CN113480602B

CN113480602B - 南瓜籽源锌络合肽及其序列

Info

Publication number: CN113480602B
Application number: CN202110758128.4A
Authority: CN
Inventors: 陈静静; 于敏; 彭梦瑶; 卢丹; 江波
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113480602A

Abstract

本发明公开了南瓜籽源锌络合肽及其序列，属于食品加工领域。本发明提供南瓜籽源锌络合肽及其相应的制备方法，所述肽的氨基酸序列是RPKHPLK或者RPKHPLSHDL，对锌的络合率分别为56.48±0.69％和92.87±0.41％。本发明所得到的肽可以用于制备易被人体肠胃吸收的络合锌。

Description

南瓜籽源锌络合肽及其序列

技术领域

本发明涉及南瓜籽源锌络合肽及其序列，属于食品加工领域。

背景技术

南瓜的食用价值和药用价值非常高，中医史书就有了南瓜的食疗记载，南瓜全身都是宝，南瓜籽中的营养成分也十分丰富，南瓜籽中含有丰富的油脂、蛋白质、维生素、多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素等。近年来，南瓜籽因其营养和保健作用而受到人们的广泛关注。它也被用作降血糖剂。南瓜籽的味道和坚果味都很独特，人们把南瓜籽腌制后烤成零食食用，南瓜籽也常用来榨油。南瓜籽的氨基酸组成含有人体必需的八种氨基酸与组氨酸，并且其必须氨基酸的比例与人体所需的模式相似。此外南瓜籽富含铁、蛋白质、锰、镁、锌、钾、铜、磷、多不饱和脂肪酸(PUFA)、α-生育酚和类胡萝卜素。南瓜籽油能改善膀胱过度活跃导致的的泌尿系统紊乱，南瓜籽的提取物可以改善泌尿功能障碍和前列腺增生，还具有抗氧化、抗炎和抗菌的功效，但是南瓜籽经过榨油之后的商业价值会降低，大部分被用来当作动物饲料来使用。但南瓜籽粕中含有丰富的植物蛋白，为了提高南瓜籽粕的经济效益，有必要对南瓜籽粕蛋白进行生理功能的探索与开发。

锌是人体必需的微量元素之一，它被称为“生命元素”，对于维持人体正常的生命活动和生理状态有着非常重要的意义，而且锌是唯一可以与所有六大酶类(氧化还原酶，水解酶，裂解酶，转移酶，连接酶和异构酶)相互作用的金属离子。缺锌会使人体的机能受到损害，儿童缺锌会导致生长发育变迟缓，成年人缺锌会导致机体性腺机能的损伤。目前促进锌吸收的方式有四种：一是降低食物基质中的植酸盐含量。二是添加补锌剂，常见的补锌剂有无机酸锌盐、有机酸锌盐、氨基酸络合锌、肽络合锌四种。三是以甘氨酸络合锌为代表的氨基酸络合锌。第四种以酪蛋白磷酸肽络合锌为代表的锌络合肽。肽锌络合物中的锌相对于无机盐中的锌更容易被肠胃吸收。

以植物加工过程的副产物为原料开发的植物蛋白源的锌络合肽是近年来研究的热点。例如，花生、榛子、绿豆、玉米、芝麻、小麦胚芽、大麻、核桃和油菜籽中的蛋白源肽，含有较为丰富的锌络合氨基酸，如丝氨酸、组氨酸和精氨酸等。虽然，目前已经鉴定出多种锌络合肽，但为了制备成本更低、锌络合效果更好和生物利用度更高的锌络合肽，需要寻找更合适的肽源。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有的肽锌络合物存在成本高、锌络合效果不佳的不足。

[技术方案]

本发明提供南瓜籽源锌络合肽，其氨基酸序列是RPKHPLK(SEQ ID NO:1)或者RPKHPLSHDL(SEQ ID NO:2)，优选RPKHPLSHDL。

本发明提供一种制备、筛选南瓜籽源锌络合肽的方法，包括以下步骤：

(1)利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末，

(2)南瓜籽源肽的制备：将南瓜籽蛋白粉末溶解，并通过加热使得南瓜籽蛋白中内源性酶失活，利用木瓜蛋白酶酶解；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物；

