CN109517866A - 一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白‑壳聚糖复合物的方法，步骤如下：所述方法以红豆提取铁蛋白为原料，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，即得铁蛋白‑壳聚糖复合物，得到的铁蛋白‑壳聚糖复合物具有相较于铁蛋白更高的稳定性。本方法利用转谷氨酰胺酶催化壳聚糖共价结合于铁蛋白外壳上，提高铁蛋白的热稳定性及肠胃消化稳定性，进而提高铁蛋白的生物利用度和补铁效率，该方法制得的铁蛋白‑壳聚糖复合物能够应用在食品添加剂、饲料、保健食品等行业中。

Description

一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物 的方法

技术领域

本发明属于食品技术领域，尤其是一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法。

背景技术

铁是人体所必需的营养元素，全球近一半人罹患铁缺乏，严重的话会影响着人们的健康。缺铁性贫血是当今世界发病率最高的营养性疾病之一。而传统的补铁制剂由于受到小分子螯合剂的干扰，导致补铁效果不理想；同时也会对人体产生毒副作用而逐渐被禁止使用。因此寻找一种天然、无毒、生物可溶性的补铁产品迫在眉睫。

铁蛋白是生物中内在铁的主要存在形式，能以可溶的、无毒的、生物可利用的形式存储大量的铁原子(每分子铁蛋白最多可容纳4500个Fe原子)，而且可以调节细胞内铁的动态平衡。研究表明铁蛋白是含有三价铁离子的复合物，其储存的铁生物利用性较高，且不会引起毒副作用，是非常有效的铁营养源。其中以大豆铁蛋白为代表的植物铁蛋白被认为是未来的一种天然安全的补铁因子。在日常接触的食物中，相较于其他铁来源，豆科植物中铁蛋白含量最为丰富，其铁蛋白含量大约为50-70mg/kg，每分子铁蛋白能够容纳约1800个三价铁。因此，铁蛋白是补铁制剂开发的良好材料。其中以大豆种子铁蛋白研究最多，大豆种子铁蛋白被认为是未来一种新型的、天然的功能性补铁因子。

现今国内外对于铁蛋白的研究主要集中于铁蛋白体内调节铁的代谢平衡及铁蛋白的独特的纳米空腔方面，但是在应用方面受到很多的限制。例如，铁蛋白作为一种蛋白组分，其理化性质极易受到外界环境的影响，例如pH、温度、离子强度等。铁蛋白等电点在pH5.0左右，低酸性条件下，溶解度及稳定性都很差，当食品为酸性体系时，铁蛋白的使用就会受到限制。在肠胃中，铁蛋白也非常不稳定，容易被胰蛋白酶和胃蛋白酶降解，导致了铁蛋白中铁的生物利用度下降。因此，为改善铁蛋白的一些功能特性，扩大铁蛋白的应用范围，通过铁蛋白改性显得尤为重要。

利用多糖对铁蛋白进行修饰的手段是一种良好的技术手段，越来越受到人们的关注。研究发现，蛋白质多糖复合物可以提高蛋白质的物理稳定性、溶解性、抗菌性、抗氧化性等。壳聚糖是自然界唯一带阳离子(游离-NH³⁺)的天然氨基多糖，其化学结构由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的直链氨基多糖，生物相容性好，成本低。转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TG)，是一种可催化转酰胺基反应的酶，它可以催化蛋白质赖氨酸上的氨基和其他化合物上的酰胺基结合，从而导致蛋白质与其他分子之间发生共价交联，形成相应的聚合产物。因此，通过转谷氨酰胺酶的催化作用，将壳聚糖催化结合于铁蛋白外壳上，具有改进铁蛋白结构，提高铁蛋白的功能特性，进而提高铁蛋白中铁的生物利用率的潜力。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于针对铁蛋白不稳定的难题，克服现有技术的不足之处，提供一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，该方法利用转谷氨酰胺酶催化壳聚糖共价结合于铁蛋白外壳上，提高铁蛋白的热稳定性及肠胃消化稳定性，进而提高铁蛋白的生物利用度和补铁效率，该方法制得的铁蛋白-壳聚糖复合物能够应用在食品添加剂、饲料、保健食品等行业中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，步骤如下：

