发明，特别优选的盐是(NH₄)₂SO₄。

根据本发明，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。根据本发明，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19th ed.Pennsylvania：Mack PublishingCompany，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

本领域技术人员熟知，HEV衣壳蛋白(包括其变体或片段)在变性剂(例如尿素)存在的情况下，不能组装成HEV VLP。在通常的情况下，需要将变性剂去除，HEV衣壳蛋白才能够组装成VLP。然而，发明人出人意料地发现：HEV衣壳蛋白或其变体或片段(例如，p239蛋白)在溶液中存在变性剂(例如，4M尿素)的情况下，当向溶液中添加一定浓度的盐(例如至少0.3M硫酸铵)时，能够自组装成VLP，而无需将溶液中的变性剂去除。此外，发明人还发现，硫酸铵的加入有助于HEV衣壳蛋白或其变体或片段形成更加均一的VLP，并且VLP的组装速度受溶液中的盐浓度以及温度的影响。

因此，在一个方面，本发明提供了制备戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括步骤：在变性剂存在的条件下，通过添加盐使HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP，其中所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段具有组装成VLP的能力。

在一个优选的实施方案中，所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂是尿素，例如4M尿素。

在一个优选的实施方案中，所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，并且特别优选地是(NH₄)₂SO₄。在进一步优选的实施方案中，所述盐的离子强度为至少0.9mo l/kg。例如，所述盐可以是至少0.3M的(NH₄)₂SO₄。

在一个优选的实施方案中，所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段例如可以是以包含体形式表达于大肠杆菌中的HEV衣壳蛋白或其变体或片段。

在另一个优选的实施方案中，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段例如可以是p239蛋白。优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

在另一个方面，本发明提供了制备戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括如下步骤：

1)提供具有组装成VLP的能力的HEV衣壳蛋白或其变体或片段；

2)将步骤1)的HEV衣壳蛋白或其变体或片段溶解于含变性剂的溶液中；

3)向步骤2)获得的溶液中添加盐，以使所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP；

任选地，在进行步骤3)之前，对在含变性剂的溶液中的HEV衣壳蛋白或其变体或片段进行纯化，例如，通过阴离子交换层析和/或疏水相互作用层析进行纯化；

任选地，在步骤3)之后，去除溶液中的变性剂，例如通过将含有HEV VLP的溶液透析到PBS溶液中来去除变性剂。

在一个优选的实施方案中，在步骤1)中，例如通过将其以包含体形式表达于大肠杆菌中来提供所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段。

在一个优选的实施方案中，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段是p239蛋白。优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在一个优选的实施方案中，在步骤2)中，所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂是尿素，例如4M尿素。

在一个优选的实施方案中，在步骤3)中，所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，并且特别优选地是(NH₄)₂SO₄。在进一步优选的实施方案中，所述盐的离子强度为至少0.9mol/kg。例如，所述盐可以是至少0.3M的(NH₄)₂SO₄。

本领域技术人员公知，HEV病毒样颗粒具备良好的免疫反应性和免疫原性，可用于研制重组戊型肝炎疫苗。因此，在一个方面，本发明还提供了制备用于预防和/或治疗戊型肝炎的疫苗的方法，其包括：

1)根据本发明的方法来制备HEV病毒样颗粒；

2)将所获得的HEV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂组合，从而制备疫苗。

在另一个方面，本发明还提供了用于预防和/或治疗戊型肝炎的疫苗，其是根据本发明的上述方法获得的，或包含根据本发明的方法制备而得的HEV病毒样颗粒。任选地，本发明的疫苗还可以包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

在另一个方面，本发明提供了控制HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的组装速度的方法，其包括步骤：控制包含HEV衣壳蛋白或其变体或片段的溶液的盐浓度和/或控制所述溶液的温度，其中所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段具有组装成VLP的能力。

在一个优选的实施方案中，所述溶液包含或不包含变性剂。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂是尿素，例如4M尿素。

在一个优选的实施方案中，所述溶液包含的盐为NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，优选(NH₄)₂SO₄。

在一个优选的实施方案中，当所述溶液的盐浓度升高和/或所述溶液的温度升高时，所述组装速度加快。

在另一个方面，本发明提供了盐用于促进具有组装成VLP的能力的HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的用途。

在一个优选的实施方案中，所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，并且特别优选地是(NH₄)₂SO₄。在进一步优选的实施方案中，所述盐的离子强度为至少0.9mol/kg。例如，所述盐可以是至少0.3M的(NH₄)₂SO₄。

在一个优选的实施方案中，所述盐在变性剂存在或不存在的条件下用于促进VLP的组装。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合。在进一步优选的实施方案中，所述变性剂是尿素，例如4M尿素。

在另一个方面，本发明提供了破坏HEV衣壳蛋白或其变体或片段的颗粒组装能力的方法，其包括将HEV衣壳蛋白或其变体或片段中的位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的疏水氨基酸突变为亲水氨基酸。

