ES2274208T3 - Procedimiento para la extraccion, purificacion y modificacion enzimatica de la subunidad alfa' de globulina 7s de soja para su uso como agente hipocolesterolemiante. - Google Patents

Procedimiento para la extraccion, purificacion y modificacion enzimatica de la subunidad alfa' de globulina 7s de soja para su uso como agente hipocolesterolemiante. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para la extracción, purificación y modificación enzimática selectivas de la subunidad alfa¿ de beta-conglicinina de soja, procedimiento que comprende las siguientes etapas: a) extracción de soja molida desgrasada con una solución acuosa de bisulfito sódico a pH ligeramente ácido obteniendo una fracción proteínica soluble enriquecida en beta-conglicinina; b) precipitación de la fracción de beta-conglicinina de la etapa a) mediante tratamiento con etanol; c) purificación de la fracción precipitada de la etapa b) mediante Cromatografía de afinidad por metales (CAM) en condiciones desnaturalizantes, aislando la subunidad alfa¿; d) precipitación de la subunidad alfa¿ con disolventes orgánicos; e) tratamiento enzimático de la subunidad alfa¿ de la etapa d) con una enzima proteolítica y purificación adicional por cromatografía CAM.

Description

Procedimiento para la extracción, purificación y modificación enzimática de la subunidad \alpha' de globulina 7S de soja para su uso como agente hipocolesterolemiante.
La presente invención se refiere aun procedimiento para la extracción, purificación y modificación enzimática de subunidad \alpha' de \beta-conglicinina.
De acuerdo con la invención, \beta-conglicinina se extrae selectivamente de soja molida y desgrasada, después se precipita por tratamiento con etanol acuoso; la fracción enriquecida después se somete a cromatografía de afinidad por metales (CAM) en condiciones desnaturalizantes obteniendo la subunidad \alpha'. Ésta se trata con quimotripsina, después se somete a una etapa adicional de cromatografía de afinidad para recuperar la región del extremo amino de este polipéptido (PM 28.000 Da).
Antecedentes técnicos
Las conocidas propiedades de reducción del colesterol de la soja y sus derivados están relacionadas con el contenido en isoflavonas (Kirk y cols., 1998) y en proteínas (Anderson y cols., 1995).
Las proteínas de la soja están formadas principalmente por glicininas (fracción 11 S) y \beta-conglicininas (fracción 7S). Éstas últimas están formadas por tres subunidades, denominadas \alpha, \alpha' y \beta (Thanh y Shibasaki, 1976). Los estudios realizados sobre las proteínas de la soja han establecido que la fracción 7S (Lovati y cols., 1992, 1996), en particular la subunidad \alpha' (Manzoni y cols., 1998) es capaz de activar el receptor LDL y por lo tanto es la principal responsable de la reducción de los niveles de colesterol en plasma. De hecho, el tratamiento de una línea hepatocelular con globulina 7S induce una extensa degradación de las subunidades \alpha y \alpha' y la estimulación de la actividad del receptor de LDL, mientras que las subunidades \beta no son degradadas y el receptor no se activa. Además, los mutantes de soja en los que la fracción 7S carece de la subunidad \alpha' no tienen capacidad de modificar la actividad del receptor, incluso a concentraciones elevadas.
Como consecuencia de estas observaciones experimentales, son necesarios procedimientos para obtener \beta-conglicinina en forma pura, así como para recuperar y purificar la subunidad \alpha', de la que subsiguientemente podrían obtenerse secuencias de aminoácidos específicas mediante tratamiento enzimático, sin usar síntesis peptídica.
El procedimiento que sugieren Than y cols. (1975 y 1976) y que subsiguientemente modificaron O'Keefe y cols. (1991) permite separar las glicininas y las \beta-conglicininas basándose en sus diferentes solubilidades a pH diferentes; sin embargo, la contaminación cruzada todavía es elevada y es necesaria la filtración en gel o la cromatografía de afinidad, que son costosas y difíciles de realizar a escala industrial. También la modificación que sugieren Nagano y cols. (1992), aunque permite aumentar la pureza de las fracciones, todavía es un procedimiento caro que puede usarse sólo a escala de laboratorio.
