KR100991641B1

KR100991641B1 - 저콜레스테린혈증 화제용 소이(ｓｏｙ）7Ｓ글로불린알파’서브유닛의 효소적 수식과 추출, 정제 공정

Info

Publication number: KR100991641B1
Application number: KR1020047011441A
Authority: KR
Inventors: 마셀로 두란티; 파올로 모라쪼니
Original assignee: 인데나 에스피아
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2003-01-27
Publication date: 2010-11-04
Also published as: DK1469741T3; PT1469741E; US20110118182A1; PL209342B1; EP1469741A1; ITMI20020147A1; NO20043186L; PL370294A1; DE60308994D1; ITMI20020147A0; CY1107514T1; AU2003208346B8; EP1469741B1; HK1073590A1; IL163225A; CA2474106A1; US7901718B2; ES2274208T3; DE60308994T2; SG152048A1

Abstract

본 발명은 β-콘글리시닌 α’서브유닛의 추출, 정제 및 효소적 수식 방법에 관한 것으로, 여기서 β-콘글리시닌은 탈지된 소이 분말에서 선택적으로 추출되고, 다음 수성 에탄올로 처리하여 침전시킨 다음 ; 풍부한 분획물을 키모트립신 처리된 α’서브유닛을 얻기 위해 변성제 조건에서 금속 친수성 클로마토그래피(MAC)로 처리한 후, 이 폴리펩티드(MW 28,000 Da)의 아미노-말단 영역을 회복하기 위해 추가로 MAC 처리한다.

β-콘글리시닌 α’서브유닛(β-conglycinin α'subunit), 저콜레스테린혈증화제(hypocholesterolemizing agent)

Description

저콜레스테린혈증 화제용 소이(ｓｏｙ）7Ｓ 글로불린 알파’서브유닛의 효소적 수식과 추출, 정제 공정{A process for the extraction, purification and enzymatic modification of soy 7S globulin alpha'subunit for use as hypocholesterolemizing agent}

본 발명은 β-콘글리시닌(β-conglycinin) α’서브유닛(subunit)의 효소적 수식(enzymatic modification)과 추출, 정제 공정에 관한 것이다.

발명에 따르면, β-콘글리시닌은 탈지된 소이(soy) 가루에서, 선택적으로 추출되고, 그 다음 수성 에탄올의 처리로 인해 침전된다 ; 풍부한 분획물을, α’서브유닛을 획득하기 위하여, 변성제 조건에서 금속 친화성 클로마토그래피(Metal affinity chromatography. MAC)를 행하였다. 후자는 키모트립신(Chymotrypsin)으로 처리되고, 다음 이 폴리펩티드(MW 28,000 Da)의 아미노-말단 영역을 회복시키기 위해 추가로 친화성 클로마토그래피 단계를 수행했다.

소이(soy) 및 그의 유도체의 알려진 콜레스테롤 저하 특성은 이소플라본(isoflavones)(Kirk et al., 1998)과 단백질(proteins)(Anderson et. al., 1995) 성분과 연관이 있다.

소이 단백질은 주로 글리시닌(11S 분획물)과 β-콘글리시닌(7S 분획물)로 구성되며, 후자는 α, α’ 그리고 β(Thanh 그리고 Shibasaki, 1976)로 명명된, 3가지 서브유닛으로 구성되어있다. 연구는 7S 분획물(Lovati et. al., 1992, 1996)을 확립한 소이 단백질 상에서 실행했는데, 특히 α’서브유닛(Manzoni et. al, 1998)은 LDL 수용체를 활성화할 능력이 있고, 그런 까닭에 콜레스테롤 혈장 수치를 감소시키는 주된 원인임이 규명되어있다. 사실, 7S 글로블린으로 간세포 선의 치료는 α와 α’서브유닛의 광범위한 분해와, LDL 수용체 활성의 자극을 야기하는데 반해, β 서브유닛은 분해되지 않고, 수용체는 활성되지 않는다. 또한 α’서브유닛이 부족한 7S 분획물 중 소이 돌연변이체는 심지어 높은 농도에서도 수용체 활성 수식이 불가능하다.