在一个优选的实施方案中，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段包含与HEV ORF2 aa368-395对应的区域。在进一步优选的实施方案中，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段是p239蛋白。优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在一个优选的实施方案中，所述位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的疏水氨基酸可以是HEV ORF2的第372、375或395位亮氨酸。在进一步优选的实施方案中，所述亮氨酸被突变为谷氨酸。

在另一个方面，本发明提供了促进HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法，其包括将HEV衣壳蛋白或其变体或片段中的位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的亲水氨基酸突变为疏水氨基酸。

如本发明中所使用的，表述“与HEV ORF2aa 368-395对应的区域”是指，当序列与HEV ORF2编码的多肽进行最优比对时，即当进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中与HEV ORF2aa368-395处于等同位置的区域。

发明的有益效果

目前用于制备HEV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。

在真核表达系统中表达的HEV衣壳蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往表达出来后即为具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难，并且不利于在细胞内研究VLP的组装机制。

在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量高等优点。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白往往失去正确的天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中的蛋白进行复性和颗粒组装是一个难题。复性困难和效率低下使得从包含体中获得具有正确构象的VLP难以在大规模生产中实施，只能局限于小规模的实验室研究中。

本发明在阐明HEV衣壳蛋白组装成VLP的机制的基础上，提供了新的将HEV衣壳蛋白组装成VLP的方法，有效地解决了上述问题。首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达HEV衣壳蛋白(p239蛋白)，确保了较高表达量。其次，本发明的方法使得能够简单、快速且方便地使表达于包含体中的HEV衣壳蛋白进行复性和颗粒组装，并且组装得到的HEV VLP经证实具有良好的免疫反应性和免疫原性，与天然病毒颗粒形态相似，是适合于大规模生产的良好疫苗形式。第三，本发明所提供的将HEV衣壳蛋白组装成VLP的方法操作简单，重复性好，可应用于大规模工业化生产。因此，本发明的方法使得将大肠杆菌表达系统应用于戊型肝炎疫苗的大规模工业化生产成为可能。

此外，本发明证实，通过控制盐浓度和/或温度，可以控制HEV衣壳蛋白或其变体至VLP的组装，并且证实，在一定浓度的盐(例如，0.3M硫酸铵)存在的情况下，组装获得的HEV VLP更加均一。这对于戊型肝炎疫苗的大规模工业化生产的控制和标准化十分有利。

最后，本发明的HEV VLP可在变性剂(例如，尿素)存在的情况下组装得到。因此，本发明所提供的新的VLP组装方法，为控制VLP组装提供了一种新的思路，也为蛋白质的聚集提供了一种全新的视界。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1：衍生自戊型肝炎病毒衣壳蛋白的p239和E2(对照蛋白)在4M尿素中的形式。图1A显示了p239在4M尿素中的沉降速率实验的结果；图1B显示了E2在4M尿素中的沉降速率实验的结果；图1C显示了p239在4M尿素中的沉降平衡实验的结果；图1D显示了E2在4M尿素中的沉降平衡实验的结果。从图1中可知，在不存在盐的情况下，p239和E2在4M尿素中均呈现单一组分，为均一的二聚体形式，不能组装成VLP。

图2：用不同浓度的硫酸铵孵育24小时后的p239和E2的沉降系数的测定。将p239(图2A-D)和E2(图2E-H)分别在含有不同浓度的硫酸铵的4M尿素中孵育24小时，然后透析至PBS溶液中以进行复性。其中，p239：图2A，0M(NH₄)₂SO₄；图2B，0.3M(NH₄)₂SO₄；图2C，0.5M(NH₄)₂SO₄；图2D，1.0M(NH₄)₂SO₄。E2：图2E，0M(NH₄)₂SO₄；图2F，0.3M(NH₄)₂SO₄；图2G，0.5M(NH₄)₂SO₄；图2H，1.0M(NH₄)₂SO₄。从图2中可知，硫酸铵的孵育有利于p239形成VLP颗粒(图2A-D)，而对E2没有影响(图2E-H)。另外，未经硫酸铵处理的p239复性后呈现两种不同大小的组分(图2A)，这表明硫酸铵的处理可促使p239形成更均一的颗粒。

图3：用不同浓度的硫酸铵孵育6小时后的p239在尿素中的状态分析。图3A，远紫外圆二色光谱结果，黑线为未组装的p239，红线为在4M尿素+0.3M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239，兰线为经组装的p239颗粒；图3B，近紫外圆二色光谱结果，黑线为未组装的p239，红线为在4M尿素+0.3M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239，兰线为经组装的p239颗粒；图3C，分子筛层析分析结果，1暗绿线为未组装的p239，2亮绿线为在4M尿素+0.3M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239，3棕线为在4M尿素+0.5M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239，4粉红线为在4M尿素+1.0M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239，5兰线为经组装的p239颗粒；图3D，动态光散射分析结果，在4M尿素+0.3M(NH₄)₂SO₄中处理6小时的p239。从图3可知，在尿素中加入一定浓度的硫酸铵并且孵育6小时后，p239即可组装成VLP，而无需去除变性剂尿素。该结果表明，在存在变性剂的情况下，p239的组装可通过一定的盐浓度来诱导。

