KR101343904B1

KR101343904B1 - 우유 카제인의 효소 가수분해물에서 식별된 생물활성펩티드 및 그것을 얻는 방법

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Publication number: KR101343904B1
Application number: KR1020087000546A
Authority: KR
Inventors: 산체스 이시드라 레시오; 델 보스퀴에 안나 퀴로스; 레데스마 블란카 헤르난데스; 루이스 호세 앤젤 고메스; 카스트로 마르타 미구엘; 가리도 마리아 로우르데스 아미고; 엑스포시토 이반 로페즈; 곤잘레스 마리아 메르세데스 라모스; 데 아르티나노 아마야 알레익산드레; 고메스 마르 콘트레라스
Original assignee: 콘세호 수페리오르 데 인베스티가시오네스 시엔티피카스 씨.에스.아이.씨.
Priority date: 2005-06-08
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2013-12-23
Anticipated expiration: 2026-06-08
Also published as: EP1905779A4; BRPI0611729A2; AU2006256720A1; CN101305017B; JP2008545774A; CN103254278B; EP2495250A3; WO2006131586B1; ES2319475B1; NO20080103L; CA2611416C; ES2319475A1; US20100048464A1; EP1905779A1; KR20080045108A; MX2007015528A; CN101305017A; US8354502B2; CN103254278A; CA2611416A1

Abstract

본 발명은 우유 단백질, 특히 카제인으로부터 유래하는 생물활성 유제품 제조용 우유 단백질로부터 유래하는 생물활성 생성물의 제조에 관한 것이다. 16개의 본 발명의 펩티드는 화학적으로, 생물공학적으로, 또는 효소처리에 의해 이것을 함유하는 단백질로부터 얻을 수 있고, 또한 항균 활성 및/또는 체외 ACE-억제 활성 및/또는 체내 항고혈압 활성 및/또는 항산화 활성을 가진 펩티드를 생산할 수 있다.

생물활성 펩티드

Description

우유 카제인의 효소 가수분해물에서 식별된 생물활성 펩티드 및 그것을 얻는 방법{BIOACTIVE PEPTIDES IDENTIFIED IN ENZYMATIC HYDROLYZATES OF MILK CASEINS AND METHOD OF OBTAINING SAME}

본 발명은 우유 카제인에서 유래된 생물활성 생성물의 제조로 구성된다. 이들 단백질은 효소처리 후, 항균 활성, 체외 안지오텐신 전환 억제 활성(ACE-억제 활성), 혈압강하작용 및/또는 항산화활성을 갖는, 식품 및 약품 공업에 사용하기 적합한 펩티드를 생성한다.

인간의 영양에 있어서 우유의 역할은 태어날 때부터 필수적이며 영영가와 기능치가 높은 식품이다. 최근 새로운 생물공학적 분리기술들의 개발은 새로운 식품 및 비식품용으로 사용되는 우유의 각종 성분들을 분획할 수 있게 되고, 새로운 용도는 그 소비를 증가시켜 부상하고 있다. 따라서, 우유 분획물에서 분리된 단백질을 생산을 하는 다양한 회사들은 카제인 및 유청 단백질 등 성분들의 이용 및 다양화에 관심을 갖고 있다. 이는 항균제로서 사용되고, 이미 유아식품, 요구르트, 보조식품, 특정 약제 및 치과용과 피부용 제품에 사용되고 있는 락토페린 생산에 관련된 산업의 경우를 포함한다. 또한 락토페린은 그 항균 활성이 신선한 우유의 저장기간을 연장하기 위한 첨가제로서 사용된다.

최근, 식품과 건강의 관계에 대한 소비자들의 인식이 높아짐에 따라 기능성 식품이 식품 산업에 등장하였다. 기능성 성분 중에서, 식품에 첨가되어 단순히 영양상의 역할을 넘어 그 다양성 및 다기능성에 기인한 특정 생물학적 활성을 발휘하는 성분으로서 특정된 것은 생물활성 펩티드이다. 이들 펩티드는 전구체 단백질 내에서는 불활성 단편이나, 체내 및/또는 체외 가수분해 과정에 의해 유리된 후에는 신체 내에서 여러 가지 생리학적 기능을 발휘한다. 1979년에 발견된 이후로, 항균, 혈압강하, 면역조절, 혈액응고, 오피오이드, 항산화 등 다양한 생물학적활성을 갖는 식품 단백질에서 유래된 펩티드가 개시되고 있다. 이들 펩티드는 식품 및/또는 약품에서 이용가능성이 있으며, 최근 많이 사용되는 효소 가수분해 및 미생물 발효 등의 다양한 방법으로 유리시킬 수 있다.

생물활성 펩티드 중에 특기할 만한 것은 항균 활성을 발휘하는 것이다(R.Floris, I.Recio, B.Berkhout 및 S.Visser, Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivatives thereof, Current Pharmaceutical Design, 2003, 9:1257~1275). 우유의 항균 활성은 오랫동안 연구되어 온 것으로 이는 종래에는 이 식품에 존재하는 항균 활성을 갖는 각종 단백질(면역글로불린, 락토페린, 락토페록시다제, 리소자임 등)에 기인한 것이었다. 그러나, 우유 단백질에서 유래된 펩티드의 항균 활성이 최근 입증되었다. 우유 단백질에서 유래된 항균 펩티드의 작용 기작에 대한 결정적인 연구가 지금까진 없지만, 먼저 발견되는 사실들이 이들 생물활성 서열의 일부가 미생물막에 작용하여 제거할 수 있음을 기술하고 있다(D.Chapple, D.J.Mason, C.L.Joannou, E.W.Odell, V.Grant, R.W.Evans, Structure-function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface region on human lactoferrin against Escherichia coli serotype 0111, Infection and Immunity, 1998, 66, 2434-2440). 소의 카제인 효소 가수분해물에서 얻은 항균 활성을 갖는, α_s2-카제인 등의 펩티드가 개시되어 있고(유럽특허 제1114060호, Process for producing cationic peptides from biological fluids), β-카제인 및 κ-카제인이 개시되어 있다(국제공개특허 99/26971호, Antimicrobial peptides). 동일한 가수분해 과정에 의해, 유청 단백질에서 유래된 항균성을 갖는, 락토페린 등의 펩티드가 분리 및 검출되었다(국제공개특허 2004/089986호, Antimicrobial peptide from transferrin family).

두드러지게 중요한 생물활성 펩티드의 다른 군은 선진국에서 빈도가 높은 고혈압 관련 관상동맥질환에 대해서 항고혈압 활성을 갖는 펩티드이다. 다른 기작을 통해 그 영향이 미치는 것을 배제할 수 없지만 이들 펩티드의 다수는 안지오텐신전환효소(ACE)의 억제를 통한 레닌-안지오텐신계를 조절함으로써 작용한다(T.Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8:375~381). 여러 가지 펩티드는 카제인(미국특허 제6514941호, Method of preparing a casein hydrolyzate enriched in antihypertensive peptides) 및 유청 단백질(국제공개특허 01/85984호, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals)의 효소 가수분해물에서 얻은 ACE-억제 활성(ACEla)을 갖는 것이 발견되었다. 항고혈압 활성을 갖는 펩티드의 구조-활성 관계에 대한 연구로 이 활성이 작용하는데 있어서 특정 소수성 아미노산의 기본적인 역할을 밝혀졌다(H.-S.Cheung, F.-L.Wang, M.A.Ondetti, E.F.Sabo 및 D.W, Cushman, Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme, Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence, Journal of Biological Chemistry 1980, 255:401~407). 또한 이들 아미노산 일부의 존재는 항산화 활성 작용을 위해 필수적인 것으로 간주되며, 최근 이 활성이 현저히 중요시되고 있다(H.M.Chen, K.Muramoto, F.Yamauchi, K.Fujimoto 및 K.Nokihara, Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46:49~53). 암, 알츠하이머, 백내장 또는 노화 그 자체 등 여러 가지 퇴행성 질병은 세포 성분, 지질, 단백질 또는 DNA의 산화에 관련되어 있다. 이들 질병은 생체의 산화제와 항산화계 사이의 불균형의 결과로서 발생할 수 있는데, 그 이유는 음식에서 항산화 화합물의 흡수가 이 유형의 질병의 억제에 유용할 수 있기 때문이다. 또한, 이들 항산화 화합물은 음식에 존재하여 이들 음식이 상해서 불쾌한 냄새와 맛을 내는 것에 관여하는 것으로 생각되는 지방의 산화과정을 지연시킨다. 최근의 연구는 각종의 우유 단백질과 그 유도체가 다양한 작용기작에 의한 항산화 활성을 발휘할 수 있음을 밝히고 있다. 그러므로, 펩티드는 가수분해된 카제인(K. Suetsuna, H. Ukeda 및 H. Ochi, Isolation and characterization of free radical scavening activities peptides derived from casein, Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11:128~131; 유럽특허 1188767호, Isolated antioxidant peptides from casein and methods for preparing, isolating and identifying antioxidant peptides)과 유청 단백질(B. Hernandez-Ledesma, A. Davalos, B. Bartolome 및 L. Amigo, Preparation of antioxidant enzymatic hydrolyzates from α-lactoalbumin and β-lactoglobulin, Identification of active peptides by HPLC-MS/MS, Journal of Agricultural and Food chemistry 2005, 53, 588~593)로부터 자유 라디칼을 킬레이팅할 수 있음이 개시되어 있다. 또한, 카제인은 지방 산화과정을 촉매하는 효소에 대한 억제 작용을 갖는 펩티드의 주요 공급원이 되었다(S. G. Rival, S. Fornaroli, C. G. Boeriu 및 H. J. Wichers, Caseins and casein hydrolyzates, I. Lipooxygenase inhibitory properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49:287~294).

