MX2007015528A - Peptidos bioactivos identificados en hidrolizados enzimaticos de caseinas lacteas y procedimiento de obtencion. - Google Patents

Abstract

La invencion consiste en la produccion de productos bioactivos derivados de las proteinas lacteas para produccion de lactoproductos bioactivos derivados de proteinas de lacteas, en especial, caseinas. Los 16 peptidos objeto de la patente se pueden obtener quimicamente, biotecnologicamente o por tratamiento enzimatico a partir de proteinas que los contengan y dan lugar a peptidos con actividad antimicrobiana, inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Estos productos nutraceuticos, ya sea como hidrolizado o como peptido biactivos, son tanto utiles para la industria alimentaria como para la farmaceutica.

Description

PEPTIDOS BIOACTIVOS IDENTIFICADOS EN HIDROLIZADOS ENZIMÁTICOS DE CASEÍNAS LÁCTEAS Y PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN.

SECTOR DE LA TÉCNICA La invención consiste en la producción de productos bioactivos derivados de las proteínas lácteas. Estas proteínas dan lugar, tras un tratamiento enzimático, a péptidos con actividad antimicrobiana y/o actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante, que pueden aplicarse a la industria alimentaria y farmacéutica.

ESTADO DE LA TÉCNICA El papel de la leche en la nutrición humana es esencial desde el momento del nacimiento y constituye un alimento con un alto valor nutritivo y funcional. El reciente desarrollo de nuevas técnicas biotecnológicas y de separación permite el fraccionamiento de distintos componentes de la leche para ser usados con nuevos propósitos alimenticios o no alimenticios y, de este modo, están apareciendo nuevas aplicaciones que contribuyen a aumentar su consumo. Así, distintas empresas dedicadas a la producción de proteínas aisladas a partir de fracciones de la leche, están interesadas en aumentar y diversificar los usos de algunos componentes, como las caseínas y las seroproteínas. Este es el caso de las industrias dedicadas a la producción de lactoferrina, utilizada como agente antimicrobiano y que ya se utiliza en alimentos infantiles, yogures, suplementos alimenticios, formulaciones especiales, productos dentales y dermatológicos. La lactoferrina también se emplea por su actividad antimicrobiana como aditivo en leche fresca para alargar su duración.