Recientemente, Wu y cols. (1999) han descrito un procedimiento para separar glicininas y conglicininas a escala de planta piloto. Las glicininas se precipitan mediante dos extracciones acuosas subsiguientes a pH 8,5, seguidas de tratamiento del sobrenadante con una solución de bisulfito a 0,98 g/l, mientras las conglicininas se precipitan añadiendo NaCl 0,25 M a las aguas madre de la precipitación de las glicininas, y después se ajusta el pH a 4,8. El procedimiento permite tratar grandes cantidades de material inicial y también proporciona rendimientos de proteína elevados, pero la pureza de las fracciones todavía es insatisfactoria; en particular, \beta-conglicinina sufre degradación, aparentemente durante la filtración con agua, que es un tratamiento necesario para reducir el exceso de iones bisulfito y para eliminar las sales.
Los procedimientos citados anteriormente no sólo no proporcionan \beta-conglicinina pura, sino que sobre todo no prevén la separación y purificación de la subunidad \alpha'.
De acuerdo con la invención, se prepara una fracción sólida enriquecida en \beta-conglicinina extrayendo soja molida desgrasada en un medio acuoso de acuerdo con procedimientos convencionales y subsiguientemente precipitando el sobrenadante con etanol acuoso; la fracción resultante después se purifica mediante cromatografía de afinidad por metales (CAM) en condiciones desnaturalizantes proporcionando la subunidad \alpha' pura, que se somete a tratamiento enzimático con quimotripsina obteniendo la región del extremo amino que aparentemente tiene la mayor actividad de activación del receptor de LDL.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción, purificación y modificación enzimática selectivas de la subunidad \alpha' de \beta-conglicinina de soja, procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a) extracción de soja desgrasada molida con una solución acuosa de bisulfito sódico a pH ligeramente ácido obteniendo una fracción de proteína soluble enriquecida en \beta-conglicinina;
b) precipitación de la fracción de \beta-conglicinina de la etapa a) mediante tratamiento con etanol;
c) purificación de la fracción precipitada de la etapa b) mediante Cromatografía de afinidad por metales (CAM) en condiciones desnaturalizantes, aislando la subunidad \alpha';
d) precipitación de la subunidad \alpha' con disolventes orgánicos;
e) tratamiento enzimático de la subunidad \alpha' de la etapa d) con una enzima proteolítica y purificación adicional por cromatografía CAM.
El enriquecimiento de \beta-conglicinina se realiza tal como se muestra en la Figura 1. El material inicial es harina de soja, desgrasada eliminando la fracción lipídica con disolventes. El material se extrae con una solución acuosa de bisulfito sódico a pH ligeramente ácido. Se usa un volumen de solución que varía en el intervalo de 14 a 16 veces el peso del material inicial, preferiblemente de 14,5 a 15,5 veces. La concentración de bisulfito varía en el intervalo de 0,80 a 1,20 g/l, preferiblemente de 0,90 a 1,0 g/l, lo más preferiblemente de 0,95 a 1,05 g/l. La extracción se lleva a cabo durante un tiempo que varía entre 14 y 18 horas a una temperatura que varía en el intervalo de -2 a 8ºC. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la extracción se lleva a cabo durante 16 horas con 15 volúmenes de una solución de bisulfito a 0,98 g/l a pH 6,4, a temperaturas que varían en el intervalo de 0 a 4ºC.
En estas condiciones de pH y temperatura, la solubilidad de las glicininas es muy reducida, por lo tanto éstas precipitan junto con otro material insoluble. El precipitado se separa por centrifugación y la fracción soluble se trata con etanol acuoso al 35-60% (vol/vol), preferiblemente etanol acuoso al 40%, a temperaturas que varían en el intervalo de 20 a 30ºC, preferiblemente a temperatura ambiente, 25ºC. El sobrenadante se elimina por centrifugado y el precipitado, que está formado principalmente por \beta-conglicinina, se liofiliza. El polvo resultante se somete a la etapa subsiguiente (Figura 2).
La elección de separar y purificar la subunidad \alpha' mediante CAM (Ostrove y Weiss, 1990) depende de su capacidad de coordinar iones metálicos tales como as Zn^{2+} y Ni^{2+}, ya que esta subunidad tiene un mayor contenido en histidina que las subunidades \alpha y \beta (Thanh y Shibasaki, 1978).
