CN110732018A - 一种金枪鱼鱼肉ace抑制肽咀嚼片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，涉及降压肽咀嚼片制备领域，包括以下制备步骤：1）使用酶解法从金枪鱼鱼肉中提取得到ACE抑制肽；2）原辅料预处理：将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂研磨粉碎过筛；3）将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂混合制备得到软材料；4）将软材料干燥后进行筛分，制成干燥粒料；5）将干燥粒料进行压片、杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片；本发明采用天然来源的ACE活性抑制肽为原料制备得到降压咀嚼片，制备工艺简便、风味口感好，无腥味，且降压效果好。

Description

一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法
技术领域
本发明涉及降压肽咀嚼片制备领域，尤其涉及一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法。
背景技术
高血压是以动脉血管收缩压或(和)舒张压升高为特征，并且导致脑卒中、心肌梗死、心力衰竭、痴呆、肝肾功能衰竭、失明等多种并发症的全身性疾病，已经成为我国乃至世界一个重要的公共卫生问题。现代医学认为高血压发病的主要原因是：交感神经过度激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统、血管内皮功能障碍、血小板功能受损和血栓的形成等，由于高血压不能根治，要通过长期服用降压药物来控制血压，长期服用传统药物会引发多种副作用，且降压效果不明显。例如，一种在中国专利文献上公开的“复方降压药物组合物及复方降压片剂”，其公告号CN201110187762.3，其公开了一种复方降压药物组合物及复方降压片剂，复方降压药物组合物包括左旋氨氯地平或药学上可接受的盐与吲哒帕胺，其中，吲哒帕胺与左旋氨氯地平的重量比为1∶1.5～12。然而长期服用该传统药物会引发多种副作用。
发明内容
本发明是为了克服目前由于高血压不能根治，要通过长期服用降压药物来控制血压，长期服用传统药物会引发多种副作用，且降压效果不明显等问题，提出了一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，包括以下制备步骤：
1)使用酶解法从金枪鱼鱼肉中提取得到ACE抑制肽；
2)原辅料预处理：将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂研磨粉碎过筛；
3)将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂混合制备得到软材料；
4)将软材料干燥后进行筛分，制成干燥粒料；
5)将干燥粒料进行压片、杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片。
本发明将从金枪鱼鱼肉中提取得到ACE抑制肽作为原料，经过与辅料与添加剂混合、制备软材料、造粒、干燥、压片、杀菌、包装后得到金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片，口感适宜，外观好，硬度适中，且使用了抑制活性好的降压肽金枪鱼鱼肉ACE抑制肽，降压效果好。
作为优选，步骤1)中所述ACE抑制肽的肽段氨基酸序列为Ser-Pro、Val-Asp-Arg-Tyr-Phe、Met-Trp-Asn、Met-Glu-Lys-Ser、Met-Lys-Lys-Ser或Leu-Pro-Arg-Ser。
本发明通过酶解法从金枪鱼鱼肉中成功提取纯化得到氨基酸序列为Ser-Pro、Val-Asp-Arg-Tyr-Phe、Met-Trp-Asn、Met-Glu-Lys-Ser、Met-Lys-Lys-Ser和Leu-Pro-Arg-Ser的多种肽段的ACE抑制肽，通过FAPGG-ACE体外评价模型和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型评价，具有明显的降血压作用。
作为优选，步骤2)中所述辅料各组分的质量份数为：脱脂奶粉5-10份，淀粉25-30份，山梨醇10-15份。
加入脱脂奶粉能够增加咀嚼片的奶香，减少金枪鱼鱼肉ACE抑制肽的腥味，淀粉和山梨醇能够作为咀嚼片的重量填充剂。
作为优选，步骤2)中所述食品添加剂各组分的质量份数为：矫味剂40-50份，酸味剂2-5份，所述矫味剂为麦芽糖醇、山梨糖醇、蔗糖、木糖醇中的一种或几种，所述酸味剂为柠檬酸、苹果酸或乳酸中的一种或几种。
作为优选，步骤3)中制备软材料时各组分质量份数为：ACE抑制肽10-15份，辅料35-50份，食品添加剂40-50份。
