JPH05236909A - グルタミン含量の高いペプチド組成物、その製造方法及び経腸栄養剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 グルテンあるいはゼインをプロテアーゼで処
理して得られるグルタミンもしくはグルタミン酸を構成
アミノ酸の40％以上含有し、分子量が 131〜1141ダルト
ン (ゲル濾過法による）の範囲に分布するペプチド組成
物。 【効果】 小腸粘膜退化抑制機能を有し、経腸栄養剤あ
るいは輸液の成分として利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グルタミンもしくはグ
ルタミン酸を構成アミノ酸の40％以上含有するペプチド
組成物、このペプチド組成物の製造方法及びこの組成物
を配合した経腸栄養剤に関する。本発明のペプチド組成
物は、経腸栄養剤などの窒素源として、また輸液原料と
して有用である。

【０００２】

【従来の技術】外科手術後の栄養補給方法や各種疾患の
栄養療法として静脈栄養と経腸栄養をあげることができ
る。外科手術などによる異化機能が高進した場合には、
高カロリーの栄養を補給し、生体の回復を促進させる療
法が一般的に行われている。このための栄養組成物とし
て、消化吸収に負担のかからないものが使用される。そ
の代表的なものとして、高カロリー輸液があげられる。
高カロリー輸液はアミノ酸の溶解液と高濃度の糖液を中
心静脈を経由して連続的に投与される。経腸栄養剤とし
ては消化吸収に負担の掛からないように設計された成分
栄養剤が用いられる。これは、栄養成分としてアミノ酸
混合物、デキストリン、トリグリセリド、無機塩、ビタ
ミン混合物からなり、消化吸収の負担が、殆どないとい
われている。また窒素源として蛋白質を酵素加水分解し
たペプチドを用いた成分栄養剤も市販されている。

【０００３】これらの高カロリー輸液や成分輸液のアミ
ノ酸組成については種々の配合が検討されている。特
に、必須アミノ酸については種々の研究がなされてお
り、病態に応じ特定のアミノ酸を増減させた組成が提案
されている。しかし非必須アミノ酸についてはこのよう
な検討は殆どなされていなかった。最近、非必須アミノ
酸についても検討がおこなわれ、アルギニンやグルタミ
ンの添加が検討されている。しかしグルタミンは非常に
不安定であり、製剤学上の問題があり、また必要量につ
いても明確な基準がなく、上述の成分栄養剤や高カロリ
ー輸液のアミノ酸組成としてグルタミンの代用として一
般にはグルタミン酸を用いて済ませており、グルタミン
を強化した製品は未だ提供されていない。

【０００４】しかし、アミノ酸の代謝に関する最近の研
究には目ざましいものがあり、グルタミンの重要性があ
らため明らかにされつつある。特に各種侵襲時やストレ
ス時における窒素平衡の改善や、創傷治癒効果、抗潰瘍
効果、完全静脈栄養時の消化管粘膜萎縮の予防効果な
ど、外科手術後の栄養剤としては欠くことのできない作
用を有していることが判明している。このため輸液中に
グルタミンを添加する試みがなされている。

【０００５】これらの輸液に添加するグルタミンとして
は、結晶グルタミンやアシル化グルタミンの使用が提案
されている。また特開平2-119762号公報にはL-グルタミ
ン残基を含むトリペプチドあるいはジペプチドの使用が
提案されている。輸液に使用する窒素源としてはアミノ
酸が一般的に使用されており、このようなアミノ酸誘導
体やジペプチドを使用することには問題はないと考えら
れる。しかし経腸栄養剤として使用する場合には、低分
子の化合物が高濃度に存在すると浸透圧が高くなりしば
しば下痢を引き起こすことが指摘されている。またアミ
ノ酸や低分子のペプチドは刺激味があり、経口投与を行
う場合に抵抗があることが指摘されている。