Se usa una matriz conjugada con cinc o níquel, preferiblemente cinc. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la matriz está formada por agarosa con ácido iminodiacético. El material proteínico liofilizado se suspende en un tampón desnaturalizado formado por Tris 50 mM, NaCl 0,5 M, a pH 7,2 y que contiene urea de 5 a 8 M, preferiblemente 5 M. En estas condiciones, la subunidad \alpha' se une selectivamente a la matriz, y las subunidades \alpha y \beta pueden eliminarse mediante elución con el tampón anterior; la subunidad \alpha' se eluye subsiguientemente con imidazol 0,1 M en el mismo tampón o en agua destilada.
La fracción de proteína enriquecida en subunidad \alpha' se recoge y se trata con disolventes orgánicos que precipitan las proteínas, preferiblemente con acetona fría. Se usa acetona en un volumen que varía en el intervalo de 2 a 5 veces el volumen de la fracción, preferiblemente de 3 a 4 volúmenes, a una temperatura que varía en el intervalo entre -10 y -30ºC, preferiblemente entre -15 y -25ºC. De acuerdo con una realización preferida de la invención, se usan 3 volúmenes de acetona a -20ºC. El precipitado resultante se separa por centrifugación, se resuspende en etanol, preferiblemente en etanol al 95%, se centrifuga adicionalmente y se liofiliza. El liofilizado contiene 94% de material proteínico y está 10 veces más enriquecido en la subunidad \alpha' que el material inicial.
La tabla 1 muestra los rendimientos en \beta-conglicinina y subunidad \alpha' de la extracción de la harina de soja.
TABLA 1
Fracción proteínica Material inicial Rendimiento de la extracción
(% en peso)
\beta-conglicinina Harina desgrasada 18,7
Subunidad \alpha' \beta-conglicinina 11,0
Subunidad \alpha' Harina desgrasada 2,1
Los fragmentos polipeptídicos de la subunidad \alpha' se preparan sometiendo el liofilizado de la etapa anterior a tratamiento enzimático con una enzima proteolítica. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la enzima proteolítica es quimotripsina y el fragmento resultante está formado principalmente por la región del extremo amino que tiene un PM de 28.000 Da.
El procedimiento es el siguiente: el liofilizado de la etapa anterior se disuelve a una concentración de 5 mg/ml en NH_{4}HCO_{3} 0,2 M que contiene urea 1,6 M a un pH que varía en el intervalo de 7,5 a 8,5. Se añade quimotripsina en una proporción de 1:10 a 1:50, preferiblemente 1:25 p/p al sustrato, incubando a 37ºC agitando durante 24 horas. Subsiguientemente se lleva a cabo una etapa de CAM, tal como se describe anteriormente.
El material eluido con imidazol contiene fragmentos polipeptídicos, donde el principal tiene un PM de 28.000 Da, y constituye la región del extremo N de la subunidad \alpha'.
La administración de la subunidad \alpha' y del fragmento de quimotripsina a ratas (tabla 2) demostró que ambos son capaces de disminuir notablemente los niveles de colesterol y triglicéridos totales en plasma. En particular, el fragmento de quimotripsina demostró no sólo ser más eficaz que otros componentes de la soja, sino también que el clorofibrato, en la reducción de los niveles de colesterol y proporcionó resultados comparables en los triglicéridos.
Los resultados de la experimentación biológica sugieren que los productos que pueden obtenerse de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, en particular la subunidad \alpha' y sus fragmentos, pueden usarse como medicamentos, en particular para el tratamiento de aquellas patologías que requieren reducir los niveles en plasma de colesterol y/o triglicéridos. Dichos compuestos se usarán, solos o combinados con otros principios activos y mezclados con vehículos adecuados, para la preparación de composiciones farmacéuticas, en particular para el tratamiento de hiperlipidemias. Además, también pueden usarse para la preparación de suplementos o productos alimentarios para regímenes dietéticos a seguir en las afecciones mencionadas anteriormente.
Ejemplos
Primera etapa
Purificación de globulina 7S de soja
El material inicial era soja molida, desgrasada de acuerdo con el procedimiento Soxhlet, usando pentano como disolvente.
Se extrajeron las proteínas con una solución de 0,98 g/l de NaHSO_{3} en cantidades de 15 veces el volumen de la soja molida desgrasada, durante 16 horas a temperaturas que varían en el intervalo de 0 a 4ºC, manteniendo el pH a 6,4. Después de la centrifugación, el sobrenadante se trató con etanol al 40% (vol/vol) a temperatura ambiente. El precipitado resultante, enriquecido en \beta-conglicinina y que contenía la subunidad \alpha' a una concentración doble que el material inicial, se liofilizó.