현재까지 실시된 연구의 대부분은 소의 카제인에서 유래된 펩티드의 생물학적 활성을 주로 다루었다. 그러나, 양 및 염소 카제인 등 다른 유형의 카제인의 펩티드에 의한 생물학적 활성에 대해 간행된 기록이 거의 없다. J.A.Gomez-Ruiz, I.Recio 및 A.Pihlanto(Antimicrobial activity of ovine casein hydrolyzates, A preliminary study: Milchwissebschaft-Milk Science International 2005, 60:41~45)는 β-카제인 가수분해물에 의해 활성되는 Escherichia coli JM103의 대사활성에 대한 용량의존성 억제효과의 가능성을 기술하였다. 그러나, 이 효과에 관여하는 펩티드의 연구에서 확인된 것은 없다. 한편, 만체고 치즈 제조에 전형적인 발효 및 숙성 과정 동안 양의 카제인에서 유리된, ACE-억제 활성을 나타낸 일부 서열이 검출되었다(J.A.Gomez-Ruiz 및 I.Recio, Identification and formation of angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2004, 1054: 269:277). 이들 서열의 IC₅₀값(효소 활성을 50% 억제하는 농도)는 24.1~1275.4μM 범위이다. 이 연구에서, 가장 큰 ACE-억제 활성을 보이는 펩티드는 서열 VRYL(SEQ. ID. No. 11)의 α_s1-카제인 단편 f(205~208)의 펩티드로서, 24.1μM 의 IC₅₀값을 보이고 있다(J.A.Gomez-Ruiz 및 I.Recio, Angiotensin converting enzyme-inhibitory activity of peptides isolated from Manchego cheese, Stability under simulated gastrointestinal digestion. Int. Dairy Journal 2004, 1075~1080). 그러나, 장의 장벽(intestinal barrier)을 통과하여 체내에서 혈압강하 작용을 할 수 있는 이들 펩티드에 대한 간행된 기록이 없다. 체외 ACE-억제 작용을 보이는 다수의 펩티드가 체내 실험할 경우 그의 활성 전부 또는 일부를 잃는 경우가 있으며, 또는 체외에서 중요한 ACE-억제 효과를 전혀 보이지 않는 펩티드일지라도 소화효소의 작용으로 인해 체내에서 이 활성을 보이는 경우(M.Maeno, N.Yamamoto 및 T.Takano, Identification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316~1321)가 있음이 강조되어야 한다. 다양한 유형의 카제인에서 유리된 펩티드의 각종 생물학적 활성, 혈압강하, 항균 및/또는 항산화 활성 등을 나타내는 다기능성에 대한 간행된 연구는 없다.

가수분해에 의해 일단 유리된 음식 단백질 서열 내에 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 특정 영역이 있다. 생물활성 펩티드로서 알려진 이들 단편은 위장효소의 작용에 의해 단백질을 가수분해하는 동안 체내에서 생성되거나, 특정 효소의 작용에 의해 또는 특정 식품을 준비하는 과정에서 체외에서 생성될 수 있다. 우유 단백질의 높은 생물학적 품질은, 이들 단백질로부터 생물활성 펩티드를 얻는 것이 주요 관심으로서, 음식의 일부로서 섭취하는 경우 이들의 기본적인 영양 기능의 작용 외에 건강 유지 및 질병 예방에 유익한 대사 또는 생리적 작용을 할 수 있다. 우유 단백질에서 생물활성 펩티드의 제조는 종래의 영양가치 이상으로 약품 및 영양보조식품을 포함한, 이 식품의 새로운 용도 발견을 가능하게 했다. 이는 건강에 좋고, 안전한 고품질의 식품의 개발을 가능하게 하고, 유제품이 제공하는 것과 가치가 더 높아진 것들을 가장 잘 활용할 수 있게 한다.

본 발명은 카제인 단편의 효소 가수분해에 의해 항균 활성, 체외 ACE-억제 활성, 항고혈압 활성 및/또는 항산화활성을 갖는 생물활성 펩티드를 포함하는 우유 단백질에서 유래된 제품 제조로 구성된다.

생물활성 펩티드는 단백질 가수분해 효소(바람직하게는 펩신 및 어디서든 구입할 수 있는 Corolase PP^®)에 의한 상기 생물활성 펩티드의 아미노산 서열과 그 유리에 적합한 곳에서 단백질 사슬 절단이 가능한 가수분해 조건을 갖는 1종 이상의 단백질, 펩티드 또는 동일한 단편들의 가수분해로 생성된다. 위장소화를 자극하는 효소들을 사용하는 경우에 있어서, 위장 내에 흡수되어 혈류가 될 수 있는 최소 기능성 펩티드 단위를 얻을 수 있다. 이러한 특성은 이들 펩티드를 경구 투여 외의 다른 투여 형태의 용도를 가능하게 하거나, 또는 그 흡수율을 증가시킨다. 또한 펩티드는 화학적 합성 또는 재조합법 등에 의해서도 생산될 수 있다. 이들 펩티드는 원료 가수분해물, 저분자량 농축물, 또는 크기를 기초로 한 분리법 또는 크로마토그래피법에 의해 얻은 다른 활성 아분획물(subfractions) 등으로서 흡수될 수 있다.

이들 가수분해물, 이들의 분획물 또는 펩티드는 식품 보존제로서 작용하는 식료품의 일부를 형성할 수 있고, 섭취시에는 신체의 자연적인 방어력을 강화시키는 것 이외에 질병 치료용 약품 제조에 사용될 수 있고, 특히 혈압 조절 및/또는 박테리아 감염의 제어를 촉진할 수 있다. 본 발명은 우유 단백질이 제공할 수 있는 최상의 용도를 만들어 그 가치를 더욱 높임으로써 우유 단백질의 용도를 확장한다.

본 발명은 우유 카제인에서 생물활성 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 이들 생물활성 펩티드는 SEQ.ID. No. 1, SEQ.ID. No. 2, SEQ.ID. No. 3, SEQ.ID. No. 4, SEQ.ID. No. 5, SEQ.ID. No. 6, SEQ.ID. No. 7, SEQ.ID. No. 8, SEQ.ID. No. 9, SEQ.ID. No. 10, SEQ.ID. No. 12, SEQ.ID. No. 13, SEQ.ID. No. 14, SEQ.ID. No. 15, SEQ.ID. No. 16, SEQ.ID. No. 17(표 1)로 나타낸 아미노산 서열로 검출되고, 이들 중 일부는 항균 활성, 체외 ACE-억제 활성, 항고혈압 및/또는 항산화 활성을 나타낸다.

본 발명의 출발물질은 동물, 식물 또는 미생물에서 유래된 1종 이상의 단백질 또는 펩티드로서, 목적한 생물활성 펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것으로 구성된 적절한 기질이면 된다. α_s2-카제인 서열에 속하는 것들(SEQ.ID. No. 1, SEQ.ID. No. 2, SEQ.ID. No. 3, SEQ.ID. No. 4, SEQ.ID. No. 5, SEQ.ID. No. 6, SEQ.ID. No. 7, SEQ.ID. No. 8, SEQ.ID. No. 9, SEQ.ID. No. 10, 표 1)은 각종 형태의 α_s2-카제인, 그 분획물, 펩티드 또는 모든 크기의 그 단편들을 포함하는 조제품이 사용될 수 있으며, 단독으로 또는 다른 단백질과 병합하여 사용될 수 있다. α_s1-카제인에 속하는 것들(SEQ.ID. No. 12, SEQ.ID. No. 13)은 각종 형태의 α_s1-카제인, 그 분획물, 펩티드 또는 소정 크기의 그 단편들을 포함하는 조제품이 사용될 수 있으며, 단독으로 또는 다른 단백질과 병합하여 사용될 수 있다. β-카제인에 속하는 것들(SEQ.ID. No. 14, SEQ.ID. No. 16 및 SEQ.ID. No. 17)은 각종 형태의 β-카제인, 그 분획물, 펩티드 또는 소정 크기의 그 단편들을 포함하는 조제품이 사용될 수 있으며, 단독으로 또는 다른 단백질과 병합하여 사용될 수 있다. 따라서, 목적한 펩티드 또는 펩티드들에 따라서, 그 존재 형태가 다른 발효 유제품, 우유 단백질 가수분해물, 우유 부산물, 동물 사료용 우유 파생물 등에서 순수 α_s1-카제인, 순수 α_s2-카제인, 순수 β-카제인, 전체 카제인, 카제인염 및 우유를 사용할 수 있다.