【０００６】

【解決しようとする課題】本発明者らは、外科手術後や
疾患時に投与する栄養剤に添加するグルタミン製剤につ
いて検討を行った結果、製剤学的に安定で、かつ浸透圧
への影響の少ないグルタミンを高濃度にふくむペプチド
組成物を見いだし、本発明を完成するに至った。従っ
て、本発明は、グルタミンもしくはグルタミン酸を構成
アミノ酸の40％以上含有するペプチド組成物、このペプ
チド組成物の製造方法及びこの組成物を配合した経腸栄
養剤に関する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明により提供される
グルタミンを高度に含むペプチド組成物は下記の特性値
により特定される。 ペプチド組成物中のグルタミンもしくはグルタミン
酸含量: 加水分解後、アミノ酸を定量した場合構成アミ
ノ酸の40％以上がグルタミン酸として定量される。 遊離アミノ酸量: 10％以下でかつ遊離グルタミンが
５％以下である。 平均分子量: 約200 分子量分布: ゲル濾過による分子量分布が 131〜14
11の範囲に分布し、200付近にピークを有する。

【０００８】このような特性を有するペプチド組成物は
これまで得られておらず、本発明により初めて提供され
るものである。本発明ペプチド組成物を得るためには、
グルタミンを蛋白質の構成アミノ酸として、高度に含有
する蛋白質を特定条件下で酵素分解し、さらに分子量分
画を行うことにより得ることができる。グルタミンは通
常の食品中にも大量に含まれており、蛋白質構成アミノ
酸の20％以上であるものが好ましいが、特に、小麦蛋白
質であるグルテンやトウモロコシ蛋白質であるゼイン、
乳蛋白であるカゼインなどに比較的多く含有されてお
り、このような蛋白質を原料とすることが特に好まし
い。原料の入手や、供給の面からみるとグルテンを用い
ることが好ましい。

【０００９】グルテンはその全アミノ酸配列がcDNA配列
から明らかとなっている [ニュウクレイック アシド
リサーチ(Nucleic Acid Res)，13, 8729,(1985)]が、グ
ルタミンとグルタミン酸の総和のうち96％がグルタミン
であり、原料として特に適している。また酸加水分解に
よりアミノ酸を分析するとグルタミンはグルタミン酸と
して定量されるため、グルタミン酸を指標とすることに
より、グルタミン量を正確に把握できる利点を有する。
また原料とする蛋白質は粗製品であっても精製品であっ
ても使用することができる。

【００１０】蛋白質濃度を0.5 〜10％濃度になるように
水に溶解もしくは懸濁させ、酵素処理を行う。酵素とし
ては、酸性プロテアーゼであればどのようなものでも使
用できるが、一般には微生物プロテアーゼ、もしくは動
物プロテアーゼが好ましい。微生物プロテアーゼとして
は真菌プロテアーゼが例示できる。真菌プロテアーゼと
してはラピダーゼ（武田化学製) 、モルシン（シグマ
製) などが、また動物プロテアーゼとしてはペプシンな
どが例示できる。これ以外の酵素であっても酸性プロテ
アーゼであれば使用できる。酵素を上述の水溶液中に添
加し酵素分解処理を行う。使用する酵素の至適条件下で
処理を行うが、グルテンを基質とした酵素処理では、モ
ルシンが低分子ペプチドの生産に特に適していることが
確認されている。

【００１１】グルテンを基質とした場合、酵素/ 基質比
を1:100 、1 ％酢酸溶媒中で37℃、24時間処理を行い、
ペプチド組成物を含む溶液をえることができる。反応終
了後、加熱処理等により酵素反応を停止させ、ゲル濾過
により分子量分画を行い、本発明のペプチド組成物を分
画するか、あるいはさらに酵素処理を行い、ペプチド組
成物の分子量を一定の大きさに調整する。

【００１２】本発明においては、グルテンを原料として
モルシンにより酵素分解処理を行った場合、さらに中性
プロテアーゼにより酵素処理を行うことが好ましい。酸
性プロテアーゼの処理をおこなった溶液を、アルカリた
とえば炭酸水素ナトリウム溶液などによりpHを中性に
し、中性プロテアーゼを添加して酵素処理を行う。使用
する酵素としては放線菌プロテアーゼ、特にアクチナー
ゼ（科研製薬製) などが特に好ましい。グルテンを基質
とした場合、酵素/ 基質比を1:100 、pH7 溶液中で37
℃、24時間処理を行い、ペプチド組成物を含む溶液を得
ることができる。反応終了後、酵素を失活させた後、ゲ
ル濾過や吸着クロマトグラフィーを用いて遊離アミノ酸
を除去し、ペプチド画分のみを得ることができる。ペプ
チドの分画については、ペプチド鎖長2 〜5 の大きさの
ものを分離できるような担体であればどのようなもので
も使用できる。

