CN104212818B - 一种优化的人乳头瘤病毒31型l1蛋白的基因序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地,本发明涉及一种终止密码子为TAG的编码人乳头瘤病毒31型L1蛋白的基因序列,其编码的蛋白和制备方法,以及包含其编码的蛋白的病毒样颗粒,所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV(特别是HPV31)感染及由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途,所述药物组合物或疫苗用于预防HPV(特别是HPV31)感染及由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。

Description

一种优化的人乳头瘤病毒31型L1蛋白的基因序列
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地,本发明涉及一种终止密码子为TAG的编码人乳头瘤病毒31型L1蛋白的基因序列,其编码的蛋白和制备方法,以及包含其编码的蛋白的病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP),所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV(特别是HPV31)感染及由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途,所述药物组合物或疫苗用于预防HPV(特别是HPV31)感染及由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种无包膜DNA病毒。其病毒颗粒直径为45~55nm,病毒衣壳呈20面体对称,有72个壳微粒,由病毒的主要衣壳蛋白L1及次要衣壳蛋白L2组成。
目前已知的HPV约有90多种亚型,在人群中主要引起皮肤,粘膜的各类良性及恶性病变。HPV分子流行病学调查证实,高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中,HPV DNA检出率高达80%以上。宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤,其发病率仅次于乳腺癌,严重威胁着女性的健康。据统计,每年世界范围内约有490,000例的新发病例,约有270,000人死于该疾病(Boyle,P.,and J.Ferlay.Ann Oncol2005,16:481-8)。在所有宫颈癌病例中,发生于发展中国家的占了约83%,在这些国家中,宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15%。撒哈拉以南地区,中南亚,拉丁美洲,东亚 均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫颈癌高发区。在陕西略阳县,已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。
有关世界范围内宫颈癌标本中HPV型别分布的荟萃分析发现,宫颈癌中最常见的15种HPV高危型别中,HPV31在HPV16、HPV18、HPV58、HPV33、HPV45之后,位于第6位;而且在宫颈癌高发的非洲南部和中美洲地区,HPV31甚至位居引起宫颈癌的HPV型别的第三位(Clifford GM,Smith JS,Plummer M,et a1.Br J Cancer,2003,88(1):63-73)。这说明HPV31在世界范围内的妇女宫颈癌患者中的感染率较高,是普遍易感染的HPV型别之一。
目前已上市的HPV疫苗为Merck的及GSK的 ,上述两种疫苗分别含有HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP,但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍易感的HPV31型别VLP,也无法提供针对HPV31型别的感染与致病提供保护。
因此,针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安全有效的HPV疫苗,特别是针对HPV16,18及31等高危型别的疫苗,是有效预防宫颈癌,改善广大妇女(特别是我国及亚洲妇女)健康状况的有效途径。
HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白,分子量为55-60kDa,是HPV疫苗主要候选免疫抗原。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构,由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位,具有较强的免疫原性,可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体(Kirnbauer,R.,F.Booy,et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A89(24):12180-4)。并且,病毒样颗粒不带有病毒核酸,无潜在致癌危险,具有良好的安全性。因此,VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。
HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备高纯度的VLP样品。目前较为常用的VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表达 系统。
常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少,能自发形成VLP,往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP,为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低,培养成本高,给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市的HPV疫苗采用了酿酒酵母表达系统,其表达量低,生产成本高,因此该产品价位偏高,影响其广泛应用。
在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如已报道利用大肠杆菌表达HPV16L1蛋白(Banks,L.,G.Matlashewski,et al.(1987).J GenVirol68(Pt12):3081-9)。但是大肠杆菌表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象,不能产生针对HPV的保护抗体。或者尽管上述蛋白通过包含体纯化,复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall,S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol Methods53(1):75-90),但是在复性过程中蛋白损失量大,得率低,因此,难以在大规模生产上应用。虽然HPV L1蛋白也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达,溶解于菌体的裂解上清中,但是其表达量较低,而且上清中杂蛋白种类多且量大,要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量,而且有助目的蛋白的纯化(Li,M.,T.P.Cripe,et al.(1997).J Virol71(4):2988-95),但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶,依然无法应用于大规模生产。
