JPH1129594A - アンジオテンシン変換酵素阻害物質、その製造方法およびそれを用いた血圧降下剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 缶詰の加工残滓として処理されるマグロ魚肉
等の、延いては天然資源の有効活用に資するとともに、
健康食品の素材や医薬品の原料として有用なアンジオテ
ンシン変換酵素阻害物質およびその製造方法並びに血圧
降下剤を提供する。 【解決手段】 下記構造式（１）、（２）および（３）
で示されるテトラペプチド、トリペプチドおよびジペプ
チドからなる群から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を主成分として含有するアンジオテンシン変換酵素阻害
物質。 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アンジオテンシン
変換酵素（ＡＣＥと称する場合もある。）の阻害物質お
よびその製造方法並びに当該アンジオテンシン変換酵素
阻害物質を用いた血圧降下剤に関する。さらに詳しく
は、血圧上昇作用を示すアンジオテンシン変換酵素（Ａ
ＣＥ）の活性を阻害し、健康食品や医薬品として有用な
アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造方法
等に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、人体の血圧上昇に関する原因の一
つとして、アンジオテンシン変換酵素がアンジオテンシ
ンＩをアンジオテンシンIIに変換させるメカニズムが知
られている。このアンジオテンシンII は血圧を上昇せ
しめ、人体に対し数々の悪影 響を及ぼすことが知られ
ており、したがって、このアンジオテンシン変換酵素の
働きを阻害することで、血圧の上昇を抑制できるとし
て、従来より阻害活性物質に関する様々な研究が行なわ
れてきた。

【０００３】そこで、蛇毒ペプチドやその類緑体あるい
は合成ペプチドが、アンジオテンシン変換酵素阻害物質
として知られている。しかしながら、蛇毒ペプチドやそ
の類緑体は阻害活性効果が低く、また値段が高いという
問題があった。一方、合成ペプチドは人体への影響等の
点で問題があった。

【０００４】そこで、蛇毒ペプチド以外の天然物を対象
とした有効成分の検索も行われており、それらの幾つか
は既に報告されるに至っている。例えば、特開平６−４
１１９１号公報や特開昭６０−２３０８６号公報等に
は、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、牛乳や
牛等のカゼイン由来のペプチドが開示されており、特開
平４−２８２４００号公報には、アンジオテンシン変換
酵素阻害物質として、乳清タンパク質由来のペプチドが
開示されている。また、特開平５−１１２４６５号公報
や特公平７−１１６２３３号公報には、アンジオテンシ
ン変換酵素阻害物質として、カツオやイワシ由来のペプ
チドが開示されており、特公平７−１１９２３４号公報
には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質として、オキ
アミ由来のペプチドが開示されており、特公平７−７８
０７６号公報には、アンジオテンシン変換酵素阻害物質
として、マグロやサバ由来のペプチドが開示されてい
る。

【０００５】しかしながら、これまでに用いられてきた
天然のアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質の抽出原
料は、回収効率が低く、高価であるという問題があっ
た。また、従来の抽出原料から得られるアンジオテンシ
ン変換酵素阻害活性物質の阻害活性は、不十分なものが
多かった。さらに、従来のアンジオテンシン変換酵素阻
害活性物質は、農業・水産業の分野において一次的に採
取・収穫された状態のものを対象としており、資源の有
効な活用という面からも、食品などの二次的な製造過程
で発生する加工残滓中等から、生理活性物質を得ること
が望まれていた。特に、今後の我が国に予想される高齢
者社会に対応し、有用な生理活性物質を医薬品のみなら
ず、様々な食品へ素材として利用するためにも、安価に
供給できる原料・製造方法の開発が望まれるが、この様
な観点からの開発研究は、未だ実用の域に達していない
のが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上述の問題に
鑑みなされたものであり、缶詰の加工残滓として処理さ
れるマグロ魚肉等の、延いては天然資源の有効活用に資
するとともに、健康食品の素材や医薬品の原料として有
用な活性作用に優れたアンジオテンシン変換酵素阻害物
質、その製造方法および当該アンジオテンシン変換酵素
阻害物質を用いた血圧降下剤を安価に提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明者は、主にキハダマグロやビンナガマグロを
原料としたツナ缶詰の製造工程で、残滓として発生する
血合い肉や普通筋肉等を原料として、これに含まれるア
ンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する成分の検索と
特定とを行ない、新規なぺプチドを見出し、本発明を完
成させるに至った。

【０００８】すなわち、本発明によれば、アンジオテン
シン変換酵素阻害物質であって、下記式（１）で表され
るテトラペプチド、下記式（２）で表されるトリペプチ
ドおよび下記式（３）で表されるジぺプチドからなる群
から選ばれる少なくとも一つのペプチドを含有すること
を特徴とする。