이와 같은 실험결과로 미루어 볼 때, 이 처리방법은 α’서브유닛을 회수하고 정제함은 물론, 순수한 형태에서 β-콘글리시닌을 획득하는 것이 필요하고, 특이한 아미노 산성 서열이 효소 처리에 의해, 펩티드 합성의 사용 없이 계속하여 얻어 질수 있어야 할 것이다.

탄 등(Than et al.)(1975와 1976)에 의해 제안되고 그 후 오’케페 등(O'Keefe et al.)(1991)에 의해 수정된 공정으로 다른 pH에서 다른 용해도에 근거한 글리시닌과 β-콜글리시닌을 분리된 바 있다.; 그러나, 교차-오염(cross-contamination)은 여전히 높고, 겔 여과법 또는 친화성 클로마토그래피가 요구되며, 공업용 규모 상에서 실행되는데 비싸고 어렵다. 나가노 등(Nagano et al.)(1992)에 의해 제안된 변형된 방법 역시, 비록 분획물 순도를 높일 수는 있을지라도, 단지 실험실 규모 상에서 사용될 수 있는 방법으로 역시 고비용의 방법이었다.

최근, 우 등(Wu et al.)(1999)은 파일롯-식물 규모(pilot-plant scale) 상에서 글리닌과 콘글리시닌을 분리하는 방법을 발표했다. 글리시닌은 pH 8.5에서 두개의 연속 수용성 추출을 하고, 다음 0.98 g/L 아황산수소염 용액으로 상등액을 처리하여 침전시키는데, 반면에 콘글리시닌은 글리시닌 침전물에서 유래된 모액에 0.25 M NaCl을 첨가하고, 다음 pH 4.8로 맞춰 침전시킨다. 이 공정은 출발 재료의 과량을 처리 할 수 있고, 또한 단백질 중에 높은 수득률을 제공하나, 분획물 순도는 여전히 불만족스럽다 ; 특히, 명백히 물로 완전여과(diafiltration) 동안, β-콘글리시닌은 분해를 일으키며, 아황산수소염 이온의 과량을 줄이고, 염을 제거하는 처리가 필수적이다.

위에 인용된 방법은 순수 β-콘글리시닌을 수득하지 못할 뿐만 아니라, 위의 모든 방법은 α’서브유닛의 분리와 정제를 할 수 없다.

본 발명에 따르면, β-콘글리시닌에서 풍부한 고체 분획물은 관용적인 절차에 따른 수성 매질 중에서 탈지된 가루 소이를 추출하고 그 후 수성 메탄올로 상등액을 침전시켜 제조한다 ; 다음 얻어진 분획물을 변성제 조건 하 금속 친화성 클로마토그래피(Metal affinity chromatography, MAC)로 정제하여 순수 α’서브유닛을 수득하고, 가장 높은 LDL 수용체-활성능력을 갖는 아미노-말단 영역을 얻기위해 키모트립신으로 효소 처리를 행하였다.

본 발명은 소이 β-콘글리시닌 α’서브유닛의 선택적인 추출, 정제 및 효소적 수식 방법에 관한 것으로, 다음 단계를 포함하는 공정으로 구성되어있다.

a) β-콘글리시닌이 풍부한 용해성 단백질 분획물을 얻기 위하여 약산성 pH 에서 나트륨 아황산수소염의 수성 용액으로 탈지된 소이분말을 추출하고 ;

b) 에탄올로 처리하여 단계 a) 에서 얻은 β-콘글리시닌 분획물을 침전시키며 ;

c) α’서브유닛을 분리하기위아여, 변성제 조건 하에서 금속 친화성 클로마토그래피(Metal affinity chromatography, MAC)로 단계 b) 로부터 침전된 분획물을 정제하고 ;

d) 단백질분해 효소로 단계 c)에서 얻은 α’서브유닛을 효소 처리하고 추가로 MAC 클로마토 그래피에 의한 정제를 행하며 ;

e) 유기 용매로 α’서브유닛을 침전 시키는 단계로 구성되어있다.

