JP2008538922A - 蛍光多重ｈｐｖｐｃｒアッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、同一ＨＰＶ型の複数のＨＰＶ遺伝子を同時に検出するために複数の発蛍光団を使用する、サンプル内のＨＰＶ型の核酸配列の存在を検出するための蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。ここで、該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる。本発明はまた、本発明の方法において使用するための、該ＨＰＶ型に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに関する。

Description

本発明は、全般的には、臨床サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型の存在を検出するための、ＰＣＲに基づくアッセイに関する。より詳しくは、本発明は、単一のＰＣＲ反応チューブ内で複数のＨＰＶ遺伝子座を同時に検出するために複数の発蛍光団を使用する蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。
８０を超えるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型が特定されている。種々のＨＰＶ型が、良性増殖性疣贅から悪性癌に及ぶ多種多様な生物学的表現型を引き起こす（概説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、良性疣贅に最も一般的に関連している型であり、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、悪性病変に最も頻繁に関連している高リスク型である。したがって、臨床サンプルにおけるＨＰＶの特異的型の決定は、ＨＰＶ関連疾患の発生のリスクを予測するために決定的に重要である。
臨床サンプルにおける特異的ＨＰＶ型を特定し定量するために、核酸に基づくいくつかの方法、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるウイルス核酸の検出、サザンブロット分析、ハイブリッド捕捉（ｈｙｂｒｉｄ ｃａｐｔｕｒｅ）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が利用されている。Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）ＩＩ（Ｄｉｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）アッセイは抗体捕捉および非放射性シグナル検出を利用するものであるが、一定の組合せのＨＰＶ型のシグナル標的を検出するに過ぎない（例えば、Ｃｌａｖｅｌら，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０（９）：１３０６−１１（１９９９）を参照されたい）。また、Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）ＩＩアッセイはＲＮＡプローブの混合物（プローブ混合物は高リスクまたは低リスクＨＰＶ型に対して利用可能である）を使用するものであるため、サンプルにおいて検出された特異的ＨＰＶ型に関する情報を提供するものではなく、高リスクまたは低リスクＨＰＶの存在に関する陽性または陰性を示すに過ぎない。同様に、ＰＣＲに基づく多数の方法は、しばしば、単一の特異的ＨＰＶ標的配列の増幅、およびそれに続く、得られたアンプリコンの、膜へのブロッティング、および放射能標識オリゴヌクレオチドプローブでのプローブを含む。
他の方法は、サンプル中に存在する多数のＨＰＶ型をＰＣＲ増幅しうる商業的に入手可能なコンセンサスプライマーを使用することにより異なる型の特異的ＨＰＶ遺伝子間の高い相同性を利用する。ついで型特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用して特異的ＨＰＶ型の存在を特定する。例えば、Ｋｌｅｔｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７（８）：２５０８−２５１７（１９９９）；Ｇｒａｖｉｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８（１）：３５７−３６１（２０００）を参照されたい。同様に、縮重ＰＣＲプライマーを使用するアッセイはＨＰＶ型間の相同性を利用して、特異的プライマーセットを使用する方法より多数のＨＰＶ型の検出を可能にする。例えば、Ｈａｒｗｏｏｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７（１１）：３５４５−３５５５（１９９９）を参照されたい。そのようなアッセイは、特異的ＨＰＶ型を特定するための追加的な実験をも要する。
前記のＰＣＲ法はいくつかの問題を伴いうる。例えば、ＨＰＶ型間の反応効率における相違により、いくつかの型が他のものに対して不均衡に増幅されうる。また、増幅の平衡が、より高いコピー数でサンプル中に存在する型へと傾き、それらがＰＣＲ反応成分を消費して、少数派のＨＰＶ型の増幅を起こりにくくする。
５’エキソヌクレアーゼ発蛍光性ＰＣＲ利用アッセイ（Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲ）も当技術分野において記載されており、これはリアルタイムでのＰＣＲ産物の検出を可能にし、放射能の必要性をなくす。例えば、米国特許第５，５３８，８４８号；Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）を参照されたい。この方法は、蛍光レポーター（発蛍光団）と、ＰＣＲプライマー間の標的ＤＮＡにハイブリダイズする消光剤とを含む標識プローブを使用する。発蛍光団の励起は発蛍光団による蛍光シグナルの放出をもたらし、それは消光剤により消光される。アンプリコンはＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により検出されうる。該エキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲプライマーの伸長中に遭遇した二本鎖ＤＮＡを分解して、プローブから発蛍光団を遊離させる。その後、蛍光シグナルはもはや消光されず、標的ＤＮＡの量と正比例的に相関する蛍光シグナルの蓄積が自動蛍光光度計でリアルタイムに検出されうる。
Ｔａｑ−Ｍａｎ ＰＣＲアッセイはＨＰＶ型検出に応用されている。Ｓｗａｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５（４）：８８６−８９１（１９９７））は、Ｌ１遺伝子の一部を増幅する型特異的ＨＰＶプライマーを型特異的プローブと共に使用する発蛍光性プローブアッセイを開示している。このＳｗａｎらのアッセイは一定数のＰＣＲサイクルの終了時の蛍光シグナルを測定するものであり（終点測定）、リアルタイムのものではない。
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７（３）：４９０−９６（１９９９））は、種々の蛍光色素で標識された型特異的プローブと共に、Ｅ１遺伝子の高度に保存された部分を標的化するＴａｑ−Ｍａｎアッセイを報告している。特異的な縮重プライマーの混合物を使用することにより多数のＨＰＶ型が増幅された。Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎらは、種々のＨＰＶ型からのＥ１遺伝子の一部を検出するよう設計された、アッセイ当たり３個までの型特異的プローブを使用した。Ｓｗａｎらのアッセイとは異なり、Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎらは蛍光の蓄積をリアルタイムで測定した。
Ｔｕｃｋｅｒら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６（１）：３９−４７（２００１））は、Ｅ６／Ｅ７結合部にまたがる保存領域を標的化するアッセイを記載している。Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎのアッセイと同様に、Ｔｕｃｋｅｒらはリアルタイム検出および型特異的蛍光プローブを使用した。Ｔｕｃｋｅｒらはまた、ＨＰＶ標的配列とアクチンまたはグロビン細胞遺伝子座とを同一反応チューブにおいて同時に検出するために多重（マルチプレックス）ＰＣＲを使用した。
前記の方法は、典型的には、ＤＮＡサンプルにおける単一のウイルス遺伝子座、例えばＬ１遺伝子座の存在に関して試験することを含む。単一遺伝子座アッセイの欠点は、１つのＨＰＶ型からの特異的ＨＰＶ遺伝子と別のＨＰＶ型からの特異的ＨＰＶ遺伝子との間の高度の相同性が偽陽性結果の過剰な発生を招くことである。このような相同性レベルは、単一のＨＰＶ型に特異的なＰＣＲアッセイの設計を困難にする。したがって、単一のＨＰＶ型のいくつかの遺伝子座の存在に関して試験することにより陽性結果を確認することが必要である。陽性結果を実証するために必要な追加実験は面倒であり長時間を要する。４つの異なるＨＰＶ型に関する臨床サンプルのＨＰＶ状態の確認には、典型的には、２６〜３０人時を要する。
単一遺伝子座アッセイは偽陰性結果を招くこともある。ＨＰＶゲノムと染色体宿主ＤＮＡとの関係は多段階腫瘍発生過程中に変化しうることが十分に確認されている（総説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．８２：１５−３３（２００１）を参照されたい）。前癌病変は、しばしば、ＨＰＶ ＤＮＡのエピソーム形態に関連しており、一方、後の段階の腫瘍は、典型的には、組込まれたＨＰＶ配列を有する。疾患経過の段階の進行と相関した組込みの結果として、Ｌ１遺伝子のような特異的ＨＰＶ遺伝子のオープンリーディングフレームが破壊されうる。ＨＰＶ遺伝子配列のそのような破壊は、該破壊遺伝子を標的とするアッセイにおいて偽陰性結果を招きうる。
単一のＨＰＶ型からの複数のＨＰＶ遺伝子の同時特定をもたらす多重アッセイがＷＯ ０３／０１９１４３に記載されている。しかし、これらのアッセイは特にＨＰＶ型６、１１、１６および１８の特定に向けられたものである。
前記のＨＰＶアッセイの開発にもかかわらず、当技術分野において開示されている方法と比較して少ない人時で十分な高感度かつ再現可能なアッセイを開発することが好都合であろう。また、追加的なＨＰＶ型、特に、病理表現型に関連したＨＰＶ型の特定のためのアッセイを開発することが好都合であろう。
発明の概要
本発明は、同一ＨＰＶ型の複数のＨＰＶ遺伝子座を同時に検出するために複数の発蛍光団を使用する、サンプル内のＨＰＶ型の核酸の存在を検出するための蛍光多重ＰＣＲアッセイに関する。ここで、該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる。該ＨＰＶ型は発癌表現型に関連づけられている。
より詳しくは、本発明は、核酸含有サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型の核酸の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび複数のオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅して、複数のＰＣＲアンプリコンを得（ここで、
各オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）ＨＰＶ型の核酸配列の第１位置にハイブリダイズするフォワード識別性ＰＣＲプライマー、（ｂ）第１位置の下流の該ＨＰＶ型の核酸配列の第２位置にハイブリダイズするリバース識別性ＰＣＲプライマー、および（ｃ）消光剤分子と、特有の放射極大においてエネルギーを放射する発蛍光団とで標識された蛍光プローブよりなり、該プローブは、第１位置と第２位置との間の該ＨＰＶ型の核酸配列の位置にハイブリダイズし、