作为优选，步骤3)中制备软材料时ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂混合后，喷洒润湿剂，所述润湿剂为40-60wt％的乙醇水溶液控制软材料的润湿性，使软材料达到捏之成团，触之即散的状态。
作为润湿剂的乙醇水溶液中，乙醇浓度过低，软材料水分相对较高，干燥后得到的颗粒易结块开裂，而乙醇浓度过高水分少，乙醇则容易挥发，导致制备得到的颗粒较为松散。
作为优选，步骤4)干燥时将软材料置于50-70℃下干燥1-2h，至水分含量为2-4wt％。
干燥温度过低，软材料干燥速度过慢，制备得到的颗粒成品率过低；干燥温度过高，颗粒表面水分蒸发过快，表面形成硬膜导致内部水分无法被蒸发，制备得到的咀嚼片有颗粒感。
作为优选，步骤5)压片时在干燥粒料加入1-1.5wt％硬脂酸镁，放入压片机中，在0.3-0.4MPa下进行压片。
作为优选，金枪鱼肉ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
a)将金枪鱼肉解冻、烘干除去水份，随后脱脂、烘干、粉碎备用；
b)将预处理后的鱼肉粉末加入蒸馏水，调节pH值后，加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
c)将酶解液进行灭酶处理，随后离心取上清液，得灭酶酶解液，冷冻干燥，得到多肽粉，测ACE抑制活性；
d)随后将灭酶酶解液进行超滤、柱层析、高效液相色谱纯化、氨基酸测序后，制备得到金枪鱼肉ACE抑制肽。
其中，步骤1)中所述脱脂为：在金枪鱼中加入乙酸乙酯，浸没40-60h，随后旋转蒸发；步骤2)中鱼肉粉末与蒸馏水的质量比为1-3:20，调节pH值至6-10.5，加酶量为1-3％，酶解温度为45-65℃；步骤4)中所述的超滤步骤为在35.1-35.6Hz、0.5-1.2pa下，使用超滤膜对金枪鱼鱼肉灭酶酶解液进行超滤分级，将产物组分冷冻干燥后得到酶解物粉，超滤膜的截留分子量为3.5KDa；层析步骤为将酶解物粉溶解过滤，使用Sephadex G-25凝胶过滤层析，随后冷冻干燥。
在金枪鱼ACE抑制肽提取时，以ACE抑制活性为指标，以酶解法提取金枪鱼鱼肉ACE抑制肽，并以三因素(温度、加酶量和pH)优化酶解工艺，随后，经过超滤、Sephadex G-25凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)一系列纯化技术制备出具有ACE抑制活性的肽段，并且通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型对其降压活性进行进一步评价，具有明显的降血压作用。
因此，本发明具有如下有益效果：本发明采用天然来源的ACE活性抑制肽为原料制备得到降压咀嚼片，制备工艺简便、风味口感好，无腥味，且降压效果好。
附图说明
图1是本发明实施例1-5制备过程中不同pH下多肽粉ACE活性抑制率。
图2是本发明实施例3、6-9制备过程中不同酶解温度下多肽粉ACE活性抑制率。
图3是本发明实施例3、10-13制备过程中不同加酶量下多肽粉ACE活性抑制率。
图4是本发明实施例11和对比例1-3制备过程中不同超滤分子量酶解物粉的ACE活性抑制率。
图5是本发明实施例11制备过程中Sephadex G-25凝胶柱层析洗脱曲线。
图6是本发明实施例11制备过程中不同Sephadex G-25凝胶柱层析洗脱峰ACE活性抑制率。
图7是本发明实施例11制备过程中Zorbax SB-C18反相高效液相的谱图。
图8是本发明蛋白标准曲线。
图9是本发明ET-1标准曲线。
图10是本发明实施例11ACE抑制肽L1和L2对HUVEC的增殖活性影响。
图11是本发明实施例11不同浓度ACE抑制肽L1和L2对人脐静脉内皮细胞NO含量的影响(##P＜0.01，#P＜0.05vs Control组；**P＜0.01，*P＜0.05vs NE组)。
图12是本发明实施例11不同浓度ACE抑制肽L1和L2对人脐静脉内皮细胞ET-1含量的影响(##P＜0.01，#P＜0.05vs Control组；**P＜0.01，*P＜0.05vs NE组)。
图13是本发明实施例16-20制备过程中不同pH下多肽粉ACE活性抑制率。
图14是本发明实施例16、22-24制备过程中不同酶解温度下多肽粉ACE活性抑制率。
图15是本发明实施例18、25-28制备过程中不同加酶量下多肽粉ACE活性抑制率。
图16是本发明实施例26和对比例4-5制备过程中不同超滤分子量酶解物粉的ACE活性抑制率。
图17是本发明实施例26制备过程中Sephadex G-25凝胶柱层析洗脱曲线。
图18是本发明实施例26制备过程中不同Sephadex G-25凝胶柱层析洗脱峰ACE活性抑制率。
图19是本发明实施例26制备过程中Zorbax SB-C18反相高效液相的谱图。
图20是本发明实施例26ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对HUVEC的增殖活性影响。
图21是本发明实施例26不同浓度ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对人脐静脉内皮细胞NO含量的影响(##P＜0.01，#P＜0.05vs Control组；**P＜0.01，*P＜0.05vs NE组)。
