CN111150063A - 一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法和应用 - Google Patents
一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，步骤如下：将水溶性活性成分溶于去离子水中制备母液，将疏水性活性成分溶于乙醇中制得母液；调节pH，将水溶性活性成分添加到变性的铁蛋白溶液中，搅拌，孵育；调节pH，混匀；调节温度诱使铁蛋白的通道扩张，加入疏水性活性成分母液，诱导疏水性活性成分通过通道进入铁蛋白空腔内部；离心，收集上清液，即得铁蛋白‑水溶性活性成分‑疏水性活性成分复合物。本方法得到的复合物水溶性好，包埋率高，同时有效地提高了水溶性活性成分的热稳定性，改善了疏水性活性成分的溶解性和热稳定性，提高了两种活性分子在模拟胃肠液中的稳定性，提高了铁蛋白的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，尤其是一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法和应用。
背景技术
食品天然生物活性化合物因其具有调节人体健康等多种功能而受到越来越多的关注。限制这些生物活性成分应用的一个障碍即是它们在加工和储存过程中，由于温度、氧气和光照等环境因素的影响，容易发生降解，从而失去功能活性。限制这些活性成分应用的一个障碍是其生物利用度低。比如它们加工储藏时的热稳定性较差，而且，这些活性组分在胃肠道的稳定性差，容易降解。值得注意的是，生物活性化合物和许多生物大分子(例如蛋白质、碳水化合物和脂类等)共存于食物基质中，它们的共价或非共价相互作用将影响生物利用度。目前，在功能食品领域，单一成分作为添加物的营养学功能较为有限，随着功能食品产业的发展，人们日益要求产品富含多种活性成分进而实现更广泛的功能，这一需求日渐增加。如何将不同性质的活性成分同时包封在同一基质中，成为了此类功能性食品开发中的一个挑战。
蛋白质是一种常见的生物大分子，蛋白质作为不同性质氨基酸(亲水性或疏水性)经过盘曲折叠形成的多级结构，普遍在蛋白表面具有亲水/疏水和荷电区域，可能特定组分(如多酚类生活活性分子)结合，进而实现活性分子的载体化。存在于豆科植物种子中的铁蛋白为多种活性组分的同时载体化提供了一条新思路。首先，球形空壳状的铁蛋白具有装载活性小分子的天然结构。铁蛋白(ferritin)是存在于动物、植物体内的铁储藏蛋白。结构上，铁蛋白一般由24个相同或相似的亚基组成，形成一个4-3-2轴对称的球状空壳状的蛋白质分子。铁蛋白24个亚基形盘曲围绕形成多个通道结构，具有6个4倍轴通道，8个3倍轴通道，12个2倍轴通道，这些通道是连接铁蛋白内部空腔和外部环境的重要媒介。铁蛋白球形空壳蛋白的内径为8nm，外径为12nm，厚度为2nm，因此铁蛋白存在直径为8nm的空腔结构，其内表面氨基酸同时分布有疏水性氨基酸(酪氨酸等)和亲水性氨基酸(谷氨酸等)，铁蛋白独特的纳米空腔界面为不同活性小分子的载体化提供了天然的结构基础，并具有对内部分子起到包埋和屏蔽作用的潜力。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法和应用，该方法得到的铁蛋白-水溶性小分子-疏水性小分子复合物，其具有水溶性好，两种小分子组分包埋率高的特点，同时复合物的形成有效地提高了水溶性活性成分的热稳定性，并且显著改善了疏水性活性成分的溶解性和热稳定性，提高了两种活性分子在模拟胃肠液中的稳定性，提高了铁蛋白的应用范围，并为多种活性小分子同时载体化提供了途径，该方法制得的产品能够应用在饮料、食品添加剂、功能食品等行业中。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，步骤如下：
将水溶性活性成分溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中水溶性活性成分的浓度为3.0mM，将疏水性活性成分溶于浓度为90％-95％的乙醇中制得母液，该母液中疏水性活性成分的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使铁蛋白变性解离为亚基状态，将水溶性活性成分添加到变性的铁蛋白溶液中，使水溶性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10-20min，并随后孵育90-120min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置30min，目的是使铁蛋白复性并诱导水溶性活性成分包埋于铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的铁蛋白-水溶性活性成分复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，诱使铁蛋白的通道扩张，随后将疏水性活性成分母液稀释后添加到该体系中，使疏水性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导疏水性活性成分通过通道进入铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
而且，具体步骤如下：
⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2-3倍体积含有质量浓度为1％-2％聚乙烯吡咯烷酮的50mM KH2PO4-Na2HPO4溶液，该溶液的pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；
⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；
⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；
⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；将获得的红豆铁蛋白放入透析袋，置于pH8.0-8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，然后使用质量浓度为1-2％连二亚硫酸钠溶液不断透析还原铁蛋白，直到铁蛋白中的Fe3+逐步还原为Fe2+，被透析除去，再加入1-2mM 2,2’-联吡啶螯合去掉铁蛋白外壳上吸附的铁离子，最后用pH 7.5-7.9的50mM MOPS缓冲液把2,2’-联吡啶透析除去，获得脱铁红豆铁蛋白，下一步备用；
⑸采用铁蛋白的可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应分别进行两种组分的包埋，即进行水溶性的表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和疏水性的槲皮素的包埋：
首先将EGCG溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为3.0mM，将槲皮素溶于浓度为90-95％的乙醇中制得母液，该母液中槲皮素的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节脱铁红豆铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使脱铁红豆铁蛋白变性解离为亚基状态，将EGCG添加到变性的脱铁红豆铁蛋白溶液中，使EGCG：脱铁红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10min，并随后孵育90min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节脱铁红豆铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置20-30min，目的是诱导脱铁红豆铁蛋白复性并诱导EGCG包埋于脱铁红豆铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的脱铁红豆铁蛋白-EGCG复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，使脱铁红豆铁蛋白的通道扩张，随后将槲皮素母液稀释后添加到该体系中，稀释液为90％-95％浓度乙醇，使槲皮素：脱铁红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导槲皮素进入脱铁红豆铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
如上所述的利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法制得的铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物在食品方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法成功地将具有不同溶解性特征的两种生物活性成分(如，亲水性的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和疏水性的槲皮素)包封在同一食品蛋白基质-铁蛋白中，该方法能够用天然植物蛋白同时包埋疏水性和水溶性活性成分并提高它们的稳定性。本发明方法通过应用铁蛋白的可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应，同时诱导两种不同溶解性质的活性小分子同时包埋于铁蛋白内部，获得铁蛋白-水溶性小分子-疏水性小分子复合物。并且，复合物的形态相较于铁蛋白并没有显著改变，为典型的球形状态；复合物尺寸维持在12nm，相比于铁蛋白也没有显著变化。。复合物中两种活性分子的包埋率分别为22.0％(EGCG)和16.6％(槲皮素)。获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物在70℃下能够有效提高EGCG的稳定性3.07倍，能够提高槲皮素的稳定性2.41倍。获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物在模拟胃肠消化中能够显著提高两种活性组分的保留率，有利于EGCG和槲皮素在肠道中的稳定性和生物利用度。本发明方法提供了一种新的方案来设计和制造用于多种生物活性成分的基于铁蛋白的载体，并且有益于在一种蛋白基质中强化多种活性组分的食品。
2、本发明的开展基于铁蛋白的两个重要性质：即(1)铁蛋白的可逆自组装性质；(2)铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应。具体的，铁蛋白的空腔结构在变性条件下(如调节pH值至2.0或添加变性剂)可以解离为单亚基，当恢复pH值至中性时，铁蛋白会恢复其球形结构。利用这一性质，将铁蛋白空壳结构作为可食纳米材料，在铁蛋白的变性复性过程中添加小分子活性物质，将其包埋于铁蛋白的空腔内，具有一定的可行性。另外，铁蛋白受热引发铁蛋白通道扩张，扩张的通道具有容纳活性组分通过的性质，这也为小分子的包埋提供了全新的途径。本发明同时应用铁蛋白的可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应诱导两种不同溶解性质的活性小分子同时包埋与铁蛋白内部，进而提高水溶性分子的热稳定性及肠胃稳定性，并提高疏水性小分子的水溶性、热稳定性及肠胃稳定性。该发明以铁蛋白、活性小分子类物质为原料，利用铁蛋白将两种小分子物质载体化以提高其溶解性和稳定性的方法应用在国内外未见公开报道，未见公开使用。
附图说明
图1为本发明中一种获得铁蛋白-水溶性小分子-疏水性小分子复合物路线图；
图2为本发明中红豆铁蛋白的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明中红豆铁蛋白的透射电镜图；
图4为本发明中红豆铁蛋白的动态光散射尺寸分布图；
图5为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物产品照片与铁蛋白、EGCG、槲皮素水溶液对比图；