图4：不同的盐离子和不同的盐浓度对p239蛋白的颗粒组装的影响。将未组装的p239蛋白加入到含不同浓度(0.3M，0.5M或1.0M)的(NH₄)₂SO₄，Na₂SO₄，NH₄Cl或NaCl的4M尿素中并且孵育6小时，然后测定p239的沉降系数。结果显示，离子强度的升高可促进p239的组装，并且p239的组装需要一定的离子强度，即：至少约0.9mol/kg的离子强度(0.3M硫酸铵的离子强度为0.9mo l/kg)。

图5：p239蛋白在含不同浓度(0.3M，0.5M或1.0M)的(NH₄)₂SO₄的4M尿素中的组装的动态过程(在孵育后第1、2、3、4、5、6、7和8小时的时间点进行分析)。图5A，用0.3M(NH₄)₂SO₄，25℃处理的p239的组装过程；图5B，用0.3M(NH₄)₂SO₄，37℃处理的p239的组装过程；图5C，用0.5M(NH₄)₂SO₄，25℃处理的p239的组装过程；图5D，用0.5M(NH₄)₂SO₄，37℃处理的p239的组装过程；图5E，用1.0M(NH₄)₂SO₄，25℃处理的p239的组装过程；图5F，用1.0M(NH₄)₂SO₄，37℃处理的p239的组装过程；图5G，对照样品E2蛋白在含有0.0M、0.3M、0.5M或1.0M(NH₄)₂SO₄的4M尿素中于37℃孵育24小时后的沉降速率分析。从图5中可以看出，p239的组装速度与温度和(NH₄)₂SO₄浓度呈正相关：浓度越高，组装速度越快，并且温度越高，组装速度也越快。

图6：p239在含有不同浓度的硫酸铵的尿素中，在不同温度下的组装动态过程的组分分析。图6A，在25℃孵育温度和不同(NH₄)₂SO₄浓度下，p239组装过程中的组分分布；图6B，在37℃孵育温度和不同(NH₄)₂SO₄浓度下，p239组装过程中的组分分布；图6C，在25℃孵育温度和不同(NH₄)₂SO₄浓度下，p239组装过程中的各组分的变化曲线；图6D，在37℃孵育温度和不同(NH₄)₂SO₄浓度下孵育24hr后，p239颗粒和E2蛋白的沉降系数的分布范围。从图6A-6C可以看出，随着温度的增加或(NH₄)₂SO₄浓度的提高，p239的组装速度加快。从图6D可以看出，(NH₄)₂SO₄浓度对p239颗粒和E2蛋白的沉降系数的影响趋势是一致的：随着(NH₄)₂SO₄浓度的提高，沉降系数下降。

图7：在4M尿素中组装的p239颗粒的最终组装状态的分析。p239蛋白在含有0.5M(NH₄)₂SO₄的尿素中在37℃下孵育12小时，以组装成p239颗粒，然后将其透析至PBS溶液中，从而得到p239颗粒的最终组装状态。图7A，p239颗粒最终组装状态的透射电镜分析，Bar＝100nm；图7B，p239颗粒最终组装状态的沉降速率分析；图7C，p239颗粒最终组装状态的分子筛高效液相色谱分析；图7D，p239颗粒最终组装状态的动态光散射分析。从图7可以看出，p239蛋白组装成了均一的HEV病毒样颗粒。

图8：p239蛋白组装成为病毒样颗粒时在三倍轴位置的相互作用。图8A，三倍轴位置的α-螺旋的相互作用；图8B，三倍轴位置的局部放大图，其显示，HEV衣壳蛋白的第397位和第443位的酪氨酸残基侧链在相互作用中具有重要贡献。

图9：p239蛋白在组装过程中形成的三聚化中间态的N端结构域模型。图9A，p239蛋白N端结构域的骨架；图9B，p239蛋白N端结构域形成的疏水核(蓝色表面)，其中HEV衣壳蛋白的第372，375和395位的亮氨酸残基对疏水作用有重要贡献；图9C，p239蛋白三聚化中间态的结构模型(朝内看视图)；图9D，p239蛋白三聚化中间态的结构模型(朝外看视图)。注：该模型摘自HEV 3型病毒样晶体结构中与p239对应的部分(所述晶体结构在PDB数据库中的编号为2ZTN，参见Yamashita等，Proc Natl Acad Sci USA，2009，106：12986-12991)。