【０００９】 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３）

【００１０】また、本発明のアンジオテンシン変換酵素
阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織を精製す
ることにより得られるものであることが好ましい。

【００１１】また、本発明のアンジオテンシン変換酵素
阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織が、加工
残滓であることが好ましい。

【００１２】また、本発明のアンジオテンシン変換酵素
阻害物質を構成するにあたり、マグロ魚肉組織の精製
が、タンパク分解酵素により、マグロ魚肉組織のタンパ
ク鎖中のぺプチド結合を切断する段階を含むものである
ことが好ましい。

【００１３】また、本発明のアンジオテンシン変換酵素
阻害物質を構成するにあたり、タンパク分解酵素が、エ
ンド型の酵素およびエキソ型の酵素あるいはいずれか一
方であることが好ましい。

【００１４】また、本発明の別の態様は、アンジオテン
シン変換酵素阻害物質の製造方法であって、以下の工程
（Ａ）〜（Ｅ）を含む、下記式（１）で表されるテトラ
ペプチド、下記式（２）で表されるトリペプチドおよび
下記式（３）で表されるジぺプチドからなる群から選ば
れる少なくとも一つのペプチドを含有することを特徴と
する。

【００１５】 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３）

【００１６】（Ａ）マグロ魚肉組織を回収し、均一化処
理を施す工程。 （Ｂ）均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパ
ク分解酵素を加えて、４０〜７０℃の範囲内の温度で以
て当該マグロ魚肉組織を分解処理する工程。 （Ｃ）分解処理後、大分子画分を除去するとともに、短
鎖ペプチドを回収する工程。 （Ｄ）短鎖ペプチドを脱塩し、塩基性ペプチド粗製物を
得る工程。 （Ｅ）塩基性ペプチド粗製物を分離処理してアンジオテ
ンシン変換酵素阻害物質を回収する工程。

【００１７】また、本発明のアンジオテンシン変換酵素
阻害物質の製造方法を実施するにあたり、使用するマグ
ロ魚肉組織が、加工残滓であることが好ましい。

【００１８】また、本発明の別の態様は、血圧降下剤で
あって、上述したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を
有効成分として含有することを特徴とする。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施形態を具体的
に説明する。本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物
質は、下記構造式（１）、（２）および（３）でそれぞ
れ示されるテトラペプチド、トリペプチドおよびジペプ
チドからなる群から選ばれる少なくとも一つのペプチド
を含有する。なお、ペプチド（１）〜（３）は、それぞ
れ単一種であっても複数種の組み合わせであってもよ
い。また、これらのペプチド（１）〜（３）は主成分と
して使用すれば良く、他の添加剤を併用することができ
る。

【００２０】 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３）

【００２１】本発明のアンジオテンシン変換酵素阻害物
質は、たとえば、ツナ缶詰加工時等に残滓として発生す
る残滓マグロ魚肉（加工残滓と称する。）を原料とし
て、これを加工する事によって製造することができる。
すなわち、残滓マグロ魚肉をタンパク分解酵素で処理
し、水溶化させた後、これを精製することによって得る
ことが出来る。

【００２２】ここで用いられる好ましいタンパク分解酵
素は、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼなど、タン
パク鎖中のペプチド結合を適時切断するものである。ま
た、より好ましくは、サモアーゼ、プロチンなどのエン
ド型、またはフレーバーザイムのようなエキソ型など市
販の酵素を単独、または組み合わせて使用する事で、抽
出の効率と必要コストを調整することができる。

【００２３】本発明を構成する各ぺプチドの精製方法と
しては、たとえば、限外瀘過膜処理、ゲル瀘過クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆層クロ
マトグラフィーなどを挙げることができる。したがっ
て、これらを単独、または任意に組み合わせて精製方法
に用いることができる。

【００２４】ツナ缶詰製造の原料として利用される魚種
にはキハダマグロ，ビンナガマグロ等があり、いずれも
使用することができる。但し、以下の例では、便宜上、
最も一般的なキハダマグロの加工残滓である血合い肉を
原料として用い、当該血合い肉から新規ぺプチドを抽出
及び精製して、本発明におけるアンジオテンシン変換酵
素阻害物質の製造方法の一例（Ａ〜Ｅ）を説明する。 （Ａ）マグロ魚肉組織の回収および均一化処理工程 まず、例えば缶詰製造工程で加熱変性処理後、不要部分
として除去、廃棄されるキハダマグロの血合い肉を回収
する。これに重量で以て約２〜５倍程度の水を加え、血
合い肉（肉片）を微小サイズにホモジナイズ処理し、さ
らに、ｐＨを５〜１０の範囲内の値に調整する。 （Ｂ）マグロ魚肉組織の分解処理工程 均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパク分解
酵素を添加し、酵素の特性によっても若干異なるが、４
０〜７０℃程度の範囲内の温度にて、所定時間、攪拌し
ながら反応処理させる。