因此,本领域仍然需要能够低成本获得且能够诱导针对HPV31的保护性抗体的HPV31L1蛋白及由其组成的病毒样颗粒,从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。
此外,细胞内的蛋白质合成研究发现,新生蛋白肽链的翻译完成与释放主要由两类肽链释放因子(polypeptide release factor,RF)来完成。其中,第一类释放因子为密码子特异性因子,第二类释放因子为密 码子非特异性的因子,是一种依赖于第一类肽链释放因子和核糖体的GTP酶,促进第一类释放因子的生物学活性.这两类因子协同作用,共同完成蛋白质合成的终止反应(朱玉贤,李毅著.现代分子生物学,第2版.北京:高等教育出版社.,2002,119-129)。其中,第一类RFs的作用更为关键,识别终止信号、促进肽酰-tRNA酯键的水解,阻止蛋白质翻译过程中的错误通读,最终释放出正确的蛋白质。原核生物中的第一类RFs是RF1/RF2,RF1识别UAG/UAA,RF2识别UGA/UAA。真核生物中是eRFl,能识别3个终止密码子。虽然在原核生物中,UAA能被RF1和RF2识别,而UAG和UGA仅被其中一种RF识别,但其终止效率却有不同,与终止密码子前的序列等一系列因素相关(Wang Y H,Zhang CT,Dong PX.Biopolymers,2002,63:207-216)。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现:利用大肠杆菌表达系统能大量表达终止密码子为TAG的HPV31L1基因,获得可以诱导针对HPV31的中和抗体的HPV31L1蛋白,与其它两种终止密码子(TGA和TAA)的基因相比,该基因能大幅提高翻译终止的效率,避免了错误终止的HPV31L1蛋白的产生,减少了纯化工艺的难度,使原液中蛋白纯度从85%提高到95%或更高,并且纯化后的所述蛋白经进一步组装处理可得到可诱导针对HPV31的保护性抗体的病毒样颗粒,组装效率也达到95%以上,高出其余2种终止密码子编码蛋白约10%。
因此,在一个方面,本发明涉及一种终止密码子为TAG的编码HPV31L1蛋白的基因,其与编码野生型HPV31L1蛋白的基因相比,终止密码子为TAG而不是TAA或TGA。
在另一个方面,本发明涉及终止密码子为TAG的编码HPV31L1蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的,包括但不限于 克隆载体和表达载体。在一个实施方案中,载体是例如质粒,粘粒,噬菌体,柯斯质粒等等。
在另一个方面,本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞,植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系,例如293T细胞。
在另一个方面,本发明涉及一种HPV31L1病毒样颗粒,其中该病毒样颗粒含有本发明的核酸序列所编码HPV31L1蛋白或其变体,或者由本发明的编码HPV31L1蛋白或其变体组成或形成。
在另一个方面,本发明还涉及包含上述HPV31L1蛋白或其变体,或上述多核苷酸或载体或宿主细胞或HPV31病毒样颗粒的组合物。在一个优选的实施方案中,所述组合物包含本发明的编码蛋白或其变体。在另一个优选的实施方案中,所述组合物包含本发明的HPV31病毒样颗粒。
在另一个方面,本发明还涉及一种药物组合物或疫苗,其包含本发明的HPV31病毒样颗粒,任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV(特别是HPV31)感染或由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。
在一个优选的实施方案中,所述HPV31病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在。在另一个优选的实施方案中,本发明的药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒:HPV6L1蛋白病毒样颗粒,HPV11L1蛋白病毒样颗粒,HPV16L1蛋白病毒样颗粒,HPV18L1蛋白病毒样颗粒,HPV45L1蛋白病毒样颗粒,HPV33L1蛋白病毒样颗粒,HPV52L1蛋白病毒样颗粒,HPV58L1蛋白病毒样颗粒;优选地,这些病毒样颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用,例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中,特别优选的施用方式是注射。
在一个优选的实施方案中,本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明,每单位剂量中包含的HPV31病毒样颗粒的量为5μg-80μg,优选20μg-40μg。
在另一个方面,本发明涉及一种获得本发明基因序列所编码的HPV31L1蛋白的方法,其包括利用大肠杆菌表达系统表达本发明基因序列所编码的HPV31L1蛋白,然后将含有该蛋白的裂解上清进行纯化处理。
在一个优选实施方案中,获得本发明所编码的HPV31L1蛋白的方法包括
a)在大肠杆菌中表达所述HPV31L1蛋白,
b)将表达所述HPV31L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎,分离得到上清液,
c)用水或低盐溶液将b)获得的上清液的盐浓度降至100mM或以下,最低至0,并收集沉淀,
d)将c)获得的沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解,同时加入还原剂,分离得到溶液,该溶液中含纯度至少50%的HPV31L1蛋白。
更一般性地,本发明还涉及一种获得HPV L1蛋白例如本发明的HPV31L1蛋白的方法,其包括
a)在大肠杆菌中表达编码HPV L1蛋白的HPV L1基因,
b)将表达HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的 溶液中破碎,分离得到上清液,
c)用水或低盐溶液将b)获得的上清液的盐浓度降至100mM或以下,最低至0,收集沉淀,
d)将c)获得的沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解,同时加入还原剂,分离得到溶液,该溶液中含纯度至少50%的HPV L1蛋白。
本发明还涉及一种获得本发明的HPV31病毒样颗粒的方法,其在获得本发明获得的HPV31L1蛋白的基础上,包括步骤:
e)将纯度至少50%的上述HPV31L1蛋白进一步通过色谱层析纯化,
f)将步骤e)中得到的HPV31L1蛋白去除还原剂。
本发明还涉及一种制备疫苗的方法,其包括将本发明的HPV31病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合,任选地还混合一种或多种选自HPV6,11,16,18,45,33,52和58的HPV型别的病毒样颗粒。如上所论述的,所获得的疫苗可以用于预防HPV(特别是HPV31)感染或由HPV(特别是HPV31)感染所导致的疾病例如宫颈癌等。
在另一个方面,本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法,其包括将预防有效量的根据本发明的HPV31病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中,所述HPV感染是HPV31感染。在另一个优选的实施方案中,所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于,宫颈癌。在另一个优选的实施方案中,所述受试者是哺乳动物,例如人。