图22是本发明实施例26不同浓度ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对人脐静脉内皮细胞ET-1含量的影响(##P＜0.01，#P＜0.05vs Control组；**P＜0.01，*P＜0.05vs NE组)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1-15：金枪鱼肉ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
a)将金枪鱼白肉解冻、烘干除去水份，随后在金枪鱼中加入乙酸乙酯，浸没脱脂，旋转蒸发后，烘干、粉碎备用；
b)将预处理后的白肉粉末加入蒸馏水，调节pH值至8.5-10.5后，加入1-3wt％碱性蛋白酶，在45-65℃下酶解3h，得到酶解液；
c)将酶解液在100℃水浴下加热10min进行灭酶处理，随后在4000r下离心20min，取上清液，得灭酶酶解液，随后冷冻干燥，得到多肽粉，测ACE抑制活性；
d)使用3.5KDa的超滤膜对金枪鱼白肉酶解液进行超滤分级，将产物组分冷冻干燥后得到酶解物粉；随后将酶解物粉与超纯水配成浓度为50mg/mL的溶液，并于4℃下以12000r/min离心10min，去除不溶性杂质，用已活化葡聚糖凝胶Sephadex G-25过滤层析，冷冻干燥后，配成浓度为100mg/mL的溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，以乙腈-水-三氟乙酸(TFA)为洗脱液进行梯度洗脱，流速为2ml/min，经高效液相色谱柱Zorbax SB-C18纯化分析，氨基酸测序、合成得到金枪鱼白肉ACE抑制肽。
表1：实施例1-15制备条件。
Figure BDA0002232959120000051
将实施例制备过程中，多肽粉的ACE抑制活性的检测方法为以FAPGG为底物，用酶标仪法测定ACE抑制活性，具体步骤如下，将10μL的ACE溶液(0.1U/mL)和40μL多肽水解液加入微孔板的微孔中但不混合，然后加入50μL底物(37℃预热15分钟)使其开始反应。迅速将微孔板放入温度为37℃酶标仪中，每5min记录1次在340nm波长处的吸光度，共记录30min。空白对照使用40μL的HEPES缓冲液代替多肽溶液。以吸光度(ΔA340nm)对时间做出曲线，计算出斜率。ACE抑制率的计算公式如下：
Figure BDA0002232959120000052
其中ACEI为ACE活性抑制率；ΔAc为加入缓冲液时吸光度在30min内的变化；ΔAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。
实施例1-5不同pH对ACE活性抑制率的影响如图1所示，pH分别为8.5、9.0、9.5、10.0和10.5，图中所示，ACE活性抑制率在pH 9.5时达到最高(62.45％)，说明此时，金枪鱼白肉酶解的程度较大。pH在8.5-9.5时呈快速上升趋势，pH在9.5后开始下降。因此pH9.5为碱性蛋白酶酶解的最适pH。
实施例3、6-9不同酶解温度对ACE活性抑制率的影响如图2所示，酶解温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃；图中可知，金枪鱼白肉在45℃、50℃等低温时的水解程度较小，ACE抑制率较低；随着温度升高，酶的催化活性增强，酶解速度加快，ACE抑制率增强，直到55℃时，产物ACE抑制率达到最大值为68.33％；但当温度高于55℃时，ACE抑制率开始下降，说明蛋白质的酶解程度下降。这是因为蛋白酶在高温条件下，蛋白酶活性减弱，导致酶的催化活性降低，产物的ACE抑制率也由此下降。因此，碱性蛋白酶作用金枪鱼白肉的最适温度在55℃。
实施例3、10-13不同加酶量对ACE活性抑制率的影响如图3所示，加酶量分别为1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％。从图中可以看出，加酶量小于1.5wt％时，酶分子与底物蛋白质分子之间的相互结合的数量随着酶量的增加而增加，因此酶解的产物含量逐渐升高；但是，一旦所有的底物分子都被酶分子饱和时，如果继续增加酶量，已生成的ACE抑制成分被过度水解甚至失活，水解物的ACE抑制率逐渐下降。因此，碱性蛋白酶酶解金枪鱼白肉最适加酶量为1.5wt％。
对比例1：与实施例11不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为3.5kDa和5kDa，截留得到分子量为3.5-5kDa的组分。
对比例2：与实施例11不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为5kDa和10kDa，截留得到分子量为5-10kDa的组分。
对比例3：与实施例11不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为10kDa，截留得到分子量为大于10kDa的组分。