图10：p239蛋白N端结构域的突变分析。图10A，p239及其3个点突变蛋白(L372E、L375E和L395E)的SDS-PAGE和Western印迹分析；图10B，p239及其3个点突变蛋白(L372E、L375E和L395E)的分子筛层析分析。从图10可以看出，3个点突变蛋白(L372E、L375E和L395E)均不能组装成为颗粒，并且失去了与戊肝恢复期患者血清的免疫反应性。在图10A中，N表示该样品为未经加热处理的样品，H表示该样品为在沸水浴中温育了3分钟的样品；(+)表示该样品包含二聚体或具有单抗反应活性和(-)表示该样品不包含二聚体或无单抗反应活性。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

序列1(SEQ ID NO：1)：

ATGATAGCGCTTACCCTGTTTAACCTTGCTGACACCCTGCTAGGCGGTCTACCCACAGAATTGATTTCGTCGGCAGG

TGGACAGCTGTTCTACTCTCGTCCCGTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCCGACTGTTAAGCTTTATACATCTGTAGAGA

ATGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTAT

GACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCTAATGA

TGTGCTTTGGCTTTCTCTCACCGCTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTACGGCTCTTCGACCGGCCCAGTCTATGTCT

CTGACTCTGTGACCTTGGTTAATGTTGCGACCGGCGCGCAGGCCGTTGCCCGGTCACTCGACTGGACCAAGGTCACA

CTTGATGGTCGCCCCCTTTCCACCATCCAGCAGCATTCAAAGACCTTCTTTGTCCTGCCGCTCCGCGGTAAGCTCTC

CTTTTGGGAGGCAGGTACTACTAAAGCCGGGTACCCTTATAATTATAACACCACTGCTAGTGACCAACTGCTCGTTG

AGAATGCCGCTGGGCATCGGGTTGCTATTTCCACTTACACCACTAGCCTGGGTGCTGGCCCCGTCTCTATTTCCGCG

GTTGCTGTTTTAGCCCCCCCTCCGCGCTAG

序列2(SEQ ID NO：2)：

MIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDY

DNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVT

LDGRPLSTTQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISA

VAVLAPPPR

序列3(SEQ ID NO：3)：

ATGCAGCTGTTCTACTCTCGTCCCGTTGTCTCGGCCAATGGCGAGCCGACTGTTAAGCTTTATACATCTGTAGAGAA

TGCTCAGCAGGATAAGGGTATTGCAATCCCGCATGACATCGACCTCGGGGAGTCTCGTGTAGTTATTCAGGATTATG

ACAACCAACATGAGCAGGACCGACCGACACCTTCCCCAGCCCCATCGCGCCCTTTTTCTGTCCTCCGAGCTAATGAT

GTGCTTTGGCTTTCTCTCACCGCTGCCGAGTATGACCAGTCCACTTACGGCTCTTCGACCGGCCCAGTCTATGTCTC

TGACTCTGTGACCTTGGTTAATGTTGCGACCGGCGCGCAGGCCGTTGCCCGGTCACTCGACTGGACCAAGGTCACAC

TTGATGGTCGCCCCCTTTCCACCATCCAGCAGCATTCAAAGACCTTCTTTGTCCTGCCGCTCCGCGGTAAGCTCTCC

TTTTGGGAGGCAGGTACTACTAAAGCCGGGTACCCTTATAATTATAACACCACTGCTAGTGACCAACTGCTCGTTGA

GAATGCCGCTGGGCATCGGGTTGCTATTTCCACTTACACCACTAGCCTGGGTGCTGGCCCCGTCTCTATTTCCGCGG

TTGCTGTTTTAGCCCCCCCTCCGCGCTAG

序列4(SEQ ID NO：4)：

MQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRAND

VLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTTQQYSKTFFVLPLRGKLS

FWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行。实施例中未注明具体条件者，均按照本领域通常已知的常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：衍生自HEV衣壳蛋白的p239在尿素中的状态

按照之前描述的方法(中国发明专利：ZL 02822218.0；Li等人，JBC，2005；和Li等人，Vaccine，2005)，克隆、表达和纯化衍生自戊型肝炎病毒衣壳蛋白的p239(HEV ORF2 aa368-606，其核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)。p239蛋白保留了HEV衣壳蛋白的组装为病毒样颗粒的能力，用于分析HEV VLP的组装机制。p239蛋白主要以包含体的形式在大肠杆菌中表达。经过洗涤纯化后，包含体中的大部分p239蛋白溶解于4M尿素溶液中，然后使用阴离子交换层析和疏水相互作用层析在含有4M尿素的溶液中将p239蛋白纯化至95％以上的纯度，以用于后续的分析。此外，以同样的方法表达和纯化衍生自HEV衣壳蛋白的E2蛋白(HEV ORF2aa394-606，其核酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示)。E2蛋白丧失了组装为病毒样颗粒的能力(参见Li等人，JBC，2005)，用作对照。