Segunda etapa
Purificación de la subunidad \alpha'
La fracción enriquecida en \beta-conglicinina se resuspendió en un tampón desnaturalizante (Tris 50 mM, NaCl 0,5 M, a pH 7,2) que contenía urea 5 M y se purificó por CAM en una matriz de azarosa y ácido iminodiacético (Sigma) conjugada con cinc. El material proteínico no unido se eluyó con el mismo tampón que anteriormente, mientras que el material proteínico, que estaba formado principalmente por la subunidad \alpha', se eluyó con imidazol 0,1 M en el mismo tampón o en agua destilada.
Las fracciones enriquecidas en subunidad \alpha' se trataron con 3-4 volúmenes de acetona a -20ºC; el precipitado resultante se suspendió en etanol al 40% a temperatura ambiente, después se centrifugó y se liofilizó. El polvo resultante contiene 94% de proteínas y está 10 veces más enriquecido en subunidad \alpha' que el inicial material.
Tercera etapa
Tratamiento enzimático de la subunidad \alpha'
El liofilizado de la etapa anterior se disolvió a una concentración de 5 mg/ml en NH_{4}HCO_{3} 0,2 M que contenía urea 1,6 M, a pH que variaba en el intervalo de 7,5 a 8,5. La solución se trató después con quimotripsina en una proporción de 1:25 p/p con el sustrato proteínico y se incubó a 37ºC agitando durante 24 horas, después se purificó por CAM tal como se describe anteriormente. El material retenido por la resina y eluido con imidazol 0,1 M contiene tres fragmentos polipeptídicos, el principal de los cuales un peso molecular 28.000 Da y está formado por la región del extremo N de la subunidad \alpha'.
Experimentación biológica Animales
Se usaron ratas CD SPF/VAF macho, que pesaban 75-100 g. Los animales se alojaron en jaulas de Makrolon (4-5 animales por jaula) en un entorno con control automático de la luz (ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad), temperatura (21 \pm 1ºC) y humedad (60 \pm 5%).
Protocolo experimental
Después de 7 días de alojamiento, los animales se dividieron aleatoriamente en siete grupos de 20 ratas cada uno (Tabla 2). Durante 28 días, un grupo se alimentó con dieta normal (código 014RF25C; Mucedola S.r.l., Settimo Milanese, MI, Italia), mientras que los otros se alimentaron con dieta hipercolesterolémica que estaba formada por colesterol al 1%, ácido cólico al 0,5% y aceite de coco hidrogenado al 25% (lote 332000, preparación 01-09-2000; Laboratorio Dottori Piccioni, Gessate, MI, Italia), con acceso a agua a voluntad. La dieta se administraba diariamente (40 g, 09:00 a.m.) y se pesaba la cantidad que no se consumía. El tratamiento se realizó de la forma siguiente.
Grupo 1 (control): animales alimentados con dieta normal y tratados por vía oral durante 28 días con una solución de carboximetilcelulosa al 0,5%.
Grupo 2: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con una solución de carboximetilcelulosa al 0,5%.
Grupo 3: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con clofibrato a una dosis de 200 mg/kg.
Grupo 4: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con el extracto de proteína total de soja (EPT) a una dosis de 200 mg/kg.
Grupo 5: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con \beta-conglicinina a una dosis de 50 mg/kg.
Grupo 6: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con la subunidad \alpha' a una dosis de 10 mg/kg.
Grupo 7: animales alimentados con dieta hipercolesterolémica y tratados por vía oral durante 28 días con el fragmento de quimotripsina de la subunidad \alpha' a una dosis de 1 mg/kg.
Se midieron los niveles de colesterol y triglicéridos totales en plasma al final del día 28 del tratamiento y después de 16 horas de ayuno. Se anestesió a los animales con éter etílico y se extrajo sangre de la vena cava inferior en tubos que contenían EDTA (1 mg/ml). Después de centrifugar durante 15 minutos a 4ºC a 3000 rpm, se recuperó el plasma, se congeló y se almacenó a -20ºC hasta las mediciones.
Se determinaron las concentraciones de colesterol y triglicéridos totales en plasma (reseñadas en la Tabla 2) de acuerdo con ensayos enzimáticos convencionales.