(3)通过优化步骤(2)木瓜蛋白酶酶解的条件，以提高所得南瓜籽蛋白水解产物的锌络合率，并得到锌络合率较高的南瓜籽蛋白水解产物；

(4)将步骤(3)得到的锌络合率较高的南瓜籽蛋白水解产物利用固定化金属亲和层析、葡聚糖G-25凝胶层析进行纯化，得到南瓜籽源锌络合肽，用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪对南瓜籽源锌络合肽的氨基酸序列进行鉴定，得到南瓜籽源锌络合肽的氨基酸序列，采用固相合成南瓜籽源锌络合肽。

在本发明的一种实施方式中，所述利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末，具体包括如下步骤：

(1)粉碎脱水：将南瓜籽磨成绿色南瓜籽渣，经过真空冷冻干燥后，去除其表面水分；

(2)脱脂：加入5倍体积的正己烷搅拌2小时除去脂肪，弃掉正己烷，于通风橱内风干2天，使正己烷完全挥发，得到白色的干燥粉末；

(3)碱溶酸沉：将脱脂的南瓜粉分散在10倍体积的去离子水中，用1M NaOH调节溶液pH＝10，搅拌30min，并在4℃离心20min，收集上清，用滤纸过滤；滤液中溶解的蛋白用1MHCl调节pH至5沉淀，于10000rpm离心20分钟，用去离子水清洗沉淀，再用1M NaOH将蛋白质的pH值调整到7.0，在-80℃下冷冻干燥得到南瓜籽蛋白粉末(PSP)。

在本发明的一种实施方式中，所述南瓜籽源肽的制备包括如下步骤：将南瓜籽蛋白粉末均匀分散在去离子水中，沸水煮15分钟，使南瓜籽蛋白中内源性酶失活；冷却后，用1M NaOH或1M HCl调节pH至7，加入3000U/g的木瓜蛋白酶在55℃酶解3h，酶解完成后，沸水浴灭酶15分钟，冷却到室温；用1M NaOH或1M HCl调节pH至7，离心15min，丢弃沉淀，保留上清，并用0.45μm的纤维素膜过滤上清液，冷冻干燥48h，获得南瓜籽蛋白水解产物(PSPH)，保存在-20℃的冰箱中备用。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)优化得到的酶解条件是：利用木瓜蛋白酶(pH＝7,T＝55℃)在底物浓度4g/100mL、加酶量为3000U/g的条件下酶解3h；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物。

本发明提供一种制备南瓜籽源肽锌络合物的方法，将制备、筛选得到的南瓜籽源锌络合肽配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比为2:1，络合温度为60℃、pH＝6，络合时间为60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，得到南瓜籽源肽锌络合物，冻干储存。

进一步的，制备南瓜籽源肽锌络合物的方法采用如下条件：将南瓜籽蛋白水解物配置成20mg/mL的肽溶液，将100mM的硫酸锌溶液滴到肽溶液中，做出最后浓度：肽:锌＝1：1，调节pH＝6，并在60℃水浴摇床上培养60分钟；之后，向锌、肽混合物中添加乙醇，使得乙醇的浓度是80％，目的是沉淀肽和肽锌络合物；室温静置60min，然后10000g离心10min，得到白色沉淀；白色沉淀物用80％的乙醇洗涤三次以除去未结合的锌；最后，收集得到南瓜籽源肽锌络合物，冻干储存于-20℃。

[有益效果]：

本发明采用新鲜南瓜籽粕为原料，采用碱溶酸沉制备南瓜籽蛋白，利用蛋白酶对南瓜籽蛋白进行酶解，综合确定适宜的蛋白酶为木瓜蛋白酶，并确定最佳酶解条件为：酶解时间为3h，底物浓度4％，加酶量为3000U/g，锌络合率为76.26±2.25％。