β-콘글리시닌은 도 1에서 보이는 것처럼 풍부하다. 출발 재료는 소이 분말(soy flour)이고, 용매로 지질 분획물을 제거하여 탈지 시킨 것이다. 출발 재료는 약산성 pH에서 나트륨 아황산수소염 수성 용액으로 추출한다. 용액 체적량은 출발 재료의 평균 14에서 16 배, 되도록이면 14.5에서 15.5의 중량 범위로 사용된다. 아황산수소염 농도는 평균 0.80에서 1.20 g/L, 되도록이면 0.90에서 1.10 g/L, 가장 좋게는 0.95에서 1.05 g/L 범위이다. 추출은 평균 14에서 18 시간 동안 평균 -2 에서 8 ℃의 온도로 실행된다. 발명의 바람직한 태양에 따르면, 추출은 pH 6.4 에서 아황산수소염 용액 0.98 g/L의 15 체적량으로 16 시간 동안, 평균 0에서 4 ℃의 온 도로 실행된다.

이들 pH와 온도 상태 하에서, 글리시닌(glycinins) 용해도는 매우 낮고, 그런 까닭에 이들은 다른 불용성 물질과 함께 침전한다. 침전물은 원심분리에 의해 분리되고, 용해성 분획물은 35 - 60 %(vol/vol) 수성 에탄올로, 되도록이면 40 % 수성 에탄올로 평균 20에서 30 ℃ 온도에서, 되도록이면 실온, 25 ℃에서 처리된다. 상등액은 원심분리하여 제거하고, 주로 β-콘글리시닌으로 구성된 침전물을 동결-건조시킨다. 얻어진 분말은 다음 단계에 사용된다(도 2 참조).

금속친화성클로마토그래피(MAC)(Ostrove와 Weiss, 1990) 방법에 의해 α’서브유닛을 분리하고 정제하기위한 선택은 Zn2+와 Ni2+와 같은 금속을 조성할 수 있는 능력에 의존하고, 마찬가지로 이 서브유닛은 α와 β 서브유닛들(Thanh와 Shibasaki, 1978) 보다 높은 히스티딘 내용량을 갖는다.

아연 또는 니켈, 바람직하게는 아연에 접합된 기질이 사용된다. 발명의 바람직한 태양에 따르면, 기질은 이미노디아세틱 에시드(iminodiacetic acid)-아가로즈(agarose)로 구성된다. 동결-건조된 단백질 재료는 50 mM 트리스, 0.5 M NaCl, pH 7.2로 구성되고, 5에서 8 M, 바람직하게는 5 M의 요소를 함유한 변성 완충용액에 현탁시킨다. 이들 조건에서, α’서브유닛은 기질에 선택적으로 결합되고, α와 β 서브유닛들은 위의 완충용액으로 용리시켜 제거될 수 있다 ; α’서브유닛은 같은 완충용액 또는 증류수 중 0.1 M 이미다졸(imidazole)로 계속해서 용리시킨다.

α’서브유닛에서 보강된 단백질 분획물을 모으고, 단백질을 침전시키기 위해, 바람직하게는 차가운 아세톤인, 유기 용매로 처리한다. 아세톤은 평균 2에서 5 배의 분획물 체적으로, 바람직하게는 3에서 4 부피의 량으로, 평균 -10에서 -30 ℃ 온도에서, 바람직하게는 -15에서 -25 ℃ 사이에서 사용된다. 발명의 바람직한 태양에 따르면, -20 ℃에서 아세톤의 3 부피량으로 사용된다. 얻어진 침전물은 에탄올, 되도록이면 95 % 에탄올 중에서 현탁시키고 원심분리하여 분리시킨다. 냉동건조물은 단백질 재료 94 %를 함유하고, 출발 재료보다 α’서브유닛 중에 10배 이상 충분히 보강됐다.