在另一个方面,还涉及根据本发明所编码的HPV31L1蛋白或HPV31病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途,所述药物组合 物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中,所述HPV感染是HPV31感染。在另一个优选的实施方案中,所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于,宫颈癌。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明,术语“变体”是指这样的蛋白,其氨基酸序列与本发明编码的HPV31L1蛋白(如SEQ ID NO:4所示的蛋白)的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸不同或者具有至少60%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%的同一性,并且其保留了所述蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以是如下特性中的一个或者多个:能够诱导针对HPV31的中和抗体;能够在大肠杆菌中可溶性地表达;利用本发明所涉及的表达纯化方法能够获得高产率的纯化蛋白。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来,以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。
根据本发明,术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统,其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株,例如但不限于:ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
根据本发明,术语“载体(vector)”是指,可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导 入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌体;柯斯质粒等等。
根据本发明,术语“HPV31L1蛋白”是指在野生型HPV31L1蛋白,其例子包括但不限于NCBI数据库中P17388.1,AEI61965.1,AEI61021.1,AEI61005.1,AEI61949.1,AEI61894.1,AEI61077.1,AEI61013.1,AEI61989.1,AEI61957.1,AEI61053.1,AEI61093.1,AEI61069.1,AEI61981.1或等全长L1蛋白。
术语“终止密码子为XXX的HPV31L1蛋白基因片段”是指终止密码子为XXX(可以是TAA,TAG或TGA的任意一种)的编码野生型HPV31L1的基因序列,其中野生型HPV31L1蛋白基因的序列例如但不限于NCBI数据库中如下序列:J04353.1,HQ537671.1,HQ537678.1,HQ537676.1,HQ537669.1,U37410.1,HQ537685.1,HQ537677.1,HQ537674.1,HQ537670.1,HQ537682.1,HQ537687.1,HQ537684.1,HQ537673.1等。本发明提供了编码人乳头瘤病毒31型L1蛋白的分离的核酸,其特征在于,终止密码子为TAG;优选地,所述核酸的核苷酸序列针对在大肠杆菌中的表达进行了优化;更优选地,所述核酸的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明,术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂,其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995),并且包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80;佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝),弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂);离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明,术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例 如,预防疾病(例如HPV感染)有效量是指,能够有效预防,阻止,或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。
根据本发明,术语“色谱层析”包括但不限于:离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明,本发明的以TAG为终止密码子的HPV31L1序列编码的HPV31L1蛋白优选通过如下步骤获得:将表达HPV31L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100-600mM,优选200-500mM的缓冲液中进行破碎,离心破碎溶液,得到上清液;用水或低盐浓度(通常低于破碎用的盐浓度)的溶液降低所得上清液的盐浓度至盐浓度100mM-0mM,从而HPV31L1蛋白在上清液中沉淀;将沉淀在含还原剂及盐浓度为150-2500mM,优选200mM以上的溶液中重新溶解,从而分离得到含HPV31L1蛋白的溶液,其中所述蛋白的纯度为至少50%,优选至少70%,更优选至少80%。
可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的,包括但不限于,Tris缓冲液,磷酸盐缓冲液,HEPES缓冲液,MOPS缓冲液等等。
根据本发明,宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现,包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。
可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐,碱式盐,中性盐,例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐,特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种。特别优选的盐是NaCl。可用于本发明的方法中的还原剂包括但不限于DTT,2-巯基乙醇,其用量包括但不限于10mM-100mM。
根据本发明的HPV31病毒样颗粒可通过如下步骤获得:将上述纯度至少50%的HPV31L1蛋白通过例如色谱层析进行进一步分离, 得到经纯化的HPV31L1蛋白溶液;去除该溶液中的还原剂,得到所述HPV31病毒样颗粒。去除还原剂的方式是本领域已知的,包括但不限于,透析,超滤或者层析等。
发明的有益效果
目前用于制备HPV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。
在真核表达系统中表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少,能自发形成VLP,往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低,培养成本高等缺陷,给大规模工业化生产带来了极大困难。
在原核表达系统中,大肠杆菌表达系统具有培养成本低,表达量大的优点。然而,在大肠杆菌中表达的HPV L1蛋白往往失去正确的天然构象,以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中的蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难和效率低下使得从包含体中获得有正确构象的VLP难以在大规模生产中实施,只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPV L1也可以以正确构象可溶性地表达于大肠杆菌中,但是其表达量低下。并且,从包含种类繁多的可溶性蛋白的大肠杆菌裂解上清中纯化出HPV L1蛋白也相当困难,往往需要借助融合表达及亲和层析等手段,而这些手段又往往需要昂贵的酶,因此,仍然无法实现工业化生产。