【００１３】ペプチド組成物は溶液のまま、あるいは凍
結乾燥や噴霧乾燥等の処理により粉末とすることができ
る。このようにして得られたペプチド組成物は単独ある
いは、アミノ酸配合の経腸栄養剤に使用することができ
る。特に本発明組成物を、組成中に1 〜5 ％添加するこ
とにより、小腸粘膜細胞の退化を抑制することができ
る。特公平51-26490号公報にはアミノ酸混合物を窒素源
とする栄養組成物が開示されている。このような組成物
のグルタミンの供給源として本発明組成物を使用するこ
とが可能である。配合にあたっては、グルタミンとして
供給される量のすべてを本発明のペプチド組成物に置き
換えることができるし、また蛋白質を窒素源とする経腸
栄養剤においては、グルタミン強化量に相当する量だけ
本発明のペプチド組成物を添加することで、小腸粘膜の
退化を抑制することができる。

【００１４】以下に実施例、実験例を示し本発明をさら
に詳細に説明する。

【実施例１】グルタミンを高度に含有するペプチド組成物の製造 原料蛋白質の調製 小麦グルテン（ナカライテスク製)10 g をエーテルで脱
脂し、エーテルを除去後、1 ％酢酸(200ml) に懸濁させ
た。ミキサーで激しくホモジナイズし、ホモジネートを
10分間、500 ×g で遠心分離した。得られた上清中の蛋
白質濃度をプロテインアッセイキット（バイオラッド
製) で測定し、蛋白質濃度が1 ％になるように1 ％酢酸
を加え、基質溶液とした。

【００１５】 酵素の選定 グルテンは酸性あるいはアルカリ性条件下で懸濁する故
に酵素反応を受けやすくなる。ピロール化反応(N末端環
化反応) はアルカリ性条件下で起こるので、蛋白質を加
水分解する酵素として酸性プロテアーゼを用いることと
した。酸性プロテアーゼとしてモルシン（シグマ製) 、
ペプシン（シグマ製) 、ラピターゼ（武田化学製) を、
それぞれ24時間、37℃で反応させ、生成する水解物の分
子量分布をバイオゲル（Biogel）P-2(バイオラッド製)
ゲル濾過により測定した。試料50mgを0.1Mリン酸緩衝液
(pH7.0) に溶解しバイオゲル（Biogel） P-2カラム(1.6
×87.5cm) にのせた。溶出は同じ溶液を用い、流速を19
ml/ 時間に設定した。カラムの排除体積は48mlであっ
た。分子量マーカーには、バシトラシン(MW 1411) 、イ
ソロイシルグリシン(MW 188)、イソロイシン(MW 131)を
用いた。その結果モルシン水解物が最も低分子化されて
いることが判った。

【００１６】 酵素処理 酵素モルシンと基質グルテンを酵素/ 基質比を1:100 、
1 ％酢酸溶媒中で37℃、24時間処理を行った。モルシン
処理による水解物は分子量が、大部分1000以上であるこ
とから、さらにモルシン水解後、pHを7 にし、アクチナ
ーゼE(科研製薬製) を作用させた。反応条件はpH以外は
同様とした。得られた水解物をバイオゲル（Biogel）P-
2 ゲル濾過により測定し図１に示した。図１上部の数値
は分子量標準の溶出位置を示す。分子量188 付近にピー
クを示していた。