표 1은 소이 분말에서 β-콘글리시닌과 α’서브유닛의 추출 수득률을 보여준다.

표 1

α’서브유닛의 폴리펩티드 단편은 단백질분해 효소로 효소 처리 이전 단계에서 동결건조를 수행함으로써 제조된다. 발명의 바람직한 태양에 따르면, 단백질분해 효소는 키모트립신이고, 얻어진 단편은 주로 MW 28,000 Da를 갖는 아미노-말단 영역으로 구성된다.

절차는 다음과 같다 ; 이전 단계에 얻어진 냉동품(lyophilizate)을 pH 7.5에 서 8.5의 pH 범위 내에서 1.6 M 요소를 함유하는 0.2 M 의 NH4HCO3 중에 5 mg/ml의 농도로 용해시킨다. 키모트립신을 1 : 10에서 1 : 50의 비로, 되도록이면 1 : 25 w/w로, 24시간 동안 교반시키면서 37 ℃에서 배양된 기질에 첨가시켰다. MAC 상의 단계를 위에 설명된 것처럼 계속해서 실행하였다.

이미다졸에 용리된 재료는 평균 MW 28,000 Da를 갖고, α’서브유닛의 N-말단 영역을 구성하는 3가지 폴리펩티드 단편을 함유한다.

쥐(rat)에(표 2 참조) α’서브유닛과 키모트립신 단편의 투여는 콜레스테롤과 총 트리글리세리드(triglycerids) 혈장 수치 둘 다를 현저하게 감소하는 능력이 있다는 것이 증명되었다. 특히, 키모트립신 단편은 다른 소이 성분보다 효능이 높을 뿐만 아니라 콜레스테롤 수치를 낮추는 클로피브레이트(clofibrate)보다 더 효과적이라는 것이 증명되었고, 트리글리세리드(triglycerid)에 대해서는 비교될만한 결과를 제공하였다.

생물학적 실험 결과는 본 발명의 공정에 따라 획득 가능한 생성물, 특히 α’서브유닛과 그것의 단편은 약제로서 사용할 수 있으며, 특히 콜레스테롤 그리고/또는 트리글리세리드 혈장 수치의 저하를 요구하는 병리학 치료에 쓰일 수 있음을 암시하였다. 언급된 화합물은 단독 또는 다른 활성 성분과 조합하여 또는 적합한 담체와 혼합물로 하여 사용될 수 있으며, 약제학적 조성물의 제제로, 특히 고지혈증(hyperlipidemias)의 치료에 사용될 것이다. 더구나, 그들은 또한 위에 언급된 상태에 따라 식이요법을 위한 보조제 또는 음식물의 제제를 위해 사용이 가능하다.

실시예

첫 번째 단계 : 소이의 7S 글로불린의 정제

출발 재료인 소이(soy)를 분말로 하고 용매로 펜탄(pentane)을 사용하는, SoXhlet 방법에 따라 탈지시켰다.

단백질은 탈지된 가루 소이의 15 배 부피 양으로, 16 시간 동안 평균 0 에서 4 ℃의 온도에서, pH 6.4를 유지하여 0.98 g/L NaHSO3 용액으로 추출시켰다. 원심분리 후에, 상등액은 실온에서 40 % 에탄올(vol/vol)로 처리됐다. 얻어진 침전물은 β-콘글리시닌이 풍부하였고 출발 재료보다 두 배 농도로 α’서브유닛을 함유하였으며, 동결-건조시켰다.

두 번째 단계 : α’서브유닛의 정제

β-콘글리시닌이 풍부한 분획물을 5 M 요소를 함유하는 변성 완충액(50 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 7.2) 중에 재현탁 시키고, 아연에 결합된 아가로스-이미노디아세트산 매트릭스(agarose-iminodiacetic acid matrix(시그마사제) 상에 MAC에 의해 정제시켰다. 미반응 단백질 재료는 위와 같은 완충액으로 용리되는데 반해, 주로 α’서브유닛으로 구성되는 반응 단백질 재료는 동일한 완충액 또는 증류수 중 0.1 M 이미다졸(imidazole) 용액으로 용리됐다.