本发明提供的以TAG为终止密码子的HPV31L1序列,及其编码的HPV31L1蛋白以及蛋白的制备方法有效地解决了上述问题。首先,本发明使用TAG为终止密码子的HPV31L1序列进行表达,与终止密码子为TAA或TGA的序列相比,大幅提高翻译终止的效率,避免了错误终止的HPV31L1蛋白的产生,减少了纯化工艺的难度,使原 液中蛋白纯度从85%提高到95%,组装病毒样颗粒的效率从90%提高到98%。其次,使用大肠杆菌表达系统来表达HPV31L1蛋白,确保了其高表达量。再次,本发明采用温和的手段选择性沉淀大肠杆菌裂解上清中的蛋白,然后采用含盐缓冲液重新溶解蛋白,从而在保持蛋白的正确构象的前提下使蛋白纯度有了显著提高,并且获得的蛋白溶液可以直接通过色谱层析例如离子交换层析及疏水交换层析进行进一步纯化,获得高纯度的目的蛋白(例如纯度达到95%)。进一步,所获得的高纯度蛋白可以组装为病毒样颗粒,并且该病毒样颗粒可以在体内诱导高滴度的针对HPV31的中和抗体,具有良好的免疫原性,是一种良好的疫苗形式,可用于预防HPV31对人体的感染。由此可见,本发明具有以下优点:本发明的蛋白可在大肠杆菌表达系统中实现大量正确表达;本发明所采用的制备方法无需使用昂贵的酶,成本低廉;HPV31L1蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程,损失小,产率高;HPV31L1蛋白所形成的病毒样颗粒能够诱导高滴度的针对HPV的保护性抗体,可用于生产疫苗。因此,本发明所编码的HPV31蛋白和其制备方法可应用于大规模工业化生产,并且使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了在实施例2的不同步骤中获得的HPV31Ctag-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1:破菌上清(即,破碎菌 体后离心获得的上清);泳道2:SPSepharose4Fast Flow柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道3:Butyl Sepharose4Fast Flow柱300mmol/LNaCl洗脱级分;泳道4:CHTII柱1000mmol/LNaCl洗脱级分。结果显示,HPV31Ctag-L1蛋白在通过3步的层析步骤之后,纯度从之前的约10%提高到了约95%(参见泳道1和4)。
图2显示了实施例2的不同步骤中获得的HPV31Ctag-L1蛋白,HPV31Ctaa-L1蛋白和HPV31Ctga-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M:蛋白分子量标记;泳道1:HPV31Ctaa-L1蛋白破菌上清;泳道2:HPV31Ctaa-L1SP Sepharose4Fast Flow柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道3:HPV31Ctaa-L1CHTII柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道4:HPV31Ctga-L1蛋白破菌上清;泳道5:HPV31Ctga-L1SP Sepharose4Fast Flow柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道6:HPV31Ctga-L1CHTII柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道7:HPV31Ctag-L1蛋白破菌上清;泳道8:HPV31Ctag-L1SP Sepharose4Fast Flow柱1000mmol/LNaCl洗脱级分;泳道9:HPV31Ctag-L1CHTII柱1000mmol/LNaCl洗脱级分。结果显示,HPV31Ctag-L1蛋白在通过3步的层析步骤之后,纯度从之前的约10%提高到了约95%,而HPV31Ctaa-L1和HPV31Ctga-L1蛋白经同样的步骤纯化后,纯度只能提高到85%。在约55kD的目的条带上方,有一条60kD的杂蛋白条带影响了蛋白的纯度,约占总蛋白量的10%。
图3显示了实施例2中所得的纯化后的HPV31Ctaa-L1蛋白的电泳和使用HPV31L1特异单抗免疫印迹的结果。M:蛋白分子量标记;泳道1:HPV31Ctaa-L1蛋白的SDS-PAGE分析结果;泳道2:HPV31Ctaa-L1蛋白使用HPV31L1特异单抗8G6免疫印迹的结果;泳道3:HPV31Ctaa-L1蛋白使用HPV31L1特异单抗11D2免疫印迹的结果。结果显示,约55kD的目的条带和60kD的杂蛋白条带均能和HPV31L1特异单抗反应。
图4显示了实施例2中所得的纯化后的HPV31Ctaa-L1蛋白中的 60kD的杂蛋白条带通过质谱方法鉴定的搜索结果。结果显示,该蛋白很大可能性为HPV31L1蛋白,匹配分子达到了81分(超过60分为可信)。
图5显示了实施例2中所得的纯化后的HPV31Ctga-L1蛋白中的60kD的杂蛋白条带通过质谱方法鉴定的搜索结果。结果显示,该蛋白很大可能性为HPV31L1蛋白,匹配分子达到了253分(超过60分为可信)。
图6显示了实施例4中所得的HPV31Ctag-L1病毒样颗粒的透射电镜观察(放大100,000倍,Bar=0.1μm)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒,颗粒大小与理论大小相符,且均匀一致。
图7显示了实施例4中所得的HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒的透射电镜观察(放大100,000倍,Bar=0.1μm)结果。视野中可见部分半径为25nm左右的病毒样颗粒,但病毒样颗粒形状较不规则,而且周围存在大量未组装的蛋白。
图8显示了实施例4中所得的HPV31Ctga-L1病毒样颗粒的透射电镜观察(放大100,000倍,Bar=0.1μm)结果。视野中可见部分半径为25nm左右的病毒样颗粒,但病毒样颗粒形状较不规则,而且周围存在大量未组装的蛋白。
图9显示了实施例4中所得的HPV31Ctag-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示,HPV31Ctag-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为28.49nm,颗粒组装百分比为98.5%。
图10显示了实施例4中所得的HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示,HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为55.81nm,颗粒组装百分比为82.9%,同时还存在2.26nm的组分,约占10%。
图11显示了实施例4中所得的HPV31Ctga-L1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示,HPV31Ctga-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为52.20nm,颗粒组装百分比为91.3%,同时还存在10nm与1000nm左右的组分,二者约共占10%。
图12显示了实施例4中所得的不同终止密码子基因编码的HPV31L1病毒样颗粒的分子筛层析检测的结果。结果显示,HPV31Ctag-L1,HPV31Ctaa-L1和HPV31Ctga-L1三种病毒样颗粒的主峰保留时间都为13min左右,其中,HPV31Ctag-L1病毒样颗粒峰型最为对称,无其他组分;HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒在18min左右有1杂质峰,可能是未组装成病毒样颗粒的组分,约占10%;而HPV31Ctga-L1病毒样颗粒也在18min左右有1杂质峰,同时主峰前约11min左右还有一个肩峰,主峰所占比例在85%左右。