En los últimos años, los alimentos funcionales han irrumpido con fuerza en el sector alimentario, debido a la mayor concienciación de los consumidores de la relación existente entre la dieta y la salud. Dentro de los ingredientes funcionales, definidos como aquellos componentes que, incorporados al alimento, ejercen actividades biológicas específicas que van más allá del mero papel nutricional, ocupan un lugar destacado, por su diversidad y multifimcionalidad, los péptidos bioactivos. Estos péptidos corresponden a fragmentos inactivos dentro de la protema precursora, pero que tras liberarse mediante procesos de hidrólisis in vivo y/o in vitro, ejercen distintas funciones fisiológicas en el organismo. Desde su descubrimiento, en 1979, se han descrito péptidos derivados de proteínas alimentarias con diferentes actividades biológicas: antimicrobiana, antihipertensiva, inmunomodulante, antitrombótica, opiácea, antioxidante, etc. Estos péptidos tienen un potencial uso alimentario y o farmacéutico y pueden liberarse mediante diversas estrategias, siendo la hidrólisis enzimática y la fermentación microbiana las más empleadas en la actualidad. Entre los péptidos bioactivos, cabe destacar aquellos que ejercen propiedades antimicrobianas (R. Floris, I. Recio, B. Berkhout, y S. Visser, Antibacterial and antiviral effects of milk proteins and derivatives thereof, Current Pharmaceutical Design, 2003, 9: 1257-1275). La actividad antimicrobiana de la leche ha sido estudiada desde hace mucho tiempo y tradicionalmente se ha atribuido a distintas proteínas con actividad antimicrobiana presentes de este alimento (inmunoglobulinas, lactoferrina, lactoperoxidasa, lisozima, etc.). Sin embargo, recientemente, también se ha demostrado la actividad antimicrobiana de péptidos derivados de proteínas lácteas. Aunque hasta el momento no hay estudios concluyentes sobre el mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos derivados de las proteínas lácteas, resultados preliminares han descrito la capacidad de algunas de estas secuencias bioactivas de interaccionar y lisar las membranas bacterianas (D.Chapple, D. J. Masón, C. L. Joannou, E. W. Odell, V. Gant, R. W. Evans, Structure-function relationship of antibacterial synthetic peptides homologous to a helical surface región on human lactoferrin against Escherichia coli serotype 011 1, Infection and Immunity, 1998, 66, 2434-2440). Se han descrito péptidos con actividad antimicrobiana obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de caseínas de origen bovino, como la aS2-caseína (EP1114060, Process for producing cationic peptides from biological fluids) y la ß-caseína y ?-caseína (WO99/26971, Antimicrobial peptides). Por procesos similares de hidrólisis se han aislado e identificado péptidos con propiedades antimicrobianas derivados de proteínas de suero, como la lactoferrina (WO2004/089986, Antimicrobial peptide from transferrin family). Otro grupo de péptidos bioactivos de gran importancia es el de los péptidos con actividad antihipertensiva dada la elevada incidencia de enfermedades coronarias relacionadas con la hipertensión en países desarrollados. Muchos de estos péptidos actúan regulando el sistema renina-angiotensina mediante la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) (T. Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381) aunque no se descarta que puedan actuar mediante otros mecanismos. Se han descubierto distintos péptidos con actividad inhibidora de la ECA (IECA), obtenidos a partir de hidrolizados enzimáticos de caseínas (US 6514941, Method of preparing a casein hydrolysate enriched in anti-hypertensive peptides) y de proteínas de suero lácteo (WOO 1/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals). Estudios sobre la relación estructura/actividad de los péptidos con actividad antihipertensiva han puesto de manifiesto el papel fundamental de ciertos aminoácidos hidrofóbicos en el desarrollo de esta actividad (H.-S. Cheung, F.-L. Wang, M. A. Ondetti, E. F. Sabo, y D. W. Cushman, Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence. Journal of Biological Chemistry 1980, 255: 401-407). La presencia de algunos de estos aminoácidos también ha sido considerada como esencial en el desarrollo de la actividad antioxidante y esta actividad ha adquirido una gran importancia en los últimos años (H. M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto y K. Nokihara, Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 49-53). Diferentes enfermedades degenerativas, como el cáncer, el Alzheimer, las cataratas, o el propio envejecimiento están relacionadas con la oxidación de componentes celulares, lípidos, proteínas o ADN. Estas patologías pueden producirse como consecuencia del desequilibrio entre agentes oxidantes y los sistemas antioxidantes del organismo, por lo que la ingestión de compuestos antioxidantes en la dieta podría ser de utilidad en la prevención de este tipo de enfermedades. Además, estos compuestos antioxidantes presentes en los alimentos retardan los procesos de oxidación de las grasas, que se consideran responsables de alteraciones y de la aparición de olores y sabores desagradables en dichos alimentos. Recientes investigaciones han puesto de manifiesto la capacidad de distintas proteínas lácteas y de péptidos derivados de las mismas para ejercer una actividad antioxidante mediante diversos mecanismos de acción. Así, se han descrito péptidos con capacidad quelante de radicales libres procedentes de hidrolizados de caseínas (K. Suetsuna, H. Ukeda y H. Ochi, Isolation and characterization of free radical scavenging activities peptides derived from casein, Journal of Nutritional Biochemistry, 2000, 11 :128-131; EP1188767, Isolated antioxidant peptides from casein and methods for preparing, isolating and identifying antioxidant peptides) y de proteínas de suero (B. Hernández-Ledesma, A. Dávalos, B. Bartolomé y L. Amigo, Preparation of antioxidant enzymatic hydrolyzates from a-lactalbumin and ß-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005, 53, 588-593). Además, las caseínas se han convertido en una fuente importante de péptidos con actividad inhibitoria de las enzimas catalizadoras de los procesos de oxidación de grasas (S. G. Rival, S. Fornaroli, C. G. Boeriu y H. J. Wichers, Caseins and casein hydrolysates. I. Lipoxygenase inhibitory properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 287-294). La mayoría de los estudios llevados a cabo hasta el momento se han centrado en la actividad biológica de péptidos derivados de caseínas bovinas. Sin embargo, existen pocos datos acerca de las actividades biológicas ejercidas por péptidos procedentes de caseínas de otras especies, como la ovina o la caprina. J. A. Gómez-Ruiz, I. Recio, y A. Pihlanto (Antimicrobial activity of ovine casein hydrolysates. A preliminary study. Milchwissenschaft-Milk Science Internacional 2005, 60:41-45) describieron el potente efecto inhibidor, dosis dependiente, de la actividad metabólica de Escherichia coli JMl 03 ejercida por hidrolizados de ß-caseína. Sin embargo, en este estudio no se llevó a cabo la identificación de los péptidos responsables de dicho efecto. Por el contrario, se han identificado varias secuencias liberadas a partir de las caseínas ovinas durante los procesos de fermentación y maduración característicos de la elaboración del queso Manchego y algunas de ellas han demostrado actividad IECA (J. A. Gómez-Ruiz, M. Ramos e I. Recio, Identification and formation of angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2004, 1054: 269:277). Los valores de IC50 (concentración que inhibe el 50% de la actividad de la enzima) de estas secuencias estuvieron comprendidos entre 24,1 y 1275,4 µM. En este estudio el péptido con mayor actividad inhibidora de la ECA correspondió al fragmento aS2-caseína f(205-208) de secuencia VRYL (SEQ. ID. N° 1 1), que presentó un valor de IC50 de 24.1 µM (J.A. Gómez-Ruiz, M. Ramos, y I. Recio, Angiotensin converting enzyme-inhibitory activity of peptides isolated from Manchego cheese. Stability under simulated gastrointestinal digestión. Int. Dairy Journal 2004, 1075-1080). Sin embargo, no hay datos sobre la capacidad de estos péptidos para atravesar la barrera intestinal y sobre su capacidad para ejercer el efecto antihipertensivo in vivo. Hay que destacar que con frecuencia, muchos péptidos que se muestran como potentes inhibidores de la ECA in vitro pierden toda o parte de su actividad cuando son ensayados in vivo, o incluso, péptidos que in vitro no presentan gran actividad como IECA la adquieran in vivo debido a la actuación de enzimas digestivas (M. Maeno, N. Yamamoto y T. Takano, Identification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790, Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316-1321). Tampoco hay estudios sobre la capacidad multifuncional de los péptidos liberados de las caseínas de diferentes especies para ejercer varias actividades biológicas, como la antihipertensiva, la antimicrobiana y/o la antioxidante.