【００２５】（Ｃ）短鎖ペプチドの回収工程 次いで、遠心分離にて上澄液のみを回収し、続いて分画
分子量１，０００〜６，０００程度の限外瀘過膜にて瀘
過し、酵素にて十分に低分子化されなかった大分子画分
を除去する。そして、腸管吸収に有利と言われているア
ミノ酸２〜５残基程度の短鎖ぺプチドを低分子画分の溶
液として選択的に回収する。 （Ｄ）短鎖ペプチドの脱塩工程 次いで、低分子画分の溶液に対して、Ｈ⁺ 型に再生処理
した強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムを用いて
脱塩処理を施す。そして、アンモニア水溶液に溶解する
塩基性画分のみに精製し、塩基性ぺプチド粗製物を得
る。

【００２６】（Ｅ）塩基性ペプチド粗製物の分離処理工
程 さらに、塩基性ぺプチド粗製物を、瀘材として、東ソー
社製、商品名：Ｔｏｙｏｐｅａｌ ＨＷ４０Ｆ樹脂を充
填したカラムにてゲル瀘過処理し、次いで、高速液体ク
ロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分離することにより、ア
ンジオテンシン変換酵素阻害物質を回収することができ
る。

【００２７】なお、本発明を構成する各ペプチドは、構
成成分となるアミノ酸を、通常のペプチド合成法に従っ
て、結合させることによって得ることも可能である。

【００２８】上述の方法によって得られた各ペプチド
は、その如何によらず、いずれも優れたアンジオテンシ
ン変換酵素阻害活性を示し、血圧降下剤として、また、
血圧降下機能を有する天然素材として利用する事が出来
る。すなわち、塩基性ペプチド粗製物または精製した各
ぺプチドを主成分とした物質を、ビスケットやスープな
どの食品の加工材料として添加し、血圧上昇抑制作用を
有する健康食品あるいは血圧降下剤そのものとして提供
することができる。

【００２９】また、当該塩基性ペプチド粗製物または精
製した各ぺプチドを主成分とした物質を、薬事的に認め
られる担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、賦香剤、等）と
共に、常法に従って経口投与用の錠剤、カプセル剤、ト
ローチ剤、粉末、または細粒・顆粒剤、水溶液に溶解さ
せた液剤などとし、血圧降下剤として経口投与するか、
または、注射剤として静脈内投与するなどして活用する
ことができる。

【００３０】

【実施例】本発明を以下の実施例により、さらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定され
るものではない。

【００３１】（実施例１） （１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質の作成 缶詰製造ではキハダマグロなどの生魚体を加熱変性処理
し、これより不要部分を除去して、製品を製造してお
り、一般に、食品として利用されるのは元重量の３５〜
４５％程度であり、さらに、５〜１０％程度のペットフ
ードが作られる。したがって、これらの合計利用率は、
元重量の５０〜５５％程度である。一方で、不要部分と
して除去される加熱変性後の魚肉は、元重量の１０〜２
０％にも及び、この中には、血合い肉や精肉などの可食
部分が、骨やウロコなどと共に少なからず含まれてい
る。そこで、実施例１ではこれらの廃棄部分に含まれる
魚肉、特にキハダ血合い肉を選別回収し、これを原料と
してアンジオテンシン変換酵素阻害物質を作成した。

【００３２】すなわち、回収した魚肉（キハダ血合い
肉）１００ｇに対して、蒸留水５００ｇを加え、ポリト
ロンを用いて微小サイズにホモジナイズし、ｐＨ＝６．
０に調整した。その後、たんぱく分解酵素サモアーゼＰ
Ｃ−１０（大和化成社製）を魚肉１００重量部に対し
て、１／１００重量程度加え、温度５０〜６５℃で以て
約２４時間攪拌しながら分解処理を施した。かかる分解
処理の終了後、温度１００℃、１０分間の条件で加熱を
行ない、魚肉中に含まれている酵素を失活させた。その
後、回転数９０００ｒｐｍ、２０分間の条件で以て遠心
分離機を用いて上清を回収した。

【００３３】次いで、０．４５μのメンブレンフィルタ
を用いて、回収した上清液から夾雑物を除去した。その
後、分画分子量約４０００の限外瀘過膜ＳＡＰ−１０１
３（旭化成工業社製）を用い、主に、分子量４０００以
下の低分子を含んだ画分と、それ以上の分子量を含んだ
画分とに分画した。なお、ペプチドの吸収において、長
鎖・大分子のペプチドは、消化作用によって分解された
り、体内での消化管表面からの吸収効率が低いと考えら
れるので、より効率的に作用すると考えられる低分子画
分を用いた。