所述方法以红豆提取的铁蛋白为原料，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，即得铁蛋白-壳聚糖复合物，得到的铁蛋白-壳聚糖复合物具有相较于铁蛋白更高的稳定性。

而且，具体步骤如下：

⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2倍体积含有质量浓度为1％PVP的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄，其pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆在于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl₂晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；

⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；

⑸向红豆铁蛋白中加入转谷氨酰胺酶及壳聚糖，酶解参数为：酶浓度5000-6000U、壳聚糖及铁蛋白的终浓度分别为10.0μM及2.0μM、反应时间2-3h、反应pH 6.5-7.0、反应温度40-45℃，得到粗制的铁蛋白-壳聚糖复合物；

⑹上述混合物经90-100℃处理3-5分钟，立即冷却至25℃，获得产物经过截留分子量为100-200kDa的透析袋透析，去除未结合的壳聚糖及转谷氨酰胺酶，并经过0.45μm的滤膜过滤；

⑺上述滤液经过凝胶过滤层析柱分离，其平衡液为50mM MOPS buffer，pH 6.75，100mMNaCl，通过凝胶过滤层析获得目标产物，即得铁蛋白-壳聚糖复合物。

而且，所述红豆去杂之后置于4℃蒸馏水中浸泡过夜。

而且，所述步骤⑺中凝胶过滤层析柱为Sephacryl-300gel凝胶过滤层析柱。

本发明取得的优点和积极效果为：

本发明以红豆为原料，提取并分离铁蛋白，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖共价结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，得到的铁蛋白-壳聚糖复合物，该复合物的热稳定性及抗胃肠消化酶的能力显著增强。本方法开发了一种新型的基于转谷氨酰胺酶催化的蛋白-多糖复合物，具有改进铁蛋白结构，提高铁蛋白的功能特性，进而提高铁蛋白中铁的生物利用率的潜力，对于提高铁蛋白稳定性及铁生物利用度具有重要的实践意义。同时对于扩展壳聚糖及转谷氨酰胺酶在食品工业中的也具有重要的意义。本发明方法制得的铁蛋白-壳聚糖复合物能够应用在食品添加剂、饲料、保健食品等行业中。

附图说明

图1为本发明中利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物并提高铁蛋白稳定性的一种技术路线图；

图2为本发明中转谷氨酰胺酶催化形成的铁蛋白-壳聚糖复合物粗制样品经过凝胶排阻色谱图；

图3为本发明中转谷氨酰胺酶催化形成的铁蛋白-壳聚糖复合物粗制样品经过SDS-PAGE电泳图；

图4为本发明中分离纯化得到的铁蛋白-壳聚糖复合物透射电镜图；

图5为本发明中分离纯化得到的铁蛋白-壳聚糖复合物与铁蛋白红外光谱图比较图；

图6为本发明中分离纯化得到的铁蛋白-壳聚糖复合物与铁蛋白热稳定性曲线比较图；

图7为本发明中分离纯化得到的铁蛋白-壳聚糖复合物与铁蛋白抗胃蛋白酶消化性比较图；

图8为本发明中分离纯化得到的铁蛋白-壳聚糖复合物与铁蛋白中的铁还原释放曲线比较图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，步骤如下：

以市售红豆为原料，利用水提法提取并分离铁蛋白，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖共价结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，得到的铁蛋白-壳聚糖复合物。该复合物的热稳定性及抗胃肠消化酶的能力显著增强。

较优地，具体步骤如下：

⑴利用市售红豆为原料，置于4℃蒸馏水中浸泡过夜(约10-12h)，去皮后，加入2倍体积含有质量浓度为1％PVP的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 7.0)，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣。将收集的匀浆在于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，得粗蛋白上清液；