상기 출발물질은 단백질 가수분해효소 작용에 적정한 pH에서 적절한 농도로 물이나 완충 용액에 용해되거나 분산된다. 출발물질에 존재하는 단백질을 분해하여 목적한 펩티드를 제공할 수 있는 단백질 분해효소는 어느 것이라도 사용될 수 있으나, pH 2.0~3.0의 펩신이 바람직하다. 또한 기질의 발효를 실시하여 단백질 가수분해를 할 수 있는 단백질 가수분해성 미생물을 사용할 수 있다.

pH, 온도, 효소-기질비, 반응 중단 등 가수분해 조건은 가장 활성적인 가수분해물 선택을 위해 최적화된다. 특정의 일실시형태에서, 효소-기질비 3.7/100(p/p)에서 pH 3.0의 펩신을 사용하여 10분~24시간에 걸쳐, 바람직하게는 30분 이하동안 37℃에서 가수분해를 실시하여 생물활성 펩티드를 생산하였다.

SEQ.ID. No. 15, SEQ.ID. No. 17(표 1)로서 검출된 생물활성 펩티드는 그 구조와 위장 효소에 대한 내성으로 인해 체외 ACE-억제 활성 및/또는 항고혈압 활성을 가지며, 위장에서 소화된 후 위장에 흡수되어 혈류가 되는 상태가 될 수 있는 최소 기능성 펩티드 단위가 된다. 출발물질은 목적한 생물활성 펩티드의 아미노산 서열(SEQ.ID. No. 15, SEQ.ID. No. 17, (표 1))을 포함하는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 1종 이상의 단백질 또는 펩티드를 포함하는 적절한 기질이면 모두 가능하지만, 바람직하게는 α_s2-카제인 및 β-카제인이다. 각종 α_s2-카제인 또는 β-카제인, 또는 펩티드 또는 모든 크기의 그 단편을 포함하는 어떠한 조제품이라도 사용될 수 있으며, 단독으로 또는 다른 단백질과 병합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 그 존재 형태가 다른 발효된 유제품, 우유 단백질 가수 분해물, 우유 부산물, 동물 사료용 우유 파생물 등에서 순수 α_s1-카제인, 순수 α_s2-카제인, 순수 β-카제인, 전체 카제인, 카제인염 및 우유이다.

pH, 온도, 효소-기질비, 반응 중단 등 가수분해 조건은 가장 활성적인 가수분해물의 선택을 위해 최적화된다. 특정의 일실시형태에서, 이는 Corolase PP^®으로 pH 7~8, 효소-기질비가 1:25p/p로 37℃에서 약 2.5시간 동안 펩신 가수분해 카제인의 가수분해 또는 3000Da 미만의 그 분획물의 가수분해, 또는 (PVYRYL SEQ.ID. No. 7, HLPLPLL SEQ.ID. No. 14)을 포함하는 합성 펩티드의 가수분해에 의해 달성될 수 있다. 반응은 수조에서 10분 동안 95℃로 가열하여 중단된다. Corolase PP^®는 트립신 및 케모트립신 외에 카르복시펩티다아제의 아미노산을 포함하는 단백질 가수분해성 돼지 췌장 효소의 조제품이다.

다음으로 생물활성 펩티드를 농축하고자 할 경우, 항균 활성을 갖는 펩티드가 자연상태에서 양이온성이라면, 생물활성 펩티드를 포함하는 분획물의 분리는 양이온 교환 크로마토그래피(FPLC)에 의해 실시될 수 있다. 더욱 고도의 양이온성 분획물로부터 활성 아분획물을 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 등으로 더 스캔하거나, 또는 바람직하게는 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분리할 수 있다. 또는, 생물활성 펩티드는 한외여과, 투석, 적절한 막공을 갖는 전기투석, 겔필터 크로마토그래피 등의 방법에 의해 가수분해물로부터 응축할 수 있다.

완료된 가수분해물 및 그 분획물 외에, SEQ.ID. No. 1, SEQ.ID. No. 2, SEQ.ID. No. 3, SEQ.ID. No. 4, SEQ.ID. No. 5, SEQ.ID. No. 6, SEQ.ID. No. 7, SEQ.ID. No. 8, SEQ.ID. No. 9, SEQ.ID. No. 10, SEQ.ID. No. 12, SEQ.ID. No. 13, SEQ.ID. No. 14로 표시된 표 1에 나타낸 펩티드는 생물활성 특성, 주로 항균 활성, ACE-억제 활성, 항고혈압 활성 및/또는 항산화 활성을 나타내며, 또한 본 발명의 목적이다. 구체적으로, 서열 SEQ.ID. No. 1, SEQ.ID. No. 2, SEQ.ID. No. 3, SEQ.ID. No. 4, SEQ.ID. No. 5, SEQ.ID. No. 6, SEQ.ID. No. 7, SEQ.ID. No. 8, SEQ.ID. No. 9, SEQ.ID. No. 10으로서 식별된 펩티드는 항균 활성을 갖는 그램 양성 박테리아를 나타내며, 또한 적어도 SEQ.ID. No. 3은 Escherichia coli에 대한 잠재적 항균 활성을 발휘한다. 또한, 서열 SEQ.ID. No. 1 및 SEQ.ID. No. 7로서 식별된 펩티드는 잠재적 체외 ACE-억제 활성을 나타내고, 서열 SEQ.ID. No. 7은 이들 동물에 구강투여할 때 자연발생적인 고혈압 래트(SHR)에서 항고혈압 활성을 나타낸다. 이와 별도로, 적어도 SEQ.ID. No. 7로서 식별된 펩티드는 산소 라디칼 킬레이팅 메카니즘을 통해 상당한 항산화 활성을 갖는다. 또한, 동일하게 보정서에 있어서 β-카제인 유래의 식별된 펩티드도 높은 ACE-억제 활성을 나타낸다. 펩신-가수분해 카제인 및 Corolase PP^® 외에 표 1에 나타내고 SEQ.ID. No. 15 및 SEQ.ID. No. 17로 표시되는 펩티드는 자연발생적인 고혈압 래트(SHR)에서 항고혈압 활성을 가지며, 또한 본 발명의 목적이다. 광범위하게 소비되는 생성물에서 얻은 이들 천연 펩티드는 거의 부작용이 없고 양호한 내성을 기대할 수 있는 사실이 특별히 언급되어야 한다.

동일하게, 펩신 가수분해물에서 식별된 생물활성 펩티드(SEQ.ID. No. 1, SEQ.ID. No. 2, SEQ.ID. No. 3, SEQ.ID. No. 4, SEQ.ID. No. 5, SEQ.ID. No. 6, SEQ.ID. No. 7, SEQ.ID. No. 8, SEQ.ID. No. 9, SEQ.ID. No. 10, SEQ.ID. No. 12, SEQ.ID. No. 13, SEQ.ID. No. 14)와 (SEQ.ID. No. 15, SEQ.ID. No. 16, SEQ.ID. No. 17)은 Corolase PP^®에 의해 부가적으로 그 공지된 서열에 대해서 현재 사용할 수 있는 기술로 이들을 화학 및/또는 효소 펩티드 합성 또는 재조합법에 의해 얻을 수 있다.

식별된 생리활성 펩티드의 서열

LKKISQ SEQ. ID. No. 1
VDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. No. 2
LKKISQYYQKFAWPQYL SEQ. ID. No. 3
LKKISQYYQKFAWPQY SEQ. ID. No. 4
TVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. No. 5
LKTVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. No. 6
PYVRYL SEQ. ID. No. 7
KTVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID.No. 8
LKKISQYYQKFAWPQYLKT SEQ. ID.No. 9
YQKFAWPQYLKTVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. No. 10
RYLGY SEQ. ID. No. 12
AYFYPEL SEQ. ID. No. 13
HLPLPLL SEQ. ID. No. 14
PYV SEQ. ID. No. 15
HLPLPL SEQ. ID. No. 16
HLPLP SEQ. ID. No. 17

종래에 펩신 가수분해된 양의α_s2-카제인으로부터 생리활성 펩티드의 제조는 기재되어 있지 않지만, 보빈 유래 단백질로부터 유래된 항균제 펩티드는 실제로 공지되어 있다(EP 1114060, Process for producing cationic peptides from biological fluids). 종래에 만체고 치즈내에 억제 활성을 갖는 다른 양의 카제인과 α_s2-카제인으로부터 유래된 일부 펩티드도 검토되었지만(J. A. Gomez-Ruiz, M. Ramos and I. Recio, Identification and formation of angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2004, 1054: 269:277), 생체내의 항고혈압 활성에 대한 검토는 행해지지 않았다. 종래에 검토된 ACE 억제 활성을 갖는 펩티드 중 하나는 VRYL 서열 (SEQ. ID.No. 11)(IC₅₀ 24.1 μM)의 양의 α_s2 카제인의 205-208 단편이다. 그러나, 본 발명의 SEQ. ID. No. 7 서열, PYVRYL (IC₅₀ 1.94)는 종래에 기재된 것보다 12배 이상의 ACE 억제 활성을 갖고, 상당한 항고혈압 활성 및/또는 항산화 활성 및/또는 항균 활성을 발휘하기 위해 본 발명에서 발견된 전체 서열의 필요성을 설명한다. SEQ. ID. No. 7 전체 서열도 항승압 작용 및/또는 항산화 활성 및/또는 항균 활성을 발휘하기 위해서 필요로 된다. 또한, 본 발명의 SEQ. ID. No. 7 서열의 위장 시뮬레이션을 행하여, 최소의 활성 단편은 PYV SEQ. ID. No. 15 서열의 것을 나타낸다.