各オリゴヌクレオチドセットは、同一ＨＰＶ型に由来する異なるＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズし、該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各蛍光プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つの放射極大において蛍光の変化が検出されれば、該サンプルが該ＨＰＶ型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
本発明の好ましい実施形態においては、複数のオリゴヌクレオチドセットの各オリゴヌクレオチドセットは、検出すべきＨＰＶ型の単一の遺伝子に特異的である。すなわち、本発明の方法の各オリゴヌクレオチドセットは、同一型の単一のＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。例えば、第１オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＥ７遺伝子にハイブリダイズし、第３オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＬ１遺伝子にハイブリダイズする。その結果、複数のＰＣＲアンプリコンが生じ、各ＰＣＲアンプリコンは、検出すべきＨＰＶ型の単一のＨＰＶ遺伝子に特異的である。
本発明のもう１つの実施形態においては、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドセットのフォワード識別性ＰＣＲプライマーおよびリバース識別性ＰＣＲプライマーは、同一ＨＰＶ型の、異なる遺伝子に特異的である。例えば、フォワード識別性プライマーはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、リバース識別性プライマーはＥ７遺伝子にハイブリダイズする。その結果、少なくとも１つのＰＣＲアンプリコンは、２以上の遺伝子に由来するヌクレオチドの配列を含む。該アンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、Ｅ６遺伝子に由来するヌクレオチドの配列、Ｅ７遺伝子に由来するヌクレオチドの配列、またはＥ６／Ｅ７境界をまたぐヌクレオチドの配列にハイブリダイズしうる。
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる。
本発明の方法のもう１つの好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドセットの数は３であり、該オリゴヌクレオチドセットはＨＰＶのＥ６、Ｅ７およびＬ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする。Ｅ６、Ｅ７またはＬ１遺伝子の２つ又は３つが検出された場合、サンプルは、試験されているＨＰＶ型に関して陽性である。
本発明のもう１つの実施形態は、単一のＨＰＶ型に特異的なヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。該オリゴヌクレオチドプローブは、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅により生じた特異的ＨＰＶアンプリコンに結合しうる。本発明のもう１つの実施形態においては、該オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６よりなる群から選ばれるヌクレオチドの配列を含む。
本発明はまた、発蛍光団および消光剤分子を更に含む該オリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、ＦＡＭ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＴＥＴ（商標）（Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）およびＣＡＬ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）よりなる群から選ばれ、消光剤は非蛍光性である。本発明の特に好ましい実施形態においては、消光剤はＢＨＱ（商標）１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
本発明は更に、フォワードＰＣＲプライマーおよびリバースＰＣＲプライマーの両方が識別性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ）である、ＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅のためのプライマーペアに関する。本発明の好ましい実施形態においては、該プライマーペアのヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、ならびに配列番号２３および配列番号２４よりなる群から選ばれる。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」なる語は、ワトソン−クリック型の塩基対形成のような単量体−単量体相互作用の規則的パターンにより標的ポリヌクレオチドに特異的に結合しうる、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む、天然の又は修飾された単量体または結合の直鎖状オリゴマーを意味する。本発明の目的においては、オリゴヌクレオチドなる語はオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーの両方を含む。
本明細書中で用いる「プライマー」なる語は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に配置された場合に相補鎖に沿った合成の相互作用の点として作用しうるオリゴヌクレオチドを意味する。そのような条件は、適当なバッファー（「バッファー」は、補因子である又はイオン強度、ｐＨなどに影響を及ぼす成分を含む）中、適当な温度での、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合誘発剤、例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在を含む。本明細書中で用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、精製された制限消化物におけるように天然で生じたものであることが可能であり、あるいは合成的に製造されうる。該プライマーは、好ましくは、増幅における効率を最大にするために、一本鎖である。
本明細書中で用いる「プライマーペア」は、ＰＣＲアンプリコンを産生するための核酸ポリメラーゼの存在下の核酸断片のＰＣＲ増幅に関与しうる、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの、２つのプライマーを意味する。プライマーペアを構成するプライマーは、単一ＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチドの配列よりなるアンプリコンを生成するよう、同一ＨＰＶ遺伝子に特異的でありうる。あるいは、プライマーペアを構成するプライマーは、２以上の遺伝子に由来するヌクレオチドの配列よりなるアンプリコンを生成するよう、ＨＰＶゲノム内で互いに非常に接近して存在する異なるＨＰＶ遺伝子に特異的でありうる。
本発明の発蛍光団に関して本明細書中で用いる「特有」なる語は、各発蛍光団が、個々のアッセイにおいて使用する全ての他の発蛍光団とは異なる放射極大においてエネルギーを放射することを意味する。特有の放射極大を有する発蛍光団の使用は、個々のアッセイにおいて使用する複数の発蛍光団のそれぞれにより放射される蛍光エネルギーの同時検出を可能にする。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに関して本明細書中で用いる「識別性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ）」なる語は、該プライマーおよびプローブが単一のＨＰＶ型に特異的であることを意味する。それは、単一のＨＰＶ型に特異的であるが他のＨＰＶ型に対するいくらかの相同性を共有するＨＰＶプライマーおよびプローブを含む。本発明の「識別性」プライマーおよびプローブは、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて他のＨＰＶ型に対する３’相同性を欠くオリゴヌクレオチドを含む。特定の位置において特異的ＨＰＶ型に特有でありアライメントにおいて該ＨＰＶ型をその他のものから識別するよう作用するそのような残基は「識別性塩基（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ ｂａｓｅ）」と称される。オリゴヌクレオチドに関する「識別性」なる語は、２以上のＨＰＶ型に特異的であるプライマーおよびプローブ、すなわち、２以上のＨＰＶ型に対して完全な相同性を共有するものを含まない。
本明細書中で用いる「アンプリコン」は、核酸ポリメラーゼおよび特異的プライマーペアの存在下に核酸を含むサンプルのＰＣＲ増幅により産生された、ＰＣＲ反応の特異的産物を意味する。アンプリコンは、単一のＨＰＶ型の単一の遺伝子に由来するヌクレオチド配列よりなるものでありうる。あるいは、アンプリコンは、単一のＨＰＶ型の２以上の遺伝子に由来するヌクレオチド配列よりなるものでありうる。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチドセット」は、単一のＨＰＶ型の特異的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーのペアの一群を意味する。該オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）ＨＰＶ型の核酸配列の第１位置にハイブリダイズするフォワード識別性プライマー、（ｂ）第１位置の下流の該ＨＰＶ型の核酸配列の第２位置にハイブリダイズするリバース識別性プライマー、および（ｃ）第１位置と第２位置との間の該ＨＰＶ型の核酸配列の位置にハイブリダイズする、発蛍光団および消光剤で標識された蛍光プローブよりなる。すなわち、オリゴヌクレオチドセットは、単一のＨＰＶ型に特異的なアンプリコンの合成を開始させうる特異的ＰＣＲプライマーと、該アンプリコンにハイブリダイズする蛍光プローブとのセットよりなる。
本明細書中で用いる「複数」は２以上を意味する。
オリゴヌクレオチドセット、オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブに関して本明細書中で用いる「特異的にハイブリダイズ（する）」は、該オリゴヌクレオチドセット、プライマーまたはプローブが単一のＨＰＶ型の核酸配列にハイブリダイズすることを意味する。
本明細書中で用いる「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与する核酸のセグメントを意味する。それは、翻訳される配列（コード領域）ならびに５’および３’非翻訳配列（非コード領域）の両方、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。本発明の目的においては、ＨＰＶゲノムは９個の遺伝子：Ｌ１、Ｌ２およびＥ１−Ｅ７を含有する。
本明細書中で用いる「遺伝子座」は、ある形質に関する遺伝子が存在する、染色体上の位置を意味する。遺伝子座なる語は特定の遺伝子の対立遺伝子のいずれか一方を含む。それはまた、異なるＨＰＶ型からの相同遺伝子を含む。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ６においてＬ１遺伝子を検出するＰＣＲアッセイは、異なるＨＰＶ型からの配列の検出であるにもかかわらず、単一遺伝子座アッセイである。逆に、例えば、単一のＨＰＶ型のＬ１遺伝子およびＥ１遺伝子を検出するアッセイは、単一のＨＰＶ型が検出される場合であっても、多遺伝子座アッセイである。