【００３４】次いで、低分子画分に対して、Ｈ⁺ 型に置
換した強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＵＢＫ５３
０（三菱化成社製）を用いて脱塩した。そして、アンモ
ニア溶液に溶出した塩基性画分を減圧濃縮及びフリーズ
ドライ処理して、乾燥粉末状態の塩基性ペプチド粗製物
を実施例１におけるアンジオテンシン変換酵素阻害物質
として得た。

【００３５】なお、得られたアンジオテンシン変換酵素
阻害物質（塩基性ペプチド粗製物）を、全自動タンパク
質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０（島津製作所社製）
を使用して構造解析することにより、当該塩基性ペプチ
ド粗製物中には、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ、Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｈｅおよびＩｌｅ−Ｐｈｅのアミノ酸
配列で表されるペプチドがそれぞれ含まれていることが
確認されている。

【００３６】（２）アンジオテンシン変換酵素に対する
阻害活性（ＩＣ₅₀値）測定 得られた塩基性ペプチド粗製物につき、山本らの方法
（日胸疾会誌１８（５），１９８０，ｐ２９７〜ｐ３０
３）に基づいて、アンジオテンシン変換酵素の阻害活性
（ＩＣ₅₀値）を測定した。

【００３７】すなわち、ウサギ肺由来のアンジオテンシ
ン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製）３ｍＵに、ホウ酸ソーダ
１／２０Ｍ溶液およびホウ酸１／５Ｍ溶液を９：１１の
重量割合で混合して調製したホウ酸緩衝液を用意した。
次に、このホウ酸緩衝液に１．０Ｍ濃度で塩化ナトリウ
ムを溶かして、食塩ホウ酸緩衝液を作成した。それか
ら、この食塩ホウ酸緩衝液に、１２．５ｍＭ濃度になる
ように基質Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ペプチド研究所
製）を溶解させ、基質溶液からなる溶液を作成した。そ
して、さらにこの溶液に対して、所定の試料（塩基性ペ
プチド粗製物）を加えて混合液を作り、この混合液０．
２５ｍｌを３７℃で６０分間の条件でインキュベート
し、その後、０．５Ｎ塩酸０．２５ｍｌを加え酵素反応
を停止させた。

【００３８】次いで、これに酢酸エチル１．５ｍｌを加
え、１５秒間強く攪拌した。生成された馬尿酸を酢酸エ
チルに溶解させ、当該酢酸エチル層を０．５ｍｌ分別回
収した。この回収した酢酸エチル層から溶媒を加熱除去
した後、１Ｍ濃度の食塩水３ｍｌを加え、吸光度を用い
て、波長２２８ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤ／
ｓ）。

【００３９】一方、インキュベート前にあらかじめ、
０．５Ｎ塩酸を加え、酵素反応を阻害したものの吸光度
をブランクとし（ＯＤ／ｂ）、試料（塩基性ペプチド粗
製物）を添加しなかったものの吸光度をコントロールと
して（ＯＤ／ｃ）、以下の式によってアンジオテンシン
変換酵素の阻害阻害率（単に、阻害率と称する場合もあ
る。）を算出した。

【００４０】

【数１】

【００４１】この式により得られた阻害率と、添加した
試料（塩基性ペプチド粗製物）量より阻害率が５０％と
なる点を求めて、その値をＩＣ₅₀値とした。なお、実施
例１におけるＩＣ₅₀値は、９５μｇ／ｍｌという優れた
ＩＣ₅₀値を示した。結果を表１に示す。

【００４２】（３）経口投与試験 得られた塩基性ペプチド粗製物を、高血圧症（ＳＨＲ）
ラット（加齢とともに血圧が上昇するラット、株式会社
星野試験動物飼育所より購入）の餌に配合して、当該ラ
ットを飼育した。具体的に、１週齢の１８匹のＳＨＲラ
ットを下記に示すストック（Ｓｔｏｃｋ）の飼料により
２週間予備飼育した後、当該ラットを６匹づつ第１群
（対照食）と、第２群（塩基性ペプチド粗製物の２．５
重量％添加食）と、第３群（塩基性ペプチド粗製物の
５．０重量％添加食）に分けた。なお、１００ｇあたり
の対照食、２．５重量％添加食および５．０重量％添加
食の各飼料素材の混合量（ｇ）はそれぞれ以下に示す表
１のとおりである。

【００４３】

【表１】

【００４４】次に、第１〜３群のＳＨＲラットに、表１
に示す各飼料を８週間それぞれ与えた。なお、飼料とと
もに、飲料水は全期間を通じて自由摂取とした。また、
室内照明を昼夜１２時間の周期で以て点灯および消灯を
繰り返した。さらに、室温を２３℃±１℃の一定温度に
保持した。そして、実験期間中、ＳＨＲラットの体重お
よび摂取量は毎日、血圧は週１回それぞれ測定した。血
圧測定は、非観血法で以て行い、静脈圧測定装置（ＫＮ
−２１０、夏目製作所製）を用い、予めＳＨＲラットを
４０℃にした加温器を用いて３〜５分間加温した後、血
圧を測定した。結果を表２及び図１に示す。