한편, 이 방법에 의해 사용하는 효소 제제 및 위장 소화를 시뮬레이션하는 조건을 사용함으로써 생리활성 펩티드(SEQ. ID. No. 15, SEQ. ID. No. 16, SEQ. ID. No. 17, 표 1) 를 얻을 수 있다. 따라서, 얻어진 단편은 가수분해의 최종물일 가능성이 있고, 위장관에 흡수될 수 있고 항고혈압 활성에 대한 직접적인 원인이 될 수 있다. 그러나, 플라스마 펩티다아제에 의해 한층 더한 가수분해를 제외할 수 없다. 활성적인 작은 단편의 제조는, 이들 단편이 다른 경로에 의해 투여하는 것이 더 용이하고, 경구로 투여할 때 빠르게 작용하기 때문에 바람직하다.

이들 유제품: 전체 우유, 우유 단편, 카제인, 카제인염 등이 저렴하고, 항균 작용 및/또는 ACE-억제 활성 및/또는 항고혈압 활성 및/또는 항산화 활성을 갖는 치료제로서 사용될 수 있는 생리활성 펩티드를 제조하는데 간단하게 이용할 수 있는 기질이다. 이들 유제품은 기능성 식품, 첨가제 또는 식품첨가제, 또는 주로 인간이지만 동물에도 모든 형태의 감염 및/또는 동맥성 고혈합의 치료 및 예방용 약품으로서 사용되기 위하여 열처리, 예를 들면 저온살균을 행할 수 있거나, 또한 건조 또는 동결건조 등을 할 수 있다. 가수분해물, 저분자 중량 분획물, 펩티드, 그 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염 및 그 조합의 양, 또한 임의의 질병을 치료하기 위한 그 투약량은 수많은 요인, 예를 들면 나이, 질병 또는 질환의 중대함, 투여경로 및 1회분의 빈도수에 따라 다르다. 이들 화합물은 임의의 투여 형태, 고체 또는 액체일 수 있고, 임의의 적당한 경로, 경구, 호흡기, 직장 또는 국소적으로 투여할 수 있지만, 특히 고체 또는 액체 형태로 경구 투약하기 위해 제조된다.

일반적으로, 이들 제품: 완전한 가수분해물, 그 분획물 및 그 구성 펩티드를 제조하기 위한 방법은 가능한 최대량의 생리활성 펩티드의 제조에 초점을 맞추거나 견딜 수 있는 정도로 쓴맛 조절하기 위해, 일반적으로 고농도의 중간의 또는 저분자의 소수성 펩티드를 생성함으로써 최적할 수 있다.

분석적 방법

항균 활성의 측정

항균 활성의 측정은 미생물로서 Escherichia coli [American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA] ATCC 25922, Listeria innocua [Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) Valencia, Spain] CECT 910T, Staphylococcus epidermidis CECT 231, Enterococcus faecalis CECT 795, Serratia marcescens CECT 854 및 Staphylococcus carnosus CECT 4491T을 사용하는 A. Pellegrini, C. Deltting, U. Thomas, P. Hunziker 의 방법(Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1526:131-140)에 따라서 측정된다.

균현탁액을 Escherichia coli, Serratia marcescens 및 포도상 구균속의 균주용 Tryptose Soy Broth(TSB), 또는 Enterococcus faecalis 및 Listeria innocua의 Brain-heart infusion(BHI)에 1%에 접종한다. 배양은 Serratia marcescens의 경우에만 30℃인 것을 제외하고 37℃에서 행한다.

접종을 시작한 세균 접종원은 37℃ 또는 30℃에서 TSB 또는 BHI 10ml에 TSB-Agar 또는 BHI-Agar에서 성장한 콜로니를 1일밤 배양한 후 얻어진다. 균현탁액(1ml)를 상응하는 배지에서 1/50 희석하고 개체군밀도 1-4x10⁸콜로니 형성 유닛(CFU)/mL를 달성할 때까지 각 균주에 대해 적당한 온도에서 배양한다. 배양액은 2000 x g 에서 10분간 원심분리하고 침전된 세균을 인산 완충액(pH 7.4) 15ml로 2회 세정하고 개체군을 10⁶ CFU/mL로 조절한다. 무균 다층판(Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Germany) 상에 균현탁액 50μL, 시험할 기질 50μL 및 인산 완충액 100μL를 각 경우에 적당한 배지의 2%에서 혼합하고, 혼합물을 37℃ 또는 30℃에서 2시간 동안 배양한다. 이후에, 혼합물을 10^-5까지 희석하고, 각 희석액 100μL를 TSB-Agar 또는 BHI-Agar판에 첨가하고 24시간 동안 배양한 후 콜로니 수를 센다.

하기 식은 항균 활성을 계산하는데 사용한다.

,

여기서 N₀ 는 CFU의 처음의 수/mL

N_f는 CFU의 최종의 수/mL

안지오텐신 전환 효소 억제 활성의 측정(ACEla)

ACE-억제 활성은 D. W. Cushman 및 H. S. Cheung의 방법(Spectrophotometric assay and properties of angiotensin-converting enzyme in rabbit lung. Biochemical Pharmacology, 1971, 20:1637-1648)에 의해 체외에서 측정되고, Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu., B. Lonnerdal 및 B. H. Chung에 의해 후변성된다 (Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human α_s1- casein expressed in Escherichia coli. Journal of Dairy Research 1999, 66, 431-439).

기질, 히푸릴 히스티딜 류신(HHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA)을, 0.3M NaCl, pH 8.3을 갖는 0.1M 보레이트 버퍼에 용해하여 최종농도 5mM을 얻는다. ACE-억제 활성을 분석할 각 샘플 40μL를 기질 100μL에 첨가한다. ACE 효소(CE 3.4.5.1, Sigma)를 첨가하고 50% 글리세롤에 용해하고 시험을 행할 때에재증류수 1/10중에서 희석한다. 반응은 수욕조에서 37℃에서 30분간 행한다. 효소는 1N HCl 150μL로 pH를 저감시킴으로써 비활성화된다. 형성된 히푸르산을 에틸 아세테이트 1000μL로 추출한다. 볼텍스에서 20초간 교반한 후, 3000×g에서 대기온도에서 10분간 원심분리한다. 95℃에서 10분간 증발된 유기상에서 750μL를 취한다. 히푸르산 잔류물은 재증류수 800μL에서 재용해되고, 20초간 교반한 후에, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, USA 제품인 Dur-70 분광기에서 228nm에서 흡광도 를 측정한다.

하기 식은 ACE 억제 활성의 백분율을 계산하는데 사용한다.

블랭크는 백그라운드 흡광도를 수정하는데 사용한다. 이 블랭크는 기질, 효소 및 샘플 대신에 재차 증류된 물 20μL를 함유하고, 0일때에 반응을 중지한다. 대조군은 저해제가 없을 때 기질상에 100%의 효소작용을 일으키고 샘플 대신에 물 20μL를 함유하고 샘플과 동일한 시간 동안 배양한다.

결과는 IC₅₀(μM), 또는 효소 활성을 50%로 억제하는 농도로 표시한다. 단백질 농도는 보빈 세로알부민을 패턴으로 사용하는 비신코닌산 시험((Pierce, Rockord, IL, USA)에 의해 측정한다.

항산화 활성의 측정

산소 라디칼 흡수 용량(ORAC)은 B. X. Ou, M. Hampsch-Woodill, RL. Prior에 의해 개발된 방법에 의해 측정된다(Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe 2001, 49:4619-4626). 이 방법은 λ_exo=493nm 및 λ_cm=515nm에서 2,2'-아조-비스 2-아미디노프로판 디하이드로클로라이드의 열적파괴에 의한 인사이투(in situ)에 제조된 퍼옥실 라디칼에 의해 플루오레세인의 산화를 토대로 한다. 항산화제의 존재에 의해 플루오레세인의 파괴를 방해하거나 저지시킨다.

플루오레세인 희석 표준용액은 보통 인산 완충액(pH 7.5) 75nM에 플루오레세인 모용액 100μM로부터 60nM의 농도로 조제한다. 항산화제 대조군으로서, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스(트롤록스))을 사용하여, 인산 완충액 중에서 20nM 농도(모 용액)로 조제하고 -20℃에서 저장한다. 트롤록스 검량곡선은 모용액으로부터 조제된 12.5, 25, 40, 50 및 100μM 농도의 패턴 용액의 분석에 의해 플롯팅한다. AAPH는 인산 완충액에 최종농도 143mM로 용해하고 저온에서 유지하여 파괴를 방지한다.

분석을 실시하기 위해, 샘플 375μL를 AAPH 375μL 및 플루오레세인 2.225mL과 혼합하고, 이 혼합물을 37℃에서 배양한다. 5분 마다, RF-1501 형광광도계(Shimadzu사)로 형광을 측정한다(λ_exo=493nm 및 λ_cm=515nm). 실험중 형광의 안정성을 확보하기 위해 확인하는 플루오레세인 및 인산 완충액를 함유하는 블랭크, 플루오레세인, AAPH 및 인산 완충액를 함유하는 포지티브 최대 산화 대조군으로 이루어진 분석에 대해 대조를 행한다. 최대 항산화 활성의 대조군으로서, 트롤록스용액 40μM이 분석될 각 샘플에 포함된다. 모든 샘플을 3회 분석했다.