【００１７】 アクチナーゼ処理条件 アクチナーゼ処理により遊離するアミノ酸を経時的測定
し、下記表１に示した。遊離量の高かったアミノ酸は、
順に、Gln 、Val 、Phe 、Ile であった。しかし、もと
のグルテンから遊離したアミノ酸の割合を各アミノ酸に
ついて計算するとGlx 9.6 ％、Val 83.4％、Phe 67.4
％、Ile 74.4％となり、Val 、Phe 及びIle が67％以上
遊離したのに対し、Gln は大部分がペプチド態として残
っていることが推定された。このようにアクチナーゼに
よりGln 以外のアミノ酸を選択的に遊離させたためペプ
チド組成物中のグルタミン含量は原料のグルテンよりか
なり上昇する。

【００１８】

【表１】

【００１９】 遊離アミノ酸の除去 ペプチドから遊離アミノ酸を除くためYamasitaらの方法
（文献:Yamasita et.al, J. Food. Sci., Vol 41, 102
9, 1976)に従いセファデックス（Sephadex） G-15(ファ
ルマシア製) カラム(2.5×60cm)ni かけた。溶出は10％
エタノール(pH7)を用い、流速を95ml/ 時間に設定し
た。カラムの排除体積は96mlであった。図２にクロマト
グラムを示した。これにより４画分に分けることができ
た。各画分をそれぞれFr.1,2,3,4としアミノ酸組成を分
析した結果を下記の表２に示した。

【００２０】

【表２】

【００２１】Glx 含量はFr.1, 及びFr.3が高かったが、
遊離アミノ酸分析の結果Fr.3のGlxの大部分は遊離アミ
ノ酸であることがわかった。一方、Fr.1のGlx の遊離ア
ミノ酸の割合は3.5 ％であり、大部分がペプチド態であ
った。またFr.1のGlx 含量は原料のグルテンより高かっ
た。

【００２２】 N 末端グルタミン分析 Fr.1 の画分のペプチドのN 末端のアミノ酸分析を行っ
た。ペプチドをハートレイ(Hartley) らの方法 [バイオ
ケミカル バイオフィジックス アクタ(Biochem. Biop
hys. Acta.),21,58,(1956)] に従いダンシル化し、その
後、110 ℃で24時間加水分解しアミノ酸分析を行った。
この時のGlx 量、即ちダンシル化されていないGlx をD
とした。同量のサンプルをダンシル化した時のGlx 量を
Q とした。N 末端に存在するGlx の量をQ −D として算
出した。Fr.1のN 末端に存在するGlx は全Glx 中の17.6
％であった。水溶液中でも安定なN 末端以外の位置に存
在するGlx の割合は、全Glx 中の78.9％であった(100−
3.5 −17.6) 。Fr.1全体に対するGlx の割合は50.33 ％
であるが、水溶液中でも安定なGlx の割合に換算すると
39.71 ％となる。グルテンを原料としたペプチドは殆ど
がグルタミンから構成される。

【００２３】 ペプチド組成物の分子量分布 Fr.1、50mgを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0) に溶解しバイオ
ゲル（Biogel） P-2カラム(1.6×87.5cm) にのせた。溶
出は同じ溶液を用い、流速を19ml/ 時間に設定した。カ
ラムの排除体積は48mlであった。分子量マーカーには、
バシトラシン(MW 1411) 、イソロイシルグリシン(MW 18
8)、イソロイシン(MW 131)を用いた。クロマトグラムを
図3 に示した。ペプチド組成物の中心はテトラ及びペン
タペプチドであった。また1mg 中のアミノ酸量の絶対値
から計算して88％がペプチドまたはアミノ酸であった。
収率は窒素基準で原料蛋白質の35％であった。

【００２４】

【実験例】小腸機能に及ぼすグルタミンペプチド投与の影響 本実験例においては、実施例１で得たペプチド組成物の
小腸機能に及ぼす効果を実験した例を示す。 材料及び方法 飼料組成: β- コーンスターチ（オリエンタル酵母工
業) 、セルロースパウダー（オリエンタル酵母工業) 、
大豆油（ナカライテスク製) 、塩化コリン（関東化学)
、カゼイン（関東化学) 、ミネラル、ビタミンを混合
して試料を調製した。ミネラル混合物、ビタミン混合物
はともにハーパー組成に基づいて配合されたものをオリ
エンタル酵母工業より購入した。ラットを５群に分け、
異なる組成の飼料を７日間ミールフィーディングした。
各群の飼料組成を表3 に示した。