Dentro de la secuencia de las proteínas alimentarias se encuentran determinadas regiones que, una vez liberadas mediante hidrólisis, pueden exhibir actividades biológicas. Dichos fragmentos, denominados péptidos bioactivos, pueden generarse in vivo, durante la hidrólisis de las proteínas por acción de las enzimas gastrointestinales, o in vitro, mediante la acción de enzimas específicas o durante los procesos de elaboración de determinados alimentos. Dada la alta calidad biológica de las proteínas de la leche es de gran interés obtener, a partir de éstas, péptidos bioactivos que consumidos como parte de la dieta, además de ejercer sus funciones nutricionales básicas, sean capaces de producir efectos metabólicos o fisiológicos, útiles en el mantenimiento de la salud y en la prevención de enfermedades. La producción de péptidos bioactivos a partir de las proteínas de la leche permitiría encontrar nuevos usos a este alimento, más allá de su valor alimenticio clásico, incluyendo la producción de productos medicinales y nutracéuticos. Esto contribuiría al desarrollo de alimentos saludables, seguros y de alta calidad, contribuyendo al aprovechamiento y revalorización de los productos lácteos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN - Breve descripción de la inveecñóipi La presente invención consiste en la producción de productos derivados de proteínas lácteas que contienen péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante, mediante hidrólisis enzimática de la fracción caseínica.

Los péptidos bioactivos se producen mediante la hidrólisis de una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos, empleando enzimas proteolíticos (preferentemente pepsina y en su caso además con Corolasa PP®) y condiciones de hidrólisis que permitan la ruptura de la cadena proteica en los lugares adecuados para su liberación. En el caso de utilizar ambos enzimas para simular la digestión gastrointestinal se obtendrían las mínimas unidades peptídicas funcionales que estarían en condiciones de ser asimilables gastrointestinalmente y de pasar al torrente sanguíneo. Esta propiedad abre la aplicación de estos péptidos a formas de administración distinta de la oral o aumenta su velocidad de absorción. También pueden obtenerse mediante síntesis química o mediante métodos recombinantes etc. Dichos péptidos pueden consumirse como tales, o a partir de los hidrolizados crudos, de concentrados de bajo peso molecular, o de otras subfracciones activas obtenidas mediante métodos de separación por tamaño o métodos cromatográficos.

Estos hidrolizados, sus fracciones o los péptidos, podrían formar parte de productos alimenticios, actuando como conservantes de los mismos, y reforzando tras su ingestión las defensas naturales del organismo. Además, podrían emplearse en la elaboración de productos farmacéuticos dirigidos a enfermedades; particularmente podrían facilitar el control de la presión arterial, y/o infecciones bacterianas. La invención amplía las aplicaciones de las proteínas lácteas contribuyendo a su aprovechamiento y revalorización.