항산화 활성은 곡면 아래의 플루오레세인 형광의 "곡면하 면적"(AUC)의 측정에 의해 정량화되고, 트롤록스 당량(ORAC 값)으로 주어진다. AUC는 하기 식을 사용하여 계산된다.

AUC = (0.5 + f₅/f₀ + f₁₀/f_o + f₁₅/f₀ + … + f₃₀/f₀)

여기서, f₀는 시간이 0일때 형광이고, f_i는 시간이 "i"일 때 형광이다

펩티드의 상대적 ORAC값은 하기 식을 사용하여 측정한다.

ORAC = [(AUC_샘플 - AUC_블랭크)/(AUC_트롤록스- AUC_블랭크)] × [(트롤록스 몰농도/ 샘플 몰농도)]

이온 교환 크로마토그래피(FPLC)에 의한 펩티드 분획물의 분리

양이온형 펩티드 분획물의 분리는 I. Recio, S. Visser방법(Identification of two distinct antibacterial domains within the sequence of bovine α_s2-casein. Biochimica et Biophysica Acta 1999,1428:314-326)에 의해 HiLoad™ 26/10 SP Sepharose Fast Flow 양이온 교환 컬럼(Pharmacia, Uppsala,Sweden)을 사용하여 FPLC 시스템에서 일부 변경시켜서 실시된다. A와 B상은 각각 NH₄HCO₃ 10 mM (HCOOH로 pH 7.0으로 조절) 및 NH₃ 1.5 M 으로 이루어진다. 샘플을 5mg/mL의 농도로 조제된 A상에 용해하고, 체적 5mL을 50mL의 Superloop™(Pharmacia)으로 주입한다. 가수분해물을 5mL/분으로 용리한다. A의 용제 100%로 20분간 적용한 후, A중에 B의 용제가 0~50%의 구배를 60분간 적용한 후 B의 용제 50%로 20분간 적용했다. 흡광도 214nm에서 검출을 실시한다. 컬럼 및 유동상의 온도는 9℃이다. 하기의 여러가지 크로마토그래피 분석으로 분애물을 수집한다.

반 준비량에 대해서 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RF-HPLC)로 펩티드 분획물 분리

2개의 프로그램 펌프 모델 Waters Delta 600, Mod. 966 다이오드 어레이 검출기, Mod. 717 플러스 자동 분사기, 및 자동 분획물 수집기(Waters Corp., Mildford, MA, USA)로 이루어진 시스템이 사용된다. 컬럼 가드로서 C₁₈ 카트리지(Waters)를 사용하는, 기공크기 6㎛이고 7.8 x 300 mm인 C₁₈ Prep NovaPack® HR 컬럼(Waters)이 사용된다. 30℃에서 분석을 행하고 214nm 및 280 nm에서 검출된다. 데이타 수집은 Millennium Software version 3.2 (Waters)에 의해 행해진다. α_s2-카제인 샘플은 2.5 mg/mL의 농도로 조제되고, 주입전에 16 000 x g 에서 10분간 원심분리한다. 샘플을 용리하기 위해, 트리플루오로아세트산을 0.1% 및 0.08%를 갖는 2성분의 MilliQ® 물 구배(A상) 및 아세토니트릴(B상) 각각이 4mL/분의 유량으로 사용된다. B상 구배는 50분후에 0~40%이고 5분간 40~70%이고, 컬럼을 B의 70%로 5분간 세정하고 컬럼을 25분간 초기조건으로 재설정한다. 주입된 샘플의 체적은 300μL이다. 총 카제인 샘플을 100mg/mL의 농도로 조제하고, 주입전에 기공크기 0.45㎛로 여과한다. 샘플을 용리하기 위해, 트리플루오로아세트산 0.1% 및 0.08%를 갖는 2성분의 MilliQ? 물 구배(A상) 및 아세토니트릴(B상)이 4mL/분의 유량으로 사용된다. B상 구배는 70분후에 0%~35%이고 5분간 35~70%이고, 컬럼을 B의 70%로 5분간 세정하고 20분 동안 초기조건으로 컬럼을 재설정한다. 주입된 샘플의 체적은 50μL이다.

탄뎀 질량분석기로 분석(오프라인)

Esquire 3000 이온 트랩 시스템(Bruker Daltonik GmbH,Bremen, Germany)이 사용된다. 샘플은 물 50%(v/v):0.01% 포름산을 갖는 아세토니트릴 용액(v/v)에 2mg/mL의 농도로 조제된다. 샘플은 모델 22 시린지 펌프(Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA)를 사용하여 4μL/분의 유량으로 전기분무 네뷸라이저(electrospray-nebulizer)에 주입한다. 이 시스템은 분무 및 건조가스로서 질소를 사용하고 헬륨압력 5 x 10^~3 bar에서 작동한다. 질량 스펙트럼은 13000Da/초의 속도로 100-2000 m/z의 간격으로 얻어진다. 펩티드 서열을 동정하기 위한 탄뎀 질량 스펙트럼의 해석은 Biotools 2.1 프로그램(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)으로 행해진다.

탄뎀 질량 분석기에 온라인으로 연결된 RP-HPLC(RP-HPLC-MS/MS)에 의한 분석

Esquire-LC 시스템((Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Germany)이 사용된다. HPLC(시리즈 1100) 시스템은 정량펌프, 자동 주입기, 용리제 탈기제 시스템 및 Esquire 3000 이온 트랩 질량 분석기(Bruker Daltonik)에 온라인으로 연결된 가변 파장 자외선 검출기(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)로 이루어진다. 컬럼은 Hi-Pore C18 컬럼(250×4.6 mm, 즉 5㎛의 입자크기)(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)이다. 용제 A는 물과 트리플루오로아세트산(1000:0.37)의 혼합물이고, 용제 B는 아세토니트릴과 트리플루오로아세트산(1000:0.27)의 혼합물이다. 4.5mg/ml의 농도로 조제된 샘플 50μL를 주입한다. 60분후에 A중에 용제 B의 0~50%의 직선 구배로서 0.8ml/분의 유량이 사용된다. 용리액은 네뷸라이저를 통해 샘플을 주입 유량을 275μL/분로 하는 것을 제외하고는 상기 선행하는 부분에서 진술한 것과 동일한 조건하에서 214nm에서 질량분석기로 조정한다.

자연발생 고혈압 래트의 항고혈압 활성의 연구(SHR)

자연발생 고혈압 래트(SHR)의 혈압에 대한 식별된 펩티드의 각종 효과가 연구된다. 이 연구에서 이 펩티드는 화학적으로 합성된다.

이 연구는 Charles River Laboratories Espana S.A.에서 300~350g의 무게의 17주~20주의 수컷 SHR 래트로 행한다. 이 래트는 케이지에, 케이지 당 5마리 유지하고, 25℃에서 안정한 온도를 유지하고, 12시간 낮밤 사이클로, 물과 식량을 멈추지않고 섭취한다. 최고 혈압(SBP)와 최저 혈압(DBP)를 측정하고, 이 목적을 위해 테일 커프법을 사용한다((RD. Bunag, Validation in awake rats of a tail-cuff method for measuring systolic pressure, J. Appl. Physiol. , 1973, 34: 279-282). 사용된 장치(Le5001, Letica)는 디지털 SBP 및 DBP 값을 자동적으로 제공한다. 이 장치는 기록하고 동물의 심장 주파수를 촉진한다. 래트의 꼬리의 부분에 테일 커프 및 트랜듀서 하기전에 꼬리 동맥의 확장을 촉진하도록 래트를 37℃ 근방의 온도에 노출시킨다. 또한, 측정의 신뢰성을 보장하기 위해, 문제의 시험을 행하기 전에 동물을 2주 동안 절차에 익숙하게 한다. SBP 및 DBP 값은 3개의 연속적인 측정값을 취하고 이들 2개의 변수의 각각에 대해 3개의 값의 평균을 계산함으로써 측정한다.

이 연구에 사용된 자연발생 고혈압 래트(SHR)의 SBP값은 190mmHg~220mmHg의 범위의 값이고, DBP값은 130mmHg~180mmHg의 범위의 값이다.

시험될 제품은 9a.m.~10a.m의 단시간내에 위내의 카테터에 의해 투여되고 증류수 1ml에 용해한 시험 1회분을 투여한다. 투여전에 SBP 및 DBP를 읽고, 투여후 8시간 까지 투여후 2시간 마다 이들 변수를 주기적으로 측정한다. 또한, 문제의 제품을 투여후 24시간 후에 SBP 및 DBP를 측정한다. 네거티브 대조군(특성화된 래트에 SBP 및 DBP의 일내변동을 설립하기 위해)로서, 물 1ml를 위내의 카테터에 의해 투여된 래트와 유사한 시험을 행하는 SBP 및 DBP가 사용된다. 포지티브 대조군으로서, 카프토프릴(원형 ACE-억제 약물) 50mg/kg을 투여한 래트와 유사한 시험에서 측정한 SBP 및 DBP를 사용한다. 증류수 1ml에 용해된 카프토프릴 1회분을 각각의 래트에 투여한다.