本发明进一步通过单因素实验优化肽锌络合工艺，综合确定最佳络合条件为：肽锌质量摩尔比为2:1，络合温度为60℃，络合时间为60min，pH＝6时，锌络合率最高，为79.2301±3.24％。

本发明进一步对南瓜籽多肽进行固定化金属亲和层析和葡聚糖G-25凝胶层析纯化，用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪对肽段的氨基酸序列进行鉴定，得出多个氨基酸序列，选择氨基酸序列为Arg-Pro-Lys-His-Pro-Leu-Lys(RPKHPLK，分子量为874.55Da)、Arg-Pro-Lys-His-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Leu(RPKHPLSHDL，分子量为1198.6622Da)的两种锌络合肽进行固相合成，并测定固相合成得到的肽的锌络合率分别为56.48±0.69％和92.87±0.41％。

附图说明

图1是本发明制备的五种蛋白酶的酶解时间对锌络合率(a)和水解度(b)的影响

图2是本发明实施例2中的加酶量对锌络合率(a)和水解度(b)的影响。

图3是本发明实施例3中的底物浓度对锌络合率(a)和水解度(b)的影响。

图4是本发明实施例4中的络合条件：肽锌质量摩尔比(a)、络合温度(b)、络合pH(c)、络合时间(d)对锌络合率的影响。

图5是本发明利用固定化金属亲和层析制备肽络合锌过程的色谱图。

图6是本发明制备的葡聚糖G-25凝胶层析色谱图。

具体实施方式

南瓜籽肽水解度的测定：参考Nielsen等人提供的邻苯二醛(OPA)法测定南瓜籽肽的水解度。将南瓜籽蛋白水解产物溶解于去离子水中，取400μL样品溶液与3mL OPA试剂精确混合2min。然后用紫外可见分光光度计在340nm处测量光密度(OD)。以蒸馏水为空白。南瓜籽肽水解度(DH)的计算公式如下:

其中，Serine-NH₂代表meqv Serine NH₂/g蛋白，OD_sample为各样品的吸光度，OD_blank为蒸馏水的吸光度，OD_standard为丝氨酸标准品的吸光度，d为稀释倍数，c为南瓜籽蛋白含量，L是样品体积。

其中，h为水解肽键数，α＝1，β＝0.4，h_tot为蛋白质底物(meqv/g蛋白)中肽键总数。

肽锌络合物锌络合率的测定：根据国标《GB 5009.14-2017食品安全国家标准食品中锌的测定》，采用原子吸收光谱法测定锌元素的含量。锌结合能力的定义如下：

实施例1

(1)利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末

粉碎脱水：将南瓜籽磨成绿色南瓜籽渣，经过真空冷冻干燥后，去除其表面水分；

脱脂：加入5倍体积的正己烷搅拌2小时除去脂肪，弃掉正己烷，于通风橱内风干2天，使正己烷完全挥发，得到白色的干燥粉末；

碱溶酸沉：将脱脂的南瓜粉分散在10倍体积的去离子水中，用1M NaOH调节溶液pH＝10，搅拌30min，并在4℃离心20min，收集上清，用滤纸过滤；滤液中溶解的蛋白用1M HCl调节pH至5沉淀，于10000rpm离心20分钟，用去离子水清洗沉淀，再用1M NaOH将蛋白质的pH值调整到7.0，在-80℃下冷冻干燥得到南瓜籽蛋白粉末(PSP)；

(2)将南瓜籽蛋白粉末溶解，并通过加热使得南瓜籽蛋白中内源性酶失活，分别利用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶或、菠萝蛋白酶在各自的最适条件下，在底物浓度4g/100ml，加酶量为3000U/g南瓜籽蛋白粉末的条件下分别酶解0.5、1、2、3、4、5、6h，得到南瓜籽肽；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物；检测南瓜籽蛋白水解产物中的肽的水解度；

