CN108741097A - 一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于功能食品制备技术领域，公开了一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品及其制备方法。将蛋白质分散于水中，得到蛋白分散液，然后加入离液剂反应，得到变性蛋白溶液；将难溶活性物质直接加入或采用离液剂水溶液溶解后加入到所得变性蛋白溶液中，搅拌混合均匀后反应，反应完成后透析去除离液剂，离心去除不溶物，得到所述蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品。本发明利用蛋白质的结构特性和离液剂如尿素诱导蛋白质对疏水物质的封装及包埋，在无需添加任何有机溶剂前提下，即可成功获得高稳定性的难溶活性物质水溶液，形成高荷载的蛋白纳米制品。
Description
技术领域
本发明属于功能食品制备技术领域，具体涉及一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品及其制备方法。
背景技术
当前，通过健康饮食提高人体各项生理功能和改善人体健康的观念已经深入人心，为此，往往需要在食品中强化或补充生物活性因子，如多酚、甾醇、维生素、矿物质、活性肽及益生菌等，但由于受到溶解性差、生物利用度低、加工或储藏过程易降解、胃肠道环境中稳定性不佳等因素的限制，很多的活性因子不能直接作为食品配料添加使用。亚微乳、胶体颗粒、脂质体、胶束(中国发明专利申请201210247061.9、201410619931.X、201710368816.3及美国专利申请7820788和7923536)等多个体系被用于提高难溶物质的生物有效性，并在制药、保健品和化妆品行业得到了广泛应用。然而在食品工业领域，这些输送体系的应用仍然受到诸多因素的限制，包括制备材料的成本较高，制备过程中需使用有机溶剂或合成的表面活性剂，以及稳定性和包埋率不佳等。
近年来，具有疏水配基亲和能力的蛋白质输送载体功能引起了研究者的关注，中国申请专利201510487563.2与201710035758.2分别利用玉米蛋白和大豆分离蛋白输送难溶活性物质。但是，这两种方法均涉及到有机溶剂的使用和繁琐的化学物理处理方法，包埋率不佳，操作不便，成本较高也不益于人体健康和不符合环境友好的理念。因此，基于食物蛋白质的胶体输送体系为提高难溶活性物质这一科学问题的解决提供了一条简单、绿色安全的途径，具有十分重要的社会、环境与经济效益。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将蛋白质加入水中，搅拌分散后水化，得到蛋白分散液；
(2)向蛋白分散液中加入离液剂，搅拌混合均匀后反应，得到变性蛋白溶液；
(3)将难溶活性物质直接加入或采用离液剂水溶液溶解后加入到步骤(2)所得变性蛋白溶液中，搅拌混合均匀后反应；所述难溶活性物质为多酚类化合物、甾类化合物、黄酮类化合物及疏水活性肽中的至少一种；
(4)将步骤(3)的反应液透析去除离液剂，离心去除不溶物，得到所述蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品。
优选地，步骤(1)中所述蛋白质为豆类7S蛋白、豆类11S蛋白、大豆分离蛋白、铁蛋白、酪蛋白酸钠中的至少一种。
优选地，步骤(1)中所述蛋白质的加入量为水质量的0.2％～6.0％。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述的离液剂是指尿素。
优选地，步骤(2)中向蛋白分散液中加入离液剂后，进一步在75～90℃温度下加热处理。
优选地，步骤(2)中所述离液剂的加入量为蛋白分散液质量的6％～48％。
优选地，步骤(3)中所述将难溶活性物质采用离液剂水溶液溶解时，离液剂的质量浓度与步骤(2)所得变性蛋白溶液中离液剂的浓度相同。
步骤(3)中所述多酚类化合物优选姜黄素或白藜芦醇；所述甾类化合物优选植物甾醇；所述黄酮类化合物优选大豆苷元或染料木素。
优选地，步骤(3)中所述难溶活性物质的加入量与变性蛋白溶液中所含蛋白质的质量比为(0.5～5):10。
优选地，步骤(4)中所述透析使用透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，透析时间为48～96h，每8h换一次透析液。
一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品，通过上述方法制备得到。
本发明的原理为：蛋白质与疏水性配体特异性结合的强度取决于蛋白质有限聚集或自组装的程度。我们常见的豆类7S蛋白或11S蛋白等通常是以不同亚基间的疏水作用形成的多聚体结构，各个亚基对环境的敏感程度不一。当蛋白质所处环境中存在离液剂(尿素或硫脲)时，离液剂会破坏各亚基间的疏水作用或氢键，从而使蛋白质结构不同程度的展开，埋于蛋白质亚基内部的疏水集团得以暴露，这为难溶活性物质提供了更多的结合位点。当通过透析去除离液剂时，解离或展开的亚基会形成以难溶物质为晶核，各亚基包裹于晶核外部的壳核结构，从而大大提高了难溶物质的溶解度及稳定性。因此，利用蛋白质的结构特征，通过离液剂诱导其与难溶物质共组装以获得不同类型的微结构，构建具有一定尺度的蛋白功能配料，以解决难溶活性物质加工稳定性与生物利用度的问题，确保特定营养素及功能因子在食品加工过程的稳定性和安全性，以及最终在人体的有效吸收。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明利用蛋白质的结构特性和离液剂如尿素诱导蛋白质对疏水物质的封装及包埋，形成高荷载的蛋白纳米制品，可以大大提高难溶物质的水溶性，如可使姜黄素增溶332,025倍。