결과를 그룹화하고, 6회 동질의 시험의 최소 측정 표준오차(SEM)의 ±평균을 계산한다. 이것을 비교하기 위해, 일원 분산 분석을 사용한 후 본페로니(Bonferroni) 검정을 행한다. p<0.05의 값의 차는 상당한 것으로 고려된다.

도 1은 30분 동안 펩신 가수분해된 양의 α_s2-카제인의 양이온 교환 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 얻은 크로마토그램으로, 5개의 분획물(FA-FE)를 선택하여 수동으로 수집하였다. 분단위로 주어진 시간을 X축에 플롯팅한다.

도 2a는 30분 동안 펩신 가수분해된 양의 α_s2-카제인으로부터 수집된 FC 분획물의 반종도의 예비량에 대한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(PR-HPLC)를 사용하여 얻은 크로마토그램이다. 수동으로 수집된 4개(4)의 아분획물(FC1-FC4)을 선택한다. 분단위로 주어진 시간을 X축 상에 플롯팅한다.

도 2b는 30분 동안 펩신-가수분해된 양의 α_s2-카제인으로부터 수집한 FD 분획물의 반정도의 예비량에 대한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 얻은 크로마토그램. 수동으로 수집된 2개(2)의 아분획물(FC1-FC2)을 선택한다. 분단위로 주어진 시간을 X축 상에 플롯팅한다.

도 3은 반정도의 예비량에 대한 RP-HPLC에 의한 FC 및 FD 분획물로부터 얻은 다른 아분획물의 향균 활성을 나타낸다.

도 4는 1㎖의 물(○), 50mg/kg 캡토프릴(□), 3mg/kg PYVRYL(▲) 및 3mg/kg LKKISQ(◆)의 위 내 유치도관에 의한 투여 후에 자연발생 고혈압 래트에서 자발적으로 발견되는 최고 혈압(SBP)의 저하 및 최소 혈압(DBP)의 저하. T(h)는 시간단위로 주어진 투여시로부터 경과된 시간의 길이를 나타낸다. 상기 데이터는 6개 동물의 최소값에 대한 ±평균 SEM을 나타낸다. ^aP<0.05 대 물; ^bP<0.05 대 캡토프릴; ^cP<0.05 대 PYVRYL.

도 5는 1㎖의 물(○), 50mg/kg 캡토프릴(□), 400mg/kg 카제인(▲), 400mg/kg 카제인 가수분해물(◆) 및 200mg/kg F<3000 Da의 카제인 가수분해물(■)의 위 내 유치도관에 의한 투여 후에 자발적 고혈압 래트에서 발견되는 최고 혈압(SBP)의 저하 및 최소 혈압(DBP)의 저하를 나타낸다. T(h)는 시간단위로 주어진 투여시로부터 경과된 시간의 길이를 나타낸다. 상기 데이터는 4개 동물의 최소값에 대한 ±평균 SEM을 나타낸다. aP<0.05 대 물; bP<0.05 대 캡토프릴; cP<0.05 대 400mg/kg 카제인.

도 6은 A는 3시간 동안 펩신-가수분해된 카제인으로부터 얻어진 3000Da의 마이너 분획물의 반정도의 예비 분석량 상에 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 얻은 크로마토그램이다. 214nm에서의 흡광도는 Y축 상에, 시간은 분단위로 X축 상에 플롯팅한다. B는 RP-HPLC에 의해 얻어진 크로마토그래피 분획물의 안지오텐신(angiotensin)-전환 효소 억제 활성(ACEla)에 해당하는 것이다. 이것의 강력한 ACE-억제 활성때문에, 자동적으로 수집된 3개의 분획물이 선택되었다(F3, F5 및 F6).

도 7은 펩신 및 Corolase PP^®로 연속 가수분해하기 전후의 합성 펩티드 PYVRYL SEQ. ID. No. 7의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용한 크로마토그램. 214nm에서의 흡광도는 Y축 상에, 시간은 분단위로 X축 상에 플롯팅한다.

도 8은 1㎖의 물(○), 50mg/kg 캡토프릴(□), 3mg/kg PYVRYL(▲) 및 2mg/kg PYV(■)의 위 내 유치도관에 의한 투여 후에 자연발생 고혈압 래트에서 자발적으로 발견되는 최고 혈압(SBP)의 저하 및 최소 혈압(DBP)의 저하를 나타낸다. T(h)는 시간단위로 주어진 투여시로부터 경과된 시간의 길이를 나타낸다. 상기 데이터는 4개 동물의 최소값에 대한 ±평균 SEM을 나타낸다. aP<0.05 대 물; bP<0.05 대 캡토프릴; cP<0.05 대 PYVRYL.

도 9는 펩신 및 Corolase PP^?로 연속 가수분해하기 전후의 합성 펩티드 HLPLPLL SEQ. ID. No. 14의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 얻은 크로마토그램이다. 214nm에서의 흡광도는 Y축 상에, 시간은 분단위로 X축 상에 플롯팅한다.

도 10은 1㎖의 물(○), 50mg/kg 캡토프릴(□), 7mg/kg HLPLP(●)의 위 내 유치도관에 의한 투여 후에 자연발생 고혈압 래트에서 발견되는 최고 혈압(SBP)의 저하 및 최소 혈압(DBP)의 저하를 나타낸다. T(h)는 시간단위로 주어진 투여시로부터 경과된 시간의 길이를 나타낸다. 상기 데이터는 4개 동물의 최소값에 대한 ±평균 SEM을 나타낸다. ^aP<0.05 대 물; ^bP<0.05 대 캡토프릴.

하기 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 이들이 그 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1. 펩신-가수분해된 양의 α _s2 -카제인으로부터 항균제, ACE-억제, 항고혈압 및 항산화 활성을 갖는 생체활성 펩티드의 제조

기질로서 H.J. Vreeman, J.A.M. van Riel(소의 카제인으로부터 α_s2-카제인의 대형 분리. Netherlands Milk and Dairy Journal, 1990, 44:43-48)의 방법을 사용하여 카제인의 잔여물의 분리 후에 얻어진 양의 α_s2-카제인을 사용하여 가수분해물을 얻었다. 효소로서 돼지 위에서 유래한 돼지 펩신(Sigma Chemical 제품, 미국 세이트루이스)(E.C. 3.4.23.1.570 U/mg 단백질)을 사용하였다. 양의 α_s2-카제인의 0.5% 수용액을 준비하였고, 1M HCl로 pH를 3.0으로 조정하였다. 펩신을 첨가하였다(효소-기질비 3.7/100, p/p). 37℃에서 30분 동안 가수분해를 행하였다. 80℃에서 15분 동안 가열한 후 1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정함으로써 펩신의 불활성화를 행하였다. 5℃에서 15분 동안 16000g으로 가수분해물을 원심분리한 후에 수집된 상청액을 FPLC(도 1)로 분석하였고, 수동으로 수집된 다음 냉동건조된 5개의 분획물(FA-FE)은 분리되었다.

대조로서 5.9×10³CFU/mL의 E. coli를 사용하여 2.5mg/mL의 농도에서 이들 5개 분획물의 항균 활성을 측정하였다. 그 결과 각각 FC 및 FD 분획물은 항균 활성을 보유하고, 미생물의 수가 2.54만큼, 0.6단계 등급 감소한 것으로 나타났다.

항균 활성을 담당하는 펩티드를 식별할 목적으로, FC 및 FD 분획물을 반정도의 예비량으로 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 도 2는 FC 분획물(도 2a) 및 FD 분획물(도 2b)의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다. 4개의 아분획물(FC1-FC4)은 FC 분획물로부터, 2개의 분획물(FD1-FD2)은 FD 분획물로부터 분리되었다. 이들 아분획물 중 각각 하나를 수집하였고, 아세토 니트릴의 증발 후에 냉동건조하였다. 이들 아분획물의 항균 활성을 E. coli(6.2×10⁶CFU/mL)에 대항하여 2.5mg/mL의 농도에서 측정하였다. 도 3은 이들 아분획물의 E. coli.에 대한 항균 활성값을 나타낸다. 모든 아분획물 중에서, 특정한 언급은 시험한 농도(6을 초과하는 log N_f/N₀)에서 살균 효과를 갖는 보다 큰 항균 활성을 나타내는 것인 FC1으로 이루어져야 한다. FC4, FD1 및 FD2 아분획물은 각각 1.24, 1.31 및 1.64단계 등급의 미생물의 감소를 위한 값을 갖는 적당한 항균 활성을 나타내었다.

FC1, FC4, FD1 및 FD2 아분획물은 상술한 방법론 이후 이온 트랩 분석기를 사용하여 질량분석법으로 분석하였다. 식별된 펩티드를 표 2에 나타낸다.

실시예 2. 항균 활성을 보유하는 펩티드의 화학적 합성

펩신-가수분해된 양으로부터 얻어진 아분획물 내에 주로 존재하는 펩티드가 30분 동안 α_s2-카제인을 화학적으로 합성하였다(SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3 및 SEQ. ID. No. 7). 이들 펩티드를 Fmoc 고체상 방법으로 합성하였고, 이들의 순도를 RP-HPLC-MS/MS로 확인하였다.