α’서브유닛- 풍부한 분획물을 -20 ℃에서 아세톤 3 - 4 부피의 량으로 처리시켰다 ; 얻어진 침전물을 실온에서 40 % 에탄올 중에 현탁시키고, 다음 원심분리 시키고 동결-건조시켰다. 얻어진 분말은 단백질 94 %를 함유하고 출발 재료보다 α’서브유닛에 10 배 더 풍부한 것이다.

세 번째 단계 : α’서브유닛의 효소 처리

위의 단계에서 얻은 동결건조품은 pH 7.5 에서 8.5의 1.6 M 요소를 함유한 0.2 M NH4HCO3 용액 중에 5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 용액은 단백질 기질에 대하여 1 : 25 w/w 비율의 키모트립신으로 처리되고, 24 시간 동안 교반하고 37 ℃에서 배양시킨 다음, 위에서 설명된 맥(MAC)으로 정제시켰다. 재료는 수지(resin)로 저류(retained)시키고, 0.1 m 이미다졸로 용리시켰는바, 3가지 폴리펩타이드 단편을 포함하면서, 이중 가장 주된 단편은 분자량이 28000 Da을 가졌으며, α'서브유닛의 N-말단 영역을 구성하고 있었다.

생물학적 실험

동물

중량이 75 - 100 g 인 수컷 쥐(rat) CD SPF/VAF가 사용됐다. 동물은 마크로론(makrolon) 케이지(케이지 당 4 - 5 마리)에 빛(12 시간 명/ 12 시간 암으로 순환) 자동 조절 환경에서, 온도(21 ±1 ℃)와 습도(60 ±5 %)로 수용됐다.

실험 계획안

7일 수용 후, 동물은 각각 20 마리 쥐(rat)로 구성된 7개의 그룹으로 임의 분배됐다(표 2 참조). 28일 동안, 한 그룹은 보통의 사료(cod. 014RF25C ; Mucedola S.r.l., Settimo Milanese, MI, Italy)로 사육된데 반해, 다른 것들은, 1 % 콜레스테롤, 0.5 % 콜린산(cholic acid)와 25 % 수소 처리된 코코넛 기름(batch 332000, 조제 01.09.2000 ; Laboratorio Dottori Piccioni, Gessate, MI, Italy)로 구성된 과콜레스테롤혈증 사료로 사육됐으며 임으로 물에 접근할 수 있도록 하였다. 사료는 매일(40 g, 09.00 a.m.)주고, 미소비된 양은 무게를 측정했다. 처치는 다음과 같이 수행되었다.

그룹 1(통제) : 보통 사료로 사육되고, 0.5 % 카르복시메틸셀룰로스 용액을 28일 동안 경구로 처리된 동물.

그룹 2 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 0.5 % 카르복시메틸셀룰로스 용액을 28일 동안 경구 처리된 동물.

그룹 3 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 200 mg/kg 복욕량의 클로피브 레이트(clofibrate)를 28 일 동안 경구 처리된 동물.

그룹 4 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 200 mg/kg 복용량의 소이 총 단백질 추출물(soy total protein extract, TPE)로 28일 동안 경구 처리된 동물.

그룹 5 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 50 mg/kg 복용량의 β-콘글리 시닌으로 28일 동안 경구 처리된 동물.

그룹 6 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 10 mg/kg 복용량의 α’서브유닛 으로 28일 동안 경구 처리된 동물.

그룹 7 : 과콜레스테롤혈증 사료로 사육되고, 1 mg/kg 복용량의 α’서브유닛 키모트립신 단편을 28일 동안 경구 처리된 동물.