【００２５】

【表３】

【００２６】実験動物: 初体重150gのWistar系雄性ラッ
トをチャールスリバーより購入し、予備飼育後実験に使
用した。4 日間絶食させて低栄養モデルラットとし、上
述の試験飼料を7 日間与え、最終投与18〜24時間後解剖
した。一方、小腸障害モデルラット作成にはメトトレキ
セート(MTX, 和光純薬) を用いた。上述の試験飼料投与
開始から4 日目にフォックス(Fox) らの方法 [サージカ
ル フォーラム(Surgical Forum)38,43,(1987)] に従っ
てMTX を20mg/kg 腹腔内投与した。その後3 日間試験飼
料の投与を続け、最終投与18〜24時間後に解剖した。日
内変動による影響を避けるため、全ラットの解剖は12:0
0 〜15:00 の間に行った。全ての飼育試験中、水は自由
摂取させた。各実験ごとに3 〜4 匹のラットを用いた。
各実験群間で、ラットの初体重には殆ど差がなかった。

【００２７】小腸: ラットをペントバルビタールナトリ
ウム（大日本製薬製) で麻酔後、開腹し、大動脈を切断
することで放血後、小腸を摘出した。内容物を氷冷生理
食塩水で洗い流した後、全小腸重量を測定した。上部10
cmを除き、次の上部10cmの部分をガラス棒を用いて反転
させ、スライドグラスで粘膜を剥離した。剥離した粘膜
に19倍量の氷冷生理食塩水を加え、ホモジナイザー（キ
ネマチカ製) で30秒間ホモジナイズ後、3000×g 、10分
間遠心分離し、上清を次項以下のアッセイに供した。

【００２８】粘膜中の蛋白質定量: プロテインアッセイ
キット (バイオラッド製) を用いて測定した。 粘膜シュクラーゼ活性:0.1M マレイン酸緩衝液(pH6.0)
を用いて0.056Mの基質シュクロース水溶液を作成し、そ
の0.1ml に供試液0.1ml 及びトルエン1 滴を加え、37°
C 30分間反応させた。反応終了後、氷冷した蒸留水1ml
を加え、沸騰水浴中で2 分間加熱した。室温まで冷却し
た後、生成したブドウ糖量を市販のキット(グルコースC
-IIテストワコー, 和光純薬製) によって測定した。酵
素活性はμmol sucrose hydrolyzed/60min/mg protein
単位で表した。

【００２９】粘膜アミノペプチダーゼ活性:1mMジチオス
レイトールを含む100mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)
の存在下、供試液を0.5mM Leu-NAに5 分間作用させ、0.
4ml の0.23N HCl を含むエタノールで反応を停止させ
た。さらに0.4ml の0.06％p-ジメチルシンナムアルデヒ
ドを含むエタノールを加えて30分間放置後、生成するシ
ッフ塩基色素の量を540nm で測定し、遊離したβ−ナフ
チルアミンを定量した。酵素活性はΔA_540nm/min/mg pr
otein 単位で表した。測定値の処理: 測定値についてt
検定を行った。

【００３０】 結果 低栄養ラットの小腸機能に及ぼす効果について表４に示
した。

【表４】

【００３１】低栄養ラットではグルテン添加あるいはグ
ルタミンペプチド添加によってのみ、体重及び小腸重量
の有意な増加が見られた。さらに空腸粘膜中の蛋白質量
は、グルタミンペプチド添加群で対照群より有意に上昇
したが、同組成のアミノ酸混合物では対照群と有意な差
が見られなかった。このことは、本発明ペプチドが小腸
機能を賦活するという点で、アミノ酸混合物よりも優れ
ている。