图13显示了实施例6中用含有HPV31Ctag-L1病毒样颗粒接种小鼠后不同时间段的血清的中和抗体滴度。在初次免疫2周后,中和抗体滴度即有明显上升;在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到105ED50的较高水平,并在6-11周的5周时间内未见显著下降。
图14显示了实施例6中用含有HPV31Ctag-L1病毒样颗粒接种兔后不同阶段血清的中和抗体滴度。在初次免疫1周后,中和抗体滴度即有明显上升;在经过一次加强免疫后,中和抗体的滴度即能达到106的较高水平,并且在8-15周的7周时间内未见显著下降。
图15使用Mega4.0软件对现有NCBI核酸数据库中的32条HPV31L1的3’端的基因序列进行比对分析结果。结果显示,野生型HPV31L1基因序列及已有的人工合成的HPV31L1的基因序列均以TAA作为终止密码子。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来 描述本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法,基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南,第3版,John Wiley & Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓,实施例以举例方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.不同终止密码子的编码HPV31L1基因的表达质粒的构建
用做模板的全长HPV31L1基因片段的制备
用做模板的全长HPV31L1基因片段根据由上海博亚公司合成。所合成的基因依据NCBI GenBank数据库中序列号为J04353.1的HPV31L1的编码序列,依照大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化,片段全长为1515bp,终止密码子为TAA(在本说明书中为SEQ ID NO.2)。在此人工合成的全长HPV31L1基因片段按HPV31的基础上,制备编码本发明的编码HPV31L1的多核苷酸序列。
不同终止密码子的编码HPV31L1基因的非融合表达载体的构建
以前一个步骤获得的以TAA为终止密码子的HPV31L1全长基因片段为模板,以HPV31NF:5’-CATATgAgCCTgTggAggCCCAg-3’(SEQ ID NO:5)为正向引物(其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CATATG,ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子);以HPV31CtagR:5'-gTCgACCTACTTCTTggTCTTCTTC-3'(SEQ ID NO:6)为反向引物(其5'端引入限制性内切酶SalI位点),在PCR热循环仪 (Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。
扩增得到1.5kb左右的大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD18-T载体(TAKARA公司生产)连接,转入大肠杆菌;提取质粒,经NdeI/SalI酶切鉴定,得到插入以TAG为终止密码子的HPV31基因的阳性克隆pMD18-T-HPV31Ctag-L1(目的基因序列为SEQ IDNO.1)。使用同样的方法,分别使用HPV31NF:5’- CATATgAgCCTgTggAggCCCAg-3’为正向引物,以HPV31CtaaR:5’-gTCgACTTACTTCTTggTCTTCTTC-3’(SEQ ID NO:7)为反向引物制备以TAA为终止密码子的HPV31基因的阳性克隆pMD18-T-HPV31Ctaa-L1(目的基因序列为SEQ IDNO.2),以及使用HPV31NF:5’-CATATgAgCCTgTggAggCCCAg-3’为正向引物,以HPV31CtgaR:5’-gTCgACTCACTTCTTggTCTTCTTC-3’(SEQ ID NO:8)为反向引物制备以TGA为终止密码子的HPV31基因的阳性克隆pMD18-T-HPV31Ctga-L1(目的基因序列为SEQ ID NO.3)。
利用M13(+)/(-)引物,分别测得pMD18-T-HPV31Ctag-L1质粒,pMD18-T-HPV31Ctaa-L1质粒和pMD18-T-HPV31Ctga-L1质粒中插入的目的片段的核苷酸序列如SEQID NO:1-3所示,其编码的氨基酸序列均为全长HPV31L1蛋白,如SEQ ID NO:4所示,但为了区 别不同终止密码子的基因对应的翻译产物,将其分别命名为HPV31Ctag-L1,HPV31Ctaa-L1和HPV31Ctga-L1。
将上述的pMD18-T-HPV31Ctag-L1质粒,pMD18-T-HPV31Ctaa-L1质粒和pMD18-T-HPV31Ctga-L1质粒分别进行NdeI/SalI酶切,获得HPV31Ctag-L1,HPV31Ctaa-L1和HPV31Ctga-L1基因片段。再将该片段分别与经NdeI/SalI酶切的非融合表达载体pTO-T7(罗文新等,生物工程学报,2000,16:53-57)相连接,转入ER2566细菌;提取质粒,经NdeI/SalI酶切鉴定得到插入目的片段的阳性表达克隆pTO-T7-HPV31Ctag-L1,pTO-T7-HPV31Ctaa-L1和pTO-T7-HPV31Ctga-L1。
分别取1μL的pTO-T7-HPV31Ctag-L1,pTO-T7-HPV31Ctaa-L1和pTO-T7-HPV31Ctga-L1(0.15mg/ml)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司),将其涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL,下同)的固体LB培养基(LB培养基成分:10g/L蛋白胨,5g/L酵母粉,10g/L氯化钠,下同),并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。分别挑取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管,在37℃220转/分钟下振荡培养10小时,从中取1mL菌液于-70℃保存。
实施例2.不同终止密码子的基因编码的HPV31L1蛋白的表达与纯化
本文以HPV31Ctag-L1为例描述HPV31L1蛋白的表达与纯化。
HPV31Ctag-L1蛋白的大量表达
从-70℃中取出携带重组质粒pTO-T7-HPV31Ctag-L1的大肠杆菌菌液,接种入50ml含卡那霉素的LB液体培养基中,在200rpm,37℃下培养大约8小时;然后转接入10瓶500ml含卡那霉素的LB培养基 中(每瓶接入5ml菌液),在200rpm,37℃下培养过夜,作为种子液。
采用上海保兴生物公司生产的50L发酵罐进行大规模培养。校正发酵罐PH电极,将30L LB培养基装入发酵罐,原位121℃灭菌30min;校正溶氧电极,以灭菌后未通气前为零点,以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100%。
补料准备:配制30%的蛋白胨和酵母膏混合物(20g蛋白胨、10g酵母膏溶至100ml),50%的葡萄糖(50g溶至100ml),121℃灭菌20min。
次日将10瓶种子液共5L接入发酵罐中,设定温度37℃,pH值7.0,手动调节搅拌速度及通气量,维持溶氧在40%以上。
流加补料:将50%的葡萄糖和30%的蛋白胨和酵母膏混合物按溶质质量比2:1的比例混合。
流加速度如下:第一小时:5%;第二小时:10%;第三小时:20%;第四小时:40%;第五小时及以后60%(以25mL/min为100%)。
当细菌浓度达到OD600为10左右时,将培养温度降至25℃,加入4g IPTG诱导培养4小时。终浓度为大约60(OD600),下罐,离心收集菌体。获得表达了HPV31Ctag-L1蛋白的菌体,重约2.5kg。同样方法分别制备表达了HPV31Ctaa-L1蛋白的菌体和表达了HPV31Ctga-L1蛋白的菌体。
