JP4522706B2 - 血中コレステロール低下剤として使用するための大豆β−コングリシニンα’サブユニットの選択的抽出、精製及び酵素的改変方法 - Google Patents

Description

本発明は、血中コレステロール低下剤として使用するための大豆β−コングリシニンα’サブユニットの選択的抽出、精製及び酵素的改変方法に関する。

本発明によれば、β−コングリシニンが、破砕し、脱脂された大豆から選択的に抽出され、次いで水性エタノールで処理することによって沈殿される；濃縮された画分は次いでα’サブユニットを得るために変性条件下で金属アフィニティクロマトグラフィ（ＭＡＣ）にかけられる。α’サブユニットはキモトリプシンで処理され、次いで再びアフィニティクロマトグラフィにかけられ、このポリペプチドのアミノ末端部分（ＭＷ２８、０００Ｄａ）が回収される。

大豆並びにその誘導品について知られているコレステロールを低下する性質は、イソフラボン（カークら、１９９８（非特許文献２））及びタンパク質（アンダーソン、１９９５（非特許文献１））の含有量に関係している。

大豆タンパク質は、主にグリシニン（１１Ｓ画分）及びβ−コングリシニン（７Ｓ画分）からなり、後者は、α、α’およびβと呼ばれる、３つのサブユニットからなる（タン及びシバサキ、１９７６（非特許文献１０））。大豆タンパク質に関する研究の結果、７Ｓ画分（ロバッチら、１９９２（非特許文献３）、１９９６（非特許文献４））、特にα’サブユニット（マンゾーニら、１９９８（非特許文献５））がＬＤＬ受容体を活性化すること、さらに血漿中のコレステロール濃度を低下するように作用することが確認された。事実、肝細胞系の７Ｓグロブリンでの処理はα及びα’サブユニット並びに同時のＬＤＬ受容体活性の甚だしい低下を誘起するが、一方、βサブユニットは低下しないし、受容体は活性化されない。さらに、７Ｓ画分がα’サブユニットを欠く大豆突然変異体は、たとえ高濃度であっても、受容体活性を変えることができない。

これら実験的観察の結果として、β−コングリシニンを純粋な形で得、並びに、さらに何らのペプチド合成をすることなく、酵素処理によって、特定のアミノ酸鎖が得られる、α’サブユニットを回収、精製する方法が求められている。

タンら（１９７５（非特許文献９）及び１９７６（非特許文献１０））によって提案され、続いてのオキーフ（１９９１（非特許文献７））によって改良された方法では、異なるｐＨにおける溶解性の相違に基づきグリシニンとβ−コングリシニンを分離している；しかし、交雑汚染はかなり高く、工業的規模で実施するには費用がかかり、困難であるゲルろ過またはアフィニティクロマロトグラフィが必要とされる。ナガノら（１９９２（非特許文献６））によって提案された改良方法は、画分の純度を向上させることができるけれど、やはり、実験室規模でのみ利用できる費用のかかる方法である。

最近、ウらはパイロット規模でグリシニンとコングリシニンを分離する方法を報告している（１９９９（非特許文献１２））。グリシニンはｐＨ８．5での２段水性抽出と、それに続く０．９８ｇ／Ｌ重亜硫酸塩溶液による上澄み液の処理によって、沈殿され、一方、コングリシニンはグリシニン沈殿母液へ０．２５ＭＮａＣｌを添加し、その後のｐＨ４．８への調整によって沈殿される。この方法では大量の原料を処理せねばならず、タンパク質を高収率で得ことができるが、画分の純度はなお不満足である；特に、β−コングリシニンは、過剰の重亜硫酸イオンを減らし、塩を除くために必要な処置である、水によるダイアフィルトレーション中に明らかに分解する。
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上述した方法は、純粋なβ−コングリシニンが得られないばかりでなく、α’サブユニットの分離及び精製を全く考慮していない。

本発明によれば、脱脂破砕大豆を、水性媒体での従来の方法に従う抽出に付し、次いでその上澄み液を水性エタノールで処理することによってβ−コングリシニンが濃縮された固体画分が製造される。次いで得られた画分は変性条件下で金属アフィニティクロマトグラフィ（ＭＡＣ）にかけられて純粋なα’サブユニットを得る。これをキモトリプシンの酵素処理に付し、明らかに最も高いＬＤＬ受容体活性化能を有するアミノ末端部分を得る。