【００３２】MTX ラットの小腸機能に及ぼす効果につい
ては表5 に示した。

【表５】

【００３３】MTX 投与3 日後に小腸柔毛の障害がピーク
に達し、20mg/kg 投与すると 156時間以内に100 ％死亡
することが知られている。さらにFox らは遊離態のグル
タミン投与によりMTX による障害が有意に抑えられるこ
とも報告している [サージカル フォーラム(Surgical
Forum)38、43,(1987)]。MTX投与により正常ラットと比
べ、小腸重量は57％(P<0.05)に、空腸中蛋白質量は71％
(P<0.05)に減少し、またシュクラーゼ活性、ロイシンア
ミノペプチダーゼ活性は0.01％有意で低下した。MTX ラ
ットでは、その約25％が下痢を起こしており、さらに解
剖時の所見では、低栄養ラットとは異なり、飼料消化物
が胃および腸管に多く残留していた。以上のことから、
MTX により小腸機能が障害を受けていると判定した。

【００３４】MTXラットにグルタミンペプチドを投与す
ると、シュクラーゼ活性は1 ％有意で、ロイシンアミノ
ペプチダーゼ活性は5 ％有意で上昇した。ほぼ同様の効
果が遊離グルタミン添加群で見られたが、アミノ酸混合
物では見られなかった。このことは、少なくともMTX 障
害モデルにおいてはペプチド吸収系の方がアミノ酸吸収
系よりも障害抵抗性があることを示していた。小腸に対
するグルタミンの効果は遊離型よりペプチド型の方が大
きいことが確認できた。

【００３５】

【発明の効果】本発明の実施により、グルタミンを高濃
度に含有するペプチド組成物、及びこれを配合した経腸
栄養剤が提供される。本発明で提供されるペプチド組成
物はペプチドのN 末端のグルタミンが結合していないた
め、水中でも安定であり、また低栄養などに発生する小
腸粘膜の退化を抑制する。また経腸栄養剤として配合さ
れた組成物のグルタミン吸収性が向上する。

【図の簡単な説明】

【図１】グルテンの酸性プロテアーゼ酵素分解物をさら
にアクチナーゼ処理した溶液のバイオゲル(Biogel) P-2
ゲル濾過クロマトグラフィーを示す。260nm 吸光度を測
定し、ペプチド濃度の指標とした。

【図２】上記溶液からセファデックス(Sephadex)G-15に
より遊離アミノ酸を除去した液のクロマトグラフィーを
示す。260nm 吸光度を測定し、ペプチド濃度の指標とし
た。

【図３】本発明のペプチド組成物（図２のＦr.1)のバイ
オゲル(Biogel)P-2 ゲル濾過クロマトグラフィーを示
す。260nm 吸光度を測定し、ペプチド濃度の指標とし
た。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルタミンもしくはグルタミン酸を構成
   アミノ酸の40％以上含有するペプチド組成物。
2. 【請求項２】 ペプチド組成物中の遊離アミノ酸含量が
   10％以下であり、ペプチドの平均鎖長がアミノ酸２乃至
   ５である請求項1 記載のペプチド組成物。
3. 【請求項３】 グルテンまたはゼインを酸性プロテアー
   ゼ及び中性プテアーゼで順次加水分解し、加水分解物を
   クロマトグラフにかけて得ることができる次の性質を有
   し、ジペプチドからペンタペプチドより構成され、それ
   以外に少量の遊離アミノ酸を含むペプチド組成物。 平均分子量約 200ダルトン（ゲル濾過法による) 分子量分布、その大部分が分子量 131〜1411ダルト
   ンの範囲に分布しており、分子量 200ダルトン付近にピ
   ークを有する（ゲル濾過法による) 。 加水分解後のアミノ酸の40％以上がグルタミン酸と
   して定量される。 遊離アミノ酸量が10％以下で、かつ遊離グルタミン
   酸が５％以下である。 小腸粘膜退化抑制機能を有する。
4. 【請求項４】 グルタミンを構成アミノ酸として20％以
   上含有する蛋白質を、一種以上の蛋白質分解酵素により
   分解し、ついで遊離アミノ酸を除去し、ペプチド画分を
   分取することを特徴とするグルタミンもしくはグルタミ
   ン酸を構成アミノ酸の40％以上含有するペプチド組成物
   の製造方法。
5. 【請求項５】 蛋白質がグルテンもしくはゼインである
   請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のペプチド組成物をグルタ
   ミン供給源として配合し、小腸粘膜退化抑制効果を有す
   ることを特徴とする経腸栄養剤。