(2)本发明方法在无需添加任何有机溶剂前提下，即可成功获得高稳定性的难溶活性物质水溶液。
(3)本发明的制备方法工艺简单、安全、成本低、能耗低，操作可控，适合大规模工业化生产与加工，在食品、保健品、日化用品、药品行业具有广阔的应用空间。
附图说明
图1是本发明实施例1在蛋白质量浓度均为1％，尿素(Uren)质量浓度为12％～48％时，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液外观图。
图2是本发明实施例1在蛋白质量浓度均为1％，尿素质量浓度为12％～48％时，游离姜黄素和所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒中姜黄素在水溶液(pH 7.0,80℃)中的降解动力学曲线图。
图3是本发明实施例1在蛋白质量浓度均为1％，尿素质量浓度为12％～48％时，游离姜黄素和所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒中姜黄素在体外模拟消化液中的降解动力学曲线图。
图4是本发明实施例2在大豆7S蛋白质量浓度为2％，尿素质量浓度为48％时，体系中姜黄素添加浓度为1～6mg/mL条件下，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液的外观图。
图5是本发明实施例3在大豆7S蛋白质量浓度为0.5％～6％条件下，尿素质量浓度为12％～48％时，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液对姜黄素的荷载量及姜黄素溶解度示意图。
图6是实施例5所得大豆7S蛋白-大豆苷元颗粒溶液的外观图。
图7为实施例5所得大豆7S蛋白-大豆苷元颗粒溶液在不同大豆苷元浓度条件下的荷载率与荷载量分布曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)准确称取1g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别取3g、6g、9g、12g尿素加入到25g大豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素浓度为12％～48％的变性蛋白溶液。
(3)另取3g、6g、9g、12g尿素分别加入到25g蒸馏水中，搅拌溶解1h得到与步骤(2)相同浓度的尿素溶液。然后向各浓度尿素溶液中加入25mg姜黄素粉末，避光磁力搅拌2h，后于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解，之后离心(5000g,10min)去除不溶物得到姜黄素溶液。
(4)按体积比1:1将步骤(3)的姜黄素溶液与步骤(2)的变性蛋白溶液混合均匀，于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1％、尿素质量浓度为12％～48％条件下(尿素摩尔浓度分别为2M、4M、6M、8M)，大豆7S蛋白荷载姜黄素的情况。大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液外观图如图1所示，四份溶液均呈现黄色透明溶液。动态光衍射技术显示四组颗粒溶液的平均粒径分别为：32.82nm、45.27nm、63.22nm、77.44nm，表明大豆7S蛋白与姜黄素之间形成了纳米尺寸大小的复合物。大豆7S蛋白荷载姜黄素的能力与尿素添加量具有明显关系，尿素浓度越高，大豆7S蛋白荷载量越高，尿素摩尔浓度分别为2M、4M、6M、8M时，每克大豆7S蛋白可荷载0.117mg、0.192mg、0.637mg、0.788mg的姜黄素。本实施例中四组大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液中的姜黄素(分别为7S-姜黄素I、7S-姜黄素II、7S-姜黄素III、7S-姜黄素IV)及游离姜黄素在pH＝7.0、80℃水溶液条件下的降解动力学曲线图如图2所示。由图2可见，所得7S蛋白-姜黄素颗粒溶液中的姜黄素3h保留率均超过75％，说明与大豆7S蛋白共组装可以显著提高姜黄素的稳定性。大豆7S蛋白-姜黄素颗粒中姜黄素及游离姜黄素在体外模拟消化液中的降解动力学曲线图如图3所示。体外模拟消化实验表明，共组装行为可显著提高姜黄素在消化液中的稳定性，经3h消化后，游离姜黄素的保留率仅为24.1％，而共组装颗粒中姜黄素的保留率可达79.3％。大豆7S蛋白-姜黄素颗粒中姜黄素及游离姜黄素的生物利用率对比结果如表1所示。表1结果显示共组装行为可显著提高姜黄素的利用率，游离姜黄素的生物利用率仅为21.5％，而共组装颗粒中姜黄素的生物利用率最高可达68.3％。