本明細書中で用いる「ＨＰＶ」はヒトパピローマウイルスである。「ＨＰＶ」は、現在公知の又は後になって記載されるＨＰＶの任意のタイプを表すために用いられる一般用語である。
本明細書中で用いる「発蛍光団」は、レーザー、タングステン、水銀もしくはキセノンランプまたは発光ダイオードで励起されると一定のスペクトルを有する光の形態でエネルギーを放出する蛍光レポーター分子を意味する。蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の過程により、発蛍光団から放射された光は、該発蛍光団の発光スペクトルと重複する励起スペクトルを有する第２の分子を励起しうる。発蛍光団から別の分子への放射エネルギーの転移は該発蛍光団の発光を消光する。その第２の分子は消光剤分子として知られている。「発蛍光団」なる語は、本明細書においては「蛍光レポーター」なる語と互換的に用いられる。
本明細書中で用いる「消光剤」または「消光剤分子」は、発蛍光団を含む蛍光プローブに結合している場合に該発蛍光団により放射されたエネルギーを受容して該発蛍光団の放射を消光しうる分子を意味する。消光剤は、受容したエネルギーを光として放出する蛍光性のもの、または受容したエネルギーを熱として放出する非蛍光性のものであることが可能であり、該プローブの長さの途中の任意の位置に結合されうる。
本明細書中で用いる「暗消光剤（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」は非蛍光性消光剤を意味する。
本明細書中で用いる「プローブ」は、標的領域内または検出すべき領域内の配列に対する該プローブの少なくとも１つの配列の相補性により標的核酸内の配列と二重らせん構造を形成しうるオリゴヌクレオチドを意味する。「プローブ」なる語は、結合している発蛍光団および消光剤分子を伴う又は伴わない前記のオリゴヌクレオチドを含む。「蛍光プローブ」なる語は、発蛍光団と消光剤分子とを含むプローブを意味する。
本明細書中で用いる「ＦＡＭ」は発蛍光団６−カルボキシ−フルオレセインを意味する。
本明細書中で用いる「ＪＯＥ」は発蛍光団６−カルボキシ−４’５’−ジクロロ−２’７’−ジメトキシフルオレセインを意味する。
本明細書中で用いる「ＴＥＴ」は発蛍光団５−テトラクロロ−フルオレセインを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、臨床サンプルにおけるＨＰＶ型ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８（該型は発癌表現型に関連づけられている）の個々の検出のためのアッセイに関する。本発明のアッセイの使用は、当技術分野で公知の他のアッセイと比較して偽陰性結果の危険性を実質的に減少させる。
ＨＰＶゲノムと染色体宿主ＤＮＡとの関係は多段階腫瘍発生過程中に変化しうることが良く知られている（総説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．８２：１５−３３（２００１）を参照されたい）。前癌病変は、しばしば、ＨＰＶ ＤＮＡのエピソーム形態に関連しており、一方、後の段階の腫瘍は、典型的には、組込まれたＨＰＶ配列を有する。疾患経過の段階の進行と相関した組込みの結果として、Ｌ１遺伝子のような特異的ＨＰＶ遺伝子のオープンリーディングフレームが破壊されうる。ＨＰＶ遺伝子配列のそのような破壊は、該破壊遺伝子を特異的に検出するよう設計されたアッセイにおいて偽陰性結果を招きうる。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、単一のＨＰＶ型の複数のＨＰＶ遺伝子を同時に検出し増幅することを含む、サンプルにおける特異的ＨＰＶ型の核酸配列の存在を特定するための方法を提供する。それらの複数のＨＰＶ遺伝子の大多数が本発明の方法により検出された場合、サンプルは該ＨＰＶ型に関して陽性とみなされる。本発明のもう１つの好ましい実施形態は、単一のＨＰＶ型の３つのＨＰＶ遺伝子を同時に検出し増幅することを含む、特異的ＨＰＶ型の存在に関するアッセイを提供する。それらの３つの遺伝子の少なくとも２つが検出された場合、サンプルは該ＨＰＶ型に関して陽性とみなされ、それらの３つの遺伝子のいずれもが本発明の方法により検出されなかった場合、サンプルはＨＰＶ陰性とみなされる。該アッセイは、単一のＨＰＶ遺伝子座に関して試験するアッセイに伴う偽陰性結果を得る危険性を減少させる。本発明の方法は高度に特異的であり再現可能である。
臨床サンプルにおいてＨＰＶ型を検出するための本発明の方法はまた、当技術分野で公知の他のアッセイと比較して偽陽性結果の危険性を実質的に減少させる。そのような偽陽性結果は、異なるＨＰＶ型からの同一ＨＰＶ遺伝子と比較した場合の特異的ＨＰＶ遺伝子間の高度の相同性により生じる。このような相同性レベルは、単一のＨＰＶ型に特異的なＰＣＲアッセイの設計を困難にする。したがって、単一遺伝子座を検出する、当技術分野で公知の他の方法を用いる場合には、単一のＨＰＶ型のいくつかの遺伝子座の存在に関して順次試験することにより陽性結果を確認することが必要である。陽性結果を実証するために必要な追加実験は面倒であり長時間を要する。４つの異なるＨＰＶ型に関する臨床サンプルのＨＰＶ状態の確認には、典型的には、２６〜３０人時を要する。
当技術分野において利用可能な方法とは異なり、本発明は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる単一のＨＰＶ型の複数の異なるＨＰＶ遺伝子を同時に検出し増幅するための方法を提供する。それにより、単一遺伝子座アッセイに一般に伴う偽陽性結果の発生が実質的に減少する。また、本発明のアッセイは、陽性結果を確認するための連続的な実験を要さず、サンプルのＨＰＶ状態を判定するのに必要な人時を著しく減少させる。したがって、本発明の方法は、特異的ＨＰＶ型の核酸に関する臨床サンプルのハイスループットスクリーニングに応用可能である。該方法は、例えば９６ウェルＰＣＲ形態を用いることにより、多数のサンプルに関する同時スクリーニングを可能にする一方、高い特異性および精度を保有する。
複数の発蛍光団形態を使用するもう１つのＨＰＶリアルタイムＰＣＲアッセイが当技術分野において記載されている（Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３７（３）：４９０−９６（１９９９））。この方法は、多数のＨＰＶ型におけるＥ１遺伝子の一部を増幅するために特異的および縮重プライマーの混合物を使用する。アッセイ当たり３個までのプローブが使用された。ここで、各プローブは、異なる発蛍光団を含み、各プローブは、異なるＨＰＶ型のＥ１遺伝子を検出する。臨床サンプルにおいてではなくＨＰＶ ＤＮＡを含有するプラスミドを使用してアッセイ感度が試験された。
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎらは、異なるＨＰＶ型にそれぞれが特異的である複数の蛍光プローブを同時に使用した場合、単一プローブアッセイと比較してＨＰＶ１８ ＤＮＡの検出において実質的に感度が低下することを開示している。同様に、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ３５に関するプローブの混合物を使用した場合、ＨＰＶ３５に関する単一のプローブの場合と比較してＨＰＶ３５の検出がいくぶん低下した。また、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１を検出するために複数のプローブアッセイを用いた場合、高コピー数においていくぶん感度が低下することが観察された。
本発明の方法は複数の蛍光プローブを使用するものであり、各プローブは、個々のアッセイで使用するそれぞれの他の発蛍光団と比較して特有の放射極大においてエネルギーを放射する発蛍光団を含む。本発明で提供するアッセイは高度に特異的であり、３つの遺伝子座において１０コピーより少ないＨＰＶゲノムＤＮＡを検出しうる。
本発明の各ＰＣＲアッセイの線形性および感度は、１０〜１０６コピー／反応の範囲の濃度の遺伝子座特異的プラスミドを使用して確認した。ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８多重ＰＣＲアッセイは１０〜１０６コピーの範囲内で線形性であった（図３〜６を参照されたい）。
本発明の方法により示される非常に高いアッセイ感度は、ＨＰＶのコピー数が低い可能性のある臨床サンプルのスクリーニングにおいて決定的に重要である。ＨＰＶ感染の身体的発現はしばしば潜在的であり、潜伏期間が長いため、ＨＰＶ感染は、患者が頚部表皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）と診断されるまで検出されず、ＣＩＮは、治療せずに放置されると癌へと進行しうる。典型的には、高い進行期の病変（ＣＩＮ２、ＣＩＮ３および癌）は高いＨＰＶコピー数に関連しており、これは、当技術分野で公知の通常の方法により検出可能であろう。しかし、現在使用されている多数のアッセイは、低いコピー数のＨＰＶを検出するのに十分な感度も特異性も有さない。したがって、ＨＰＶコピー数が低く、治療的介入が有効である可能性が高い場合、ＨＰＶの初期検出には非常に高い感度が決定的に重要である。
本発明は、より詳しくは、核酸含有サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型の核酸配列の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび複数のオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅して、複数のＰＣＲアンプリコンを得（ここで、
各オリゴヌクレオチドセットは、（ａ）ＨＰＶ型の核酸配列の第１位置にハイブリダイズするフォワード識別性ＰＣＲプライマー、（ｂ）第１位置の下流の該ＨＰＶ型の核酸配列の第２位置にハイブリダイズするリバース識別性ＰＣＲプライマー、および（ｃ）消光剤分子と、特有の放射極大においてエネルギーを放射する発蛍光団とで標識された蛍光プローブよりなり、該プローブは、第１位置と第２位置との間の該ＨＰＶ型の核酸配列の位置にハイブリダイズし、
各オリゴヌクレオチドセットは、同一ＨＰＶ型に由来する異なるＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズし、該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各蛍光プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つの放射極大において蛍光の変化が検出されれば、該サンプルが該ＨＰＶ型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
本発明の好ましい実施形態においては、複数のオリゴヌクレオチドセットの各オリゴヌクレオチドセットは、検出すべきＨＰＶ型の単一の遺伝子に特異的である。すなわち、本発明の方法の各オリゴヌクレオチドセットは、同一型の単一のＨＰＶ遺伝子に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。例えば、第１オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＥ７遺伝子にハイブリダイズし、第３オリゴヌクレオチドセットのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはＬ１遺伝子にハイブリダイズする。その結果、複数のＰＣＲアンプリコンが生じ、各ＰＣＲアンプリコンは、検出すべきＨＰＶ型の単一のＨＰＶ遺伝子に特異的である。
