CN102197856A - 一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗氧化肽的制备方法，目的在于提供一种原料来源广泛、成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制备方法，（1）南瓜籽分离蛋白溶液制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成南瓜籽分离蛋白溶液；（2）酶解：将南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5~3.5，然后加蛋白酶5000~8000U/g，在45~55℃水浴中水解2~6h；（3）灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。所得抗氧化肽具有显著的还原能力，较强的清除自由基的能力，应用广泛，具有显著的社会效益和经济效益；酶解工艺条件最优，提高原料的利用率；原料来源广泛，实现了废物利用的目的。

Description

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗氧化肽的制备方法，具体为一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，活性氧和自由基导致的各种疾病严重危害了人类的健康，已经引起了社会各界的广泛关注。近年来，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势，而各种原料产生的抗氧化肽由于其低毒、高效等特点，成为国内外研究的热点。

目前，以酶水解蛋白质获得抗氧化肽的方法得到了很大的发展，各种不同来源的蛋白质在专一酶的作用下，得到了许多具有高抗氧化活性的肽段。近年来，从廉价易得的动植物原料制备抗氧化肽的研究有很多，这些原料主要有大豆蛋白、玉米蛋白、麦胚蛋白、乳蛋白、鱼类蛋白等，此外在牛奶蛋白、家蝇幼虫蛋白等动物蛋白原料，以及黑米、菜籽、灵芝、枸杞等植物蛋白原料中均获得了具有抗氧化作用的活性肽。由此可见，生产抗氧化肽的原料范围非常广泛。

南瓜籽作为南瓜的副产品，蛋白质含量高达30%～40%，南瓜籽含有平衡性很好的各种必需氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸和儿童必需的组氨酸，并且有与人体所需氨基酸组成模式相似的必需氨基酸比例。南瓜籽蛋白质在人体中的吸收率可达88 %～97 %，生理效价为73 %～86 %，蛋白质的品质好、含量高，可见南瓜籽是一种优质的、廉价易得、产量巨大的植物蛋白资源。但是目前这些籽资源大多被用作饲料或被堆积甚至直接废弃，不仅造成资源的浪费，而且造成环境污染。其实南瓜籽经过清理、去皮后，可采用压榨法、浸出法、超临界CO₂ 萃取法等方法提取油脂，同时对提取的粗油进行精炼，即可得到香味浓郁、风味独特的南瓜籽油，其品质可以和大豆色拉油等油脂相媲美。提油后的饼粕含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等，在美国和加拿大早有将其加工成高蛋白的动物饲料或肥料的报道，目前开发的重点则是其中的蛋白质。国内对榨油后的南瓜籽饼粕未能充分开发利用，还处于起步阶段。李燕杰等对南瓜籽饼粕的可开发性和其中蛋白质资源的综合利用进行综述，提出了南瓜籽饼粕开发的两种思路，即作为全部蛋白原料和作为部分蛋白原料，指出南瓜籽蛋白产品和蛋白饮料的开发具有一定的市场前景。但是目前国内外对于南瓜籽多肽及其生理活性的研究几乎没有，还未见有将南瓜籽蛋白抗氧化肽作为抗氧化剂的报道，这对南瓜籽饼粕资源的开发具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种原料来源广泛、制造成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为4~8%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热5~15分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5~3.5，然后加蛋白酶5000~8000U/g，在45~55℃水浴中水解2~6h，水解过程中保持pH恒定；（3）灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

所述碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为40~50℃，料液比为1∶30~40，pH值为10~11，浸提时间为1.5~2.5h。所述碱溶酸沉淀法为本领域公知技术，本发明通过单因素和正交实验确定了碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的最佳工艺条件是条件为：温度为50℃，料液比为1∶30，pH值为11，浸提时间为1.5h，在此条件下蛋白质的提取率达到85.52%，纯度为91.07%。

所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或风味蛋白酶或2709碱性蛋白酶或Alcalase2.4L碱性蛋白酶中的任意一种。上述五种蛋白酶均为现有公知商品，其中酸性蛋白酶至少可从宁夏和氏璧生物技术有限公司购得，酶活力≥10万，木瓜蛋白酶至少可从广西南宁庞博生物工程有限公司购得，酶活力为80万U/g，风味蛋白酶至少可从广西南宁庞博生物工程有限公司购得，2709碱性蛋白酶至少可从天津诺奥科技发展有限公司购得，酶活力为20万U/g，Alcalase2.4L碱性蛋白酶至少可从丹麦Novo Nordisk 公司购得，酶活力为2.4AU-A/g。