합성 펩티드의 항균 활성을 Escherichia coli, Serratia marcescens, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis 및 Listeria innocua에 대항하여 0.05mM의 농도에서 측정하였다. 활성 결과를 표 3에 나타낸다.

이들 펩티드는 Gram-포지티브 박테리아, 특히 Staphylococcus 유전자의 시험한 균주에 대항하여 고도의 항균 활성을 나타낸다. 3개의 이들 펩티드 SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2 및 SEQ. ID. No. 3는 S. carnosus에 대항하여 살균 활성을 나타내었다. 그러나, SEQ. ID. No. 3으로 식별되는 펩티드는 E. coli.에 대항하여 고도의 항균 활성을 나타낸다는 사실로 특정한 언급이 이루어질 수 있지만, Gram-네거티브 박테리아(E. coli 및 S. marcesens)는 이들 펩티드 모두의 작용에 대하여 매우 저항력이 있다.

실시예 3. ACE-억제 및 항고혈압 활성을 보유하는 펩티드의 화학적 합성

2개의 화학적으로 합성된 펩티드, 구체적으로 실시예 1에 언급된 서열 SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 7의 ACE-억제 활성을 측정하였다. IC₅₀,또는 효소 활성을 50% 억제하는데 필요한 단백질 농도로 나타낸 활성 결과를 표 4에 나타낸다. 이들 2개의 펩티드는 강력한 ACE-억제 활성을 나타낸다.

이들 펩티드(3mg/kg)를 자연발생 고혈압 래트(SHR)에 투여하기 위해서, SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 7 펩티드의 항고혈압 활성을 시험하였다. 펩티드를 증류수에 용해하여 해당량을 1㎖의 부피로 각각 래트에게 투여하였다.

도 4는 3mg/kg의 SEQ. ID. No. 1 및 SEQ. ID. No. 7 펩티드를 투여한 후에 다른 포인트에서 SBP 및 DBP가 자연발생 고혈압 래트(SHR)에서 저하된 정도를 나타낸다. SEQ. ID. No. 7 펩티드의 투여는 이들 동물 내에서 SBP 및 DBP의 현저한 저하를 유발하는 것으로 볼 수 있다. 이들 변수의 저하는 이 펩티드의 투여 후 4시간에서 피크에 도달한다. 또한 이 저하는 증명된 항고혈압 활성의 화합물인 캡토프릴의 투여에 의해 유발되는 SBP 및 DBP 저하와 유사한 오버 타임 코스를 나타낸다. 이들 결과는 서열 SEQ. ID. No. 7로 식별되는 펩티드는 급성 기준으로 구강 투여했을 때 명확하고 현저한 항고혈압 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 4. 항산화 활성을 보유하는 펩티드의 화학적 합성

실시예 1에서 언급한 SEQ. ID. No. 7 서열의 항산화 활성을 측정하였다. 퍼옥실 라디칼 킬레이팅 활성을 하기에 나타낸다:

ORAC_PYVRYL=1.82μmol 트롤록스 당량/μmol 펩티드

그러므로 이 결과는 PYVRYL(SEQ. ID. No. 7)이 1μmol 트롤록스의 활성보다 1.82배 큰 항산화 활성을 보유한다는 것을 나타낸다.

실시예 5. 펩신을 갖는 소의 카제인으로부터 ACE-억제 활성을 보유하는 생체활성 펩티드의 제조

젖소의 우유 원액으로부터 등전위 침전을 사용하여 얻어진 소의 카제인 기질을 사용하여 가수분해를 행하였다. 효소(E.C. 3.4.23.1.570 U/mg 단백질)로서 돼지의 위에서 유래한 돼지 펩신을 사용하였다(Sigma Chemical, St. Louis, USA). 0.5% 소의 카제인 수용액을 준비하였고, 1M HCl로 pH를 2.0으로 조정하였다. 펩신을 첨가하였다(효소-기질비 3.7/100, p/p). 37℃에서 3시간 동안 가수분해를 행하였다. 80℃에서 20분 동안 가열한 후 1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정함으로써 펩신을 불활성화하였다. 5℃에서 15분 동안 16000g에서 가수분해물을 원심분리한 후 수집한 상청액을 기공크기가 3000Da인 친수성막(Centripep, Amicon Inc, Beverly, MA, USA)을 통해 한외 여과하였다. 총 가수분해물 및 투과물(분자량이 3000Da 미만인 가수분해물의 분획물)의 SHR(분석 방법에서 상술한 것에 따름)에서 ACE-억제 및 항고혈압 활성을 측정하였다. 표 4는 IC₅₀, 또는 효소 활성을 50% 억제하는데 필요한 단백질 농도로 나타낸 ACE-억제 활성값, 및 Kjeldahl법으로 측정한 단백질 함유량을 나타낸다. 도 5는 카제인 가수분해물의 투여 및 분자량이 3000Da 미만인 카제인 가수분해물 분획물의 투여 후 다른 포인트에서 자연발생 고혈압 래트(SHR)에서 발견된 SBP 및 DBP의 저하를 나타낸다. 표에 나타낸 바와 같이, 카제인 가수분해물의 투여는 이들 동물에서 SBP 및 DBP의 현저한 저하를 유발한다. 분자량이 3000Da 미만인 카제인 가수분해물 분획물의 투여는 자연발생 고혈압 래트에서 카제인 가수분해물을 투여한 후 관찰되는 것과 유사한 정도로 SBP 및 DBP를 저하시킨다. 이들 변수의 저하는 이들 생성물을 투여한 후 2시간 후에 피크에 도달한다. 가수분해되지 않은 카제인의 투여는 자연발생 고혈압 래트(SHR)의 SBP를 현저히 변형시키지 않고, 이들 동물에서 이전의 화합물보다 매우 낮은 정도로 DBP를 저하시킨다. 이들 결과는 카제인 가수분해물 및 분자량이 300Da 미만인 카제인 가수분해 분획물은 급성 기준으로 구강 투여했을 때 명백한 항고혈압 효과를 갖는 것을 나타낸다.

ACE-억제 및 항고혈압 활성을 담당하는 펩티드를 식별할 목적으로, 한외 여과 후, 8개 분획물이 수집된 반정도의 예비 분석량 상에 RP-HPLC에 의해 투과물을 분리공정에서 처리하였다. 아세토 니트릴의 증발 후, 이들 크로마토그래피 분획물을 냉동건조하고 비신코닌산(bicinchoninic acid)법을 사용하여 ACE-억제 활성 및 단백질 함유량을 측정하였다. 도 6은 각각 하나의 크로마토그래피 분획물에 대한 IC₅₀로 나타낸 ACE-억제 활성값 뿐만 아니라, 얻어진 크로마토그래피 프로파일 및 분획물을 나타낸다. 도 6에서 F3, F5 및 F6으로 표시된 분획물은 보다 큰 ACE-억제 활성, 즉 낮은 IC₅₀값을 나타내는 것이다. 이들 분획물은 상술한 방법론을 사용하여 직렬 질량분석기(RP-HPLC-MS/MS)에 온라인으로 연결된 RP-HPLC로 분석하였다. 식별된 주요 펩티드를 표 6에 나타낸다.

이들 크로마토그래피 분획물에서 얻어진 주요 펩티드를 고체상 Fmoc법에 의해 화학적으로 합성하였고, 이들 순도를 RP-HPLC-MS/MS로 확인하였다. 화학적으로 합성된 펩티드, 구체적으로 서열 SEQ. ID. No. 12, SEQ. ID. No. 13 및 SEQ. ID. No. 14의 ACE-억제 활성을 측정하였다. IC₅₀로서 나타낸 내거나 또는 ACE 활성을 50% 억제하는데 필요한 단백질 농도로 나타낸 활성 결과를 표 7에 나타낸다. 식별된 3개의 주요 펩티드 중 적어도 2개는 강력한 ACE-억제 활성을 나타내었다.

분획물 중에 확인된 합성 펩티드의 ACE-억제 활성

서열 번호 아미노산 IC₅₀

SEQ. ID. No. 12 RYLGY Ld
SEQ. ID. No. 13 AYFYPEL 7.5
SEQ. ID. No. 14 HLPLPLL 34.2

실시예 6: α _s2 -카제인 PYVRYL SEQ. ID. No. 7의 가수분해에 의해 얻어진 분획물의 위장 소화를 시뮬레이션한 후의 펩티드의 ACE-억제 및 항고혈압 활성

α_s2-카제인 가수화물 중에서 사전에 식별된 PYVRYL SEQ. ID. No. 7는 화학적으로 합성하여 위장 소화를 시뮬레이팅하는 2단계 가수분해 공정을 통해 얻어진다(Alting, A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under siumulated gastrointestinal conditions of infants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). 이러한 목적을 위해서, 합성 펩티드 수용액(10mg/ml)을 우선 pH 2.0, 37℃에서 90분간 펩신(E.C. 3.4.4.1, 570U/mg 단백질)(Sigma사)(효소-기질 비율, 1:50, p/p)으로, 그 다음 pH 7~8, 37℃에서 2.5시간 Corolase PP^®(효소-기질 비율 1:25, p/p)(Rohm, Darmstadt 제품. 독일)을 사용하여 가수분해한다. 이 반응은 수조에서 95℃에서 10분간 가열함으로써 중단하였다.