총 콜레스테롤과 트리글리세리드 혈장 수치는 28일 처치의 끝과 단식 16 시간 후에 측정됐다. 동물은 에틸 에테르로 마취됐고, 혈액은 EDTA(1 mg/ml)를 포함한 튜브로 하부 대정맥에서 뽑았다. 4 ℃에 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리 후, 혈장을 회수하고, 동결시킨 후 측정할 때까지 -20 ℃에서 보관됐다.

총 콜레스테롤과 트리글리세리드 혈장 농도(표 2에 기재하였다)는 관용적인 효소 분석법에 따라 측정됐다.

표 2

참고문헌

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Claims

하기 단계로 구성된, 소이 β-콘글리시닌 α’서브유닛의 선택적인 추출, 정제 및 효소적 수식 방법.

(하기)

a) β-콘글리시닌-풍부한 수용성 단백질 분획물을 얻기 위하여 약 산성 pH에서 나트륨 아황산수소염 수용성 용액으로 탈지된 가루 소이를 추출하고 ;

b) 단계 a)에서 얻은 β-콘글리시닌의 분획물을 에탄올로 처리하여 침전시킨 다음 ;

c) α’서브유닛을 분리하기위해, 변성제 조건 하에서 금속 친화성 클로마토그래피(Metal affinity chromatography, MAC)로 단계 b)에서 얻은 침전된 분획물을 정제하고 ;

d) 단백질 분해효소로 단계 c)에서 얻은 α’서브유닛을 효소적 처리를 하고, 추가로 MAC 클로마토그래피로 정제한 다음 ;

e) 유기용매로 α’서브유닛을 침전시키는 단계로 구성된다.
청구항 1에 있어서, 추출을 pH 6.4에서 0.98 g/L 나트륨 아황산수소염 용액의 15 부피량으로 수행하는 방법.
청구항 1에 있어서, 단계 b)의 침전을 40 % 에탄올로 수행하는 방법.
청구항 1에 있어서, 단계 c)에서 맥(MAC) 클로마토그래피를 아연 또는 니켈이 결합된 매트릭스(matrix) 상태에서 수행하는 방법.
청구항 4에 있어서, 매트릭스(matrix)는 아연과 결합된 매트릭스(matrix)인 방법.
청구항 4에 있어서, 매트릭스(matrix)는 아가로스-이미노디아세틱 산으로 구성된 매트릭스인 방법.
청구항 1에 있어서, 단계 c)의 MAC에서 사용된 변성제(denaturating agent)가 요소인 방법.
청구항 1에 있어서, 단계 d)의 효소처리를 위한 단백질분해 효소가 키모트립신인 방법.
청구항 1에 있어서, 단계 e)에서 α’서브유닛을 위한 침전 용매가 아세톤인 방법.
청구항 1에 있어서, β-콘글리시닌-풍부한 분획물과 α’서브유닛을 동결건 조로 안정화 시키는 방법.
삭제
청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 공정으로 획득 가능한 소이 β-콘글리시닌 α’서브유닛의 폴리펩티드 단편.
청구항 8에 따라 획득될 수 있는 아미노-말단 폴리펩티드 단편.
청구항 12의 소이로부터 유도된 β- 콘글리시닌 α’서브유닛의 폴리펩티드 단편을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 치료제.
청구항 12의 아미노-말단 폴리텝티드 단편을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 치료제.
삭제
삭제
청구항 12의 폴리펩티드 단편을, 단독 또는 다른 활성성분과의 조합하여, 적당한 담체와의 혼합물 중에 포함하는 고지혈증 치료제의 약제학적 조성물.
청구항 12의 폴리펩티드 단편을 포함하는 영양 보충 또는 식사제품(supplementary or alimentary products).
청구항 5에 있어서, 매트릭스(matrix)는 아가로스-이미노디아세틱 산으로 구성된 매트릭스인 방법.
청구항 13의 폴리펩티드 단편을, 단독 또는 다른 활성성분과 조합하여, 적당한 담체와의 혼합물 중에 포함하는 고지혈증 치료제의 약제학적 조성물.
청구항 13의 폴리펩티드 단편을 포함하는 영양 보충 또는 식사제품(supplementary or alimentary products).