所述超滤所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.15~0.25MPa、料液质量浓度为1~3%、料液pH为6~8，操作时间为50~70分钟。

所述离心时转速为4500~5500r/min，离心时间为10~30分钟。

本发明所述南瓜籽抗氧化肽的最佳制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为5%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50℃水浴中水解5h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5000r/min的条件下离心20分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.2MPa、料液质量浓度为2%、料液pH为7，操作时间为60分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

上述步骤中，脱脂南瓜籽粉的制备方法为现有公知技术，本发明提供以下最佳方法：将去皮南瓜籽在60℃烘箱中烘4小时，使水分含量在5%以下，然后粉碎，利用超临界CO₂萃取技术进行脱脂，脱脂条件为：萃取釜压力25MPa，萃取温度45℃，分离柱压力10MPa，分离温度50℃，CO₂流量2.4-4.2L/h。

本发明通过以下实验及数据分析得出上述工艺步骤的最佳参数，具体过程为：

一、实验方法

1、测定方法

1.1蛋白酶活力的测定

采用福林-酚法测定蛋白酶活力

1.2 水解度的测定

水解度（DH%）=                                                

其中游离氨基氮含量用甲醛电位滴定法，总氮含量用微量凯氏定氮法。

1.3 DPPH自由基（二苯代苦味酰基自由基）清除率的测定

DPPH自由基清除率采用比色法，具体过程为：在反应管中加入2ml 0.2mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，再加入2ml 不同浓度的南瓜籽蛋白水解液，混合均匀，室温下避光反应50min 后，于517nm 波长处测定吸光度。同时以2ml DPPH溶液与2ml 蒸馏水混合后的吸光度为对照组；以2ml 蒸馏水与2ml 乙醇混合后的吸光度为空白组。

清除率(%)=[1-(A1-A2 )/A3]×100

式中：A1为加水解液后DPPH 溶液的吸光度；A2为空白水解液的吸光度；A3为未加水解液时DPPH 溶液的吸光度。

2、南瓜籽蛋白酶解液的制备

配置一定浓度的南瓜籽分离蛋白溶液，在沸水中加热处理10 min，冷却至酶解反应的最适温度，调节一定的pH值，然后按一定比例加入蛋白酶，反应过程中使pH值保持恒定。反应到预定时间，沸水浴灭酶10 min，冷却后离心分离，上清液置于冰箱中待用。

3、蛋白酶的筛选实验

3.1 单酶水解

参照厂家提供的酶最适反应条件，选定底物（南瓜籽分离蛋白溶液，以下同）浓度为0.05g/mL（即质量浓度为5%），充分搅拌后，100℃水浴10min使蛋白变性，冷却后调节pH到规定值，加酶量为2000U/g，水解4h。水解过程中保持pH基本恒定。水解完迅速煮沸10min使酶失活，冷却离心后分别测定水解度和DPPH清除率。

4、单因素实验设计

4.1酶添加量的确定

配置底物浓度为0.05g/mL的蛋白溶液，在温度为50℃，pH为3.5，加酶量分别为500、2000、4000、6000、8000 U/g的条件下水解4 h。以DPPH清除率为第一指标，水解度为第二指标，确定最佳的加酶量。

4.2最适温度的确定

分别在温度为30、40、45、50、55 ℃的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最适温度。

4.3最适pH值的确定

分别在pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最适pH值。

4.4底物浓度的确定

分别在底物浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/ml的条件下进行水解，其它同上述操作，确定水解的最佳底物浓度。

4.5酶解时间的确定

分别测定水解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h时的DPPH清除率，其它同上述操作，确定最佳的水解时间。

5、酶解工艺条件的优化

在单因素实验的基础上，利用MINITAB15.0软件设计5因素两水平的Plackett-Burman筛选试验，从5个因素中筛选出具有显著性的因素，然后采用Box-Behnken中心组合试验对其工艺参数进行优化。

二、结果与分析

1 、蛋白酶的筛选

1.1 标准曲线的绘制

以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，如图1，得到回归方程y=0.0111x+0.0461， R²=0.9996，线性良好，符合测定酶活力的要求。