表1
| 样品 | 姜黄素的生物利用率(％) |
| 游离姜黄素 | 21.5％±4.84 |
| 7S-姜黄素I | 64.0％±6.21 |
| 7S-姜黄素II | 68.3％±5.71 |
| 7S-姜黄素III | 43.9％±5.39 |
| 7S-姜黄素IV | 40.6％±3.88 |
实施例2
(1)准确称取2g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为2％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)取48g尿素加入到100g大豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素质量浓度为48％的变性蛋白溶液。
(3)分别取姜黄素25mg、50mg、100mg、150mg加入到25g变性蛋白溶液中，避光磁力搅拌4h，后置于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解或吸附于蛋白质表面。
(4)将步骤(3)中充分混匀的组合液于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
本实施例在大豆7S蛋白质量浓度(C7S)为2％，尿素质量浓度(CUrea)为48％(8M)时，体系中姜黄素添加浓度为1～6mg/mL条件下，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液的外观图如图4所示。
本实施例在2％蛋白浓度下，姜黄素添加浓度为2mg/mL条件下，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液中姜黄素在水中的溶解度逐渐增大至3.68mg/mL，这相对于姜黄素晶体在水中的溶解度增大了332,025倍，其增溶效果显著高于环糊精及改性淀粉(4700倍，1670倍)。
实施例3
(1)分别称取2g、4g、8g、16g、24g大豆7S蛋白粉末，将其分别分散于400g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度分别为0.5％、1％、2％、4％、6％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)分别取0g、12g、24g、36g、48g尿素加入到100g步骤(1)所得各质量浓度的大豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，得到变性的蛋白溶液。
(3)分别取姜黄素50mg粉末加入到步骤(2)中所得16组25g变性蛋白溶液中，避光磁力搅拌4h，后置于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解或吸附于蛋白质表面。
(4)将步骤(3)中充分混匀的组合液于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
本实施例在大豆7S蛋白质量浓度分别为0.5％～6％条件下，尿素质量浓度分别为12％～48％(Urea＝2～8M)时，所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液对姜黄素的荷载量及姜黄素溶解度示意图如图5所示。由图5可见，当蛋白浓度为1％时荷载效率最高，可达20.21％。此外，随着蛋白浓度的增大，其对姜黄素的增溶作用是逐渐增大的，6％蛋白浓度下，姜黄素的溶解度可高达4.59mg/mL。且高浓度尿素处理的大豆7S蛋白，荷载能力更高。
实施例4
(1)准确称取2g芸豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为2％的芸豆7S蛋白贮存液。
(2)分别取3g、6g、9g、12g尿素加入到25g芸豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素浓度为12％～48％的变性蛋白溶液。
(3)另取3g、6g、9g、12g尿素分别加入到25g蒸馏水中，搅拌溶解1h得到与步骤(2)相同浓度的尿素溶液。然后向各浓度尿素溶液中加入50mg姜黄素粉末，避光磁力搅拌2h，后于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解，之后离心(5000g,10min)去除不溶物得到姜黄素溶液。
(4)按体积比1:1将步骤(3)的姜黄素溶液与步骤(2)的变性蛋白溶液混合均匀，于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到芸豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
本实施例考察了芸豆7S蛋白浓度为2％、尿素浓度为2～8M条件下，芸豆7S蛋白对荷载姜黄素的影响。结果显示四份溶液均呈现浅黄色透明溶液，且颜色差别不明显。四组蛋白荷载量分别为0.14mg/g、0.15mg/g、0.15mg/g及0.143mg/g。与芸豆7S蛋白对比，大豆7S蛋白具有更为优越的荷载姜黄素能力。