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液,pH7.2,300mM NaCl)的比例分别重悬菌体。采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar压力破碎菌体5次。以13500rpm(30000g)离心菌体破碎液15min,留取上清(即,破菌上清)。
HPV31Ctag-L1的阳离子交换色谱纯化
往含有HPV31Ctag-L1蛋白的菌体破碎上清中补加二硫苏糖醇(DTT),使其终浓度达到20mmol/L。使用Beckman J25高速离心 机以15000rpm(40000g)离心20min,收获上清。所获得的样品(即,重溶后上清)用于进行阳离子交换色谱纯化:
仪器系统:GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer100型制备型液相色谱系统。
层析介质:SP Sepharose4Fast Flow(GE Healthcare公司)。
柱体积:5.5cm×20cm。
缓冲液:20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT
20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT,2M NaCl。
流速:25mL/min
检测器波长:280nm。
样品为上述步骤中获得的经0.22μm孔径滤膜过滤的、纯度约为10%的HPV31Ctag-L1蛋白溶液。
洗脱程序为:500mM NaCl洗脱杂蛋白,1000mM NaCl洗脱目的蛋白,收集1000mMNaCl洗脱级分。
HPV31Ctag-L1的疏水交换纯化
仪器系统:GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer100型制备型液相色谱系统。
层析介质:Butyl Sepharose4Fast Flow(GE Healthcare公司)
柱体积:5.5cm×20cm
缓冲液:20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT
20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT,2M NaCl。
流速:20mL/min。
检测器波长:280nm。
样品为:前一步骤获得的1000mM NaCl洗脱级分。
洗脱程序为:300mM NaCl洗脱目的蛋白,收集300mM NaCl浓度时的洗脱级分。
HPV31Ctag-L1的CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)纯化
仪器系统:GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer100型制备型液相色谱系统。
层析介质:CHT-Ⅱ(购自Bio-RAD)
柱体积:5.5cm×20cm
缓冲液:20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT
20mM磷酸盐缓冲液pH8.0,20mM DTT,2M NaCl。
流速:20mL/min。
检测器波长:280nm。
样品为:前一步骤获得的300mM NaCl洗脱级分。
洗脱程序为:500mM NaCl洗脱杂蛋白,1000mM NaCl洗脱目的蛋白,收集1000mMNaCl浓度时的洗脱级分,从而获得纯化后的HPV31tag-L1蛋白。将各纯化步骤中获得的HPV31tag-L1蛋白样品进行SDS-PAGE分析,结果如图1所示,结果表明,HPV31Ctag-L1蛋白在通过3步的层析步骤之后,纯度从之前的约10%提高到了约95%(参见泳道1和4)。使用同样的方法,纯化获得HPV31taa-L1蛋白和HPV31tga-L1蛋白。将各纯化步骤中获得的HPV31tag-L1蛋白, HPV31taa-L1蛋白和HPV31tga-L1蛋白进行SDS-PAGE分析,结果如图2所示,结果表明,HPV31Ctag-L1蛋白在通过3步的层析步骤之后,纯度从之前的约10%提高到了约95%(图2泳道;而HPV31Ctaa-L1和HPV31Ctga-L1蛋白经同样的步骤纯化后,纯度只能提高到85%。在约55kD的目的条带上方,有一条60kD的杂蛋白条带影响了蛋白的纯度,约占总蛋白量的10%。见图2泳道1-3和4-6。
实施例3.HPV31taa-L1蛋白和HPV31tga-L1蛋白的鉴定与分析
HPV31Ctaa-L1的蛋白质免疫印迹检测
将纯化获得的HPV31taa-L1蛋白进行电泳,电泳结束后,使用HPV31L1特异抗体8G6以及11D2分别进行Western检测,结果见图3。结果显示,55kD的目的条带以及60kD的杂蛋白条带均能与HPV31L1特异抗体8G6以及11D2反应,证明该条带含有HPV31L1蛋白。
HPV31Ctaa-L1与HPV31Ctga-L1的60kD蛋白条带的质谱分析
将HPV31taa-L1蛋白与HPV31Ctga-L1蛋白分别进行电泳,电泳结束后,使用考马斯亮蓝染色,将55kD的目的条带上方的60kD的杂蛋白条带切下。蛋白胶块用40μL脱色液(30%ACN,50mmol/L醋酸铵,pH7.0)脱色两次,每次30min,并间断振荡3~5次,瞬时离心后弃上清。然后用乙醇—氯仿洗涤去除SDS和盐离子,加入40μLACN脱水3~4min,弃上清。用氮气吹干(约20min),再向干燥后的胶块中加入10μL胰蛋白酶工作液(50ng/μL),室温下预酶解1h,使胰蛋白酶完全渗入胶块中。然后加入40μL酶解缓冲液(0.5mmol/LCaCl2,50mmol/L醋酸铵,pH7.0),37℃水浴中振荡酶解16~20h。将酶解液于10000×g离心20s,收集上清液,胶块分别用40μL抽提液I(0.1%TFA)、抽提液II(30%ACN,0.1%TFA)和抽提液III(60%ACN,0.1%TFA)依次抽提,每种抽提液各抽提1次,抽提时于30℃水浴下振荡30min。每次抽提后将上清液10000×g 离心20s,收集上清液并以氮气吹干。将干燥好的肽段复溶在基质缓冲液中进行质谱分析。
使用的MALDI-TOF-TOF串联质谱仪(美国Waters公司)对消化的肽段分别进行检测。采用反射模式采集每个靶点的一级质谱信息(MS),激光强度为4000,扫描质量范围800~4000Da,一级质谱扫描完成后,选取10个信号强度最高的母离子进行二级质谱分析,加速电压2kV,采用碰撞裂解母离子,获取每个母离子的离子碎片指纹谱。将一级、二级质谱分析获取的数据导入GPS软件,采用Mascot算法综合分析,在NCBI蛋白质数据库中搜索与之匹配的蛋白质。搜索条件参数:酶解类型包括Trypsin和肽质量指纹谱误差,修饰类型包括磷酸化修饰和烷基化修饰;搜索结果以置信度>95%为鉴定成功标准。根据谱图和Mascot得分比较鉴定结果和肽段覆盖率。搜索得到的HPV31Ctaa-L1与HPV31Ctga-L1的60kD蛋白条带鉴定结果如图4和图5。结果表明,HPV31Ctaa-L1与HPV31Ctga-L1的60kD蛋白条带均含有HPV31L1蛋白。综合蛋白免疫印迹及质谱鉴定的结果,HPV31Ctaa-L1与HPV31Ctga-L1的60kD蛋白条带是由翻译时终止不完全而引入载体序列的蛋白。由此可见以TAG为终止密码子的HPV31L1序列进行表达,与终止密码子为TAA或TGA的序列相比,大幅提高翻译终止的效率,避免了错误终止的HPV31L1蛋白的产生,减少了纯化工艺的难度,使原液中蛋白纯度从85%提高到95%。
实施例4.不同终止密码子的基因编码的HPV31L1的病毒样颗粒的组装
仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE5切向流系统;膜包截留分子量为30kDa;样品为实施例2所得的HPV31tag-L1蛋白,HPV31taa-L1蛋白和HPV31tga-L1蛋白。