按照之前描述的方法，使用分析型超速离心机(XL-A型，美国Beckman公司生产)，通过沉降速率法和沉降平衡法(Schuck P等，Biophys J，2000，78：1606-1619)测定p239在4M尿素溶液中的状态。测定结果如图1所示。结果显示，p239蛋白在4M尿素溶液中呈现单一组分，其沉降系数为1.7s，摩擦系数为1.94(图1A)，分子量为45772±730Da(理论单体分子量为25521Da)(图1C)。这表明，p239蛋白在4M尿素溶液中为组分单一的二聚体形式，且为结构较为舒展的非球状蛋白(球状蛋白的摩擦系数为1.2)。对照蛋白E2在4M尿素溶液中亦为均一的二聚体形式，其沉降系数为2.0s，摩擦系数为1.94(图1B)，分子量为40981±1523Da(理论单体分子量为23097Da)(图1D)。上述结果说明，在4M尿素溶液中，p239蛋白的状态与E2蛋白相同，二者均为均一的二聚体形式，并且无颗粒组分。

实施例2：p239颗粒组装的关键因素的发现

利用疏水相互作用层析对4M尿素溶液中的p239蛋白进行纯化时，需要使用硫酸铵来增加蛋白的疏水性。通常，在进行Phenyl FFSepharose层析时，上样液中含有1M硫酸铵，并且最终用含有0.1-0.2M硫酸铵的溶液进行p239蛋白的洗脱。在洗脱后，一般通过去除溶液中的变性剂尿素来使p239蛋白复性并组装为颗粒。在本申请中，发明人意外地发现，将尿素溶液中的硫酸铵增加到至少0.3M，并且放置一段时间后，p239蛋白在尿素存在的情况下即可组装为颗粒，而无需去除尿素(即，与尿素是否存在无关)。以下是对p239蛋白的组装机制和过程的研究结果。

p239蛋白的复性受不同浓度的硫酸铵的影响

将经纯化的p239蛋白(在4M尿素溶液中)稀释至1.0mg/ml，并且向溶液中添加(NH₄)₂SO₄直至终浓度为0M、0.3M、0.5M或1M，并且尿素的浓度保持4M不变。将各个蛋白样品分别置于37℃孵育24小时，然后分别对PBS溶液进行透析复性。另外，还以同样的方式处理E2蛋白，用作对照。处理后，如实施例1中所述，通过沉降速率法测定各个p239样品和E2样品在PBS溶液中的状态。

结果如图2所示。结果显示，硫酸铵的处理促进了p239颗粒的形成(图2A-D)。特别地，未经硫酸铵处理的p239样品(即，0M(NH₄)₂SO₄)复性后呈现两种不同大小的组分(图2A)，表明硫酸铵的处理可促使p239形成更均一的颗粒；经0.5M(NH₄)₂SO₄处理的p239样品呈现最均一的颗粒(图2C)。相比之下，经同样方式处理的E2蛋白全部呈现为单一的2.7S组分，这表明E2蛋白仍为二聚体形式，而未发生颗粒组装(图2E-H)。

D239蛋白在尿素中组装为颗粒的证据

如之前所描述的，利用远紫外圆二色(Circular Dichroism，CD)光谱、近紫外圆二色光谱(Beychok S，1966，Science，154(754)：1288-1299)，分子筛层析分析(Regnier FE，1983，Science，222(4621)：245-252)和动态光散射分析(Bnachowicz E，2006，Biochim Biophys Acta，1764(3)：405-413)等方法检测p239蛋白在含不同浓度(0.3M、0.5M或1.0M)的硫酸铵的4M尿素中在37℃孵育6小时后的状态。

在室温下在CD光谱仪(J-810型，日本JASCO公司生产)上测定未组装的p239蛋白(在4M尿素中)、经0.3M硫酸铵处理的p239蛋白(在含0.3M硫酸铵的4M尿素中)以及经切向流复性的p239颗粒(即，经组装的p239颗粒)的远紫外和近紫外CD光谱。所使用的参数如下：灵敏度2m°/cm；波段宽度1nm；时间常数1sec；扫描速度50nm/min。CD数据以椭圆值(θ)表示，单位为毫度(mdeg)。远紫外CD光谱分析所使用的样品浓度为4mg/ml，扫描波长为190-260nm，比色皿光径为0.01cm；近紫外CD光谱所使用的样品浓度为0.5mg/ml，扫描波长为260-320nm，比色皿光径为1cm。