TABLA 2
Tratamiento Colesterol total Triglicéridos totales
(mg/dl) (mg/dl)
Grupo 1 55,4 \pm 3 105,1 \pm 7,2
Grupo 2 284,1 \pm 10,3 226,9 \pm 12,6
Grupo 3 191,2 \pm 8,0 139,1 \pm 5,8
Grupo 4 236,1 \pm 10,2 176,9 \pm 8,1
Grupo 5 196,4 \pm 7,6 146,7 \pm 5,9
Grupo 6 182,2 \pm 12,1 150,1 \pm 9,8
Grupo 7 175,8 \pm 7,9 140,3 \pm 7,4
Referencias
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Lovati M.A., Manzoni C., Corsini A., Granata A, Fumagalli R., Sirtori C., 1996 J. Nutr. 126, 2831-2842.
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Nagano T., Hirotsuka M., Mori H., Kohyama K, Nishinari K, 1992 J. Agric. Food Chem. 40, 941-944.
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Ostrove S., Weiss S., 1990 Methods in Enzimology 182, 371-379.
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Thanh V.H., Shibasaki K., 1978 J.Agric. Food Chem. 26, 695-698.
Wu S., Murphy P.A, Johnson L.A., Fratzke AA., Reuber M.A 1999 JAOCS 76, 285-293.

Claims (18)

1. Un procedimiento para la extracción, purificación y modificación enzimática selectivas de la subunidad \alpha' de \beta-conglicinina de soja, procedimiento que comprende las siguientes etapas:
a) extracción de soja molida desgrasada con una solución acuosa de bisulfito sódico a pH ligeramente ácido obteniendo una fracción proteínica soluble enriquecida en \beta-conglicinina;
b) precipitación de la fracción de \beta-conglicinina de la etapa a) mediante tratamiento con etanol;
c) purificación de la fracción precipitada de la etapa b) mediante Cromatografía de afinidad por metales (CAM) en condiciones desnaturalizantes, aislando la subunidad \alpha';
d) precipitación de la subunidad \alpha' con disolventes orgánicos;
e) tratamiento enzimático de la subunidad \alpha' de la etapa d) con una enzima proteolítica y purificación adicional por cromatografía CAM.
2. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la extracción se lleva a cabo con 15 volúmenes de una solución de bisulfito sódico a 0,98 g/l a pH 6,4.
3. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la precipitación de la etapa b) se lleva a cabo con etanol al 40%.
4. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la CAM de la etapa c) se lleva a cabo en una matriz conjugada con cinc o níquel.
5. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 4, en el que la matriz está conjugada con cinc.
6. Un procedimiento tal como se reivindica en las reivindicaciones 4 ó 5, en el que la matriz está formada por azarosa y ácido iminodiacético.
7. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el agente desnaturalizante que se usa en la CAM de la etapa c) es urea.
8. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la enzima proteolítica para el tratamiento enzimático de la etapa e) es quimotripsina.
9. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el disolvente de precipitación para la subunidad \alpha' de la etapa d) es acetona.
10. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la fracción enriquecida en \beta-conglicinina y la subunidad \alpha' se estabilizan mediante liofilización.
11. Fragmentos polipeptídicos de la subunidad \alpha' de \beta-conglicinina de soja que pueden obtenerse mediante el procedimiento de las reivindicaciones 1-10.
12. Fragmento polipeptídico del extremo amino que puede obtenerse de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 8.
13. Fragmentos polipeptídicos de la subunidad \alpha' de \beta-conglicinina de soja de la reivindicación 11 para usar como medicamento.
14. Fragmento polipeptídico del extremo amino-terminal de la reivindicación 11 para usar como medicamento.
15. El uso de los fragmentos polipeptídicos de la subunidad \alpha' de \beta-conglicinina de soja de la reivindicación 11 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de hiperlipidemias.
16. El uso del fragmento polipeptídico de la reivindicación 11 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de hiperlipidemias.
17. Composiciones farmacéuticas que contienen los fragmentos polipeptídicos de las reivindicaciones 11 ó 12, solos o combinados con otros ingredientes activos, mezclados con vehículos adecuados.
18. Suplementos o productos alimentarios que contienen los fragmentos polipeptídicos de las reivindicaciones 11 ó 12.
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