将实施例11和对比例1-3超滤后的产物分别标记为TLMH-I(<3.5kDa)、TLMH-II(3.5-5kDa)、TLMH-III(5-10kDa)和TLMH-IV(>10kDa)，冷冻干燥后配制蛋白质浓度为1.0mg/mL的溶液，测定各组分的ACE抑制活性，结果如图4所示。图中可得，组分TLMH-I的ACE抑制活性最强，组分TLMH-II的活性次之，组分TLMH-IV的活性最小。结果显示，超滤组分的ACE抑制活性随着分子量分布范围的减小而升高。使用截留分子量为3.5kDa的超滤，通过截留样品中的大分子物质能够实现对小分子物质的富集，TLMH-I组分中富集有分子质量<3.5kDa的多肽，而该组分中富含ACE抑制肽的可能性要大于其它三个组分，故其ACE抑制活性最高。
将实施例11制备得到的酶解物粉与超纯水配成浓度为50mg/mL的溶液，并于4℃下以12000r/min离心10min，去除不溶性杂质，用已活化葡聚糖凝胶Sephadex G-25过滤层析(上样浓度为50mg/mL，进样体积为3ml，洗脱速度为0.7ml/min)，洗脱结果如图5所示，共有5个洗脱峰，分别记为A1、A2、A3、A4和A5，然后按峰合并管内溶液，冻干后，将五个组分分别配制成1.0mg/mL的样品溶液测定ACE抑制活性，结果如图6所示，A4组分的降压活性最好，ACE抑制率可达81.87％，相比其他组分都较高。
将实施例11制备得到的A4组分组分配成浓度为100mg/mL的溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，以乙腈-水-三氟乙酸(TFA)为洗脱液进行梯度洗脱，流速为2ml/min，经高效液相色谱柱Zorbax SB-C18纯化分析，结果如图7所示，由图可知，经RP-HPLC分离得到6个主要的峰，对这6个峰的成分进行N端测序及质谱分析，确定共6条多肽序列，其序列分别为：Ser-Pro(L1，202.21Da)、Val-Asp-Arg-Tyr-Phe(L2，698.78Da)、Val-His-Gly-Val-Val(L3，509.61Da)、Tyr-Glu(L4，310.31Da)、Phe-Glu-Met(L5，425.51Da)和Phe-Trp-Arg-Val(L6，606.73Da)，测定6个肽段在不同浓度下的ACE抑制率，然后利用SPSS Statistic软件进行统计，计算6个肽段IC50值，分别为：L1(IC50＝0.064mg/mL)，L2(IC50＝0.284mg/mL)，L3(IC50＝0.901mg/mL)，L4(IC50＝0.800mg/mL)，L5(IC50＝2.179mg/mL)，L6(IC50＝0.755mg/mL)。IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序或者是(包含在此程序中的某些物质)的半量。其中，L1氨基酸序列为Ser-Pro的肽段ACE抑制活性最好。这是由于ACE抑制肽的C末端三肽结构对其降血压活性起着关键作用，ACE抑制肽C末端氨基酸为芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)或Pro(脯氨酸)残基的短肽时其抑制活性最强，并且多肽的C端三肽含支链氨基酸(Ile，Leu，Val)，其ACE抑制活性会较强。此外，N末端为疏水性的撷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的肽与ACE的亲和力较强，抑制活性较高，但是脯氨酸则除外；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的统称支链氨基酸。L1的氨基酸序列为Ser-Pro，处于C末端的氨基酸是Pro(脯氨酸)残基，因此L1具有较好ACE酶抑制活性。而本发明中得到的L2(Val-Asp-Arg-Tyr-Phe)为五肽，但其C末端结构特征也符合ACE抑制短肽的构效关系规律，其C端Tyr和Phe芳香族氨基酸，而N端Val又是疏水性的缬氨酸，因此其活性也很高，仅次于L2肽段。
在上述实验数据中，在已建立的FAPGG-ACE体外评价模型中表现出较好的ACE抑制活性，但其降血压活性仍需通过生物水平实验进行证实，因此，本发明通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型对其降压活性进行进一步评价。
人脐静脉内皮细胞的培养：HUVEC采用高糖DMEM+FBS+双抗(青霉素-链霉素)培养基(DMEM：FBS：双抗＝9:1:0.1)进行培养。培养流程如下：复苏后的细胞置于含5％CO2培养箱中，37℃培养，24小时后换液，等到细胞生长融合至能覆盖瓶底85％以上时，胰酶消化，1:2传代至两个瓶中。取对数生长期的HUVEC作为实验材料。
实验分组及处理：取对数生长期的HUVEC细胞，弃去培养基，PBS洗涤两遍，胰酶消化，2.4×105/孔接板，随机分组如下：
(1)空白对照组：不加任何试剂处理细胞；
(2)ACE抑制肽低剂量组：加入肽终浓度为100μM；