本発明のもう１つの実施形態においては、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドセットのフォワード識別性ＰＣＲプライマーおよびリバース識別性ＰＣＲプライマーは、同一ＨＰＶ型の、異なる遺伝子に特異的である。例えば、フォワード識別性プライマーはＥ６遺伝子にハイブリダイズし、リバース識別性プライマーはＥ７遺伝子にハイブリダイズする。その結果、少なくとも１つのＰＣＲアンプリコンは、２以上の遺伝子に由来するヌクレオチドの配列を含む。該アンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、Ｅ６遺伝子に由来するヌクレオチドの配列、Ｅ７遺伝子に由来するヌクレオチドの配列、またはＥ６／Ｅ７境界をまたぐヌクレオチドの配列にハイブリダイズしうる。
蛍光の変化は、以下の特徴を有するリアルタイムＰＣＲを行うよう設計された自動蛍光光度計により検出されうる：蛍光プローブの発蛍光団を励起するための励起方法、ＰＣＲ反応混合物を加熱し冷却するための手段、および蛍光の変化を検出するための手段。この特徴の組合せは、単一のリアルタイムＰＣＲ装置により行われる場合、ＰＣＲアンプリコンのリアルタイム検出を可能にし、これはリアルタイムでの蛍光増加の速度論の精査によるＰＣＲ産物増幅の証明を可能にする。例えば以下のような、リアルタイムＰＣＲ反応を行うための自動蛍光光度計が当技術分野で公知であり、この特異的アッセイにおける使用に応用されうる：Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＭｘ３０００Ｐ（商標）、ＭＸ３００５Ｐ（商標）およびＭＸ４０００（登録商標）、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７３００、７５００、７７００および７９００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）およびＧｅｎｅ Ｘｐｅｒｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ならびにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
本発明の方法は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。この装置は、荷電結合素子（ＣＣＤ）カメラ越しに予測可能に配置されるパターンへと（波長に基づいて）蛍光放射を分離するために分光器を使用する。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００の配列検出システムアプリケーションは該ＣＣＤカメラから蛍光シグナルを集め、データ解析アルゴリズムを適用する。
本発明の方法で使用する核酸ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有していなければならない。例えばＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｂｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）およびＴｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼのようないくつかの適当なポリメラーゼが当技術分野で公知である。ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼは本発明の好ましいポリメラーゼである。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、ＰＣＲプライマーの伸長中に遭遇した二本鎖ＤＮＡの分解により特徴づけられる。アンプリコンにアニールした蛍光プローブは同様に分解されて、オリゴヌクレオチドから発蛍光団を遊離する。該発蛍光団と消光剤とが解離すると、該発蛍光団により放射された蛍光はもはや消光されず、それにより、蛍光における検出可能な変化が生じる。ＰＣＲ産物の指数関数的な増加中、アンプリコン特異的蛍光は、配列検出アプリケーションが複合スペクトルに多成分アルゴリズムを適用した後、それを該アプリケーションが非増幅サンプルのバックグラウンド蛍光から識別しうる点まで増加する。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出装置はサンプルに関する閾値サイクル（Ｃｔ）（予め決められた閾値を超えてこの蛍光が増加するサイクル）を決定するソフトウェアアプリケーションをも含む。ＰＣＲ陰性サンプルは、実施したサイクルの総数に等しいＣｔを有し、ＰＣＲ陽性サンプルは、実施したサイクルの総数より小さなＣｔを有する。
本発明は、核酸含有サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型（該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる）の核酸配列の存在を検出するための方法に関する。本発明の方法の好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドセットの数は３であり、サンプルは、２以上の発蛍光団における蛍光の変化が検出された場合にＨＰＶ型に関して陽性である。
本発明の方法のもう１つの好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドセットはＨＰＶのＥ６、Ｅ７およびＬ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする。Ｅ６、Ｅ７またはＬ１遺伝子のうちの２つ又は３つが検出された場合、サンプルは、試験されているＨＰＶ型に関して特異的である。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは多数の方法により合成されうる。例えば、Ｏｚａｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５２０５−５２１４（１９９２）；Ａｇｒａｗａｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８：５４１９−５４２３（１９９０）を参照されたい。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ＡＢＩ ３９００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような自動ＤＮＡ合成装置で合成されうる。他の化学法、例えば、ホスホロチオアート、ホスホロアミダートなどのような非天然バックボーン基を与える方法を用いることも可能である。ただし、それは、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ばさないものでなければならない。
本発明のＰＣＲ増幅工程は、当技術分野でよく知られた標準的な技術により行われうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；米国特許第４，６８３，２０２号；およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０）（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。ＰＣＲサイクリング条件は、典型的には、ＰＣＲ反応混合物を約８０℃〜約１０５℃の範囲の温度へ約１〜約１５分の範囲の時間にわたって加熱することにより行われうる初期変性工程を含む。加熱変性後、典型的には、約２０〜約５０サイクルの範囲の多数回のサイクルを行う。各サイクルは通常、初期変性工程およびそれに続くプライマーアニーリング／プライマー伸長工程を含む。核酸ポリメラーゼ、例えばＴＡＱポリメラーゼによる該プライマーの酵素的伸長は、後続サイクルにおいて鋳型として使用されうる、鋳型のコピーを与える。
誤ったプライミングおよび非特異的アンプリコンの生成を避けるために、「ホットスタート（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）」ＰＣＲ反応が本発明の方法と共に用いられうる。この目的には、本発明の好ましい実施形態においては、核酸ポリメラーゼはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）ＤＮＡポリメラーゼである、ＰＣＲサイクリング条件は「ホットスタート」ＰＣＲ反応を含む。該ポリメラーゼは、ＰＣＲサイクリング前にＰＣＲ反応成分を９５℃で約１５分間インキュベートすることにより活性化されるまでは不活性である。同様の初期インキュベーション工程を含むＰＣＲ法は「ホットスタートＰＣＲアッセイ」として当技術分野において公知である。
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは約２０〜約４０ヌクレオチド長の範囲である。より好ましくは、該オリゴヌクレオチドプローブは約１８〜約３０ヌクレオチド長の範囲である。最も好ましくは、該オリゴヌクレオチドプローブは約２４〜約３０ヌクレオチド長の範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの厳密な配列および長さは、部分的には、それが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に左右される。結合位置および長さは、個々の実施形態のための適当なアニーリングおよび融解特性がもたらされるよう様々なものとなりうる。
好ましくは、該オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドは遮蔽される。すなわち、該ヌクレオチドは核酸ポリメラーゼによる伸長を不能にされる。そのような遮蔽は３’末端ヌクレオチドのリン酸化により簡便に行われる。なぜなら、ＤＮＡポリメラーゼは３’ヒドロキシルのみにヌクレオチドを付加することが可能であり、３’リン酸には付加し得ないからである。
本発明のＨＰＶプライマーおよびプローブは他のＨＰＶ型に対する完全な相同性を共有しないことが好ましい。本発明の各プライマーは、少なくとも１つのヌクレオチドにおいて３’相同性を欠くよう設計されるべきである。そのようなプライマー設計は、誤ったＨＰＶ型へのプライマーアニーリングの可能性を実質的に減少させ、意図されないＨＰＶ型へのアニーリングが生じた場合にはプライマー伸長を妨げるであろう。なぜなら、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼは３’末端のみからプライマーを伸長させ、３’末端が適切にアニーリングされることが必要だからである。
各プローブが、非特異的ＨＰＶ標的へのオリゴヌクレオチド結合を不安定化する、オリゴヌクレオチドの長さの途中のミスマッチを含有することも好ましい。遺伝子座間を識別するためには、該オリゴヌクレオチドプローブの長さの途中の僅か１個のミスマッチで十分である。本発明のプローブは、増幅されているＤＮＡ断片に結合した場合にのみ加水分解され検出されるため、増幅されていないＤＮＡ配列への該プローブの非特異的結合は検出されない。
この目的において、本発明は、フォワードＰＣＲプライマーおよびリバースＰＣＲプライマーの両方が識別性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ）である、ＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅のためのプライマーペアに関する。本発明の好ましい実施形態においては、該プライマーペアのヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号７および配列番号８、配列番号９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、ならびに配列番号２３および配列番号２４よりなる群から選ばれる。