(3)利用南瓜籽肽络合锌：将南瓜籽蛋白水解物加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比为1:1，络合温度为60℃、pH＝6，络合时间为60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存。检测肽锌络合物中的锌络合率。

结果见图1：相比于其他几种蛋白酶，经木瓜蛋白酶酶解后的南瓜籽肽在酶解一定时间后具有较高的锌络合率；经不同蛋白酶水解的南瓜籽肽，水解度均呈随时间的延长而增加的趋势，锌络合率随时间的增加均呈先增加后降低的趋势。当木瓜蛋白酶水解3小时后，南瓜籽肽锌络合率最高，为76.26±2.25％。

实施例2

(1)利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末

碱溶酸沉：将脱脂的南瓜粉分散在10倍体积的去离子水中，用1M NaOH调节溶液pH＝10，搅拌30min，并在4℃离心20min，收集上清，用滤纸过滤；滤液中溶解的蛋白用1M HCl调节pH至5沉淀，于10000rpm离心20分钟，用去离子水清洗沉淀，再用1M NaOH将蛋白质的pH值调整到7.0，在-80℃下冷冻干燥得到南瓜籽蛋白粉末(PSP)

(2)将南瓜籽蛋白粉末溶解，并通过加热使得南瓜籽蛋白中内源性酶失活，利用木瓜蛋白酶(pH＝7,T＝55℃)在底物浓度4g/100ml，加酶量分别为1500U/g南瓜籽蛋白粉末、3000U/g南瓜籽蛋白粉末、4500U/g南瓜籽蛋白粉末、6000U/g南瓜籽蛋白粉末、7500U/g南瓜籽蛋白粉末、9000U/g南瓜籽蛋白粉末的条件下酶解3h，得到南瓜籽肽；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物；检测南瓜籽蛋白水解产物中的肽的水解度；

结果见图2：南瓜籽肽水解度随加酶量的增加而逐渐增加，南瓜籽的锌络合率呈先增加后降低的趋势，在加酶量为3000U/g、4500U/g、6000U/g时，锌络合率基本变化不大，为了节约成本，选择3000U/g的加酶量为最佳加酶量。

实施例3

(1)利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末

(2)将南瓜籽蛋白粉末溶解，并通过加热使得南瓜籽蛋白中内源性酶失活，利用木瓜蛋白酶(pH＝7,T＝55℃)在底物浓度分别是3g/100ml、4g/100ml、5g/100ml、6g/100ml，加酶量为3000U/g南瓜籽蛋白粉末的条件下酶解3h，得到南瓜籽肽；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物；检测南瓜籽蛋白水解产物中的肽的水解度；

结果见图3：水解度随底物浓度的增加逐渐增加，锌络合率随底物浓度的增加而降低，当底物浓度为4％，锌络合率最高，为76.26±2.25％。

实施例4

(1)利用碱溶酸沉法制备南瓜籽蛋白粉末

(2)将南瓜籽蛋白粉末溶解，并通过加热使得南瓜籽蛋白中内源性酶失活，利用木瓜蛋白酶(pH＝7,T＝55℃)在底物浓度分别是4％，加酶量为3000U/g南瓜籽蛋白粉末的条件下酶解3h，得到南瓜籽肽；酶解完成后，加热灭酶，冷却后调节pH至中性，离心并丢弃沉淀、保留上清，将上清液过滤并冻干得到南瓜籽蛋白水解产物；检测南瓜籽蛋白水解产物中的肽的水解度；

(3)利用南瓜籽肽络合锌：

将南瓜籽蛋白水解物加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比分别选择1:2、1:1、2:1、3:1、4:1，络合温度为60℃、pH＝6，络合时间为60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存，检测肽锌络合物中的锌络合率；

或者，

将南瓜籽蛋白水解物加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比分别选择1:1，络合温度为60℃、pH＝6，分别络合30、60、90、120、150min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存，检测肽锌络合物中的锌络合率；