- Descripción detallada de la im-vemcióin La invención proporciona un método para producir péptidos bioactivos a partir de las caseínas de la leche. Dichos péptidos bioactivos son los identificados con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13, SEQ. ID. N°. 14, SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 16, SEQ. ID. N°. 17, (tabla 1), algunos de los cuales poseen actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. El material de partida de la presente invención sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal, o procedentes de microoganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés . Los que pertenecen a la secuencia de la aS2-caseína, (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, tabla 1) resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga aS2-caseína de diferentes especies, sus fracciones o péptidos o fragmentos de aS2-caseína de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Los que pertenecen a as?-caseína (SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13,), resulta también obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga as? -caseína de diferentes especies, sus fracciones o péptidos o fragmentos de las mismas del tamaño requerido, solos o mezclados con otras proteínas. Los que pertenecen a ß-caseína (SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13,), resulta también obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga ß-caseína de diferentes especies, sus fracciones, o péptidos o fragmentos de las mismas del tamaño requerido, solos o mezclados con otras proteínas. Así dependiendo del péptido o los péptidos buscado se podrían usar as? -caseína pura, aS2-caseína pura, ß-caseína pura, caseína entera, caseinatos y leche en sus diferentes formas de presentación, productos lácteos fermentados, hidrolizados de proteínas lácteas, subproductos lácteos, derivados lácteos para alimentación animal, etc. Dicho material de partida se disuelve o dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica. Puede emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2,0-3,0. También podrían emplearse microorganismos proteolíticos que llevasen a cabo una fermentación del sustrato y la hidrólisis de la proteína.

Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, relación enzima-sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, se obtienen los péptidos bioactivos empleando pepsina a pH 3,0, en una relación enzima/sustrato 3,7/100 (p/p) y realizando la hidrólisis a 37°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 30 minutos. Los péptidos bioactivos identificados como SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 17, (tabla 1), que poseen actividad actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva, por su estructura y resistencia a las enzimas gastrointestinales, serían las mínimas unidades peptídicas funcionales que tras la digestión gastrointestinal estarían en condiciones de ser asimilables gastrointestinalmente y pasar al torrente sanguíneo. El material de partida sería cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal, o procedentes de microoganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés (SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 17, tabla 1), preferiblemente aS2-caseína y ß-caseína. Resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga aS2-caseína o ß-caseína de diferentes especies, o péptidos o fragmentos de las mismas de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por ejemplo: aS2-caseína pura, ß-caseína puras, caseína entera, caseinatos y leche en sus diferentes formas de presentación, productos lácteos fermentados, hidrolizados de proteínas lácteas, subproductos lácteos, derivados lácteos para alimentación animal, etc. Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, relación enzima-sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, esto se consigue mediante hidrólisis del hidrolizado de caseínas con pepsina, o de la fracción del mismo menor de 3000 Da, o de los péptidos sintéticos que contiene (PVYRYL SEQ ID N°7, HLPLPLL SEQ ID N°13), con Corolasa PP®, a pH 7-8, en una relación enzima/sustrato 1 :25 p/p a 37°C, durante un tiempo de, aproximadamente, 2.5 horas. La reacción se interrumpe calentando a 95°C durante 10 minutos en un baño de agua. La Corolasa PP® es una preparación de enzimas proteolíticas de páncreas de cerdo que contiene, además de tripsina y quimiotripsina, amino y carboxipeptidasas. A continuación, si se desea concentrar los péptidos bioactivos, y dado que los péptidos con actividad antimicrobiana poseen carácter catiónico se puede llevar a cabo la separación de las fracciones conteniendo los péptidos bioactivos mediante cromatografía de intercambio catiónico (FPLC). A partir de las fracciones con mayor carácter catiónico pueden aislarse subfracciones activas mediante un nuevo paso de cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía hidrofóbica, etc., o preferiblemente cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC). Alternativamente, a partir del hidrolizado, pueden concentrarse los péptidos bioactivos mediante métodos tales como ultrafiltración, diálisis, electrodiálisis con membranas de poro adecuado, cromatografía de filtración por gel, etc. Además de los hidrolizados completos y sus fracciones, los péptidos mostrados en la tabla 1 y señalados con las SEQ. ID. N°. 1 , SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13, SEQ. ID. N°. 14, poseen propiedades bioactivas, fundamentalmente actividad antimicrobiana y/o actividad IECA y/o actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante y son también objeto de la presente invención. En concreto, los péptidos identificados con las secuencias SEQ. ID. N°. 1 , SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N°. 9 y SEQ. ID. N°. 10 presentan actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas y al menos la secuencia SEQ. ID. N° 3 ejerce además un potente efecto antimicrobiano frente a Escherichia coli. Además, los péptidos identificados con las secuencias SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N°. 7 muestran una potente actividad IECA in vitro y las secuencia SEQ. ID. N°. 7 posee actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) cuando se administra por vía oral a estos animales. Por otra parte, al menos el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 7, posee una notable actividad antioxidante mediante un mecanismo de quelación de radicales de oxígeno. Asimismo el péptido identificado en el certificado de adición como SEQ. ID. N°. 14 y procedente de las ß caseínas presenta también una alta actividad inhibidora de la ECA. Además del hidrolizado de caseínas con pepsina y Corolasa PP®, los péptidos mostrados en la Tabla 1 y señalados con las SEQ. ID. N°. 15 y SEQ. ID. N°. 17 poseen actividad antihipertensiva en ratas SHR, y son también objeto de la presente invención. Debe destacarse que se trata de péptidos naturales procedentes de productos de amplio consumo de los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena tolerancia. Asimismo, los péptidos bioactivos identificados en los hidrolizados con pepsina (SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9, SEQ. ID. N° 10, SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N°. 13, SEQ. ID. N°. 14) y además con Corolasa PP®, (SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 16, SEQ. ID. N°. 17 tabla 1) al conocerse su secuencia, la tecnología disponible permite que pueden obtenerse por síntesis química y/o enzimática de péptidos o por métodos recombinantes. Tabla 1. Secuencias de los péptidos bioactivos identificados LKKISQ SEQ. ID. N°. 1 VDQHQ AMKPWTQP TNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. 2 LKK.ISQYYQKFAWPQYL SEQ. ID. N°. 3 LK ISQYYQKFAWPQY SEQ. ID. N°. 4 TVDQHQ AMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. 5 LKTVDQHQKAMKPWTQP TNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. 6 PYVRYL SEQ. ID. N°. 7 KTVDQHQKAMKPWTQP TNAIPYVRYL SEQ. ID. N° 8 L ISQYYQICFAWPQYLKT SEQ. ID. N° 9 YQKFAWPQYL TVDQHQKA PWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. 10 RYLGY SEQ. ID. N°. 12 AYFYPEL SEQ. ID. N° 13 HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14 PYV SEQ. ID. N°. 15 HLPLPL SEQ. ID. N°. 16 HLPLP SEQ. ID. N°. 17 No se había descrito previamente la obtención de péptidos bioactivos a partir de hidrolizados de aS2-caseína ovina con pepsina aunque sí se habían identificado péptidos antimicrobianos derivados de esta proteína de origen bovino (EP11 14060, Process for producing cationic peptides from biological fluids). También se habían identificado previamente algunos péptidos derivados de aS2-caseína y otras caseínas ovinas en queso Manchego con actividad IECA (J. A. Gómez-Ruiz, M. Ramos e I. Recio, Identification and formation of angiotensin-converting enzyme-inhibitory peptides in Manchego cheese by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2004, 1054: 269:277), aunque no se había estudiado su actividad antihipertensiva in vivo. Entre los péptidos con actividad IECA previamente identificados se encuentra el fragmento 205-208 de la as2-caseína ovina de secuencia VRYL (SEQ. ID. N° 1 1) (IC50 24,1 µM). Sin embargo, la secuencia SEQ. ID. N°. 7 de la presente invención, PYVRYL (IC50 1.94) presenta una actividad IECA 12 veces más potente que la previamente descrita, lo que justifica la necesidad de la totalidad de la secuencia que se encuentra en la presente invención para ejercer una notable actividad IECA. También se requiere la totalidad de la SEQ. ID. N°. 7 para ejercer la actividad antihipertensiva y/o antioxidante y/o antimicrobiana. Además, se demuestra que tras la simulación gastrointestinal de la secuencia SEQ. ID. N°. 7 de la presente invención, el mínimo fragmento activo corresponde a la secuencia PYV SEQ. ID. N°. 15. Por otra parte, este proceso permite la obtención de los péptidos bioactivos (SEQ. ID. N°. 15, SEQ. ID. N°. 16, SEQ. ID. N°. 17, tabla 1) empleando preparaciones enzimáticas y condiciones que imitan la digestión gastrointestinal. Por ello, es probable que los fragmentos que se obtienen sean los productos finales de hidrólisis, susceptibles de ser absorbidos en el tracto gastrointestinal, y de ser los responsables directos de la acción antihipertensiva. No puede, sin embargo, descartarse una hidrólisis ulterior por las peptidasas plasmáticas. La obtención de fragmentos pequeños activos es ventajosa porque estos fragmentos serían más fáciles de administrar por distintas vías, y cuando se administran por vía oral producirían el efecto más rápidamente. Estos productos lácteos: leche entera, fracciones lácteas, caseínas, caseinatos, etc. resultan un sustrato proteico barato y asequible para producir péptidos bioactivos que podrían utilizarse como sustancias terapéuticas con actividad antimicrobiana y/o actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva y/o actividad antioxidante. Dichos productos lácteos pueden ser sometidos a un tratamiento térmico, como la pasteurización, o bien someterse a secado o liofilización etc., para emplearse como productos alimentarios funcionales, aditivos o ingredientes alimentarios, o productos farmacéuticos, para el tratamiento y/o prevención de infecciones y/o la hipertensión arterial en todas sus formas, principalmente en seres humanos, aunque también en animales. La cantidad de hidrolizado, fracción de bajo peso molecular, péptidos, sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas, así como su dosificación para el tratamiento de alguna patología, variará dependiendo de numerosos factores, como la edad, severidad de la patología o disfunción, vía de administración y frecuencia de la dosis. Estos compuestos podrían presentarse en cualquier forma de administración, sólido ó líquido, y administrarse por cualquier vía apropiada, oral, respiratoria, rectal o tópica, aunque particularmente están diseñados para una administración sólida o líquida por vía oral. En general, el proceso de obtención de estos productos: los hidrolizados completos, las fracciones de los mismos y sus péptidos constituyentes, se podrá optimizar, dirigiéndolo a la producción de la mayor cantidad posible de péptidos bioactivos o para controlar en lo posible la aparición de amargor, originado normalmente por una elevada concentración de péptidos hidrófobos de peso molecular intermedio o bajo. Procedimientos analíticos Medida de la actividad antimicrobiana La actividad antimicrobiana se determina de acuerdo con el método de A. Pellegrini, C. Deltting, U. Thomas, P. Hunziker (Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine ß-lactoglobulin. Biochimica et Biophysica Acta, 2001 , 1526: 131-140), empleando como microorganismos Escherichia coli [American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA] ATCC 25922, Listeria innocua [Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) Valencia, España] CECT 910T, Sthaphylococcus epidermidis CECT 231, Enterococcus faecalis CECT 795, Serratia marcescens CECT 854 y Sthaphylococcus carnosus CECT 4491T.