特異的型のＨＰＶ遺伝子を選択的に増幅する他の識別性オリゴヌクレオチドプライマーが設計されうる、と当業者に容易に理解される。該オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書に開示されているものと同じ長さでありうる。あるいはそれは１２〜４５ヌクレオチドの範囲でありうる。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１８〜３０ヌクレオチドの範囲である。最も好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１９〜２９ヌクレオチドの範囲である。
各プローブが、非特異的ＨＰＶ標的へのオリゴヌクレオチド結合を不安定化する、オリゴヌクレオチドの長さの途中のミスマッチを含有することも好ましい。遺伝子座間を識別するためには、該オリゴヌクレオチドプローブの長さの途中の僅か１個のミスマッチで十分である。本発明のプローブは、増幅されているＤＮＡ断片に結合した場合にのみ加水分解され検出されるため、増幅されていないＤＮＡ配列への該プローブの非特異的結合は検出されない。
この目的において、本発明の好ましい実施形態は、単一のＨＰＶ型に特異的なヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。該オリゴヌクレオチドプローブは、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅により生じた特異的ＨＰＶアンプリコンに結合しうる。本発明のもう１つの実施形態においては、該オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６よりなる群から選ばれるヌクレオチドの配列を含む。本発明はまた、発蛍光団と消光剤分子とを更に含む該オリゴヌクレオチドプローブに関する。
本発明の発蛍光団は、５’末端、３’末端または両末端の内部を含む該プローブの任意の位置において該プローブに結合されうる。すなわち、該発蛍光団は、該プローブが検出するよう設計された特異的ＨＰＶ遺伝子にハイブリダイズしうるヌクレオチドの特異的配列を含むヌクレオチドのいずれか１つに結合されうる。本発明の好ましい実施形態においては、該発蛍光団はヌクレオチドの特異的配列の５’末端ヌクレオチドに結合され、該消光剤はヌクレオチドの特異的配列の３’末端ヌクレオチドに結合される。
好ましくは、発蛍光団は、連結部分を介して該プローブの３’炭素または５’炭素に結合させるために誘導体化された蛍光性有機色素である。好ましくは、消光剤分子も有機色素であり、これは、本発明の実施形態に応じて、蛍光性であっても蛍光性でなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施形態においては、該消光剤分子は非蛍光性である。一般に、該消光剤分子が蛍光性であるか、あるいはレポーターからの転移エネルギーを非放射性崩壊により放出するに過ぎないかどうかにかかわらず、該消光剤の吸収バンドはレポーター分子の蛍光放射バンドと実質的に重複すべきである。励起されたレポーター分子からのエネルギーを吸収するがエネルギーを放射的に放出しない非蛍光性消光剤分子は、本明細書においては「暗消光剤（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）」、「暗消光剤分子」、「非蛍光性消光剤」または「非蛍光性消光剤分子」と称される。
いくつかの発蛍光団−消光剤のペアが当技術分野において記載されている。例えば、Ｐｅｓｃｅら編，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｉ−ｏｓｃｏｐｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７０）などを参照されたい。文献は、蛍光性および非蛍光性分子ならびにそれらの関連光学特性の網羅的一覧を示す参考文献をも含む（例えば、Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｒｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７１））。さらに、オリゴヌクレオチドに付加されうる一般的な反応性基を介した共有結合のためにレポーターおよび消光剤分子を誘導体化するための広範な指針も文献に記載されている。例えば、米国特許第３，９９６，３４５号および米国特許第４，３５１，７６０号を参照されたい。
典型的な発蛍光団−消光剤のペアは、フルオレセインなどのキサンテン色素およびローダミン色素から選ばれうる。オリゴヌクレオチドへの結合のための結合部位または結合官能基として使用されうるフェニル部分上の置換基を有するこれらの化合物の多数の適当な形態が商業的に広く入手可能である。蛍光性化合物のもう１つの一群は、アルファまたはベータ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。そのようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホナート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホナートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホナートが含まれる。他の色素には、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン、例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、発蛍光団および消光剤分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選ばれる。これらの色素、およびオリゴヌクレオチドへの結合のための適当な連結法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．７：２９９−３０３（１９７５）；および米国特許第５，１８８，９３４号を参照されたい。本発明の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ（商標），Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ（商標），Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．）、５−テトラクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ（商標），Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．）およびＣＡＬ ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）よりなる群から選ばれる。
本発明の方法で使用する他の発蛍光団には、ＣＡＬ ｆｌｕｏｒ（登録商標）レッド（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＶＩＣ（商標）およびＨＥＸ（商標）（Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）ならびにＣｙ３（登録商標）およびＣｙ５（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ．ＮＪ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の好ましい実施形態においては、該消光剤分子は非蛍光性である（暗消光剤）。暗消光剤は、より低いバックグラウンド蛍光を有し、光を放射せず、多重アッセイのための追加的な発蛍光団の選択肢を可能にする。本発明の好ましい消光剤分子は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により開発された非蛍光性消光剤であるＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）１（ＢＨＱ１）である。他の暗消光剤には、ＢＨＱ（商標）−２、ＢＨＱ（商標）−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈ．）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）ならびにＤｅｅｐ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ＩおよびＩＩ（（ＤＤＱ）Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ｓ．ａ．，Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明での使用には暗消光剤が好ましいが、当業者は、本発明の方法における使用のために蛍光性消光剤、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標），Ａｐｐｌｅｒａ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を選択しうるであろう。ただし、該蛍光性消光剤は、選択された発蛍光団のそれぞれから放射されたエネルギーの検出を妨げるものであってはならない。
本発明の方法で使用する最適な消光剤は、一定のスペクトルを有する光の形態でエネルギーを放射する選択された蛍光性色素の蛍光を消光するそれらの能力に基づいて選択される。当業者は、本発明の方法で使用する発蛍光団−消光剤のペアを容易に特定することが可能である。好ましい発蛍光団−消光剤のペアには、ＦＡＭ−ＢＨＱ１、ＪＯＥ−ＢＨＱ１およびＴＥＴ−ＢＨＱ１が含まれる。当技術分野において記載されている他の発蛍光団−消光剤のペアには、Ｃｙ３−ＢＨＱ２、Ｃｙ５−ＢＨＱ３、ＴＥＴ−ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ−ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＤＤＱＩまたはＩＩが含まれる。選択した個々の消光剤は、蛍光が放射される波長において、選択した発蛍光団の蛍光を有効に消光しうるものでなければならない、と当業者は認識するであろう。種々の鋳型の同時検出（多重化）の目的に適した複数の発蛍光団を選択する場合、各発蛍光団は特有の放射極大においてエネルギーを放射すべきである、と当業者は認識するであろう。
好ましくは、合成中にオリゴヌクレオチドに結合されうる商業的に入手可能な連結部分（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なもの）を用いる。
本発明は、核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ３１核酸の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２５に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２６に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号５に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号６に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２７に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ３１型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
前記方法の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれ、該消光剤分子はＢＨＱ１である。
前記のサンプルにおけるＨＰＶ３１の存在を検出するための方法のもう１つの好ましい実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＦＡＭであり、第２オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＪＯＥであり、第３オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＴＥＴである。