1.2 蛋白酶活力的测定

由于不同产家生产的蛋白酶采用不同的单位符号，给实际操作带来不便，此外随着储藏时间和条件的影响，实际应用时的酶活力已经和出厂时有了一定的差别，故本发明采用福林酚法统一测定实验选取的各种蛋白酶的实际活力，以便于操作，结果见表1。从表1中可以看出，不同的蛋白酶所表现的酶活力具有较大的差异。由于植物蛋白的酶解比动物蛋白难，故有必要进行蛋白水解酶的筛选，以期获得能够产生较高活性的抗氧化肽的酶制剂。

1.3 单酶的筛选

从图2可以看出，5种蛋白酶对南瓜籽蛋白的酶解效果有差异。从抗氧化活性来看，C（酸性蛋白酶）效果最好，D（木瓜蛋白酶）和E（风味蛋白酶）相当；从水解度来看，A（2709碱性蛋白酶）和B（Alcalase2.4L碱性蛋白酶）两种酶占优势。本实验的目的是制备抗氧化肽，因此以抗氧化活性为第一指标，水解度为第二指标，选择C（酸性蛋白酶）作为第一步酶解用酶。

2、酸性蛋白酶酶解的单因素结果

2.1加酶量对酶解效果的影响

由图3看出，南瓜籽蛋白酶解液对DPPH的清除率和水解度都随着酶用量的增加而增大。当加酶量超过 6000 U/g时，清除率增加变得缓慢。这可能是由于加酶量小于6000 U/g时，在底物浓度一定的情况下，增加的酶量未使底物浓度饱和，随着加酶量的增大，反应速度越快，蛋白质水解度也越高，得到的多肽液清除DPPH的能力越强。而当加酶量继续增加时，底物浓度相对较低，酶分子过饱和，所以水解程度变化不大，活性多肽的量不再增加。同时，酶量的增加也会使生产成本大大增加，所以本发明选择酶用量为5000~8000U/g较为合适，最佳为6000 U/g。

2.2 温度对酶解效果的影响

温度对酶催化反应的影响是多方面的，温度提高会影响酶的稳定性和底物转化成产物的速度。由图4可知，随着温度的升高，水解度程度加大，DPPH清除能力增强，50 ℃左右时南瓜籽蛋白酶解液表现出最强的抗氧化活性，这可能是因为随着温度的升高，酶促反应的速度加快，体系中活性多肽的含量增加；当温度高于50 ℃时，蛋白酶结构发生改变，酶活降低，使活性肽的含量保持在一定水平。因此较适宜的酶解温度为45~55 ℃，最佳为50 ℃。

2.3 pH值对酶解效果的影响

pH能影响酶活性部位的解离和底物蛋白的解离，从而直接影响了酶与底物蛋白的结合与催化,每个催化反应都有一个最适宜的pH，此外，不同的反应条件对酶解产物的结构、性质有着不同的影响，从而使产物表现出不同的清除DPPH自由基的活性。由图5可见，水解度随着pH的增大先增加后减小，在pH=3.5左右酶活性最高，水解度最大。酶解液的DPPH清除能力随着pH值的升高而下降并逐渐趋于平缓，旨在得到抗氧化活性较高的多肽片段，因此选择pH2.5~3.5作为较合适的pH值，最佳为2.5。

2.4 底物浓度对酶解效果的影响

由图6所示，水解度随着底物浓度的增加而减小，酶解液的DPPH清除能力却先增大后减小，在0.06 g/ml左右达到最大。考虑到在低浓度时，溶液太稀不利于酶分子与蛋白质分子相互作用，而实际生产也希望底物浓度较大，获得较多的活性多肽；但是浓度过高，溶液比较粘稠，也会阻碍酶与蛋白之间的充分作用，使水解度降低。故初步确定酶解体系的较适底物浓度为0.04~0.08 g/ml（即质量浓度为4~8%），最佳为 0.06 g/ml（质量浓度为6%）。

2.5 时间对酶解效果的影响

由图7可以看出，随着时间的延长，水解度和DPPH清除率都增大，但是4 h以后DPPH清除率增加缓慢。由于在反应的初始阶段，蛋白酶活力最强，能与底物充分结合，而且底物浓度最大，酶作用位点也最多，此时水解度和酶解液活性显著增加。随着反应的继续进行，底物浓度减少，产物浓度增加，对酶催化反应起到抑制作用，同时酶活力也随时间的延长而降低。这些因素共同导致酶解液的活性趋于稳定，因此选择较适合的反应时间为2~6h，最佳为4 h。