图6为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物透射电镜图；
图7为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的尺寸分布图；
图8为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物与铁蛋白的圆二色谱对比图；
图9为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的EGCG在模拟胃消化释放中的稳定性图；
图10为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的槲皮素在模拟胃消化释放中的稳定性图；
图11为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的EGCG在模拟肠消化释放中的稳定性图；
图12为本发明中获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的槲皮素在模拟肠消化释放中的稳定性图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，步骤如下：
将水溶性活性成分溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中水溶性活性成分的浓度为3.0mM，将疏水性活性成分溶于浓度为90％-95％的乙醇中制得母液，该母液中疏水性活性成分的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使铁蛋白变性解离为亚基状态，将水溶性活性成分添加到变性的铁蛋白溶液中，使水溶性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10-20min，并随后孵育90-120min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置30min，目的是使铁蛋白复性并诱导水溶性活性成分包埋于铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的铁蛋白-水溶性活性成分复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，诱使铁蛋白的通道扩张，随后将疏水性活性成分母液稀释后添加到该体系中，使疏水性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导疏水性活性成分通过通道进入铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。如图5所示。
如上所述的利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法制得的铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物能够应用在食品方面中。
实施例2
一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，步骤如下：
⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2-3倍体积含有质量浓度为1％-2％聚乙烯吡咯烷酮的50mM KH2PO4-Na2HPO4溶液，该溶液的pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；
⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；
⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；
⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；将获得的红豆铁蛋白放入透析袋，置于pH8.0-8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，然后使用质量浓度为1-2％连二亚硫酸钠溶液不断透析还原铁蛋白，直到铁蛋白中的Fe3+逐步还原为Fe2+，被透析除去，再加入1-2mM 2,2’-联吡啶螯合去掉铁蛋白外壳上吸附的铁离子，最后用pH 7.5-7.9的50mM MOPS缓冲液把2,2’-联吡啶透析除去，获得的脱铁铁蛋白即为步骤⑸中使用的铁蛋白。
⑸采用可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应分别进行两种组分的包埋，即进行表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和疏水性的槲皮素的包埋：
首先将EGCG溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为3.0mM，将槲皮素溶于浓度为3.0mM的乙醇中制得母液，该母液中槲皮素的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节红豆铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使红豆铁蛋白变性解离为亚基状态，将EGCG添加到变性的红豆铁蛋白溶液中，使EGCG：红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10min，并随后孵育90min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节红豆铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置20-30min，目的是诱导红豆铁蛋白复性并诱导EGCG包埋于红豆铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的红豆铁蛋白-EGCG复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，使红豆铁蛋白的通道扩张，随后将槲皮素母液稀释后添加到该体系中，稀释液为90％-95％浓度乙醇，使槲皮素：红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导槲皮素进入红豆铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得红豆铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