或者，

将南瓜籽蛋白水解物加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比分别选择1:1，络合温度分别为30、40、50、60、70、80℃，pH＝6，络合60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存，检测肽锌络合物中的锌络合率；

或者，

将南瓜籽蛋白水解物加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比分别选择1:1，络合温度分别为60℃，pH＝4、5、6、7、8或9，络合60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存，检测肽锌络合物中的锌络合率；

结果见图4，当肽锌的质量摩尔比为2：1，络合温度为60℃，络合时间为60min，pH6.0时，锌络合率最高，为79.23±3.24％。

实施例5利用离子亲和层析法络合锌离子

(1)固定化锌离子：将填料IMAC Sepharose 6Fast Flow(25mL,GE Healthcare)与50mM的硫酸锌溶液混合，在30℃摇床下孵育12h，然后装填到柱子中，将装填好的柱子接到pure蛋白质纯化仪上。首先用2倍柱体积的超纯水冲洗柱子，去除一些杂质和未结合的锌离子，接着用2倍柱体积的20mM PBS(添加0.1M的NaCl)(pH＝7.4)冲洗柱子去除未特异性结合的锌离子并平衡柱子。

(2)利用IMAC制备、纯化肽：选取锌络合率最高的肽(通过实施例1-3优化所得)，加水配置成20mg/mL的肽溶液，取1mL肽溶液用0.45μm纤维素膜过滤，并注入pure纯化系统的进样口，然后用3倍柱体积的20mM的PBS(添加0.1M的NaCl)(pH＝7.4)进行平衡，去除未能与锌离子结合的肽。随后，用5倍柱体积的20mM PBS(添加0.1M NaCl)(pH 3.5)溶液以1.0mL/min的流速将与锌结合的肽洗脱下来。全程在220nm的波长下监测吸光度。用自动收集器以4.0mL/管的方式收集紫外吸光度大于50mAU的洗脱组分，并将收集的洗脱肽组分在-80℃下冻干保存，以便进一步分离。制备过程的色谱结果见图5。

(3)葡聚糖G-25凝胶过滤层析纯化肽：将经过IMAC纯化后的肽做进一步的分离纯化。具体地，称取葡聚糖G-25凝胶20g，用沸水煮2h，使得填料充分溶胀，待其冷却后，用1M的NaOH溶液和超纯水洗涤，使填料呈中性，超声除去气泡，放置备用；将内径16mm×长度500mm的层析空柱垂直固定在铁架台上，加入部分超纯水，然后将葡聚糖G-25凝胶沿管壁缓缓倒入层析柱中，静置待其自然沉降，当沉降完全后，用吸管将填料上方多余的水吸走，只剩下距填料顶端1cm深的水；装柱完成后，将层析柱与洗脱装置和紫外检测器相连，用超纯水以1mL/min的速度持续冲洗凝胶柱，以平衡柱体。取经IMAC纯化后的具有金属络合活性的样品，配置成100mg/mL的多肽液，并用0.45μm的纤维素膜过滤，以1mL/min的流速将4mL的多肽液注入到层析柱中，并用超纯水持续洗脱。在220nm下监测洗脱液的吸光度，收集各峰的流出液，色谱结果见图6。图6中，每个峰代表分子量接近的一种或几种肽。以相同的条件反复多次进样，合并各峰的流出液，在-80℃下冻干保存。

通过原子光谱法检测肽锌络合物中的锌络合率，得到II-1，II-2，II-3的锌螯合能力分别为67.78±1.89％、86.62±2.19％、52.32±1.05％。因此取络合合率最高的II-2片段，进行下一步的分析处理。

实施例6锌络合肽序列的分析鉴定(LC/MS/MS)、合成、应用

(1)肽序列分析鉴定：将实施例5中经葡聚糖G-25凝胶层析纯化的具有高锌络合能力的肽段进行多肽氨基酸序列分析。具体地，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪进行检测，色谱条件为：质谱条件：Waters Platform 2MD 4000，离子源温度100℃，离子方式：EIS+，脱溶剂气温度400℃，毛细管电压：3.5kV，检锥孔气体流量50.0L/h，锥孔电压：20V，脱溶剂气流量：700.0L/h；质荷比扫描范围50～2000m/z。