【００４５】また、飼育期間終了後ＳＨＲラットを解剖
し、臓器重量（肝臓、脾臓、心臓、腎臓）、血漿脂質
（コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬＣ／高密度
リボタンパク−コレステロール、リン脂質）および肝臓
脂質（コレステロール、トリグリセリド、リン脂質）を
それぞれ常法を用いて測定した。結果を表３に示す。

【００４６】さらに、血漿中のアンジオテンシン変換酵
素（ＡＣＥ）の阻害阻害率を、山本らの方法に準拠して
測定した。すなわち、塩化ナトリウムーホウ酸緩衝液
（ｐＨ＝８．３）に、基質のヒプリル−Ｌ−ヒスチジル
−Ｌ−ロイシン（ペプチド研究所Ｎｏ．３０６４）を溶
解させ、血漿を加えて３７℃で以て６０分間加温した。
そして、ＡＣＥの作用で遊離した馬尿酸を酢酸エチルで
抽出し、乾固した後、１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム溶
液に溶解させ、波長２２８ｎｍにおける吸光度を測定し
た。また、ＡＣＥ活性１Ｕは、この実験条件下で毎分１
ｎｍｏｌの馬尿酸を生成する酵素量として表した。な
お、当該試験に用いたサンプル（塩基性ペプチド粗製
物）のＡＣＥ５０％阻害活性濃度、すなわちＩＣ₅₀は、
４０μｇ／ｍｌであった。

【００４７】表２、３及び図１に示す結果から容易に理
解されるように、実施例１の塩基性ペプチド粗製物を配
合した実験群のＳＨＲラット（第２群および第３群）
は、通常食の実験群のＳＨＲラット（第１群）と比較し
て、 飼料の投与を開始して第３週（１０週齢）までは血圧
上昇抑制に関して顕著な差は見られなかったが、第４週
からは有意に血圧上昇が抑制されていることが確認され
た（ダンカン／Ｄｕｎｃａｎの多重範囲検定法により、
危険率５％の有意差検定準拠、以下同様である）。 但し、第２群と第３群との間に、血圧上昇の抑制に関
して有意差は見られなかった。したがって、第２群の飼
用量、すなわち、１００ｇあたり２．５重量％添加する
だけで、第３週から、十分な血圧上昇抑制効果が得られ
ることが確認された。 ＳＨＲラットの体重変化および飼料摂取量ともに顕著
な差は見られなかった。 ＳＨＲラットの血漿中のコレステロール、トリグリセ
ライド含量および肝臓中のコレステロール、リン脂質含
量については、顕著な差は見られなかった。但し、肝臓
中のトリグリセライド含量については、有意で以て低下
する傾向が見られた。 血漿ＡＣＥ活性については、有意に低い値が得られる
ことが確認された。但し、第２群と第３群との間に、血
漿ＡＣＥ活性について有意差は見られなかった。

【００４８】

【表２】 ＊各数字は、６匹のＳＨＲラットの平均値を示し、また併せて標準誤差を示して ある。

【００４９】

【表３】

【００５０】（４）静脈注射試験 得られた塩基性ペプチド粗製物を、ＳＨＲラット（株式
会社星野試験動物飼育所より購入）の静脈に注射して、
当該ラットの血圧を測定した。具体的に、９週齢の９匹
のＳＨＲラットを上記ストック飼料により１週間予備飼
育した後、当該ラットを３匹づつ第１群（生理食塩水を
注射）と、第２群（塩基性ペプチド粗製物／生理食塩水
を注射）と、第３群（血圧降下剤カプトプリルを注射）
に分けた。そして、ＳＨＲラットの尾静脈に塩基性ペプ
チド粗製物／生理食塩水等を注射した。

【００５１】なお、各注射量は、ＳＨＲラットの体重差
を考慮して５０ｍｇ／ｋｇ体重とした。また、飼育中、
飼料と飲料水は自由摂取とした。そして、注射直前、注
射後１、２、４および６時間経過後の血圧を非観血法で
以て測定した。結果を図２に示す。

【００５２】図２に示す結果から容易に理解できるよう
に、実施例１の塩基性ペプチド粗製物をＳＨＲラットに
直接投与することにより、当該ＳＨＲラットの血圧を低
下させる効果があり、しかも長時間（６時間以上）にわ
たって効果が持続することが確認された。