结果如图3所示。CD光谱分析的结果显示，经硫酸铵处理的p239蛋白的CD光谱与经组装的p239颗粒的CD光谱更为相似，而与未组装的p239蛋白的CD光谱存在显著不同(参见图3A和3B)，这说明经硫酸铵处理的p239蛋白在结构上与p239颗粒更为相似。分子筛层析分析的结果显示，经硫酸铵(0.3M、0.5M或1.0M)处理的p239样品在4M尿素存在的情况下，已经形成了与经组装的p239颗粒相同的颗粒组分，其显著区别于未组装的p239蛋白(参见图3C)。动态光散射分析的结果显示，经硫酸铵处理的p239蛋白在4M尿素存在的情况下，已经形成半径为约20nm的颗粒(参见图3D)。这些证据均表明，在尿素中加入一定浓度的硫酸铵并在37℃孵育6小时后，p239蛋白即可组装成颗粒，而无需去除变性剂尿素(与尿素的存在与否无关)，这说明p239蛋白的颗粒组装可通过一定的盐浓度来诱导。

不同的盐离子和不同的盐浓度对p239蛋白的颗粒组装的影响

在本实验中，进一步考察各种盐((NH₄)₂SO₄，Na₂SO₄，NH₄Cl和NaCl)和盐浓度(0.3M，0.5M或1.0M)对p239蛋白的颗粒组装的影响。具体而言，将未组装的p239蛋白加入到含不同浓度的(NH₄)₂SO₄，Na₂SO₄，NH₄Cl或NaCl的4M尿素溶液中，并于37℃孵育6小时，然后如实施例1中所述，进行沉降系数的测定，观察不同盐离子和盐浓度对p239蛋白的颗粒组装的影响。

结果如图4所示。结果显示，不同种类的盐离子均能促使239蛋白在尿素中组装成颗粒，但需要达到一定的离子强度p239蛋白才能最终组装成颗粒：0.3M NaCl或NH₄Cl不能诱使p239蛋白在尿素中组装形成颗粒，溶液中的p239蛋白主要为沉降系数为1.6S的二聚体形式；当NaCl或NH₄Cl的浓度提高至1M时，p239蛋白开始组装；0.3M Na₂SO₄或(NH₄)₂SO₄足以诱使p239蛋白组装形成颗粒；上述结果说明，p239蛋白的颗粒组装需要一定的离子强度，即：大于或等于0.9mol/kg的离子强度可促使p239蛋白组装成颗粒。此外，图4的结果还表明，不同阴离子对颗粒组装的影响存在差异：SO₄ ^2-的作用明显优于Cl^-。

p239在尿素中组装的动态过程

将(NH₄)₂SO₄添加至p239蛋白/4M尿素中，使(NH₄)₂SO₄的终浓度分别为0.3M、0.5M和1M，蛋白终浓度为1.0mg/ml，尿素浓度仍维持4M不变，然后将其分别置于25℃和37℃两种温度下进行孵育，每1小时取样一次，共获得8个样品(孵育后第1、2、3、4、5、6、7和8小时的样品)。按照实施例1中描述的方法，对获得的所有样品进行沉降系数测定，以分析p239蛋白的颗粒组装的动态过程。

结果如图5所示。结果显示，不同浓度的(NH₄)₂SO₄均可诱使p239蛋白在存在4M尿素的变性条件下发生组装，且组装需要一定的时间才能得到稳定的组分，并且在组装过程中形成了中间态(沉降系数4.5-5.5S)。结果还显示，p239蛋白的组装速度与温度和(NH₄)₂SO₄浓度都呈正相关(图5A-5F)。(1)(NH₄)₂SO₄浓度越高，组装速度越快。特别地，在用0.3M或0.5M(NH₄)₂SO₄进行处理的情况下，在组装过程中可观察到明显的中间态组分，而在1M(NH₄)₂SO₄所诱导的组装过程中，则未观察到中间态组分，这进一步证实组装速度与(NH₄)₂SO₄浓度呈正相关。(2)温度越高，组装速度越快。特别地，在用0.3M(NH₄)₂SO₄进行处理的情况下，在25℃下颗粒组装在孵育6小时后达到稳定，而在37℃下颗粒组装仅需4小时即可达到稳定。颗粒组装达到稳定所需的时间如下：0.3M(NH₄)₂SO₄/25℃(6小时)＝0.5M(NH₄)₂SO₄/25℃(6小时)＝1.0M(NH₄)₂SO₄/25℃(6小时)＞0.3M(NH₄)₂SO₄/37℃(4小时)＞0.5M(NH₄)₂SO₄/37℃(2小时)＞1.0M(NH₄)₂SO₄/37℃(1小时)。由此可见，温度对组装速度的影响大于(NH₄)₂SO₄浓度的影响。对照蛋白E2在含有0.0M、0.3M、0.5M或1.0M(NH₄)₂SO₄的4M尿素中于37℃孵育24小时后均未形成颗粒组分(图5G)。此外还发现，(NH₄)₂SO₄浓度越高，p239颗粒和E2蛋白的沉降系数越小，这表明(NH₄)₂SO₄对沉降系数的测量有一定的干扰。