(3)ACE抑制肽中剂量组：加入肽终浓度为200μM；
(4)ACE抑制肽高剂量组：加入肽终浓度为400μM；
(5)卡托普利(Cap)组：加入Cap终浓度为1μM；
(6)去甲肾上腺素(NE)组：加入NE终浓度为0.5μM
(7)治疗组：加入肽和NE终浓度分别为200μM和0.5μM。
细胞毒性试验(MTT法)：将HUVEC细胞调整为0.8×104个/孔的细胞悬液后，接种至96孔板中，160μl/孔，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24小时后，空白孔加入20μL完全培养液和20μL PBS，样品孔加入20μL完全培养液和20μL终浓度分别为和25μM、50μM、100μM、200μM和400μM的样品(溶于水的用PBS溶解，不溶于水的用DMSO溶解)，置于5％CO2培养箱中，37℃培养24小时后加入20μLMTT溶液，37℃培养4h后弃去培养基，加入150μLDMSO，37℃避光震荡10min使反应均匀，酶标仪上测定OD490nm值，测定细胞相对存活率。
总蛋白含量测定：在碱性环境下，蛋白将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA试剂会形成蓝紫色的络合物，其在562nm处有特异性吸收，测定该波长下的吸光值，与标准曲线对比，计算出待测物的蛋白浓度。微孔酶标仪法操作如下所示：
1.BCA工作液的配制。根据标准品和样品的数量，按照BCA试剂和Cu试剂50:1的比例配制工作液，充分混匀；
2.绘制标准曲线。配制终浓度为0.5mg/mL的BSA标准品溶液(取10μLBSA标准品用PBS稀释到100μL)，按照表2比例依次加到96孔板内；
表2：BCA试剂盒标准曲线加样
Figure BDA0002232959120000081
混匀后，37℃放置15-30min，用多功能酶标仪测定562nm处的吸光值。以蛋白含量(g/L)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制蛋白标准曲线。所得蛋白标准曲线如图8所示，图中可知，曲线方程为y＝0.7464x+0.1304，R2＝0.9918，呈良好的线性关系。可通过此方程计算样本的细胞蛋白浓度，以便于后期NO试剂盒的使用；
3.样品测定。超声破碎完的细胞样品用标准PBS液作适当稀释，取20μL加入到96孔板中，再加入200μLBCA工作液。按照上面的操作方法测定562nm处的吸光值，根据标准曲线计算出样品的蛋白总含量。
NO含量的测定：弃六孔板培养基，加PBS洗两遍培养的细胞，加2mLPBS，然后用细胞刮板将从六孔板刮下来，制成悬液，在冰浴条件下超声破碎，制成悬液。前处理结束后按照NO试剂盒的步骤进行操作。计算公式如下：
ET-1含量的测定：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被内皮素1(ET-1)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，经过恒温孵育并彻底洗涤。用底物四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色物质，并在酸的作用下转化成最终的黄色物质。颜色的深浅和样品中的内皮素1(ET-1)含量呈现正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，作标准曲线，计算样品浓度。标准曲线如图9所示，图中可知，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。得到标准曲线如图9所示，回归方程为y＝0.0029x+0.0649，R2＝0.991，具有较好的拟合能力。
ACE抑制肽L1和L2对HUVEC的增殖活性影响如图10所示，图中可知，与空白对照组相比，多肽L1和L2在浓度25-400μM的范围内，对HUVEC的生长抑制无显著差异。说明在该系列浓度下，L1和L2ACE抑制肽对HUVEC无明显毒性作用。
不同浓度ACE抑制肽L1和L2对人脐静脉内皮细胞NO含量的影响如图11所示，图中可知，与空白对照组相比，Cap组、L1和L2组NO含量均呈现上升趋势，且具有显著性差异，说明L1的L2促进细胞释放NO的作用与卡托普利相似。NE组和空白组相比，具有显著性差异，说明NE能显著性地抑制细胞释放NO。L1促进细胞释放NO的作用呈浓度依赖性，而L2中剂量促进细胞释放NO的作用最好。同时加入NE和中剂量的L1或L2后，NO含量与单纯NE组相比有显著性上升，说明一定浓度的L1和L2能抵抗NE对NO释放的作用。
不同浓度ACE抑制肽L1和L2对人脐静脉内皮细胞ET-1含量的影响如图12所示，图中可知，和空白对照组相比，Cap组、L1组和L2组可以显著地减少细胞内ET-1的含量。由此可见，L1与Cap作用相似，可能通过抑制血管内皮细胞内ET-1的释放而起到降血压作用，并且作用与剂量之间关系明显。与促进细胞NO释放的作用相同，L1的高剂量和L2的中剂量对ET-1释放的抑制作用最强。同时加入L1或L2和NE，与NE组相比具有显著性差异，说明一定浓度的L1和L2能显著性的对抗NE促ET-1的释放作用。