本発明は更に、核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ４５核酸の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号７に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号８に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２８に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号９に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１０に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２９に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３０に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ４５型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
前記方法の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれ、該消光剤はＢＨＱ１である。
前記のサンプルにおけるＨＰＶ４５の存在を検出するための方法のもう１つの好ましい実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＦＡＭであり、第２オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＪＯＥであり、第３オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＴＥＴである。
本発明はまた、核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ５２核酸の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３１に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１５に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１６に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３２に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１７に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１８に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３３に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ５２型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
前記方法の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれ、該消光剤はＢＨＱ１である。
前記のサンプルにおけるＨＰＶ５２の存在を検出するための方法のもう１つの好ましい実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＦＡＭであり、第２オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＪＯＥであり、第３オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＴＥＴである。
本発明は更に、核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ５８核酸の存在を検出するための方法であって、
核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１９に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２０に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３４に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号２１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３５に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号２３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３６に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ５８型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法に関する。
前記方法の好ましい実施形態においては、該発蛍光団は、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれ、該消光剤はＢＨＱ１である。
前記のサンプルにおけるＨＰＶ５８の存在を検出するための方法のもう１つの好ましい実施形態においては、第１オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＦＡＭであり、第２オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＪＯＥであり、第３オリゴヌクレオチドセットの発蛍光団はＴＥＴである。
添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明はそれらの実施形態そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲または精神から逸脱することなく種々の変更および修飾が当業者により施されうると理解されるべきである。
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
識別性ＨＰＶプライマーの設計
Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ．１．０（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して各ＨＰＶ型に関するＰＣＲプライマーを設計した。ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８型のＬ１、Ｅ６およびＥ７遺伝子座のオープンリーディングフレームの遺伝子特異的ヌクレオチド配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．７（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４パーソナルコンピューター（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）を使用して整列（ａｌｉｇｎ）させた。ついでＰｈｙｌｉｐ−フォーマットアライメントファイルをＰｒｉｍｅｒ ＥｘｐｒｅｓｓアプリケーションのＡｌｌｅｌｉｃ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎモジュール内に移入（ｉｍｐｏｒｔ）し、特異的ＨＰＶ型をマーク（ｍａｒｋ）した。
以下の基準を満たすプライマーペアを選択した：Ｔｍ＝５９〜６１℃、アンプリコンサイズ：１００〜２５０ｂｐ、ＧＣ含量２０〜８０％、３’末端位置のグアノシンまたはシトシン残基、および３つの３’末端塩基内の識別性（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ）塩基。該識別性塩基は、特定の位置において該特異的ＨＰＶ型に特有であり該アライメントにおいて該ＨＰＶ型をその他のものから識別するよう働く残基である。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの両方が識別性となるよう、いくつかのプライマーペアを選択した（図１を参照されたい）。
該プライマー配列をＡｍｐｌｉｆｙ ｖ．１．２ ｆｏｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅｎｇｅｌｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により特有性およびプライマー二量体形成に関して解析した。明らかな二量体形成が生じず、各プライマーが標的遺伝子座の唯一の位置にアニーリングすると予想される、各遺伝子座に関する最適なプライマーペアを選択した。アンプリコンがプライマーペアにより定められたら、以下の基準を満たす二重標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した：Ｔｍ＝６８〜７０℃、長さ＜３０ｎｔ、せいぜい３つの同一ヌクレオチドの連続、５’末端上のグアノシン残基の非存在、およびグアノシン残基よりシトシン残基のほうが多い（図２を参照されたい）。
他の公知ＨＰＶ型に対する各プライマーおよびプローブの予想される交差反応性を、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに対して各配列をＢＬＡＳＴ検索することにより評価した。ほとんどのプライマーおよびプローブ配列は、それらが設計された特異的ＨＰＶに関して唯一のヒットを得、他のＨＰＶ型とは全く相同性を共有していなかった。ＨＰＶ３１Ｌ１センスプライマーはＨＰＶ３５、ＨＰＶ７、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１３と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ３１Ｌ１アンチセンスプライマーはＨＰＶ１６と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ４５ＬセンスプライマーはＨＰＶ５３およびＨＰＶ７１と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ４５Ｌ１アンチセンスプライマーはＨＰＶ１８、ＨＰＶ２３およびＨＰＶ４９と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ４５Ｅ６センスプライマーはＨＰＶ１８と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ４５Ｅ７ ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ１８、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ７０と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ５２Ｌ１ ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ６７と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ５２Ｅ７アンチセンスプライマーはＨＰＶ４３と或る程度の相同性を共有している。ＨＰＶ５８Ｅ７ ＴａｑＭａｎプローブはＨＰＶ１３、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５およびＨＰＶ６７と或る程度の相同性を共有している。