⑵向蛋白粗提液中加入浓度为50-100mM的MgCl₂晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；

⑶上清液静置20-30min后，加入浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑷在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；

将沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；

⑸向红豆铁蛋白中加入转谷氨酰胺酶及壳聚糖，酶解参数为：酶浓度5000-6000U、壳聚糖及铁蛋白的浓度分别为10.0μM及2.0μM、反应时间2-3h、反应pH 6.5-7.0、反应温度40-45℃，得到粗制的铁蛋白-壳聚糖复合物；

(6)上述混合物经90-100℃处理3-5分钟，立即冷却至25℃.获得产物经过截留分子量为100-200kDa的透析袋透析，去除未结合的壳聚糖及转谷氨酰胺酶。并经过0.45μm的滤膜过滤。

(7)上述滤液经过Sephacryl-300gel凝胶过滤层析柱分离，其平衡液为50mM MOPSbuffer，pH 6.75,100mM NaCl。通过凝胶过滤层析获得目标产物。

实施例2

一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，步骤如下：

所述方法以大豆提取铁蛋白为原料，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，即得铁蛋白-壳聚糖复合物，得到的铁蛋白-壳聚糖复合物具有相较于铁蛋白更高的稳定性。

过一步地，具体步骤如下：

⑴利用红豆为原料，置于4℃蒸馏水中浸泡过夜(约10-12h)，手工去皮后，加入2倍体积含有质量浓度为1％PVP的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 7.0)，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣。将收集的匀浆在于6000g 4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，得粗蛋白上清液；；

⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl₂晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为大豆铁蛋白，该大豆铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；

⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；

⑸向红豆铁蛋白中加入转谷氨酰胺酶及壳聚糖，酶解参数为：酶浓度5000-6000U、壳聚糖及铁蛋白的终浓度分别为10.0μM及2.0μM、反应时间2-3h、反应pH 6.5-7.0、反应温度40-45℃，得到粗制的铁蛋白-壳聚糖复合物；

⑹上述混合物经90-100℃处理3-5分钟，立即冷却至25℃，获得产物经过截留分子量为100-200kDa的透析袋透析，去除未结合的壳聚糖及转谷氨酰胺酶，并经过0.45μm的滤膜过滤；

⑺上述滤液经过凝胶过滤层析柱分离，其平衡液为50mM MOPS buffer，pH 6.75，100mM NaCl，通过凝胶过滤层析获得目标产物，即得铁蛋白-壳聚糖复合物。

本发明方法获得的铁蛋白-壳聚糖复合物的相关检测：

1、利用凝胶过滤层析法分析粗制的铁蛋白-壳聚糖复合物，结果见图2，由图2可以看出，分离得到四种组分。

2.利用SDS-PAGE检测分离得到的四种组分，结果见图3，在组分1、2、4中存在大豆铁蛋白，其中1、2纯度较高。

3.利用液相法分析四种组分中的氨基葡萄糖含量，利用o-phthaldialdehyde法测定四种样品中的自由氨基含量，结果如下表1所示。结果表明组分2具有较高含量的氨基葡萄糖以及较低的自由氨基含量，证明组分2是获得的成功接枝壳聚糖的铁蛋白，即铁蛋白-壳聚糖复合物。

Table 1.脱铁红小豆铁蛋白经过转谷氨酰胺酶和壳寡糖处理后的化学变化

4.利用透射电镜实验分析检测铁蛋白-壳聚糖复合物的蛋白形态，结果见图4，透射电镜图表明获得的铁蛋白具有规则的球形结构，大小约为12nm，为典型的铁蛋白形态，说明壳聚糖的结合没有显著改变铁蛋白的形态。