实施例5
(1)准确称取1g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)取36g尿素加入到100g大豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，得到变性的蛋白溶液，将每组变性蛋白溶液均分为四等份25g变性蛋白溶液。
(3)分别取0mg、12.5mg、25mg、125mg大豆苷元粉末加入到25g变性蛋白溶液中，避光磁力搅拌2h，后置于4℃静置12h，使大豆苷元充分溶解，离心(5000g,10min)去除不溶物得到大豆苷元、大豆7S蛋白混合液。
(4)将步骤(3)中所得混合液于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-大豆苷元颗粒溶液(大豆苷元浓度分别为0、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL)。
本实施例所得大豆7S蛋白-大豆苷元颗粒溶液的外观图如图6所示，由图6可见，四份溶液均为清澈透明溶液。
本实施例考察了大豆7S蛋白浓度为1％、尿素浓度6M条件下，大豆7S蛋白对荷载大豆苷元的影响，所得大豆7S蛋白-大豆苷元颗粒溶液在不同大豆苷元浓度条件下的荷载率与荷载量分布曲线图如图7所示。由图7结果可以看出，随着反应体系中大豆苷元浓度的增加(0.5～5mg/mL)，7S对大豆苷元的荷载率由99.3％降至77.6％，而大豆7S蛋白对大豆苷元的荷载量呈线性增加，当大豆苷元添加量为5mg/mL时，大豆7S对大豆苷元的荷载量达到194μg/mg，此时，大豆苷元在水中的溶解度达到3.88mg/mL，比游离大豆苷元晶体水溶性提高了151627倍，比单独使用β-环糊精包埋的大豆苷元水溶性提高了26605倍，比经羟丙基修饰的环糊精与羟丙基甲基纤维素/聚乙稀吡咯烷酮混合物作为载体包埋大豆苷元水溶性提高了11935倍。
实施例6
(1)准确称取1g大豆11S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆11S蛋白贮存液。
(2)取36g尿素加入到100g大豆11S蛋白贮存液中，于75℃下加热处理30分钟，之后冷却至室温磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素浓度为36％的变性蛋白溶液。
(3)另取36g尿素加入到100g蒸馏水中，搅拌溶解1h得到与步骤(2)相同浓度的尿素溶液。然后向尿素溶液中加入25mg姜黄素粉末，避光磁力搅拌2h，后于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解，之后离心(5000g,10min)去除不溶物得到姜黄素溶液。
(4)按体积比1:1将步骤(3)的姜黄素溶液与步骤(2)的变性蛋白溶液混合均匀，于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆11S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
经测试本实施例所得大豆11S蛋白-姜黄素颗粒溶液中每克大豆11S蛋白可荷载0.83mg姜黄素。
实施例7
(1)准确称取1g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)取36g尿素加入到100g大豆7S蛋白贮存液中，于90℃下加热处理30分钟，之后冷却至室温磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素浓度为36％的变性蛋白溶液。
(3)另取36g尿素加入到100g蒸馏水中，搅拌溶解1h得到与步骤(2)相同浓度的尿素溶液。然后向尿素溶液中加入25mg姜黄素粉末，避光磁力搅拌2h，后于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解，之后离心(5000g,10min)去除不溶物得到姜黄素溶液。
(4)按体积比1:1将步骤(3)的姜黄素溶液与步骤(2)的变性蛋白溶液混合均匀，于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
经测试本实施例所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液中每克大豆7S蛋白可荷载0.91mg姜黄素。相比实施例1中尿素浓度为36％(6M)时的0.637mg具有一定程度的提高。这说明，在提高姜黄素溶解度方面，热处理与尿素处理是协同作用。
实施例8
(1)准确称取1g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)取12g尿素加入到100g大豆7S蛋白贮存液中，于90℃下加热处理30分钟，之后冷却至室温磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，以获得尿素浓度为36％的变性蛋白溶液。