Las suspensiones bacterianas se inoculan al 1% en el medio de cultivo Triptosa-Soja (TSB) para Escherichia coli, Serratia marcescens y las cepas del género Sthaphylococcus, o en el caldo infusión cerebro-corazón (BHI) para Enterococcus faecalis y Listeria innocua. La incubación se lleva a cabo a 37°C, excepto en el caso de Serratia marcescens, que se realiza a 30°C. El inoculo bacteriano, a partir del cual se inicia el trabajo, se obtiene tras incubar una colonia crecida en TSB-Agar ó BHI-Agar en 10 mL de TSB o BHI durante toda la noche a 37°C o 30°C. La suspensión bacteriana (1 mL) se diluye 1/50 con el medio de cultivo correspondiente, incubándose a la temperatura adecuada para cada cepa hasta alcanzar una densidad de población de 1-4x108 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL. El cultivo se centrifuga a 2000 x g durante 10 minutos, se lavan las bacterias sedimentadas dos veces con 15 mL de tampón fosfato (pH 7,4) y se ajusta la población a 106 UFC/mL. En una placa multipocillo estéril (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Alemania) se mezclan 50 µL de la suspensión bacteriana, 50 µL de la sustancia a ensayar y 100 µL del tampón fosfato con un 2% del medio de cultivo adecuado en cada caso, y se incuba la mezcla a 37°C o 30°C durante 2 horas. Pasado este tiempo, la mezcla se diluye hasta 10"5, se añaden 100 µL de cada una de las diluciones a placas de TSB-Agar ó BHI-Agar y se incuban las placas durante 24 horas, pasadas las cuales se lleva a cabo el recuento de las colonias.