5.通过红外光谱法以测定铁蛋白-壳聚糖复合物的结构变化，结果见图5所示。光谱结果表明铁蛋白-壳聚糖复合物在波长1060cm^-1附近的光强度相较于铁蛋白明显提升，该波长范围属于1050–1150cm^-1区域，属于-C-O拉伸及–OH震动区域，强度的提升表明壳聚糖的结合对铁蛋白的-C-O及–OH基团有显著地影响。

6.通过紫外吸收法测定铁蛋白-壳聚糖复合物的稳定性，结果见图6所示。结果表明铁蛋白-壳聚糖复合物的热转变温度为78.16℃，显著高于铁蛋白的热转变温度73.12℃，证明壳聚糖结合在铁蛋白后，铁蛋白的热稳定性显著提升。

7.利用SDS-PAGE法检测铁蛋白-壳聚糖复合物及铁蛋白的抗胃蛋白酶、胰蛋白酶的消化能力，结果见图7，结果表明，铁蛋白-壳聚糖复合物经过酶解后，仍能够保留部分铁蛋白条带，而铁蛋白经过酶解后，条带消失。说明铁蛋白-壳聚糖复合物的抗抗胃蛋白酶、胰蛋白酶的消化能力显著提高。

8.利用铁释放还原曲线检测铁蛋白-壳聚糖复合物及铁蛋白的铁保留及释放能力，结果见图8所示。结果表明，两种组分的铁还原释放曲线相近，不存在显著地差异，表明壳聚糖的结合不会影响铁蛋白中铁的释放，在对铁蛋白进行保护的同时不会对铁蛋白的补铁效果产生显著影响。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (4)

1.一种利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，其特征在于：步骤如下：

所述方法以红豆提取的铁蛋白为原料，利用转谷氨酰胺酶的催化作用，使壳聚糖结合于铁蛋白上，通过凝胶过滤方法分离有效的结合组分，即得铁蛋白-壳聚糖复合物，得到的铁蛋白-壳聚糖复合物具有相较于铁蛋白更高的稳定性。

2.根据权利要求1所述的利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴利用红豆为原料，将红豆种子置于4℃蒸馏水中浸泡过夜，即浸泡10-12h，去皮后，加入2倍体积含有质量浓度为1％PVP的50mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄，其pH为7.0，并用内切式匀浆机匀浆3次，每次2-3min，200目滤网滤去豆渣，将收集的匀浆在于6000g、4℃下离心10-15分钟，弃沉淀，取上清液，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入终浓度为50-100mM的MgCl₂晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；上清液静置20-30min后，加入终浓度为70-100mM的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为红豆铁蛋白，该铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑶在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心后上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；

⑷将褐色沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得红豆铁蛋白，该红豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μM，其pH值为6.5-7.0；

⑸向红豆铁蛋白中加入转谷氨酰胺酶及壳聚糖，酶解参数为：酶浓度5000-6000U、壳聚糖及铁蛋白的终浓度分别为10.0μM及2.0μM、反应时间2-3h、反应pH 6.5-7.0、反应温度40-45℃，得到粗制的铁蛋白-壳聚糖复合物；

⑹上述混合物经90-100℃处理3-5分钟，立即冷却至25℃，获得产物经过截留分子量为100-200kDa的透析袋透析，去除未结合的壳聚糖及转谷氨酰胺酶，并经过0.45μm的滤膜过滤；

⑺上述滤液经过凝胶过滤层析柱分离，其平衡液为50mM MOPS buffer，pH 6.75，100mMNaCl，通过凝胶过滤层析获得目标产物，即得铁蛋白-壳聚糖复合物。

3.根据权利要求2所述的利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，其特征在于：所述红豆去杂之后置于4℃蒸馏水中浸泡过夜。

4.根据权利要求2或3所述的利用转谷氨酰胺酶及壳聚糖制备铁蛋白-壳聚糖复合物的方法，其特征在于：所述步骤⑺中凝胶过滤层析柱为Sephacryl-300gel凝胶过滤层析柱。