实施例16-30：金枪鱼肉ACE抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
a)将金枪鱼红肉解冻、烘干除去水份，随后在金枪鱼中加入乙酸乙酯，浸没脱脂，旋转蒸发后，烘干、粉碎备用；
b)将预处理后的红肉粉末加入蒸馏水，调节pH值至6-8后，加入1-3wt％碱性蛋白酶，在45-65℃下酶解4h，得到酶解液；
c)将酶解液在100℃水浴下加热10min进行灭酶处理，随后在4000r下离心20min，取上清液，得灭酶酶解液，随后冷冻干燥，得到多肽粉，测ACE抑制活性；
d)使用3.5KDa的超滤膜对金枪鱼红肉酶解液进行超滤分级，将产物组分冷冻干燥后得到酶解物粉；随后将酶解物粉与超纯水配成浓度为50mg/mL的溶液，并于4℃下以12000r/min离心10min，去除不溶性杂质，用已活化葡聚糖凝胶Sephadex G-25过滤层析，冷冻干燥后，配成浓度为100mg/mL的溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，以乙腈-水-三氟乙酸(TFA)为洗脱液进行梯度洗脱，流速为2ml/min，经高效液相色谱柱Zorbax SB-C18纯化分析，氨基酸测序、合成得到金枪鱼红肉ACE抑制肽。
表3：实施例16-30制备条件。
Figure BDA0002232959120000101
Figure BDA0002232959120000111
实施例16-20不同pH对ACE活性抑制率的影响如图13所示，pH分别为6、6.5、7.0、7.5和8.0，图中可知，ACE活性抑制率在pH 7.0时达到最高(63.54±3.19％)，说明此时，金枪鱼红肉酶解的程度较大。pH 6.0-7.0时呈上升趋势，pH 7.0后开始快速下降。因此pH 7.0为中性蛋白酶酶解的最佳pH。
实施例16、22-24不同酶解温度对ACE活性抑制率的影响如图14所示，酶解温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃；图中可知，金枪鱼红肉在45℃时的水解程度较小，ACE抑制率较低；随着温度升高，酶的催化活性增强，酶解速度加快，ACE抑制率增强，直到50℃时，产物ACE抑制率达到最大值为65.33％；但当温度高于50℃时，ACE抑制率开始下降，说明蛋白质的酶解程度下降。因此，中性蛋白酶酶解金枪鱼红肉制备ACE抑制肽的最适酶解温度为50℃左右，据此，在响应曲面实验设计中选择50℃为中心温度。
实施例18、25-28不同加酶量对ACE活性抑制率的影响如图15所示，加酶量分别为1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％。从图中可以看出，加酶量小于1.5wt％时，酶分子与底物蛋白质分子之间的相互结合的数量随着酶量的增加而增加，因此酶解的产物含量逐渐升高；但是，一旦所有的底物分子都被酶分子饱和时，如果继续增加酶量，已生成的ACE抑制成分被过度水解甚至失活，水解物的ACE抑制率逐渐下降。因此，中性蛋白酶酶解金枪鱼红肉最适加酶量为1.5wt％。
对比例4：与实施例26不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为3.5kDa和5kDa，截留得到分子量为3.5-5kDa的组分。
对比例5：与实施例26不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为5kDa和10kDa，截留得到分子量为5-10kDa的组分。
对比例6：与实施例26不同的地方在于，所用超滤膜的截留分子量为10kDa，截留得到分子量为大于10kDa的组分。
将实施例26和对比例4-5超滤后的产物分别标记为TDMH-I(<3.5KDa)、TDMH-II(3.5-5KDa)、TDMH-III(5-10KDa)和TDMH-IV(>10KDa)，冷冻干燥后配制蛋白质浓度为1.0mg/mL的溶液，测定各组分的ACE抑制活性，结果如图16所示。图中可得，组分TDMH-I的ACE抑制活性最强，组分TDMH-II的活性次之，组分TDMH-IV的活性最小。
将实施例26制备得到的酶解物粉与超纯水配成浓度为50mg/mL的溶液，并于4℃下以12000r/min离心10min，去除不溶性杂质，用已活化葡聚糖凝胶Sephadex G-25过滤层析(上样浓度为50mg/mL，进样体积为3ml，洗脱速度为0.7ml/min)，洗脱结果如图17所示，共有4个洗脱峰，分别记为B1、B2、B3和B4，按峰合并管内溶液，冻干后，将四个组分分别配制成1.0mg/mL的样品溶液测定ACE抑制活性，结果如图18所示，其中B2组分的ACE抑制活性最好，ACE抑制率可达81.87％。