【００５３】また、実施例１の塩基性ペプチド粗製物
は、注射後１時間から顕著な血圧降下傾向が見られたの
に対し、カプトプリル（ＳＱ１４２２５、ＩＣ₅₀＝１．
０９ｎｇ／ｍｌ）の場合は、注射後２時間過ぎから血圧
降下の傾向が見られた。したがって、実施例１の塩基性
ペプチド粗製物は、血圧降下剤として一般的なカプトプ
リル（ＳＱ１４２２５）よりも、血圧降下作用として速
効性を有することも確認された。

【００５４】（実施例２〜４） （１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質の作成 実施例１と同様の方法で以て、他の魚肉の部位（キハダ
精肉、ビンナガ血合い肉およびビンナガ精肉）につい
て、それぞれ塩基性ペプチド粗製物をアンジオテンシン
変換酵素阻害物質として得た。

【００５５】（２）アンジオテンシン変換酵素に対する
阻害活性（ＩＣ₅₀値）測定 実施例１と同様の方法で以て、得られた塩基性ペプチド
粗製物の阻害活性をそれぞれ測定した。その結果、キハ
ダ精肉についてＩＣ₅₀値＝１６６μｇ／ｍｌ、ビンナガ
血合い肉についてＩＣ₅₀値＝２００μｇ／ｍｌ、および
ビンナガ精肉についてＩＣ₅₀値＝１５６μｇ／ｍｌとい
う結果が得られた。それぞれの結果を表４に示す。

【００５６】表４の結果から容易に理解されるように、
他の原料魚・部位に比較し、キハダマグロの血合い肉よ
り得られた塩基性ペプチド粗製物の阻害活性が最も高い
ことが確認された。また、食品向けの加工用素材、また
は以降の精製を必要としない用途に対しては、この塩基
性ペプチド粗製物であっても十分に血圧降下作用等の目
的を達成するものである。さらに、未利用資源としてさ
れていた残滓を活用し、用途拡大を図る上で重要な、コ
ストの低減を考えた場合、この粗製物を利用すること
は、非常に有意義である。

【００５７】その他、残滓物がキハダ血合い肉に限定さ
れず、同じくツナ缶詰製造に利用されるビンナガマグロ
でも、阻害活性が認められ、同じく使用可能な原料であ
ることが確認された。さらに、残滓発生時に血合い肉と
共に廃棄される精肉にも活性が認められたことは、あえ
て、残滓を血合い肉のみに選別する必要がないというこ
ともできる。

【００５８】

【表４】

【００５９】（実施例５）実施例５においては、実施例
１で得られた塩基性ペプチド粗製物を精製することによ
り、阻害活性のより高いアンジオテンシン変換酵素阻害
物質を提供することを目的とする。これは、薬理的理由
などにより、ペプチドの粗製物は利用できない場合に適
用されるものである。

【００６０】（１）アンジオテンシン変換酵素阻害物質
の作成 実施例１の方法をもって得られた塩基性ペプチド粗製物
には、種々のペプチドが含まれ、必ずしも全ての成分が
阻害活性を示す訳ではない。そこで、塩基性ペプチド粗
製物１００ｍｇを蒸留水１ｇに溶かして溶液を作成し
た。この溶液について、ＴｏｙｏｐｅａｌＨＷ４０Ｆ
（東ソー社製）を充填したガラスカラム（φ１０×１２
００ｍｍ）を用い、蒸留水を移動相としたゲル瀘過カラ
ムクロマトグラフィー法により分画した。この時、フロ
ー温度は１５℃、フローレート（流速）は１ｍｌ／ｍｉ
ｎとした。溶出する移動相を５ｍｌづつのフラクション
に分け取り、それぞれの波長２２０ｎｍにおける吸光度
を測定した。

【００６１】その結果、図３に示す溶出パターンを得
た。これを、Ｆ１〜Ｆ４のグループに分け移動相に使用
した蒸留水を蒸発除去して溶出物を得た。さらに、これ
らの溶出物のアンジオテンシン阻害活性を測定し、得ら
れたＩＣ₅₀値を表５に示す。

【００６２】

【表５】

【００６３】これより、Ｆ２画分が他にくらべて、高い
阻害活性を示すことが確認された。そこで、再度、ゲル
瀘過カラムクロマトグラフィー法によりＦ２画分を中心
に細かく分画を行い、図４に示す様に、Ｎ１〜Ｎ３画分
を得た。Ｎ１〜Ｎ３画分のＩＣ₅₀値をそれぞれ表６に示
す。