实施例3
一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2倍体积含有质量浓度为1％聚乙烯吡咯烷酮的50mM KH2PO4-Na2HPO4溶液，该溶液的pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆在于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；
⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；
⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；
⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；将获得的红豆铁蛋白放入透析袋，置于pH8.0-8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，然后使用质量浓度为1-2％连二亚硫酸钠溶液不断透析还原铁蛋白，直到铁蛋白中的Fe3+逐步还原为Fe2+，被透析除去，再加入2,2’-联吡啶(1-2mM)螯合去掉铁蛋白外壳上吸附的铁离子，最后用pH 7.5-7.9的50mM MOPS缓冲液把2,2’-联吡啶透析除去，获得的脱铁铁蛋白即为步骤⑸中使用的铁蛋白。
⑸采用可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应分别进行两种组分的包埋，即进行表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和疏水性的槲皮素的包埋：
首先将EGCG溶于pH6.70的去离子水中制备母液，该母液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为3.0mM，将槲皮素溶于浓度为3.0mM的乙醇中制得母液，该母液中槲皮素的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节红豆铁蛋白溶液的pH至2.0，使红豆铁蛋白变性解离为亚基状态，将EGCG添加到变性的红豆铁蛋白溶液中，使EGCG：红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10min，并随后孵育90min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节红豆铁蛋白溶液的pH至6.7，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置30min，目的是诱导红豆铁蛋白复性并诱导EGCG包埋于红豆铁蛋白中；
使用水浴加热：诱导以上获得的红豆铁蛋白-EGCG复合物温度升高至46℃，并维持30min，使红豆铁蛋白的通道扩张，随后将槲皮素母液添加到该体系中，使槲皮素：红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至46℃条件30min，并搅拌，诱导槲皮素进入红豆铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
本发明方法获得铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的相关检测：
表1中槲皮素含量的测定：首先，将本发明方法获得的样品用透析袋(截留分子量为10kDa)在去离子水(pH 7.0)中透析3次，间隔为60分钟。然后将装有槲皮素的样品pH值调节至2.0，以解离铁蛋白并释放槲皮素分子，然后收集释放的槲皮素并将其转移至离心过滤装置以4000rpm离心25分钟。收集渗透到离心管中的槲皮素用于HPLC分析测定包埋率。液相条件：高效液相色谱(HPLC)通过带有UV检测器和Apollo C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)的HPLC系统进行。流动相甲醇：0.3％的磷酸(58：42，V/V)，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量20ul，波长370nm。
表1中EGCG含量的测定：首先，将本发明方法获得的样品用透析袋(截留分子量为10kDa)在去离子水(pH 7.0)中透析3次，间隔为60分钟。用HCl(1M)将样品溶液(1.0μM，4.0mL)的pH值调节至pH 2.0，4℃反应50分钟。将样品分解为亚基；随后，将EGCG储备溶液以蛋白/EGCG比率为1：120的比例添加到上述溶液中，然后在黑暗中搅拌30min(4℃)以产生均匀的溶液。然后将所得混合物的pH用NaOH(1.0M)调节至6.7，然后在4℃下孵育60分钟以诱导重新组装，从而生成负载EGCG的蛋白纳米颗粒。然后将产物用MOPS缓冲液(20mM，pH 6.7)透析(MW 10kDa截止)，并进行三个缓冲液更换(每1.5小时间隔)，从而得到负载EGCG的复合物纳米颗粒。还通过可逆拆卸/重新组装方法制备了负载EGCG的对照蛋白作为对照样品。为了测定样品中封装的EGCG浓度，通过添加HCl(1M)将装载EGCG的铁蛋白(3mL)调节至pH2.0，以将铁蛋白笼分解成亚基，从而释放EGCG，然后转移到离心过滤器设备，以4000rpm离心25分钟后，通过HPLC定量游离EGCG。高效液相色谱(HPLC)通过带有UV检测器和WatersXterra RP18色谱柱(4.6×250mm，5μm)的HPLC系统进行。通过使用甲醇/水的流动相(99.9：0.1，v/v)洗脱样品，进样量为15μL，流动相的流速为0.7mL/min，波长设置为280nm。