도 7에는 펩신과 Corolase PP^®을 사용하여 배양한 후에 PYVRYL SEQ. ID. No. 7이 완전시 가수분해된 것이 나타나 있다. RP-HPLC-MS/MS에 의해 확인된 얻어진 주 분획물은 트리펩티드 PYV SEQ. ID. No. 15이다. 이 펩티드는 화학적으로 합성되었고, 측정된 그 ACE-억제 활성, 즉 741.3μM의 IC₅₀값은 처음 펩티드보다 370배 적은 ACE-억제 활성이 얻어졌다. 이 트리펩티드 PYV SEQ. ID. No. 15의 항고혈압 활성은 SHR에 투여하여 결정하였다. 이 펩티드를 증류수에 용해시키고, 그 상응하는 1회분을 각각의 래트에 1mL의 용량으로 투여하였다. 도 8은 이어지는 1회분 2mg/kg의 PYV SEQ. ID. No. 15 및 1회분 5mg/kg의 PYCVRYL 펩티드 SEQ. ID. No. 7의 투여 시에 다른 점에 있어서 SHR 래트에서 발견된 SBP 및 DBP의 저하를 나타내는 것으로, 이들 펩티드 모두의 투여에 의해서 이들 동물의 SBP 및 DBP가 현저하게 저하하였다. PYV SEQ. ID. No. 15의 SBP에 대한 피크 효과는 그 투여후 2시간후에 나타났고, PYVRYL 펩티드 SEQ. ID. No. 7의 피크 효과는 그 투여후 4시간 까지 나타나지 않았다. SEQ. ID. No. 15의 경우에는 항고혈압 효과가 더욱 빠르게 나타나는 것은, 이 서열이 투여되면 생체 내에서 야기되어 발생되어야만 하는 효소 소화처리가 방지된다는 사실에 의한 것이다. 이들 결과로부터, SEQ. ID. No. 15의 항고혈압 활성이 입증되지만, 원리적으로는 이것이 그 ACE-억제 활성에 기인할 수 없다. PYV 펩티드 SEQ. ID. No. 15의 잠재적 항고혈합 활성을 지금까지는 설명할 수 없었다는 것을 강조한다.

실시예 7: 완성된 카제인 HLPLPLL SEQ. ID. No. 14의 가수분해에 의해 얻어진 분획물의 위장 소화를 시뮬레이션한 후의 펩티드의 ACE-억제 및 항고혈압 활성

총 카제인 가수분해물 중 3000Da 이하의 분자량을 갖는 분획물 중에서 사전에 식별된 HLPLPLL SEQ. ID. No. 14는 화학적으로 합성하여 위장 소화를 시뮬레이팅하는 2단계 가수분해 공정을 통해 얻어진다(Alting, A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under siumulated gastrointestinal conditions of infants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). 이러한 목적을 위해서, 합성 펩티드 수용액(10mg/ml)을 우선 pH 2.0, 37℃에서 90분간 펩신(E.C. 3.4.4.1, 570U/mg 단백질)(Sigma사)(효소-기질 비율, 1:50, p/p)으로, 그 다음 pH 7~8, 37℃에서 2.5시간 Corolase PP^?(효소-기질 비율 1:25, p/p)(Rohm, Darmstadt 제품. 독일)을 사용하여 가수분해한다. 이 반응은 수조에서 95℃에서 10분간 가열함으로써 중단하였다.

도 9에는 HLPLPL 헥사펩티드 SEQ. ID. No. 16 및 HLPLP 펜타펩티드 SEQ. ID. No. 17에 상응하는 RP-HPLC-MS/MS에 의해 확인된 HLPLPLL 펩티드 SEQ. ID. No. 14의 가수분해 후에 얻어진 펩티드를 나타낸다. HLPLPL SEQ. ID. No. 16은 중간 분획물이고, 펜타펩티드 HLPLP SEQ. ID. No. 17은 위장 효소의 작용에 대해 내성을 갖고, HLPLPLL 펩티드 SEQ. ID. No. 14의 말단 단백질 분해 생성물일 것이다. HLPLP 펜타펩티드 SEQ. ID. No. 17의 ACE-억제 활성을 평가하였고 21μM의 IC₅₀값인 것을 알았다. 마찬가지로, 1회분 7mg/kg을 투여했을 때의 HLPLP SEQ. ID. No. 17을 가수분해 함으로써 얻어진 최종 펩티드의 SHR의 항고혈압 활성을 측정하였다. 도 10에 SBP 및 DBP의 저하를 나타낸다. 이들 동물에 있어서 SBP 및 DBP가 현저하게 저하되었지만, 이 경우 항고혈압 효과는 실제로 그 ACE-억제 활성에 적어도 일부에 기인한다고 할 수 있다.

<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS <120> BIOACTIVE PEPTIDES IDENTIFIED IN ENZYMATIC HYDROLYZATES OF MILK CASEINS AND METHOD OF OBTAINING SAME <130> PERCASPCT <150> ES P200501373 <151> 2005-06-08 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 1 Leu Lys Lys Ile Ser Gln 1 5 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.1 <400> 2 Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys Thr 1 5 10 15 Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 20 25 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.1 <400> 3 Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr 1 5 10 15 Leu <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.1 <400> 4 Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.7 <400> 5 Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 20 25 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.7 <400> 6 Leu Lys Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln 1 5 10 15 Pro Lys Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 20 25 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <223> IN <400> 7 Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 1 5 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.7 <400> 8 Lys Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro 1 5 10 15 Lys Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu 20 25 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <400> 9 Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr 1 5 10 15 Leu Lys Thr <210> 10 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> INCLUDES SEQ. ID. No.7 <400> 10 Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr Leu Lys Thr Val Asp Gln His 1 5 10 15 Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys Thr Asn Ala Ile Pro 20 25 30 Tyr Val Arg Tyr Leu 35 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <400> 11 Val Arg Tyr Leu 1 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <400> 12 Arg Tyr Leu Gly Tyr 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 13 Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 14 His Leu Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(3) <400> 15 Pro Tyr Val 1 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 16 His Leu Pro Leu Pro Leu 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DERIVIED FROM CASEIN <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <400> 17 His Leu Pro Leu Pro 1 5

Claims

a. 체외 안지오텐신전환효소(ACE)-억제 활성, 체내 항고혈압 활성 및 항산화 활성 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 활성을 갖고,

b. 펩신-가수분해 우유 카제인 효소 가수분해물에 존재하고,

c. N-말단으로부터 제 2 위치에 제 1 타이로신 잔기, N-말단으로부터 제 4 위치 또는 제 5 위치에 제 2 타이로신 잔기 및 C-말단 트리펩티드 서열에 프롤린, 류신 및 타이로신으로 이루어진 군에서 선택되는 2개 이상의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고,

d. SEQ. ID. No. 12 또는 SEQ. ID. No. 13인 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 생물활성 펩티드는 α_S1-카제인으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
삭제
제 1 항에 있어서, 체외에서 안지오텐신전환효소(ACE)-억제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
제 1 항에 있어서, 항고혈압 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
제 1 항에 있어서, 산소 라디칼 킬레이트화에 의해 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
제 1 항에 있어서, 화학 또는 효소 합성법, 또는 재조합법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
삭제
제 1 항에 기재된 생물활성 펩티드의 제조방법으로서:

a. 카제인 또는 전체 우유를 물 또는 완충액에 pH 2.0∼3.0로 조절하면서 용해시키거나 또는 분산시켜 혼합물을 얻고,

b. 상기 카제인 또는 전체 우유 중에 존재하는 단백질을 소화할 수 있는 단백질 분해 효소 또는 단백질 분해 미생물을 상기 혼합물에 첨가하고,

c. 상기 단백질 분해 효소 또는 상기 단백질 분해 미생물을 10분 내지 24시간동안 상기 단백질과 반응시켜 상기 생물활성 펩티드를 얻는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드의 제조방법.
제 11 항에 있어서, 상기 혼합물을 pH 3.0 으로 조절하고, 상기 단백질 분해 효소를 30분 내지 3시간동안 상기 단백질과 반응시키고, 상기 단백질 분해 효소는 펩신이고, 상기 펩신은 효소-단백질 비율 3.7/100(p/p)으로 상기 혼합물에 첨가되는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드의 제조방법.
삭제
삭제
제 1 항에 기재된 생물활성 펩티드를 함유하는 단백질 분해 효소 가수분해물, 그것의 분획물 또는 그것의 정제물을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물활성 생성물.
제 1 항에 있어서, C-말단 트리펩티드 서열의 제 1 위치 또는 제 3 위치에 류신을 갖는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
제 1 항에 있어서, C-말단 트리펩티드 서열의 제 1 위치에 타이로신을 갖고, SEQ. ID. No. 12인 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
제 1 항에 있어서, C-말단 트리펩티드 서열의 제 3 위치에 프롤린을 갖고, SEQ. ID. No. 13인 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 생물활성 펩티드.
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