Para calcular la actividad antimicrobiana se emplea la fórmula siguiente: No Actividad antimicrobiana = log , donde Nf No corresponde al número de UFC/mL inicial Nf corresponde al número de UFC/mL final Medida de la actividad inhibidora de la enzima comvertidora de aegiotensiraa (IECA) La actividad IECA se mide in vitro de acuerdo con el método de D. W. Cushman y H. S. Cheung (Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung, Biochemical Pharmacology, 1971 , 20: 1637- 1648), modificado posteriormente por Y. K. Kim, S. Yoon, D. Y. Yu., B. Lónnerdal y B. H. Chung (Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from recombinant human as? -casein expressed in Escherichia coli. Journal of Dairy Research 1999, 66, 431-439). El sustrato, hipuril histidil leucina (HHL, Sigma, Chemicals Co, St. Louis, MO, USA), se disuelve en tampón borato 0.1 M con NaCl 0.3 M, pH 8.3, para obtener una concentración final 5 mM. A 100 µL de sustrato se le añaden 40 µL de cada una de las muestras cuya actividad IECA se quiere determinar. Se adiciona la enzima ECA (EC 3.4.15.1, Sigma), disuelta en glicerol al 50%, y diluida en el momento de realizar el ensayo 1/10 en agua bidestilada. La reacción se lleva a cabo a 37°C, durante 30 minutos en un baño de agua. La enzima se inactiva descendiendo el pH con 150 µl de HCl ÍN. El ácido hipúrico formado se extrae con 1000 µL de acetato de etilo. Tras agitación en vórtex durante 20 segundos, se centrifuga a 3000 x g durante 10 minutos y a temperatura ambiente. Se toman 750 µL de la fase orgánica que se evapora por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. El residuo de ácido hipúrico se redisuelve en 800 µL de agua bidestilada y, tras agitar durante 20 segundos, se mide la absorbancia a 228 nm en un espectrofotómetro Dur-70 de Beckman Instruments, Inc., Fullerton, EEUU.

Para calcular el porcentaje de actividad IECA se emplea la fórmula siguiente: Acontrol-Amuestra % IECA = * 100 Acontrol-Ablanco El blanco se utiliza para corregir la absorbancia de fondo. Este contiene sustrato, enzima y 20 µl de agua bidestilada en lugar de muestra, y la reacción se para a tiempo cero.

El control supone el cien por cien de la acción enzimática sobre el sustrato en ausencia de inhibidores, y contiene 20 µl de agua en lugar de muestra y se incuba el mismo tiempo que la muestra. Los resultados se presentan como IC50 (µM) o concentración a la que se inhibe el 50% de la actividad de la enzima. La concentración de proteína se determina mediante el ensayo del ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EEUU) empleando como patrón seroalbúmina bovina.

Medida de la actividad antioxidante La capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) se determina siguiendo el método desarrollado por B. X. Ou, M. Hampsch-Woodill, RL. Prior (Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probé, 2001, 49:4619-4626). Este método se basa en la oxidación de la fluoresceína por los radicales peroxilos producidos in situ por descomposición térmica del 2,2 '-azobis 2-amidinopropano dihidrocloruro (AAPH). La oxidación de la fluoresceína causa un descenso de la fluorescencia a ?exc = 493 nm y ?em = 515 nm. La presencia de antioxidantes evita o retrasa la descomposición de la fluoresceína. La solución de trabajo de la fluoresceína se prepara diariamente a una concentración 60 nM a partir de una solución madre de fluoresceína 100 µM en tampón fosfato 75 mM (pH 7,5). Como antioxidante de referencia se utiliza ácido 6-hidroxi-2, 5,7,8-tettametilcromano-2-carboxílico (Trolox), que se prepara a una concentración 20 mM (solución madre) en tampón fosfato y se conserva a -20°C. Se obtiene una curva de calibrado de Trolox por el análisis de las soluciones patrón de concentraciones 12,5; 25; 40; 50 y 100 µM, preparadas a partir de la solución madre. El AAPH se disuelve en el tampón fosfato hasta una concentración final de 143 mM, manteniéndose a baja temperatura para impedir su degradación. Para llevar a cabo el ensayo, se mezclan 375 µL de la muestra con 375 µL del AAPH y 2,225 mL de fluoresceína, incubando esta mezcla a 37°C. Cada 5 minutos se mide la fluorescencia (?exc=493 nm y ?em =515 nm) en el fluorímetro RF-1501 (Shimadzu). Se realizan controles del ensayo consistentes en un blanco que contiene fluoresceína y tampón fosfato, para comprobar la estabilidad de la fluoresceína durante el experimento, y un control positivo de oxidación máxima que contiene fluoresceína, AAPH y tampón fosfato. Como control de la medida de actividad antioxidante, se incluye una solución de trolox 40 µM en cada set de muestras a analizar. Todas las muestras se analizaron por triplicado. La actividad anti oxi dante se cuantifica a través de la medida del "área bajo la curva" (AUC) de la curva de decadencia de la fluorescencia de fluoresceína y se expresa como equivalentes de Trolox (valor de ORAC). El AUC se calcula empleando la siguiente fórmula: AUC = (0,5 + f5/f0 + f10/f0 + f15/f0 + + f30/f0) Donde f0 es la fluorescencia a tiempo cero y f, es la fluorescencia a tiempo i.