3、Plackett-Burman设计确定关键影响因素

3.1 PB实验设计与结果

根据单因素实验得结果，设计了N= 12 的Plackett-Burman筛选实验。每个因子取高( + 1)低( - 1) 两个水平，以DPPH自由基清除率为响应值Y，结果如表2所示。对PB实验结果拟合模型的回归方程进行方差分析，结果见表3。各因素的效应评价及系数显著性检验见表4，P小于0.05，说明该因素是显著的，可进一步对其进行考察。

表2  PB实验设计与结果

表3 回归方程方差分析

表4 回归系数及显著性检验

模型项	效应	回归系数	标准误差	T	P
						常量		86.0825	0.4989	172.53	0.000
A	3.7417	1.8708	0.4989	3.75	0.010
						B	0.6883	0.3442	0.4989	0.69	0.516
C	2.2750	1.1375	0.4989	2.28	0.063
						D	10.4883	5.2442	0.4989	10.51	0.000
E	3.4317	1.7158	0.4989	3.44	0.014

由表3可以看出，模型的P<0.001，决定系数R²=95.95%，这说明模型显著，本实验95.95%的数据变异可以用此回归方程解释，将其用于实际预测的误差小。

由表4可以看出，影响酸性蛋白酶酶解效果的因素的重要性排序为：D>A>E>C>B，其中A、D、E的影响达到显著水平。因此，选取加酶量、底物浓度和时间这三个显著因素进一步作响应面分析，以确定他们所对应的最优水平。

4、 酸性蛋白酶酶解的响应面优化

4.1 响应面实验设计

表5 响应面分析因素水平表

表6  响应面试验设计与结果

在PB试验的基础上，运用Box-Behnken试验设计原理，选择加酶量，底物浓度，水解时间为自变量，DPPH清除率为响应值，采用软件MINITAB15.0开展三因素三水平的响应面试验。试验共有15个试验点，其中12个分析因子，3个零点，零点实验进行三次以估计误差。试验以随机次序进行，重复三次。试验设计见表6。

4.2 多元二次模型方程的建立及检验

酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白的响应面分析试验根据Box-Behnken设计进行了15组试验，其中3组中心点重复试验，结果见表6。利用MINITAB15.0软件对表6的实验数据进行多元回归拟合，得到编码空间的酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白的三元二次回归方程如下：

Y=90.9767＋1.0113A＋4.4488B＋1.8225C－0.7596A ² －2.7946B ² －1.2721C ² －0.3275AB－0.4200AC-0.7450BC                                      

表7 回归方程方差分析

来源	自由度	平方和	均方	F值	P
						回归	9	230.247	25.5830	67.12	0.000
线性	3	193.084	64.3614	168.87	0.000
						平方	3	33.808	11.2694	29.57	0.001
交互作用	3	3.355	1.1182	22.9	0.138
						失拟	3	1.687	0.5623	5.14	0.167
误差	2	0.219	0.1094
						合计	14	232.152		R2=99.18%	R2 M=97.70%

表8  回归系数显著性分析

项	系数	系数标准误	t	P
					常量	90.9767	0.3564	255.244	0.000
A	1.0113	0.2183	4.633	0.006

B	4.4488	0.2183	20.382	0.000
					C	1.8225	0.2183	8.350	0.000
A2	-0.7596	0.3213	-2.364	0.064
					B2	-2.7946	0.3213	-8.698	0.000
C2	-1.2721	0.3213	-3.959	0.011
					A*B	-0.3275	0.3087	-1.061	0.337
A*C	-0.4200	0.3087	-1.361	0.232
					B*C	-0.7450	0.3087	-2.414	0.061

从该模型的方差分析表7可见，本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P<0.0001)。失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.167>0.05)，其决定系数为0.9918，校正决定系数为0.9770，说明该模型能解释97.70%响应值的变化，仅有总变异的2.30%不能用此模型来解释，说明该模型拟合程度良好，用该模型对酸性蛋白酶水解制备南瓜籽抗氧化肽的工艺进行优化是合适的。