本発明は、処理が下記の工程からなる、大豆β−コングリシニンα’サブユニットの選択的抽出、精製及び酵素的改変の方法である：
ａ）ｐＨ６．４において脱脂粉砕大豆を重亜硫酸ナトリウム水溶液で抽出し、β−コングリシニンを濃縮した溶解したタンパク質画分を得る工程；
ｂ）工程ａ）からのβ−コングリシニン画分をエタノールで処理して沈殿形成する工程；
ｃ）工程ｂ）からの沈殿画分を変性条件下において金属アフィニティクロマトグラフィ（ＭＡＣ）によって精製し、α’サブユニットを単離する工程；及び
ｄ）有機溶媒でα’サブユニットを沈殿する工程。
また、本発明は、さらに、ｅ）工程ｃ）からのα’サブユニットをタンパク質分解酵素で酵素処理し、ＭＡＣクロマトグラフィでさらに精製する工程を有する上記方法である。

β−コングリシニンは図１に示したように濃縮される。原料は、溶媒で油脂画分を除いて脱脂された大豆粉である。原料は微酸性ｐＨの重亜硫酸ナトリウム水溶液での抽出に付される。原料の１４〜１６質量倍、好ましくは１４．５〜１５．５質量倍の範囲である体積の溶液が使用される。重亜硫酸塩濃度は、０．８０〜１．２０ｇ／Ｌ、好ましくは０．９０〜１．１０ｇ／Ｌ、最適には０．９５〜１．０５ｇ／Ｌの範囲である。抽出は１４〜１８時間、−２〜８℃の温度で実施される。本発明の好ましい実施態様によれば、抽出は、温度０〜４℃、ｐＨ６．４で、１５倍容の０．９８ｇ／Ｌの重亜硫酸塩溶液で１６時間実施される。

これらのｐＨ及び温度条件下では、グリシニン類の溶解性は非常に低く、従って、これらは他の不溶物と共に沈殿する。沈殿は遠心分離され、溶解した画分は３５〜６０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）水性エタノール、好ましくは４０％水性エタノールで、温度２０〜３０℃、好ましくは室温、２５℃で処理される。上澄み液は遠心除去され、主としてβ−コングリシニンからなる沈殿は凍結乾燥される。得られた粉末は次の工程（図２）に供される。

α’サブユニットはヒスチジン含量がα及びβサブユニットよりも高い（タン及びシバサキ、１９７８（非特許文献１１））ので、ＭＡＣ（オストローブ及びワイス、１９９０（非特許文献８））にてα’サブユニトを分離精製するとの選択は、Ｚｎ²⁺及びＮｉ²⁺のような金属イオンと結合する能力に頼っている。

亜鉛またはニッケル、好ましくは亜鉛と組み合わされた基材が使用される。本発明の好ましい実施態様によれば、基材はイミノ二酢酸−アガロースからなる。凍結乾燥タンパク質原料はｐＨ７．２で５０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣｌからなり、５〜８Ｍ、好ましくは５Ｍの尿素を含む変性用バッファーに分散される。この条件で、α’サブユニットは選択的に基材に結合し、α及びβサブユニットが上記バッファーで溶出させることによって除かれる；α’サブユニットは続いて同じバッファーあるいは蒸留水に溶かした０．１Ｍイミダゾールで溶出される。

α’サブユニットが濃縮されたタンパク質画分は集められ、タンパク質を沈殿させる有機溶媒で、好ましくは冷アセトンで処理される。アセトンは画分容積の２〜５倍容、好ましくは３〜４倍容で、−１０〜−３０℃、好ましくは−１５〜−２５℃で使用される。本発明の好ましい実施態様によれば、−２０℃で３倍容のアセトンが使用される。得られた沈殿は遠心分離され、エタノール、好ましくは９５％エタノールに再分散され、さらに遠心され、凍結乾燥される。凍結乾燥物はタンパク質成分９４％を含み、原料よりもα’サブユニットが１０倍以上濃縮されている。

表１は大豆粉からのβ−コングリシニン及びα’サブユニットの抽出収率を示す。

α’サブユニットのポリペプチド断片は前記工程からの凍結乾燥物をタンパク質分解酵素で酵素処理に供することにより製造される。本発明の好ましい実施態様によれば、タンパク質分解酵素はキモトリプシンであり、得られる断片は主にＭＷ２８、０００Ｄａであるアミノ末端部分からなる。

手順は以下の通りである：前記工程からの凍結乾燥物が１．６Ｍの尿素を含む０．２ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液にｐＨ７．５〜８．５で濃度５ｍｇ／ｍｌで溶解される。キモトリプシンが基質に対して１：１０〜１：５０、好ましくは１：２５（ｗ／ｗ）の比率で加えられ、３７℃で２４時間撹拌下に培養される。続いてＭＡＣの工程が、上述と同様に、実施される。