如表1所示，各个肽段的分子量在850Da～2000Da以内，其中，最低的分子量为875.56Da，最高为1895.74Da。肽分子量与目前已鉴定的锌络合肽序列的分子量相似(2000Da以下)。纯化后的南瓜籽肽富含脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸，天冬氨酸、缬氨酸、谷氨酸等多个氨基酸。这些氨基酸都被证明具有潜在的锌络合能力。

(2)肽合成：将挑选出的肽序送由南京肽谷生物科技有限公司进行合成。合成方式采用固相多肽合成法。选择分子量相对较低的RPKHPLK和RPKHPLSHDL这两种锌络合肽进行固相合成，其纯度为98％。

(3)肽的络合锌的能力的检测：将合成南瓜籽肽加水配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比选择2:1，络合温度分别为60℃，pH＝6.0，络合60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，最后，将肽锌络合物冻干储存，通过原子光谱法检测肽锌络合物中的锌络合率，得到RPKHPLK、RPKHPLSHDL这两种肽的锌络合能力分别为76.48±0.69％和92.87±0.41％。相比于目前已被鉴定出的锌络合肽，纯化合成的南瓜籽源肽的锌络合率更高。如：海参蛋白源肽Trp-Leu-Thr-Pro-Thr-Tyr-Pro-Glu、Ala-Ala-Thr-Gly-Val-Met-Pro-Leu-Asp-Met和Ala-Ala-Tyr-Cys-Ala-Thr-Lys-Phe-Ala的锌络合率分别为56.93％、56.80％、53.46％；菜籽蛋白源肽Asn-Ser-Met、Gly-Lys-Arg、Glu-Pro-Ser-His为82.13000U/g、54.50％、56.11％；小麦胚芽蛋白源肽Asn-Ala-Pro-Leu-Pro-Pro-Pro-Leu-Lys-His和His-Asn-Ala-Pro-Asn-Pro-Gly-Leu-Pro-Try-Ala锌络合率为15.15％和91.67％。

表1肽序列的鉴定

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 南瓜籽源锌络合肽及其序列

<130> BAA210583A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 1

Arg Pro Lys His Pro Leu Lys

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 2

Arg Pro Lys His Pro Leu Ser His Asp Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 3

Gln Met Pro Trp Leu Gln Pro Lys Lys Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 4

Gly Pro Asn Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 5

Glu Gly Ser Met His Gly Ala Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val

1 5 10 15

Met

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 6

Pro Thr Ala Asp Pro Gly Asn Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr

1 5 10 15

Val Met

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 7

His Pro Gln Asn Gly Gly Ala Pro Pro Thr Ala Ser Pro Asn Pro Leu

1 5 10 15

Gly Pro Asn

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 南瓜

<400> 8

Leu Pro Gly Pro Phe Leu Val Ser Ser Val Pro Ala Ser Gly Pro Gln

1 5 10 15

Claims

1.用于络合锌的肽，其特征在于，以南瓜籽为原料制备得到，其氨基酸序列是RPKHPLK或者RPKHPLSHDL；络合所用的锌是无机锌。

2.肽锌络合物，其特征在于，利用权利要求1所述肽络合锌得到。

3.一种制备权利要求2所述肽锌络合物的方法，其特征在于，将肽RPKHPLK或者肽RPKHPLSHDL配置成肽溶液，将硫酸锌溶液滴到肽溶液中，肽锌质量摩尔比为2:1，络合温度为60℃、pH＝6，络合时间为60min；然后，添加乙醇使得乙醇的终浓度达到80％，用以沉淀肽和肽锌络合物，沉淀结束后收集白色沉淀物，并用80％的乙醇洗涤以除去未结合的锌，得到南瓜籽源肽锌络合物，冻干储存。

4.含有权利要求2所述肽锌络合物的保健品。