样品的复性:以复性缓冲液(50mM PB(磷酸钠缓冲液)pH6.0,2mM CaCl2,2mMMgCl2,0.5M NaCl,0.003%Tween-80)充分交换样品缓冲液,交换体积为样品原始体积的10倍以上。切向流装置的运 行压力为0.5psi,切向流速度为10mL/min。在复性缓冲液交换完后,用储存缓冲液(20mM PB(磷酸钠缓冲液)pH6.5,0.5M NaCl)进行交换,交换体积为样品体积4倍以上。切向流装置的运行压力为0.5psi,切向流速度为25mL/min。交换完毕后,使用PALL0.20μm滤器无菌过滤样品,得到HPV31tag-L1病毒样颗粒,HPV31taa-L1病毒样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒,将其置于4℃保存备用。
实施例5:不同终止密码子的基因编码的HPV31L1病毒样颗粒的形态学检测
不同终止密码子的基因编码的HPV31L1病毒样颗粒的透射电镜观察
使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜,放大倍数为100,000倍。将实施例4所得HPV31tag-L1病毒样颗粒,HPV31taa-L1病毒样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒用2%磷钨酸pH7.0负染,固定于喷炭的铜网上,进行观察。电镜结果见图6-图8。结果显示,其中HPV31tag-L1病毒样颗粒在电镜下可见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒,大小均匀,呈现为空心形态;而视野中可见部分半径为25nm左右的病毒样颗粒,但HPV31taa-L1病毒样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒在电镜下可见部分半径为25nm左右的病毒样颗粒,大小不均,病毒样颗粒形状也较不规则,而且周围存在大量未组装的蛋白。由此可见,HPV31tag-L1病毒样颗粒的形态与组装效率优于HPV31taa-L1病毒样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒。
不同终止密码子的基因编码的HPV31L1病毒样颗粒的动态光散射检测
使用的仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器),使用的算法为Regulation算法。样品为实施例4所得HPV31tag-L1病毒样颗粒,HPV31taa-L1病毒 样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图9-图11。结果表明,HPV31tag-L1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为28.49nm,组装百分比为98.5%;而HPV31taa-L1病毒样颗粒和HPV31tga-L1病毒样颗粒测得的水化分子动力学半径均在55nm左右,且存在较小或较大的杂质组分,杂质组分占到了10%。
不同终止密码子的基因编码的HPV31L1病毒样颗粒的分子筛层析分析
采用美国安捷伦公司的1120Compact LC高效液相色谱系统层析分析不同终止密码子的基因编码的HPV31L1病毒样颗粒,使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl7.8x300mm。以2倍柱体积的PBS预先平衡层析柱至280nm处的吸收值无明显的变化,将检测器的吸收值归零。由自动进样器进样并分析结果。结果如图12所示,结果表明,HPV31Ctag-L1病毒样颗粒峰型最为对称,无其他组分,说明其组分均一;HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒存在18min左右的未组装成病毒样颗粒的组分,约占10%;而HPV31Ctga-L1病毒样颗粒不但有小组分还有大组分。
综合实施例5的结果,可知HPV31Ctag-L1病毒样颗粒组装率高(高于95%),获得的病毒样颗粒均一,和野生型HPV31蛋白衣壳形态及大小都一致。而HPV31Ctaa-L1病毒样颗粒和HPV31Ctga-L1病毒样颗粒则组装率较低(小于90%),获得的病毒样颗粒也形态不均一。因此使用HPV31Ctag-L1的基因序列进行蛋白表达能使HPV31L1蛋白组装病毒样颗粒的效率从90%提高到98%。
实施例6.HPV31tag-L1蛋白免疫原性的测定
HPV31假病毒中和细胞模型的建立
由于HPV难以在体外进行培养,而且HPV宿主特异性强,难以在人以外的宿主上繁殖,缺乏合适的动物模型,因此,为了能对HPV 疫苗的免疫保护性进行快速评估,需要建立有效的体外中和实验模型。
假病毒(pseudovirions)体外感染模型:利用HPV VLP可非特异性包装核酸的特性,通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白,通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒,组成HPV假病毒(Yeager,M.D,Aste-Amezaga,M.et al(2000)Virology(278)570-7)。具体方法包括重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。本实施例示例性采用多质粒共转染方法。
HPV假病毒的构建方法如下:
用CsCl密度梯度离心方法分别纯化质粒p31L1h(携带编码HPV31L1蛋白(NCBI数据库,P17388.1)的核苷酸序列的pAAV载体)、质粒p31L2h(携带编码HPV31L2蛋白(NCBI数据库,P17389.1)的核苷酸序列的pAAV载体)及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP(pN31-EGFP和上述的pAAV载体均由NIH的John T.Schiller教授惠赠)。利用CsCl密度梯度离心来纯化质粒的方法是本领域公知的,参见《分子克隆:第三版》。
使用磷酸钙转染法,用纯化后的p31L1h、p31L2h、pN31-EGFP各40μg共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。磷酸钙转染法是本领域公知的,参见《分子克隆:第三版》。简言之,将p31L1h、p31L2h、pN31-EGFP各40μg加入1mL的HEPES溶液(每50mL去离子水含有pH=7.3的1M Hepes125μL,4℃储存)和1mL的0.5mol/L CaCl2溶液的混合溶液中,混匀,然后逐滴加入2mL2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g),0.05M HEPES(11.9g),1.5mMNa2HPO4(0.213g),溶解于1000mL去离子水,pH=6.96,-70℃储存)中,室温下静置1min;然后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中,培养6hr;然后弃去原培养液,加入10mL新鲜的完全培养液(Invitrogen公司)。转染48hr后,弃去培养基,用PBS清洗细胞2次;然后将细胞刮下收集细胞,进行细胞计数,并且每108个细胞用1mL裂解液(0.25%Brij58,9.5mM MgCl2)重悬。裂解后, 以5000g离心10min,收集上清,加入5M NaCl(终浓度为850mM),从而获得假病毒液,将其分装为小份后置于-20℃保存。
抗体中和滴度的测定
将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×104/孔)。5hr后如下进行中和实验:将待测的血清样品(含待测抗体)分别用10%DMEM进行连续倍比稀释,然后取50μL各个经稀释的样品分别与50μL稀释于10%DMEM中的如上制备的假病毒液混合(moi=0.1);在4℃下孵育1h后,将混合物分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中,并在37℃培养72h;然后先通过荧光观察确定各样品大概的抗体滴度,再用流式细胞仪(EPICS XL,美国Beckman Coulter公司)检测各孔细胞的感染率,计算血清的准确抗体滴度。感染率为待测细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区中的数量百分率。