イミダゾールで溶出した物質は、３つのポリペプチド断片を含んでいる。主なものはＭＷ２８、０００Ｄａであり、α’サブユニットのアミノ末端部分である。

α’サブユニット及びキモトリプシン断片をラットへ投与してみると、両方共に血漿中のコレステロール並びに総トリグリセリド濃度を明らかに低下させる能力を有することが分かった（表２）。特に、キモトリプシン断片は、コレステロール濃度を低下させることにおいて、他の大豆成分のみならず、クロフィブラートよりも有効であり、トリグリセリドについても同様の結果が得られた。

生物的試験の結果から、本発明の方法で得られる製品、特にα’サブユニット及びその断片は医薬として、特に血漿中のコレステロール及び／またはトリグリセリド濃度を低下させる必要がある病状の治療ために用いることができる。該化合物は、特に高脂血症治療のための医薬組成物製造に、活性成分として単独であるいは組み合わせて、適当な担体と共に、使用される。さらに、これらは、上記条件における食事療法のための補助剤あるいは食品の製造のためにも使用できる。

第一工程：大豆から７Ｓグロブリンの精製
原料は、溶媒としてペンタンを用いるソックスレー法によって脱脂された、粉砕大豆であった。

脱脂粉砕大豆の１５倍容の０．９８ｇ／Ｌ ＮａＨＳＯ₃溶液で、ｐＨを６．４に保ちながら、０〜４℃で１６時間タンパク質が抽出された。遠心分離した後、上澄み液が室温で４０％エタノールにより処理された。β−コングリシニンが濃縮され、原料よりも２倍の濃度のα’サブユニットを含む得られた沈殿は凍結乾燥された。

第二工程：α’サブユニットの精製
β−コングリシニン濃縮画分は５Ｍの尿素を含む変性バッファー（５０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中に再分散され、亜鉛を結合したアガロース−イミノニ酢酸基材によるＭＡＣにより精製された。非結合タンパク質は上述と同様のバッファーで溶出され、一方、主にα’サブユニットからなる、結合しているタンパク質物質は同じバッファーあるいは蒸留水に溶かした０．１Ｍイミダゾールで溶出された。

α’サブユニットが濃縮されたタンパク質画分は−２０℃で３〜４倍容のアセトンで処理された；得られた沈殿は４０％エタノールに分散され、次いで遠心され、凍結乾燥された。得られた沈殿はタンパク質９４％を含み、α’サブユニットが原料よりも１０倍以上濃縮されている。

第三工程：α’サブユニットの酵素処理
前記工程からの凍結乾燥物はｐＨ７．５〜８．５で、１．６Ｍの尿素を含む０．２ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃溶液に濃度５ｍｇ／ｍｌで溶解された。この溶液はタンパク質基質に対する比率が１：２５ｗ／ｗとなるようキモトリプシンが加えられ、３７℃で２４時間撹拌下に培養され、続いて上述と同様にＭＡＣにより精製された。樹脂によって保持され、０．１Ｍイミダゾールで溶出された物質は、３つのポリペプチド断片を含んでいる。主なものはＭＷ２８、０００Ｄａである、α’サブユニットのアミノ末端部分である。

［生物学的試験］
動物
体重７５〜１００ｇである雄のラットＣＤ ＳＰＦ／ＶＡＦが使用された。動物は照光（明１２時間、暗１２時間のサイクル）、温度（２１±１℃）および湿度（６０±５％）の自動調節環境下、マクロロンケージ中で飼育された。

実験手続
７日間飼育した後、動物を無作為に２０匹ずつの７群に分けた（表２）。２８日間、一つの群には普通餌（コード０１４ＲＦ２５Ｃ；Ｍｕｃｅｄｏｌａ Ｓ．ｒ．Ｉ．、Ｓｅｔｔｉｍｏ Ｍｉｌａｎｅｓｅ、ＭＩ、イタリア）を与え、他の群にはコレステロール１％、胆汁酸０．５％および硬化ココナッツ油２５％を含む高コレステロール餌（バッチ３３２０００、製造２０００年９月１日；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ｄｏｔｔｏｒｉ Ｐｉｃｃｉｏｎｉ、Ｇｅｓｓａｔｅ、ＭＩ、イタリア）を与え、水は自由に摂取させた。餌を毎日与え（４０ｇ、午前９：００）、未摂取物の量は計った。投与は下記の様に実施した：