(3)另取12g尿素加入到100g蒸馏水中，搅拌溶解1h得到与步骤(2)相同浓度的尿素溶液。然后向尿素溶液中加入25mg姜黄素粉末，避光磁力搅拌2h，后于4℃静置12h，使姜黄素充分溶解，之后离心(5000g,10min)去除不溶物得到姜黄素溶液。
(4)按体积比1:1将步骤(3)的姜黄素溶液与步骤(2)的变性蛋白溶液混合均匀，于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液。
经测试本实施例所得大豆7S蛋白-姜黄素颗粒溶液中每克大豆7S蛋白可荷载0.74mg姜黄素。相比实施例1中尿素浓度为36％(6M)时的0.637mg要高。这说明在工业生产中，也可通过加热的方式，减少尿素的用量，从而减少透析时间，提高生产效率。
实施例9
(1)准确称取1g大豆7S蛋白粉末，将其分散于100g蒸馏水中(默认蒸馏水的密度为1.00g/mL)，并于室温连续搅拌2h，后置于4℃低温静置12h(静置前于蛋白分散液中添加质量浓度为0.02％的叠氮钠，防止微生物的生长)，使蛋白充分水化，以获得质量浓度为1％的大豆7S蛋白贮存液。
(2)取36g尿素加入到100g大豆7S蛋白贮存液中，磁力搅拌2h，后置于4℃低温静置12h，使蛋白充分变性，并将溶液pH调制7.0，得到变性的蛋白溶液，将每组变性蛋白溶液均分为四等份25g变性蛋白溶液。
(3)分别取0mg、12.5mg、25mg、125mg植物甾醇粉末加入到25g变性蛋白溶液中，避光磁力搅拌2h，后置于4℃静置12h，使植物甾醇充分溶解，离心(5000g,10min)去除不溶物得到植物甾醇、大豆7S蛋白混合液。
(4)将步骤(3)中所得混合液于4℃冰箱中透析72h(透析液为pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，8h更换一次透析液)去除尿素，最后离心(5000g,10min)去除不溶物，得到大豆7S蛋白-植物甾醇颗粒溶液。
实验结果表明本实施例所得四份大豆7S蛋白-植物甾醇颗粒溶液样品均呈现清澈透明溶液。随着反应体系中植物甾醇浓度的增加(0.5～5mg/mL)，大豆7S蛋白对植物甾醇的荷载率由93.1％降至79.5％，而大豆7S蛋白对植物甾醇的荷载量呈线性增加。贮藏稳定性试验表明，大豆7S蛋白-植物甾醇颗粒溶液在室温条件下贮藏7天，其上清液植物甾醇保留率高达89.5％，而游离的植物甾醇30min内保留率已下降至5％以下，说明与大豆7S蛋白共组装可以显著提高植物甾醇的稳定性。体外模拟消化实验表明，共组装行为可显著提高植物甾醇在消化液中的稳定性，经3h消化后，游离植物甾醇的保留率仅为9.7％，而共组装颗粒溶液中姜黄素的保留率可达82.1％。此外共组装行为可显著提高植物甾醇的利用率，游离植物甾醇的生物利用率仅为9.5％，而共组装颗粒溶液中姜黄素的生物利用率达到了73.6％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)将蛋白质加入水中，搅拌分散后水化，得到蛋白分散液；
(2)向蛋白分散液中加入离液剂，搅拌混合均匀后反应，得到变性蛋白溶液；
(3)将难溶活性物质直接加入或采用离液剂水溶液溶解后加入到步骤(2)所得变性蛋白溶液中，搅拌混合均匀后反应；所述难溶活性物质为多酚类化合物、甾类化合物、黄酮类化合物及疏水活性肽中的至少一种；
(4)将步骤(3)的反应液透析去除离液剂，离心去除不溶物，得到所述蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述蛋白质为豆类7S蛋白、豆类11S蛋白、大豆分离蛋白、铁蛋白、酪蛋白酸钠中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述蛋白质的加入量为水质量的0.2％～6.0％。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中所述的离液剂是指尿素。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(2)中向蛋白分散液中加入离液剂后，进一步在75～90℃温度下加热处理。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述离液剂的加入量为蛋白分散液质量的6％～48％。
7.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述将难溶活性物质采用离液剂水溶液溶解时，离液剂的质量浓度与步骤(2)所得变性蛋白溶液中离液剂的浓度相同。
8.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述多酚类化合物为姜黄素或白藜芦醇；所述甾类化合物为植物甾醇；所述黄酮类化合物为大豆苷元或染料木素。
9.根据权利要求1所述的一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述难溶活性物质的加入量与变性蛋白溶液中所含蛋白质的质量比为(0.5～5):10。
10.一种蛋白自组装包埋难溶活性物质纳米制品，其特征在于：通过权利要求1～9任一项所述的方法制备得到。
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