表2中EGCG及槲皮素热稳定性分析：将本发明方法获得的样品用透析袋(截留分子量为10kDa)在去离子水(pH 7.0)中透析3次，间隔为60分钟。得到的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物随后用铝箔覆盖，并在30和70℃的条件下处理6小时。作为对照组的游离的槲皮素、EGCG也通过相同的热处理进行。三个样品中残留的槲皮素、EGCG通过HPLC定量。
胃肠稳定性分析步骤：开始模拟胃消化前将样品用1M HCl调节pH值至2.0。将猪胃蛋白酶以1：12.5的比例(胃蛋白酶：蛋白质)添加到样品中。将样品置于装有孵化器的水浴中，在黑暗中以140rpm的速度在37℃下放置120分钟。孵育后，将样品的pH用0.1mol/LNaHCO3调节至7.0。在胃消化后(pH为2.0或4.0)进行模拟肠消化。将pH调节至7.0后，将胰酶以1：62.5的比例(胰酶：蛋白质)添加到样品中。将样品置于装有孵育摇床的水浴中，在黑暗中以140rpm在37℃下放置120分钟。分别将胃消化和肠消化后残留的EGCG和槲皮素释放量通过HPLC方法定量。定量方法见表1中两种分子含量的测定步骤。
结果分析：
1.图1为获得本发明中铁蛋白-水溶性小分子-疏水性小分子复合物的路线图。红豆经过处理获得红豆铁蛋白，经过脱铁处理获得脱铁铁蛋白。该脱铁铁蛋白经过酸处理解离变性，水溶性的活性分子(EGCG)添加到该变性体系中，经过变性复性作用构建铁蛋白-EGCG复合物。该复合物经过热处理扩大铁蛋白-EGCG复合物中的铁蛋白通道尺寸，诱导疏水性活性成分(槲皮素)进入铁蛋白内部，构建铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物。对铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的形态及结构(电镜形态、溶液尺寸分布、圆二色谱)进行分析。对铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的两种分子的热稳定性进行分析。并构建模拟胃肠体系，分析铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的两种分子的胃肠稳定性进行分析。
2、利用SDS-PAGE分析制备的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物，结果见图2，由图2可以看出，分离得到主要成分为28.5kDa分子量的亚基条带，为铁蛋白特有的蛋白质亚基条带。
3.利用透射电镜实验分析检测铁蛋白的形态，结果见图3，透射电镜图表明获得的铁蛋白具有规则的球形结构，大小约为12nm，为典型的铁蛋白形态。
4.利用动态光散射分析检测铁蛋白在溶液中的尺寸分布，结果见图4，表明获得的铁蛋白的水合半径为7.57nm，为典型的铁蛋白在溶液中的尺寸分布。
5.利用照片直观分析铁蛋白、EGCG、槲皮素、铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的溶解性状态，结果见图5，该结果清晰地表明槲皮素的溶解性经铁蛋白载体化后具有明显提升，溶液呈现透明状态。
6.利用透射电镜实验分析检测铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的形态，结果见图6，透射电镜图表明获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物具有规则的球形结构，大小约为12nm，为典型的铁蛋白形态，说明EGCG及槲皮素包埋在铁蛋白后没有显著改变铁蛋白的形态。另外，结果显示铁蛋白球的中间不具备黑色的核，这是由于小分子的EGCG和槲皮素包埋进入铁蛋白导致的。
7.利用动态光散射分析检测铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物在溶液中的尺寸分布，结果见图7，表明铁蛋白包埋EGCG和槲皮素后水合半径没有发生显著变化，主体为7.71nm，但是具有少量的19.22nm尺寸分布，这可能是由于EGCG和槲皮素诱导的铁蛋白聚合引起的。
8.通过圆二色谱法以测定铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物的结构变化，结果见图8所示。光谱结果表明铁蛋白包埋EGCG和槲皮素前后的圆二色谱图谱变化并不显著，说明小分子的包埋并没有显著改变铁蛋白的二级结构。
9.利用体外模拟胃肠稳定性分析铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中的EGCG及槲皮素稳定性，结果见图9-图12所示。图9表明，相较于对照的未包埋的EGCG，获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物能够显著提高EGCG在模拟胃消化中缓释效果，其EGCG释放速率显著低于对照游离的EGCG，减缓了EGCG在模拟胃消化中的快速释放。同样的，图10表明，相较于未包埋的槲皮素对照品，获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中能够显著提高槲皮素在模拟胃消化中缓释效果，减缓了槲皮素在模拟胃消化中的快速释放。图11表明，相较于对照的未包埋的EGCG，得到的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中能够显著提高EGCG在模拟肠消化中缓释效果，前90分钟内其EGCG释放速率显著低于对照游离的EGCG，有利于延长EGCG在肠消化中的消化时间。图12表明，相较于对照的未包埋的槲皮素，获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中在前65分钟内能够显著提高槲皮素在模拟肠消化中缓释效果。总之，铁蛋白将两种分子包埋之后，能够显著减慢EGCG和槲皮素在模拟胃肠道中的暴露时间，有利于减弱两种分子受肠胃复杂pH、离子、酶等因素的影响，从而有利于提高它们的肠胃稳定性及生物利用度