对方程的回归系数显著性分析(见表8)表明，试验中常量、A、B、C、B ² 、C ² 这几个因素对酶解液清除率的影响显著，表明在酸性蛋白酶水解南瓜籽蛋白过程中，水解时间、底物浓度对清除率有显著影响；B ² 、C ² 的影响显著也说明水解过程中时间和底物浓度对酶解液的抗氧化活性影响是非线性的。

4.3 响应面分析与优化

通过上述二次多项回归方程所作的响应曲面和等高线见图8～图13。通过该组动态图即可对任何两因素交互影响DPPH清除率效应进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平范围。等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反。

图8、9显示了加酶量和时间对DPPH清除率的交互影响效应。从其等高线图可以直观的看出，加酶量在4000～8000 U/g，时间在4～6 h时存在清除率最高值即91%～93%。图10、11显示了加酶量和底物浓度对DPPH清除率的交互影响效应，加酶量在3000～8000 U/g，底物浓度在0.04～0.06 g/ml时存在清除率最高值即92%～96%。图12、13显示了底物浓度和时间对DPPH清除率的交互影响效应，由等高线图可见二者对DPPH清除率的交互作用比较显著，当底物浓度约为0.045～0.06 g/ml，水解时间约为3～6 h时存在清除率最高值92%～96%。

4.4 南瓜籽蛋白酶解工艺条件的确定

根据Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，利用MINITAB15.0软件获得了DPPH清除率最高时的最佳水解条件为：温度50 ℃、水解pH2.5、水解时间4.87 h、底物浓度0.0543 g/ml，加酶量6181.82 U/g，在此水解条件下，DPPH清除率的预测值为93.17%。为了检验模型预测的准确性，在最佳水解条件下进行水解，考虑到操作的可行性，实际水解条件修正为：温度50 ℃、水解pH 2.5、水解时间5 h、底物浓度0.05 g/ml、加酶量6000 U/g。

4.5 模型的验证实验

在以上优化条件下进行验证实验，共进行3次实验，所得结果分别为92.15%、93.08% 和93.23%，平均值为92.82%，与预测值较为接近，证明该模型能较好地预测南瓜籽酶解液的实际DPPH清除率效果。

5、小结

（1）、以DPPH自由基清除率为第一指标，水解度为第二指标，通过单酶水解效果比较，从5种蛋白酶中筛选出制备南瓜籽抗氧化肽的最适用酶，即酸性蛋白酶单酶水解。

（2）、通过Plackett-Burman实验设计得到影响酸性蛋白酶酶解效果的因素的重要性排序为：D>A>E>C>B，其中A加酶量、D底物浓度、E时间的影响达到显著水平。

（3）、响应面优化设计得到的模型方程为Y=90.9767＋1.0113A＋4.4488B＋1.8225C－0.7596A ² －2.7946B ² －1.2721C ² －0.3275AB－0.4200AC－0.7450BC，R²=0.9918。最终确定最佳水解条件为：温度50 ℃、水解pH 2.5、水解时间5 h、底物浓度0.05 g/ml、加酶量6000 U/g。在该条件下得到的DPPH清除率为92.82%。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明通过对DPPH· 、·OH、O₂ ^﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力的测定，证明所得抗氧化肽具有显著的还原能力，较强的清除自由基的能力，可以作为活性功能性成分用于保健品、化妆品等领域，应用范围非常广泛，具有显著的社会效益和经济效益；所述的酶解工艺条件最优，使南瓜籽蛋白抗氧化肽最大程度释放出来，提高原料的利用率；所述原料来源广泛，价格低廉，不仅对南瓜籽饼粕资源的开发具有重要的意义，而且实现了废物利用的目的，减少了对环境的危害。