設計したＨＰＶプライマーおよびプローブはいずれも、他のＨＰＶ型と完全な相同性を共有していない。各プライマーは少なくとも１つのヌクレオチドの３’相同性を欠き、このことは、それが誤ったＨＰＶ型にアニーリングしたとしても、それが伸長されないことを示唆している。なぜなら、ＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼは３’末端のみからプライマーを伸長させ、３’末端が適切にアニーリングされることを要するからである。各ＴａｑＭａｎプローブは、非特異的標的へのオリゴヌクレオチド結合を安定化させる、オリゴヌクレオチドの長さの途中のミスマッチを含有する。遺伝子座間を識別するためには、該オリゴヌクレオチドプローブの長さの途中の僅か１個のミスマッチで十分である。また、該プローブは、増幅されているＤＮＡ断片に結合した場合にのみ加水分解され検出される。増幅されていないＤＮＡ配列への該プローブの非特異的結合は検出されない。
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの合成および標識
該オリゴヌクレオチドプライマーはＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）により特注で合成され、逆相ＨＰＬＣ精製された。該二重標識オリゴヌクレオチドプローブはＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により特注で合成され、逆相ＨＰＬＣ精製された。Ｌ１遺伝子座に関するオリゴヌクレオチド蛍光プローブを６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）で５’標識し、Ｅ６遺伝子座に関するオリゴヌクレオチドプローブを６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）で５’標識し、Ｅ７遺伝子座に関するオリゴヌクレオチド蛍光プローブを５−テトラクロロ−フルオレセイン（ＴＥＴ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から入手可能）で５’標識した。すべてのオリゴヌクレオチドプローブを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）により開発された非蛍光性消光剤であるＢＨＱ（商標）１で３’標識した。凍結乾燥されたプライマーおよびプローブを１×ＴＥ（ｐＨ８．０）バッファー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で還元（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）し、Ｂｅｃｋｍａｎ ６００ＤＵ分光光度計で２６０ｎｍのＯ．Ｄ．を測定し、オリゴヌクレオチド−比モル吸光度係数を用いて濃度を計算することにより、濃度を決定した。
多重反応の最適化
１つの反応が別の反応より優先されることなく３つの別々の遺伝子座が単一のＰＣＲチューブ内で同時に検出され増幅されうるよう、プライマーおよびプローブの濃度を最適化した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ装置で、１００コピーのＤＮＡ鋳型（各遺伝子座はプラスミド内にクローニングされている）を使用して漸増プローブ濃度の閾値サイクル（Ｃｔ）およびΔＲｎを評価することにより、蛍光オリゴヌクレオチドプローブ濃度を別々に最適化した。
２５μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ２×ＰＣＲマスター混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、２００ｎＭの最終濃度の各プライマー、１００コピーのプラスミドＤＮＡ鋳型、ＤＥＰＣ処理された水（Ａｍｂｉｏｎ）および或る範囲（２５〜２００ｎＭ）の濃度の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する５０μＬの反応混合物中、サンプルを増幅した。サイクリング条件は、５０℃で２分間およびそれに続く９５℃で１０分間の初期工程、ならびに９４℃で１５秒間および６０℃で１分間の４５サイクルよりなるものであった。
Ｔａｑ−Ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスター混合物は、（ｄＴＴＰではなく）ｄＵＴＰ、および５０℃で活性化されウラシル含有核酸を切断する酵素であるウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を含有していた。Ｌｏｎｇｏら，Ｇｅｎｅ ９３：１２５−１２８（１９９０）を参照されたい。ＵＮＧは、後続の実験における繰越ＰＣＲ産物の再増幅を妨げる。
最低ＣｔおよびΔＲｎ〜１を示す各プローブの濃度を選択した。既に決定された遺伝子座特異的オリゴヌクレオチドプローブ濃度および１０コピーの該プラスミドＤＮＡ鋳型を使用する微細マトリックスアッセイ（ｆｉｎｅ ｍａｔｒｉｘ）において各プライマー濃度の組合せのＣｔおよびΔＲｎを評価することにより、プライマー濃度を各遺伝子座に関して最適化した。最低Ｃｔおよび最高ΔＲｎを示すセンスおよびアンチセンスプライマーの濃度を選択した。
ついで、余分のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（０．７５Ｕ／ウェル，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の添加と共に、該プライマーおよびプローブを試験した。該追加的ＤＮＡポリメラーゼを加えたのは、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを既に含有する該ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ２×ＰＣＲマスター混合物は二重反応に関して最適化されており三重反応には最適化されていなかったからである。該追加的ＤＮＡポリメラーゼは該２×マスターミックス中のＤＮＡポリメラーゼを補足し、該反応を促進する。
各ＰＣＲアッセイの線形性および感度を、１０〜１０６コピー／反応の範囲の濃度の遺伝子座特異的プラスミドを使用して確認した。ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８多重ＰＣＲアッセイは１０〜１０６コピーの範囲内で線形性であった。
ＤＮＡの単離
ＱＩＡａｍｐ ９６ウェルＤＮＡ Ｓｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を以下の変更以外は該製造業者のプロトコールに従い使用して、ヒト臨床試料からＤＮＡを単離した：Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼの量を、推奨されている０．４ｍｇ／ウェルではなく、０．５ｍｇ／ウェルに増加させ、ＱＩＡａｍｐフィルタープレートを、Ｓｉｇｍａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）において清潔な正方形ウェルブロック上で６０００ＲＰＭで１０分間遠心乾燥させ、該ＤＮＡを、予め加温（７０℃）された溶出バッファーで溶出した。
ヒト臨床サンプルのスクリーニング
該鋳型ＤＮＡを除く該ＰＣＲ反応の成分の全てを含有するマスター混合物を調製し、試験する各ＨＰＶ型ごとに９６ウェル光学反応プレート（４６μｌ／ウェル，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内にローディングした。４μｌの該精製ＤＮＡを、該多重ＰＣＲマスター混合物を含有する各ウェルに加え、該ウェルを光学ＰＣＲキャップ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で覆った。Ｓｉｇｍａ遠心分離機における３０００ＲＰＭで２分間の遠心分離の後、該９６ウェルＰＣＲプレートをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。
各ＨＰＶ型に特異的な予め設計された鋳型により、ＰＣＲサイクリングおよびデータ収集を開始し、制御した。該ＰＣＲサイクリングが完了したら、データを電子的に保存し、増幅プレートを廃棄した。ついでＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓアプリケーション（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、該データを解析した。各色素層に関する閾値を手動で設定した。ＦＡＭ色素層閾値は０．０５に設定し、ＴＥＴ色素層は０．０４に設定した。ついで該データを、タブで範囲設定（ｔａｂ−ｄｅｌｉｍｉｔｅｄ）されたデキストファイルに電子的に送出した。該デキストファイルおよびサンプル名を含有するファイルをＨＰＶ型特異的Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥＸＣＥＬワードブック内に移入した。ロックされたワークシートは、各サンプルの閾値サイクルに基づいて色素層ＰＣＲ明確性を計算する埋め込まれた式（ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｆｏｒｍｕｌａ）を含有していた。ついで全３個の色素層からのデータを、前記の規則に基づいて各サンプルの共通のＨＰＶ ＰＣＲ明確性を計算する該ワークブックによりまとめた。
図１は、該リアルタイム多重ＰＣＲ反応において使用するオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示す。各ＨＰＶ型に関する６個のプライマーを一緒にして１つの濃縮（１００×）されたヘキサ−プライマーストックとした。各プローブは、濃縮（１００×）されたストックとして保存した。 図２は、該リアルタイム多重ＰＣＲ反応において使用するオリゴヌクレオチドプローブの配列を示す。各プローブを、その５’末端においてＦＡＭ（商標）、ＪＯＥ（商標）またはＴＥＴ（商標）発蛍光団に共有結合させた。 図３はＨＰＶ３１多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特異的プローブで得られた結果（平均±ＳＤ、ｎ＝１２）が種々の記号で示されている。黒丸はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、白丸はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角形はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。 図４はＨＰＶ４５多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。各特異的プローブで得られた結果（平均±ＳＤ、ｎ＝１２）が種々の記号で示されている。丸はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、三角形はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、四角形はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。 図５はＨＰＶ５２多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。黒丸はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、白丸はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角形はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。 図５はＨＰＶ５８多重ＰＣＲアッセイの感度を示す。黒丸はＨＰＶ６Ｌ１−ＦＡＭプローブを表し、白丸はＨＰＶ６Ｅ６−ＪＯＥプローブを表し、三角形はＨＰＶ６Ｅ７−ＴＥＴプローブを表す。