进一步对图5的结果进行数据分析。分析结果示于图6中。特别地，图6A和图6B比较了不同孵育温度(25℃/37℃)和不同(NH₄)₂SO₄浓度下，p239组装过程中的组分分布。该结果显示，随着时间的推移或温度的增加或(NH₄)₂SO₄浓度的提高，p239蛋白的组装速度加快，中间态也随之消失，这说明p239蛋白的组装过程是由(NH₄)₂SO₄诱导的疏水相互作用的吸能过程。图6C显示了在25℃孵育温度和不同(NH₄)₂SO₄浓度下，p239组装过程中的各组分的变化曲线。该结果显示，在0.3M和1.0M(NH₄)₂SO₄浓度下，组装过程中前5小时的组分变化较为显著和剧烈，而在0.5M(NH₄)₂SO₄浓度下，组装过程较为缓和，各种组分的变化较为一致，可能是更优的颗粒组装过程。图6D显示了在37℃和不同(NH₄)₂SO₄浓度下孵育24小时后，p239颗粒和E2蛋白的沉降系数的分布情况。该结果显示，(NH₄)₂SO₄浓度对p239颗粒和E2蛋白的沉降系数的影响趋势是一致的：随着(NH₄)₂SO₄浓度的提高，沉降系数下降；并且，由于E2蛋白在不同(NH₄)₂SO₄浓度下均为二聚体形式，因此，该结果也说明在各(NH₄)₂SO₄浓度下获得的p239颗粒也是一致的。

实施例3：p239颗粒的最终组装状态

根据实施例2描述的p239组装过程，将p239蛋白在4M尿素+0.5M(NH₄)₂SO₄中在37℃下孵育12小时，然后透析至PBS溶液中，从而得到p239颗粒的最终组装状态。使用透射电镜观察、沉降速率分析、分子筛层析分析、动态光散射分析等方法对p239颗粒的颗粒性进行研究。

透射电镜观察

使用的仪器为日本电子公司生产的200kV透射电镜，放大倍数为25,000倍。将获得的p239颗粒用2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图7A，其中可见样品大部分呈现直径为20nm左右、大小均匀的病毒样颗粒。

沉降速率分析

使用的仪器为美国Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50T i和An-60T i转头。如实施例1中所述，采用沉降速率法分析p239颗粒的沉降系数。结果如图7B所示，p239颗粒的沉降系数为22.6s。

分子筛层析分析

采用德国安捷伦的1120 Compact LC高效液相色谱层析系统以及TSK Gel PW5000xl 7.8x300mm柱子进行分子筛层析分析。以2倍柱体积的缓冲液1xPBS预先平衡层析柱，直至280nm处的吸收值无明显变化。将检测器的吸收值归零，然后由自动进样器进样并进行分析。结果如图7C所示，p239颗粒的保留时间为13.7min。

动态光散射测定

使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器)，使用的算法为Regulation算法。所获得的p239颗粒样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图7D。结果显示，p239颗粒在溶液中为组分单一的、水化分子动力学半径为13.5nm的颗粒。

实施例4：p239蛋白的颗粒组装机制的研究

圆二色光谱(CD)分析

根据之前描述的HEV病毒样颗粒的晶体结构(Yamashita T等.Proc Natl Acad Sci USA(2009)106：12986-12991；Guu TS等.ProcNatl Acad Sci USA(2009)106：12992-12997)(参见图8)，p239蛋白在由二聚体进一步组装成为颗粒时，α-螺旋在二十面体对称结构的三倍轴方向上发生相互作用(图8A)，且β-折叠上Tyr残基的苯环侧链对α-螺旋的取向有稳定作用(图8B)。比较p239蛋白组装前后的圆二色光谱(参见图3A和3B)发现：在远紫外CD光谱中，未组装的p239蛋白与经组装的p239颗粒在190nm附近振幅差别较大，这可能是由于组装发生在α-螺旋附近所致；在近紫外CD光谱中，未组装的p239蛋白与经组装的p239颗粒差别较小，并且主要的差别发生在275nm附近(见图3B)，这可能与Tyr的疏水环境变化相关。

HEV ORF2aa368-aa395区域中的疏水氨基酸的突变对p239蛋白的颗粒组装的影响

p239蛋白与E2蛋白在颗粒组装方面的显著差异表明，HEV ORF2aa368-aa395对于HEV VLP的组装十分重要。为此，发明人进一步分析了HEV ORF2 aa368-aa395区域的氨基酸残基(即，p239蛋白的N端序列)的自然突变保守性(参见表2)。结果显示，该区域中的多个疏水氨基酸残基(Ile或Leu)(在表2中用粗体表示)高度保守。