附图说明

图1为酪氨酸标准曲线图；

图2为单酶酶解效果比较柱状图；

图3为加酶量对酶解效果的影响曲线；

图4为温度对酶解效果的影响曲线；

图5 为pH值对酶解效果的影响曲线；

图6为底物浓度对酶解效果的影响曲线；

图7为时间对酶解效果的影响曲线；

图8为加酶量和时间交互影响清除率的响应面图；

图9为加酶量和时间交互影响清除率的等高线图；

图10为加酶量和底物浓度交互影响清除率的响应面图；

图11为加酶量和底物浓度交互影响清除率的等高线图；

图12为底物浓度和时间交互影响清除率的响应面图；

图13为底物浓度和时间交互影响清除率的等高线图。

具体实施方式

实施例1：

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为4%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀。脱脂南瓜籽粉的制备方法为：将去皮南瓜籽在60℃烘箱中烘4小时，使水分含量在5%以下，然后粉碎，利用超临界CO₂萃取技术进行脱脂，脱脂条件为：萃取釜压力25MPa，萃取温度45℃，分离柱压力10MPa，分离温度50℃，CO₂流量2.4-4.2L/h；碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为40℃，料液比为1∶30，pH值为10，浸提时间为1.5h；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热5分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5，然后加木瓜蛋白酶5000U/g，在45℃水浴中水解2h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为4500r/min的条件下离心10分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.15MPa、料液质量浓度为1%、料液pH为6，操作时间为50分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

将得到的南瓜籽抗氧化肽分别进行DPPH· 、·OH、O₂ ^﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力测定，具体测定方法和测定结果如下：

（1）DPPH自由基清除率测定：

在反应管中加入2ml 0.2mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，再加入2ml（浓度为10mg/ml）的南瓜籽蛋白水解液，混合均匀，室温下避光反应50min 后，于517nm 波长处测定吸光度。同时以2ml DPPH溶液与2ml 蒸馏水混合后的吸光度为对照组；以2ml 蒸馏水与2ml 乙醇混合后的吸光度为空白组。

清除率(%)=[1-(A₁-A₂ )/A₃]×100

式中：A₁为加水解液后DPPH 溶液的吸光度；A₂为空白水解液的吸光度；A₃为未加水解液时DPPH 溶液的吸光度。

根据所测吸光度值，计算得DPPH自由基清除率为56.6%

（2）羟自由基清除能力测定：

准确的将南瓜籽蛋白酶解液配成一定浓度（浓度为8mg/ml），具体操作按照羟自由基测定试剂盒说明书进行。室温放置20min后，以蒸馏水调零，于550nm处测定吸光度值。抑制率按以下公式计算：

抑制率%=

根据所测吸光度值，计算得羟自由基清除能力为56.34%

（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：

将南瓜籽蛋白酶解液配成一定浓度（浓度为10mg/ml），具体操作按照抗超氧阴离子自由基试剂盒说明书进行。以蒸馏水调零，于550nm处测定吸光度值。抑制率按羟自由基清除能力计算公式计算。

根据所测吸光度值，计算得超氧阴离子自由基清除率为7.68%

（4）铁离子还原能力测定：

把样品配制成一系列的浓度（10mg/ml），吸取1ml于10ml具塞刻度试管中，加入2.5mlPBS缓冲液（0.2mol/L，pH=6.6），1%铁氰化钾溶液2.5ml，混匀，50℃水浴条件下反应20min。迅速冷却，立即加入10%三氯乙酸（TCA）溶液2.5ml，反应终止，离心（3000r/min，10min）。取离心后上清液2.5ml，加2.5ml蒸馏水，0.1%三氯化铁溶液0.5ml，混合均匀，反应10min后于700nm处测定吸光度。相同浓度下的样品吸光度值越大，还原能力越强。

该条件下所测的吸光度值为0.302

实施例2：

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为5%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀，脱脂南瓜籽粉的制备方法为：将去皮南瓜籽在60℃烘箱中烘4小时，使水分含量在5%以下，然后粉碎，利用超临界CO₂萃取技术进行脱脂，脱脂条件为：萃取釜压力25MPa，萃取温度45℃，分离柱压力10MPa，分离温度50℃，CO₂流量2.4-4.2L/h；碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是条件为：温度为50℃，料液比为1∶30，pH值为11，浸提时间为1.5h；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50℃水浴中水解5h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5000r/min的条件下离心20分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.2MPa、料液质量浓度为2%、料液pH为7，操作时间为60分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

将得到的南瓜籽抗氧化肽分别进行DPPH· 、·OH、O2﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力测定，具体测定方法和测定结果如下：

（1）DPPH自由基清除率测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得DPPH自由基清除率为82.21%

（2）羟自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得羟自由基清除能力为85.19%

（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得超氧阴离子自由基清除率为9.12%

（4）铁离子还原能力测定：测定方法同实施例1，该条件下所测的吸光度值为0.526

实施例3：

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为8%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀，脱脂南瓜籽粉的制备方法同实施例1；碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为45℃，料液比为1∶40，pH值为11，浸提时间为2.0h；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热15分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到3，然后加风味蛋白酶8000U/g，在55 ℃水浴中水解6h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5500r/min的条件下离心30分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.2MPa、料液质量浓度为2.5%、料液pH为6，操作时间为65分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