群1（対照）：普通餌で飼育し、０．５％カルボキシメチルセルロース液を２８日間経口投与した動物。
群２： 高コレステロール餌で飼育し、０．５％カルボキシメチルセルロース液を２８日間経口投与した動物。
群３： 高コレステロール餌で飼育し、クロフィブラート薬剤量２００ｍｇ／ｋｇを２８日間経口投与した動物。
群４： 高コレステロール餌で飼育し、大豆全タンパク質抽出物（ＴＰＥ）薬剤量２００ｍｇ／ｋｇを２８日間経口投与した動物。
群５： 高コレステロール餌で飼育し、β−コングリシニン薬剤量５０ｍｇ／ｋｇを２８日間経口投与した動物。
群６： 高コレステロール餌で飼育し、α’サブユニット薬剤量２０ｍｇ／ｋｇを２８日間経口投与した動物。
群７： 高コレステロール餌で飼育し、α’サブユニットキモトリプシン断片薬剤量１ｍｇ／ｋｇを２８日間経口投与した動物。

血漿中の総コレステロール及びトリグリセリド濃度を２８日間の投与終了後１６時間断食したのちに測定した。動物をエチルエーテルで麻酔し、ＥＤＴＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含む試験管に下大静脈から血液を抜き取った。４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離したのち、血漿を採取し、凍結し、測定するまで−２０℃で貯蔵した。

血漿中の総コレステロール及びトリグリセリド濃度（表２に記載した）を通常の酵素法分析により測定した。

β−コングリシニン濃縮のフローを示す図である。 α’サブユニットの精製のフローを示す図である。

Claims (19)

1. 処理が下記の工程からなる、大豆β−コングリシニンα’サブユニットの選択的抽出、精製及び酵素的改変方法：
   ａ）ｐＨ６．４において脱脂粉砕大豆を重亜硫酸ナトリウム水溶液で抽出し、β−コングリシニンを濃縮した溶解したタンパク質画分を得る工程；
   ｂ）工程ａ）からのβ−コングリシニン画分をエタノールで処理して沈殿形成する工程；
   ｃ）工程ｂ）からの沈殿画分を変性条件下において金属アフィニティクロマトグラフィ（ＭＡＣ）によって精製し、α’サブユニットを単離する工程；及び
   ｄ）有機溶媒でα’サブユニットを沈殿する工程。
2. 工程ａ）の抽出がｐＨ６．４で１５倍容の０．９８ｇ／Ｌの重亜硫酸ナトリウム溶液によって実施される請求項１に記載の方法。
3. 工程ｂ）の沈殿形成が４０％エタノールで実施される請求項１に記載の方法。
4. 工程ｃ）におけるＭＡＣが亜鉛又はニッケルを結合した基材上で行なわれる請求項１に記載の方法。
5. 基材が亜鉛を結合している請求項４に記載の方法。
6. 基材がアガロース−イミノ二酢酸からなる請求項４または５に記載の方法。
7. 工程ｃ）のＭＡＣで使用される変性剤が尿素である請求項１に記載の方法。
8. 工程ｄ）のα’サブユニットの沈殿化溶媒がアセトンである請求項１に記載の方法。
9. β−コングリシニン濃縮画分及びα’サブユニットが凍結乾燥により安定化されている請求項１に記載の方法。
10. さらに、ｅ）工程ｃ）からのα’サブユニットをタンパク質分解酵素で酵素処理し、ＭＡＣクロマトグラフィでさらに精製する工程を有する請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 工程ｅ）の酵素処理用のタンパク質分解酵素がキモトリプシンである請求項１０に記載の方法。
12. 請求項１〜９のいずれかに記載の方法で得られる大豆β−コングリシニンα’サブユニット。
13. 請求項１０または１１に記載の方法に従って得られる主成分が大豆β−コングリシニンα’サブユニットのアミノ末端ポリペプチド断片であるポリペプチド断片。
14. 請求項１２に記載の大豆β−コングリシニンα’サブユニットを含む医薬。
15. 請求項１３に記載のポリペプチド断片を含む医薬。
16. 高脂血症を治療するための医薬を製造するための請求項１２に記載の大豆β−コングリシニンα’サブユニットの使用。
17. 高脂血症を治療するための医薬を製造するための請求項１３に記載のポリペプチド断片の使用。
18. 請求項１２に記載の大豆β−コングリシニンα’サブユニットまたは請求項１３に記載のポリペプチド断片を、単独であるいは他の有効成分と組み合わせて、適当な担体と混合して含む医薬組成物。
19. 請求項１２に記載の大豆β−コングリシニンα’サブユニットまたは請求項１３に記載のポリペプチド断片を含む補助剤あるいは栄養剤。

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