表2.p239蛋白N端结构域(HEV ORF2 aa368-395)氨基酸残基的自然突变率

进一步的研究发现，HEV衣壳蛋白的第372、375和395位亮氨酸残基(Leu³⁷²、Leu³⁷⁵和Leu³⁹⁵)对于维持p239蛋白N端结构域的疏水区具有重要作用(p239蛋白N端结构域的结构如图9所示，该结构可参见Yamashita等，Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106：12986-12991。

使用本领域已知的点突变方法，将p239蛋白N端结构域中的Leu³⁷²、Leu³⁷⁵和Leu³⁹⁵分别突变为亲水性氨基酸残基Glu(以破坏其疏水性)，获得p239蛋白的3个点突变蛋白，L372E、L375E和L395E。对这3个点突变蛋白进行SDS-PAGE分析，并使用戊肝恢复期患者血清(由厦门血站惠赠)通过Western印迹分析来检测它们的免疫反应性。结果显示，与p239蛋白相反，这3个点突变蛋白都不能形成二聚体，并且失去了与戊肝恢复期患者血清的反应性(参见图10A)。进一步，通过分子筛层析分析来检测这3个点突变蛋白的颗粒组装能力。结果显示，与p239蛋白相反，这3个点突变蛋白都不能组装成为颗粒(参见图10B)。

上述的结果表明，p239蛋白主要通过疏水相互作用组装成VLP，疏水相互作用对于p239蛋白的颗粒组装十分重要。进一步，结合实施例2和3的结果可知，盐离子(例如硫酸铵，氯化铵等)的添加可提高p239蛋白的疏水相互作用，促进p239蛋白的颗粒组装，从而使得p239蛋白在变性剂(例如尿素)存在的情况下能够组装成病毒样颗粒。

本发明已通过上述实验阐明了HEV VLP的组装机制，并提供了新的将HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法，该方法可应用于戊型肝炎疫苗的制备过程，促进大规模工业化生产。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.制备戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括步骤：在变性剂存在的条件下，通过添加盐使HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP，其中所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段具有组装成VLP的能力，

所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合，优选尿素；

所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，优选(NH₄)₂SO₄；优选地，所述盐的离子强度为至少0.9mol/kg，例如至少0.3M的(NH₄)₂SO₄；

所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段例如可以是以包含体形式表达于大肠杆菌中的HEV衣壳蛋白或其变体或片段；

所述HEV衣壳蛋白的变体或片段例如可以是p239蛋白，优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.制备戊型肝炎病毒(HEV)的病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括如下步骤：

1)提供具有组装成VLP的能力的HEV衣壳蛋白或其变体或片段；

其中，

在步骤1)中，例如通过将其以包含体形式表达于大肠杆菌中来提供所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段；

例如，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段可以是p239蛋白，优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

在步骤2)中，所述变性剂例如可以是尿素、脲、盐酸胍或其组合，优选尿素；

在步骤3)中，所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，优选(NH₄)₂SO₄；优选地，所述盐的离子强度为至少0.9mol/kg，例如至少0.3M的(NH₄)₂SO₄；

3.控制HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的组装速度的方法，其包括步骤：控制包含HEV衣壳蛋白或其变体或片段的溶液的盐浓度和/或控制所述溶液的温度，其中所述HEV衣壳蛋白或其变体或片段具有组装成VLP的能力，

所述HEV衣壳蛋白的变体或片段例如可以是p239蛋白，优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述溶液包含或不包含变性剂；

所述盐例如可以是NaCl、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄或其组合，优选(NH₄)₂SO₄；

其中，当所述溶液的盐浓度升高和/或所述溶液的温度升高时，所述组装速度加快。

4.盐用于促进具有组装成VLP的能力的HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的用途，其中，

所述盐可以在变性剂存在或不存在的条件下用于促进VLP的组装；

所述变性剂例如尿素、脲、盐酸胍或其组合，优选尿素。

5.破坏HEV衣壳蛋白或其变体或片段的颗粒组装能力的方法，其包括将HEV衣壳蛋白或其变体或片段中的位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的疏水氨基酸突变为亲水氨基酸，

例如，所述HEV衣壳蛋白的变体或片段可以是p239蛋白；优选地，所述p239蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

例如，所述位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的疏水氨基酸可以是HEV ORF2的第372、375或395位亮氨酸；例如，所述亮氨酸可以被突变为谷氨酸。

6.促进HEV衣壳蛋白或其变体或片段组装成VLP的方法，其包括将HEV衣壳蛋白或其变体或片段中的位于与HEV ORF2 aa368-395对应的区域中的亲水氨基酸突变为疏水氨基酸。

7.制备用于预防和/或治疗戊型肝炎的疫苗的方法，其包括：

1)根据权利要求1或2的方法来制备HEV病毒样颗粒；