将实施例26制备得到的B2组分配成浓度为100mg/mL的溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，以乙腈-水-三氟乙酸(TFA)为洗脱液进行梯度洗脱，流速为2ml/min，经高效液相色谱柱Zorbax SB-C18纯化分析，结果如图19所示，由图可知，B2组分经RP-HPLC分离得到12个主峰，对上述12个峰的成分进行N端测序及质谱分析，确定共14条多肽序列，其序列分别为：Thr-Glu(D1，248.24KDa)、Ala-Gly(D2，146.15Da)、Met-Trp-Asn(D3，449.53Da)、Met-Glu-Lys-Ser(D4，493.58Da)、Val-Lys(D5，245.32Da)、Met-Gln-Arg(D6，433.53Da)、Met-Lys-Lys-Ser(D7，492.64Da)、Val-Lys-Arg-Thr(D8，977.24Da)、Ile-Pro-Lys(D9，356.47Da)、Tyr-Asn-Tyr(D10，458.47Da)、Leu-Pro-Arg-Ser(D11，471.56Da)、Phe-Gln-Lys(D12，421.5Da)、Ile-Arg-Arg(D13，443.55Da)、和Trp-Glu-Arg-Gly-Glu(D14，675.7Da)；测定14个肽段在不同浓度下的ACE抑制率，然后利用SPSS Statistic软件进行统计，计算14个肽段IC50值，分别为D1(IC50＝1.885mg/mL)、D2(IC50＝2.475mg/mL)、D3(IC50＝0.328mg/mL)、D4(IC50＝0.527mg/mL)、D5(IC50＝2.712mg/mL)、D6(IC50＝0.946mg/mL)、D7(IC50＝0.269mg/mL)、D8(IC50＝0.868mg/mL)D9(IC50＝2.465mg/mL)、D10(IC50＝9.254mg/mL)、D11(IC50＝0.495mg/mL)、D12(IC50＝1.731mg/mL)、D13(IC50＝20.576mg/mL)和D14(IC50＝1.000mg/mL)。IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序或者是(包含在此程序中的某些物质)的半量。其中D3的ACE抑制活性最强，D4、D7、D11紧随其后。
在上述实验数据中，在已建立的FAPGG-ACE体外评价模型中表现出较好的ACE抑制活性，但其降血压活性仍需通过生物水平实验进行证实，因此，本发明通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型对其降压活性进行进一步评价。
ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对HUVEC的增殖活性影响如图20所示，图中可知，与空白对照组相比，多肽L1、L2、D3、D4、D7和D11在浓度25-400μM的范围内，对HUVEC的生长抑制无显著差异。说明在该系列浓度下，L1、L2、D3、D4、D7和D11ACE抑制肽对HUVEC无明显毒性作用。
不同浓度ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对人脐静脉内皮细胞NO含量的影响如图21所示，图中可知，D3、D4、D7和D11的高、中、低剂量组都与空白组有显著性差异，说明这四种多肽都可以促进人脐静脉内皮细胞NO的释放，且基本上都是中剂量活性最好。与NE组相比，这四种多肽的治疗组(200M+NE)的NO释放量都有有显著性增加，说明这四种多肽都能对抗NE对NO释放的抑制作用。
不同浓度ACE抑制肽D3、D4、D7和D11对人脐静脉内皮细胞ET-1含量的影响如图22所示，和空白对照组相比，Cap、D3、D4、D7和D11可以显著地减少细胞内ET-1的释放，且ACE抑制肽在中浓度时效果最好。与NE组相比，D3、D4、D7和D11的治疗组都有显著性差异，说明一定浓度的D3、D4、D7和D11能显著性地对抗NE促ET-1的释放作用。
实施例31：
一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，包括以下制备步骤：
1)原辅料预处理：将上述实施例制备得到的ACE抑制肽(肽段氨基酸序列为Ser-Pro)以及制备辅料：脱脂奶粉7份，淀粉30份，山梨醇10份和食品添加剂：麦芽糖醇45份，柠檬酸5份分别研磨粉碎过筛；
2)将12份ACE抑制肽、50份制备辅料以及40份食品添加剂混合后，喷洒润湿剂，所述润湿剂为50wt％的乙醇水溶液控制软材料的润湿性，使软材料达到捏之成团，触之即散的状态，制备得到软材料；
3)将软材料置于60℃下干燥1.5h，至水分含量为3wt％后进行筛分，制成干燥粒料；
4)在干燥粒料中加入1wt％硬脂酸镁，放入压片机中，在0.3MPa下进行压片；随后杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片。
实施例32：
一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，包括以下制备步骤：