Claims (19)

  1. 核酸含有サンプルにおけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型の核酸配列の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）核酸ポリメラーゼおよび複数のオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
    各オリゴヌクレオチドセットは、
    （ｉ）ＨＰＶ型の核酸配列の第１位置にハイブリダイズするフォワード識別性ＰＣＲプライマー、
    （ｉｉ）第１位置の下流の該ＨＰＶ型の核酸配列の第２位置にハイブリダイズするリバース識別性ＰＣＲプライマー、
    （ｉｉｉ）消光剤分子と、特有の放射極大においてエネルギーを放射する発蛍光団とで標識された蛍光プローブよりなり、該プローブは、第１位置と第２位置との間の該ＨＰＶ型の核酸配列の位置にハイブリダイズし、
    各オリゴヌクレオチドセットは、同一ＨＰＶ型に由来する異なるＨＰＶアンプリコンに特異的にハイブリダイズし、該ＨＰＶ型は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８よりなる群から選ばれる）、
    （ｂ）増幅中に該核酸ポリメラーゼに各蛍光プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
    （ｃ）該発蛍光団と該消光剤分子との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
    （ｄ）少なくとも２つの放射極大において蛍光の変化が検出されれば、該サンプルが該ＨＰＶ型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法。
  2. 放射極大の大多数において蛍光変化が検出されれば、該サンプルが該ＨＰＶ型に関して陽性である、請求項１記載の方法。
  3. オリゴヌクレオチドセットの数が３であり、該オリゴヌクレオチドセットが該ＨＰＶ型のＥ６、Ｅ７およびＬ１遺伝子に特異的にハイブリダイズする、請求項２記載の方法。
  4. 該消光剤が非蛍光性である、請求項３記載の方法。
  5. ３つの発蛍光団がＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴであり、該消光剤がＢＨＱ１である、請求項４記載の方法。
  6. 配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６よりなる群から選ばれるヌクレオチドの配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブ。
  7. 発蛍光団および非蛍光性消光剤分子を更に含む、請求項６記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  8. 該発蛍光団がヌクレオチドの配列の５’末端ヌクレオチドに結合しており、該消光剤がヌクレオチドの配列の３’末端ヌクレオチドに結合している、請求項７記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  9. 該発蛍光団が、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれる、請求項８記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  10. 該消光剤分子がＢＨＱ１である、請求項９記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
  11. ＨＰＶ核酸のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該プライマーのヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４よりなる群から選ばれる、オリゴヌクレオチドプライマー。
  12. 核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ３１核酸の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
    第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２５に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２６に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号５に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号６に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２７に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
    （ｂ）増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
    （ｃ）該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
    （ｄ）少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ３１型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法。
  13. 該消光剤分子がＢＨＱ１であり、該発蛍光団が、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれる、請求項１２記載の方法。
  14. 核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ４５核酸の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
    第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号７に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号８に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２８に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号９に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１０に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号２９に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３０に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
    （ｂ）増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
    （ｃ）該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
    （ｄ）少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ４５型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法。
  15. 該消光剤分子がＢＨＱ１であり、該発蛍光団が、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれる、請求項１４記載の方法。
  16. 核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ５２核酸の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
    第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３１に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１５に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１６に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３２に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１７に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号１８に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３３に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
    （ｂ）増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
    （ｃ）該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
    （ｄ）少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ５２型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法。
  17. 該消光剤分子がＢＨＱ１であり、該発蛍光団が、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれる、請求項１６記載の方法。
  18. 核酸含有サンプルにおけるＨＰＶ５８核酸の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）核酸ポリメラーゼおよび３つのオリゴヌクレオチドセットの存在下で核酸を増幅し（ここで、
    第１オリゴヌクレオチドセットは、配列番号１９に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２０に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３４に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第２オリゴヌクレオチドセットは、配列番号２１に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２２に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３５に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており、
    第３オリゴヌクレオチドセットは、配列番号２３に記載のフォワード識別性ＰＣＲプライマー、配列番号２４に記載のリバース識別性ＰＣＲプライマー、および配列番号３６に記載のプローブよりなり、該プローブは３’末端上の消光剤分子および５’末端上の発蛍光団で標識されており）、
    （ｂ）増幅中に該核酸ポリメラーゼに各プローブを消化させて、該発蛍光団を該消光剤分子から解離させ、
    （ｃ）該発蛍光団と該消光剤との解離の際の蛍光の変化（該蛍光変化は核酸増幅の発生に対応する）を検出し、
    （ｄ）少なくとも２つのプローブで蛍光の変化が検出されれば、該サンプルがＨＰＶ５８型に関して陽性であると判定することを含んでなる方法。
  19. 該消光剤分子がＢＨＱ１であり、該発蛍光団が、ＦＡＭ、ＪＯＥおよびＴＥＴよりなる群から選ばれる、請求項１８記載の方法。
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