感染抑制率=(1﹣加入血清的孔的感染率/未加入血清的孔的感染率)×100%。
半数有效量(50%effective dose,ED50),在此表示半数感染抑制率,即50%感染抑制率,在此作为抗体中和滴度的单位。
抗体中和滴度的定义为:达到高于50%感染抑制率(ED50)的最大稀释倍数,例如某血清抗体稀释5120倍后高于ED50,而10240倍则低于ED50,则其抗体中和滴度为5120ED50。经20倍稀释后仍能达到50%以上感染抑制率的抗体被视为具有中和能力,<20ED50则被认为不具有中和能力,记为10ED50
HPV31tag-L1病毒样颗粒用于免疫动物的免疫保护性的评价
使用小鼠评价了本发明的HPV31tag-L1病毒样颗粒的免疫保护 性。免疫用动物为4-5周龄SPF级BALB/c小鼠5只。根据实施例1-4所述方法制备HPV31tag-L1病毒样颗粒。将该颗粒稀释至0.1mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(用于初次免疫)或等体积的不完全弗氏佐剂(用于加强免疫),混合均匀。免疫程序为:0周时初次免疫;2,4和6周时加强。免疫方式为肌肉注射,初次免疫剂量为10μg/只,加强免疫剂量为10μg/只。
初次免疫后,每2周抽取外周静脉血,分离血清。然后根据上述方法检测小鼠血清中针对HPV31假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图13所示。结果表明,根据实施例1-4所述方法获得的HPV31tag-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性,可在小鼠体内诱导105以上滴度的针对HPV31的中和抗体,并可持续可用作预防HPV31感染的有效疫苗。除了使用弗氏佐剂外,该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂,例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。
还使用兔子评价了本发明的HPV31tag-L1病毒样颗粒的免疫保护性。免疫用动物为6~8周龄普通级雌性兔4只(购自广西省疾病预防与控制中心)。将实施例1-4所制备的HPV31tag-L1病毒样颗粒稀释至1.0mg/ml,然后加入等体积的完全弗氏佐剂(用于初次免疫)或等体积的不完全弗氏佐剂(用于加强免疫),混合均匀。免疫程序为:0周时初次免疫;4,8和12周时加强。免疫方式为肌肉注射,初次免疫剂量为1.0mg/只,加强免疫剂量为1.0mg/只。
初次免疫后,每2周抽取外周静脉血,分离血清。然后根据上述方法检测兔子血清中针对HPV31tag-L1病毒样颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图14所示。结果表明,根据实施例1-4所述方法获得的HPV31tag-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性,可在兔子体内诱导高滴度的针对HPV31的中和抗体,可用作预防HPV31感染的有效疫苗。除了使用弗氏佐剂外,该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂,例如氢氧化铝或磷酸铝佐剂。
以上结果表明,通过本发明的方法获得的HPV31tag-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性,可在动物体内诱导高滴度的中和抗体,从而可用作预防HPV感染的疫苗。
实施例7:编码HPV31L1蛋白的基因序列的终止密码子比对分析
使用Mega4.0软件对现有NCBI核酸数据库中的32条HPV31L1基因序列(Goldsborough,M.D.,DiSilvestre,D.,Temple,G.F.,et al.,Virology,1989.171(1):p.306-11.;Icenogle,J.P.,Clancy,K.A.,and Lin,S.Y.,Virology,1995.214(2):p.664-9.;Bousarghin,L.,Touze,A.,Sizaret,P.Y.,et al.,J Virol,2003.77(6):p.3846-50.Fleury,M.J.,Touze,A.,de Sanjose,S.,et al.,Clin Vaccine Immunol,2008.15(1):p.172-5.;Chen,Z.,Schiffman,M.,Herrero,R.,et al.,PLoS One,2011.6(5):p.e20183.;Dubin,G.,Innis,B.,Slaoui,M.M.and Wettendorff,M.A.Patent:WO2006114273-A502-NOV-2006;Jansen,K.U.,Schultz,L.D.,Neeper,M.P.and Markus,H.Z.Patent:KR1020057017936-A323-SEP-2005,JP2006523099-A112-OCT-2006;),其中包括25条野生型序列和7条人工序列,进行比对分析,其中各序列3’端的比对结果如图15所示。该结果表明,野生型HPV31L1基因序列及已有的人工合成的HPV31L1的基因序列均以TAA作为终止密码子,而以TAG作为终止密码子的序列尚无报道。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.编码人乳头瘤病毒31型L1蛋白的分离的核酸,其特征在于,所述分离的核酸以TAG为终止密码子,所述核酸的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.包含权利要求1的分离的核酸的载体。
3.包含权利要求2的载体的宿主细胞,其为大肠杆菌细胞。
4.一种组合物,其包含权利要求1的分离的核酸,或权利要求2的载体,或权利要求3的宿主细胞。
5.用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的疫苗,其包含权利要求1的分离的核酸,或权利要求2的载体,或权利要求3的宿主细胞,任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
6.制备HPV31L1蛋白的方法,所述方法包括步骤:
a)在大肠杆菌中表达编码HPV31L1蛋白的分离的核酸,所述编码HPV31L1蛋白的分离的核酸的序列如SEQ ID NO:1所示;
b)将表达HPV31L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎,分离得到上清液,加入还原剂DTT或2-巯基乙醇,其用量为10mM-100mM;
c)将获得的HPV31L1蛋白通过色谱层析进行纯化。
7.权利要求6的方法,其还包括步骤:
将制备的HPV31L1蛋白去除还原剂。
8.一种制备疫苗的方法,其包括:
a)在大肠杆菌中表达如SEQ ID NO:1所示的编码HPV31L1蛋白的分离的核酸;
b)将表达HPV31L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100mM-600mM的溶液中破碎,分离得到上清液,加入还原剂DTT或2-巯基乙醇,其用量为10mM-100mM;
c)将获得的HPV31L1蛋白通过色谱层析进行纯化;
d)将制备的HPV31L1蛋白去除还原剂;
e)将制备的HPV31L1蛋白形成病毒样颗粒并与药学可接受的载体和/或赋形剂混合,任选地还混合一种或多种选自HPV6,11,16,18,45,33,52和58的HPV型别的病毒样颗粒。
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