【００６４】

【表６】

【００６５】この結果、Ｎ１およびＮ２画分が他にくら
べて、高い阻害活性を示すことが確認された。そこで、
より回収量が多く、しかもＡＣＥ阻害活性が高いＮ１画
分を対象にして、μＢＯＮＤＡＳＨＥＲ５μＣ１８−１
００Ａ（φ１９×１５０ＩＤ）（ウォーターズ社製）を
用いた高速液体クロマトグラフィー分析装置で、１重量
％ＴＦＡアセトニトリル／水混合溶液で溶出処理を行っ
た。得られたクロマトグラフを図５に示す。さらに、Ｎ
１画分を、ここで得られたクロマトグラフに従い、再
度、同装置にて、Ｃ１〜Ｃ４画分に分画し、それぞれの
ＡＣＥ阻害活性を比較した。その結果を表７に示す。

【００６６】

【表７】

【００６７】以上の手順にて、Ｆ２画分付近のＮ１画分
中のＣ４画分が、アンジオテンシン変換酵素阻害活性が
特に高いことがわかった。そこで、Ｃ４画分の高速液体
クロマトグラフィー分析装置によるクロマトグラフの各
ピークを単独に回収し、それらの中から、本発明の構造
を持つペプチドを得た。また、得られた各ピークの５０
％阻害活性濃度であるＩＣ₅₀値を表８に示す。

【００６８】

【表８】

【００６９】得られた、（１）〜（３）の各ペプチド
を、全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０
（島津製作所社製）を用いて構造解析したところ、以下
のアミノ酸配列を有していることが確認された。 （１）Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ （２）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ （３）Ｉｌｅ−Ｐｈｅ

【００７０】また、ここで得られた各単離画分ＦＡＢ−
マススペクトル分析装置にて、質量分析した結果、上述
のデータともよく一致し、各ピークの成分として、これ
らが妥当であると判断された。

【００７１】さらに、これらの活性を再確認するため
に、上式で表されるペプチドについて、固相合成法によ
り、合成されたペプチド（国産化学社製）を用いて、５
０％阻害活性濃度ＩＣ₅₀を求めたところ、表８に示した
結果と非常によく一致し、得られたペプチドがアンジオ
テンシン阻害活性（ＡＣＥ阻害活性）を持つことが実証
された。

【００７２】したがって、（１）〜（３）の各ペプチド
が、強くアンジオテンシン変換酵素の阻害活性を阻害す
る成分であることがわかった。

【００７３】（比較例１）キハダマグロの普通肉２ｋｇ
をミンチし、これを８溶量倍の１Ｍ酢酸−２０ｍＭ塩酸
水溶液中に懸濁させ、オートクレーブ中で１２０℃にて
５分間加熱した。こん懸濁液を室温まで冷却後、遠心分
離機を用いて１６００ｒｐｍ、３０分間の条件で以て遠
心分離し、上清を採取した。この上清液に活性化したＯ
ＤＳ樹脂（５５〜１０５μｍ）８０ｇを加え、１時間撹
拌した。その後、ガラスフィルター（３Ｇ）で濾過し
て、これを４％酢酸８００ｍｌで洗浄後、１５％アセト
ニトリル１リットルで溶出させ、溶出液を減圧下で溶媒
を除去して、画分１を得た。この画分１の５０％阻害活
性濃度ＩＣ₅₀は、約５３０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であっ
た。

【００７４】また、ＳＰ−セファデックスＣ−２５を充
填したカラム（１．８×５０ｃｍ）に通し、０．２Ｍピ
リジンー酢酸緩衝液（ｐＨ＝３．１）〜２Ｍピリジンー
酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）の直線濃度勾配で溶出し
た。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集めて画分
２を得た。この画分２の５０％阻害活性濃度ＩＣ₅₀は、
約１９０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。

【００７５】次いで、画分２を、ＳＰ−セファデックス
Ｇ−２５を充填したカラム（２．５×９３ｃｍ）に通
し、０．２Ｍ酢酸で溶出した。そして、ＡＣＥ阻害活性
を有する画分を集めて画分３を得た。この画分３の５０
％阻害活性濃度ＩＣ₅₀は、約１００μ（μｍｏｌ／ｍ
ｌ）であった。

【００７６】次いで、画分３に対して、デベロシルＯＤ
Ｓ−７を用いたＨＰＬＣ（カラム：０．８×２５ｃｍ、
溶出液：０．０５％ＨＣｌの１０〜２０％ＣＨ₃ＣＮ）
処理を施した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を
集めて画分４を得た。この画分４の５０％阻害活性濃度
ＩＣ₅₀は、約５０μ（μｍｏｌ／ｍｌ）であった。

【００７７】次いで、画分４に対して、アサヒパックＧ
Ｓ−２２０を用いたＨＰＬＣ（カラム：０．７６×５０
ｃｍ、溶出液：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）処理
を施した。そして、ＡＣＥ阻害活性を有する画分を集め
て画分５（平均重量分子量約１０００）を得た。この画
分５の５０％阻害活性濃度ＩＣ₅₀は、約０．８（μｍｏ
ｌ／ｍｌ）であった。したがって、比較例１のアンジオ
テンシン変換酵素阻害物質は、本発明のアンジオテンシ
ン変換酵素阻害物質と比較して、ＡＣＥ阻害活性が低い
ことが確認された。