将得到的南瓜籽抗氧化肽分别进行DPPH· 、·OH、O2﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力测定，具体测定方法和测定结果如下：

（1）DPPH自由基清除率测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得DPPH自由基清除率为80.37%

（2）羟自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得羟自由基清除能力为81.45%

（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得超氧阴离子自由基清除率为9.04%

（4）铁离子还原能力测定：测定方法同实施例1，该条件下所测的吸光度值为0.511

实施例4：

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为6%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀，脱脂南瓜籽粉的制备方法同实施例1；碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为48℃，料液比为1∶35，pH值为10，浸提时间为1.8h；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热12分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到3.5，然后加2709碱性蛋白酶7000U/g，在45℃水浴中水解4h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为4800r/min的条件下离心25分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.25MPa、料液质量浓度为1.5%、料液pH为8，操作时间为55分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

将得到的南瓜籽抗氧化肽分别进行DPPH· 、·OH、O2﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力测定，具体测定方法和测定结果如下：

（1）DPPH自由基清除率测定：测定方法及计算公式同实施例1根据所测吸光度值，计算得DPPH自由基清除率为63.72%

（2）羟自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得羟自由基清除能力为59.39%

（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得超氧阴离子自由基清除率为7.93%

（4）铁离子还原能力测定：测定方法同实施例1，该条件下所测的吸光度值为0.394

实施例5：

一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为7%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀，脱脂南瓜籽粉的制备方法同实施例1；碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为46℃，料液比为1∶38，pH值为11，浸提时间为1.6h；（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热8分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到4.0，然后加Alcalase2.4L碱性蛋白酶6000U/g，在50℃水浴中水解3h，水解过程中保持pH恒定；（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5200r/min的条件下离心15分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.15MPa、料液质量浓度为3%、料液pH为7，操作时间为70分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

将得到的南瓜籽抗氧化肽分别进行DPPH· 、·OH、O2﹣·三种典型自由基的清除能力及铁离子还原能力测定，具体测定方法和测定结果如下：

（1）DPPH自由基清除率测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得DPPH自由基清除率为77.41%

（2）羟自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得羟自由基清除能力为75.38%

（3）超氧阴离子自由基清除能力测定：测定方法及计算公式同实施例1，根据所测吸光度值，计算得超氧阴离子自由基清除率为8.29%

（4）铁离子还原能力测定：测定方法同实施例1，该条件下所测的吸光度值为0.452。

Claims (6)

1.一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为4~8%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀；

（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热5~15分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5~3.5，然后加蛋白酶5000~8000U/g，在45~55 ℃水浴中水解2~6h，水解过程中保持pH恒定；

（3）灭酶离心后的酶解液通过超滤富集活性肽，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是碱溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工艺条件是：温度为40~50℃，料液比为1∶30~40，pH值为10~11，浸提时间为1.5~2.5h。

3.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或风味蛋白酶或2709碱性蛋白酶或Alcalase2.4L碱性蛋白酶中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述超滤所用超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.15~0.25MPa、料液质量浓度为1~3%、料液pH为6~8，操作时间为50~70分钟。

5.根据权利要求1所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是所述离心时转速为4500~5500r/min，离心时间为10~30分钟。

6.根据权利要求1至5所述的一种南瓜籽抗氧化肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）南瓜籽分离蛋白溶液的制备：以脱脂南瓜籽粉为原料，利用碱溶酸沉法得到南瓜籽分离蛋白，然后加水配制成质量浓度为5%的南瓜籽分离蛋白溶液，搅拌均匀；

（2）酶解：将步骤（1）得到的南瓜籽分离蛋白溶液在沸水浴中加热10分钟使蛋白变性，冷却后调节pH到2.5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50℃水浴中水解5h，水解过程中保持pH恒定；

（3）水解完成后迅速煮沸10分钟，使酶失活，冷却后在转速为5000r/min的条件下离心20分钟，然后将酶解液通过超滤富集活性肽，超滤膜的截留分子量为4KDa，超滤压力为0.2MPa、料液质量浓度为2%、料液pH为7，操作时间为60分钟，最后经浓缩和冷冻干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。

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