1)原辅料预处理：将上述实施例制备得到的ACE抑制肽(肽段氨基酸序列为Met-Trp-Asn)以及制备辅料：脱脂奶粉10份，淀粉27份，山梨醇10份和食品添加剂：山梨糖醇50份，苹果酸3份分别研磨粉碎过筛；
2)将15份ACE抑制肽、40份制备辅料以及40份食品添加剂混合后，喷洒润湿剂，所述润湿剂为40wt％的乙醇水溶液控制软材料的润湿性，使软材料达到捏之成团，触之即散的状态，制备得到软材料；
3)将软材料置于70℃下干燥1h，至水分含量为4wt％后进行筛分，制成干燥粒料；
4)在干燥粒料中加入1.5wt％硬脂酸镁，放入压片机中，在0.4MPa下进行压片；随后杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片。
实施例33：一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，包括以下制备步骤：
1)原辅料预处理：将上述实施例制备得到的ACE抑制肽(肽段氨基酸序列为Val-Asp-Arg-Tyr-Phe)以及制备辅料：脱脂奶粉5份，淀粉25份，山梨醇13份和食品添加剂：木糖醇40份，乳酸2份分别研磨粉碎过筛；
2)将10份ACE抑制肽、35份制备辅料以及45份食品添加剂混合后，喷洒润湿剂，所述润湿剂为60wt％的乙醇水溶液控制软材料的润湿性，使软材料达到捏之成团，触之即散的状态，制备得到软材料；
3)将软材料置于50℃下干燥2h，至水分含量为2wt％后进行筛分，制成干燥粒料；
4)在干燥粒料中加入1.2wt％硬脂酸镁，放入压片机中，在0.35MPa下进行压片；随后杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片。
对实施例31-33制备得到的金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片进行质量评价，结果如下表所示。
表4：金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片质量评价。
因此，本发明制备得到的金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片口感适宜，外观好，硬度适中，且使用了抑制活性好的降压肽金枪鱼鱼肉ACE抑制肽，降压效果好。

Claims (8)

1.一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
1）使用酶解法从金枪鱼鱼肉中提取得到ACE抑制肽；
2）原辅料预处理：将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂研磨粉碎过筛；
3）将ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂混合制备得到软材料；
4）将软材料干燥后进行筛分，制成干燥粒料；
5）将干燥粒料进行压片、杀菌、包装，制得金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片。
2.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述ACE抑制肽的肽段氨基酸序列为Ser-Pro、Val-Asp-Arg-Tyr-Phe、Met-Trp-Asn、Met-Glu-Lys-Ser、Met-Lys-Lys-Ser或Leu-Pro-Arg-Ser。
3.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述辅料各组分的质量份数为：脱脂奶粉5-10份，淀粉25-30份，山梨醇10-15份。
4.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述食品添加剂各组分的质量份数为：矫味剂40-50份，酸味剂2-5份，所述矫味剂为麦芽糖醇、山梨糖醇、蔗糖、木糖醇中的一种或几种，所述酸味剂为柠檬酸、苹果酸或乳酸中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤3）中制备软材料时各组分质量份数为：ACE抑制肽10-15份，辅料35-50份，食品添加剂40-50份。
6.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤3）中制备软材料时ACE抑制肽、制备辅料以及食品添加剂混合后，喷洒润湿剂，所述润湿剂为40-60wt%的乙醇水溶液控制软材料的润湿性，使软材料达到捏之成团，触之即散的状态。
7.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤4）干燥时将软材料置于50-70℃下干燥1-2h，至水分含量为2-4wt%。
8.根据权利要求1所述的一种金枪鱼鱼肉ACE抑制肽咀嚼片的制备方法，其特征在于，步骤5）压片时在干燥粒料加入1-1.5wt%硬脂酸镁，放入压片机中，在0.3-0.4MPa下进行压片。
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