【００７８】なお、当該画分５のペプチドに対して、全
自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−１０（島津
製作所社製）を用いて構造解析したところ、以下のアミ
ノ酸配列を主成分として有していることが確認された。
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ

【００７９】

【発明の効果】以上説明したように、Ｖａｌ−Ｔｒｐ−
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｈｅおよびＩｌｅ
−Ｐｈｅのアミノ酸配列で表されるペプチドを含んで構
成することにより、優れたアンジオテンシン変換酵素に
対する優れた阻害活性を有するアンジオテンシン変換酵
素阻害物質を提供することができるようになった。

【００８０】また、これまでは乾燥させてフィッシュミ
ール加工し、肥料や飼料程度にしか利用することのでき
なかった缶詰加工残滓のマグロ魚肉を人が摂取すること
ができる魅力のある機能性素材として、しかも安価に提
供することができるようになった。

【００８１】さらに、食品素材としての使用、血圧降下
剤の原料として利用することができるとともに、粗製品
も同様に生理活性効果を示すので、これを利用すること
ができることから、さらなる天然資源の有効利用を図る
ことができるようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＨＲラットにおける血圧の経時変化（経口投
与）を示す図である。

【図２】ＳＨＲラットにおける血圧の経時変化（静脈投
与）を示す図である。

【図３】本発明の実施例１において得られた粗製物を、
ゲル瀘過カラムクロマトグラフィーを用いて分画し、溶
出するフラクションの２２０ｎｍの吸光度を測定し、得
られた溶出パターンを示す説明図である。

【図４】図３に示す場合におけるＦ２画分を中心に、さ
らに細かく分画を行なった場合の溶出パターンを示す説
明図である。

【図５】図４に示す場合において、アンジオテンシン変
換酵素阻害活性が比較的高いＮ１画分を高速液体クロマ
トグラフィー分析装置で溶出を行ない、得られたクロマ
トグラフを示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＢＵ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＵ Ｃ０７Ｋ 123:00 (72)発明者 太田 俊也 静岡県駿東郡長泉町竹原344−６ (72)発明者 山岸 政昭 静岡県焼津市西小川５丁目17番地−12 (72)発明者 戸塚 好之 静岡県静岡市下川原２丁目14−２ (72)発明者 望月 一男 静岡県静岡市西千代田町22−５

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記式（１）で表されるテトラペプチ
   ド、下記式（２）で表されるトリペプチドおよび下記式
   （３）で表されるジぺプチドからなる群から選ばれる少
   なくとも一つのペプチドを含有するアンジオテンシン変
   換酵素阻害物質。 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３）
2. 【請求項２】 前記アンジオテンシン変換酵素阻害物質
   が、マグロ魚肉組織を精製することにより得られる請求
   項１記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
3. 【請求項３】 前記マグロ魚肉組織が、加工残滓である
   請求項２記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
4. 【請求項４】 前記マグロ魚肉組織の精製が、タンパク
   分解酵素により、当該マグロ魚肉組織におけるタンパク
   鎖中のぺプチド結合を切断する段階を含むものである請
   求項２または３記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物
   質。
5. 【請求項５】 前記タンパク分解酵素が、エンド型の酵
   素およびエキソ型の酵素あるいはいずれか一方である請
   求項４記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
6. 【請求項６】 以下の工程（Ａ）〜（Ｅ）を含む、下記
   式（１）で表されるテトラペプチド、下記式（２）で表
   されるトリペプチドおよび下記式（３）で表されるジぺ
   プチドからなる群から選ばれる少なくとも一つのペプチ
   ドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製造
   方法。 Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ ・・・（１） Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ ・・・（２） Ｉｌｅ−Ｐｈｅ ・・・（３） （Ａ）マグロ魚肉組織を回収し、均一化処理を施す工
   程。 （Ｂ）均一化処理が施されたマグロ魚肉組織に、タンパ
   ク分解酵素を加えて、４０〜７０℃の範囲内の温度で以
   て当該マグロ魚肉組織を分解処理する工程。 （Ｃ）分解処理後、大分子画分を除去するとともに、短
   鎖ペプチドを回収する工程。 （Ｄ）短鎖ペプチドを脱塩し、塩基性ペプチド粗製物を
   得る工程。 （Ｅ）塩基性ペプチド粗製物を分離処理してアンジオテ
   ンシン変換酵素阻害物質を回収する工程。
7. 【請求項７】 前記マグロ魚肉組織が、加工残滓である
   請求項６記載のアンジオテンシン変換酵素阻害物質の製
   造方法。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のア
   ンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分とする血圧
   降下剤。