10.表1表明复合物中两种活性分子的包埋率分别为22.0％(EGCG)和16.6％(槲皮素)。
11.表2表明获得的铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物在70℃下能够有效提高EGCG的稳定性3.07倍，能够提高槲皮素的稳定性2.41倍。
表1铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中两组分活性组分包埋率
表2铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物中两组分活性组分经不同温度(30℃和70℃)处理后的残留率
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (3)
1.一种利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，其特征在于：步骤如下：
将水溶性活性成分溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中水溶性活性成分的浓度为3.0mM，将疏水性活性成分溶于浓度为90％-95％的乙醇中制得母液，该母液中疏水性活性成分的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使铁蛋白变性解离为亚基状态，将水溶性活性成分添加到变性的铁蛋白溶液中，使水溶性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10-20min，并随后孵育90-120min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置30min，目的是使铁蛋白复性并诱导水溶性活性成分包埋于铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的铁蛋白-水溶性活性成分复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，诱使铁蛋白的通道扩张，随后将疏水性活性成分母液稀释后添加到该体系中，使疏水性活性成分：铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导疏水性活性成分通过通道进入铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
2.根据权利要求1所述的利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法，其特征在于：具体步骤如下：
⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2-3倍体积含有质量浓度为1％-2％聚乙烯吡咯烷酮的50mM KH2PO4-Na2HPO4溶液，该溶液的pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；
⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；
⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；
⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；将获得的红豆铁蛋白放入透析袋，置于pH8.0-8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中，然后使用质量浓度为1-2％连二亚硫酸钠溶液不断透析还原铁蛋白，直到铁蛋白中的Fe3+逐步还原为Fe2+，被透析除去，再加入1-2mM 2,2’-联吡啶螯合去掉铁蛋白外壳上吸附的铁离子，最后用pH 7.5-7.9的50mM MOPS缓冲液把2,2’-联吡啶透析除去，获得脱铁红豆铁蛋白，下一步备用；
⑸采用铁蛋白的可逆自组装性和铁蛋白受热引发的通道尺寸增大效应分别进行两种组分的包埋，即进行水溶性的表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和疏水性的槲皮素的包埋：
首先将EGCG溶于pH6.70-6.90的去离子水中制备母液，该母液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为3.0mM，将槲皮素溶于浓度为3.0mM的乙醇中制得母液，该母液中槲皮素的浓度为2.5mM；利用1M的HCl调节脱铁红豆铁蛋白溶液的pH至2.0-2.5，使脱铁红豆铁蛋白变性解离为亚基状态，将EGCG添加到变性的脱铁红豆铁蛋白溶液中，使EGCG：脱铁红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，然后将制得的溶液在25℃下搅拌10min，并随后孵育90min，使混合物均匀化；随后往该体系中添加1M的NaOH溶液并调节脱铁红豆铁蛋白溶液的pH至6.70-6.90，充分搅拌溶液使之混合均匀，并静置20-30min，目的是诱导脱铁红豆铁蛋白复性并诱导EGCG包埋于脱铁红豆铁蛋白中；
使用水浴加热，诱导以上获得的脱铁红豆铁蛋白-EGCG复合物温度升高至44-46℃，并维持20-30min，使脱铁红豆铁蛋白的通道扩张，随后将槲皮素母液稀释后添加到该体系中，稀释液为90％-95％浓度乙醇，使槲皮素：脱铁红豆铁蛋白的摩尔比为120：1，继续维持至44-46℃条件20-30min，并搅拌，诱导槲皮素进入脱铁红豆铁蛋白空腔内部，形成三组分复合物；以8000-9000rpm离心20min澄清样品，收集上清液，即得铁蛋白-EGCG-槲皮素复合物，该复合物中疏水性及水溶性活性成分的稳定性均得到提高。
3.如权利要求1或2所述的利用笼状植物铁蛋白同时提高疏水性及水溶性活性成分稳定性的方法制得的铁蛋白-水溶性活性成分-疏水性活性成分复合物在食品方面中的应用。
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