El valor relativo ORAC para los péptidos se determina con la siguiente fórmula: ORAC = [(AUCmuestra - AUCbianco)/(AUCtroiox - AUCbianco)] [(molaridad del trolox / molaridad de la muestra)] Aislamiento de fracciones peptídicas mediante cromatografía de intercamlbio iónico (FPLC) El aislamiento de fracciones peptídicas con carácter catiónico se lleva a cabo siguiendo el método de I. Recio, S. Visser (Identification of two distinct antibacterial domains within the sequence of bovine aS2-casein. Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1428:314-326) con algunas modificaciones, en un equipo de FPLC, usando una columna de intercambio catiónico HiLoad 26/10 SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las fases A y B están constituidas por NH HCO3 10 mM (ajustada a pH 7,0 con HCOOH) y NH3 1,5 M, respectivamente. Las muestras se disuelven en la fase A preparadas a una concentración de 5 mg/mL, inyectándose un volumen de 5 mL mediante un Superloop™ (Pharmacia) de 50 mL. El hidrolizado eluye a un flujo de 5 mL/min. Tras 20 minutos con 100% de solvente A, se aplica un gradiente del 0 al 50% del solvente B en A en 60 minutos, seguido de 20 minutos con el 50% del solvente B. La detección se lleva a cabo a una absorbancia de 214 nm. La temperatura de la columna y de las fases móviles es de 9°C. Las fracciones se recogen tras varios análisis cromatográficos.

Aislamiento de fracciones peptídicas mediante cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semi-preparativa Se utiliza un equipo formado por dos bombas programables modelo Waters Delta 600, un detector de diodos alineados modelo 966, un inyector automático modelo 717 plus, y un colector de fracciones automático (Waters Corp., Mildford, MA, EEUU). Se usa una columna C|8 Prep NovaPack® HR, 7.8 x 300 mm y 6 µm de tamaño de poro (Waters), con un cartucho C?8 (Waters) como guardacolumna. Los análisis se realizan a 30°C y la detección a 214 y 280 nm. La adquisición de los datos se lleva a cabo con el Software Millennium versión 3.2 (Waters). Las muestras de aS2-caseína se preparan a una concentración de 2,5 mg/mL y, previamente a la inyección, se centrifugan a 16 000 x g durante 10 minutos. Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de agua milliQ (fase A) y acetonitrilo (fase B) con 0,1 % y 0,08%> de ácido trifluoroacético, respectivamente, y un flujo de 4 mL/min. El gradiente de fase B es del 0% al 40% en 50 minutos y del 40% al 70% durante 5 min, lavándose la columna con 70% de B durante 5 minutos y acondicionando de nuevo la columna en las condiciones iniciales durante 25 min. El volumen de muestra inyectado es de 300 µl. Las muestras sobre caseínas totales se preparan a una concentración de lOOmg/mL y, previamente a la inyección, se pasan a través de un filtro de tamaño de poro 0.45 µm. Para la elución de las muestras se utiliza un gradiente binario de agua milliQ® (fase A) y acetonitrilo (fase B) con 0,1 % y 0,08% de ácido trifluoroacético, respectivamente, y un flujo de 4 mL/min. El gradiente de fase B es del 0% al 35% en 70 minutos y del 35% al 70% durante 5 min, lavándose la columna con 70%) de B durante 5 minutos y acondicionando de nuevo la columna en las condiciones iniciales durante 20 min. El volumen de muestra inyectado es de 50 µl.

Análisis mediante espectrometría de masas en tándem Se emplea un equipo de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Las muestras se preparan a una concentración de 2 mg/mL en una solución de agua:acetonitrilo al 50% (v/v) con ácido fórmico al 0,01% (v/v). La muestra se inyecta en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4 µl/min, utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado, y opera con una presión de helio de 5 x 10~3 bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 100-2000 m/z, y a una velocidad de 13000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de masas en tándem para la identificación de las secuencias peptídicas se realiza con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).

Análisis mediante RP-HPLC acoplado on-line a espectrometría de masas eni t ndem (RP-HPLC-MS/MS) Se emplea un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania). El equipo de HPLC (serie 1 100) está formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna es una columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 µm de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0.37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0.27). Se inyectan 50 µl de muestra preparada a una concentración de 4,5 mg/ml. Se emplea un flujo de 0.8 ml/min, con un gradiente lineal del 0% al 50%> de disolvente B en A en 60 minutos. El eluyente se monitoriza a 214 nm, mediante espectrofotometría de masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en el apartado anterior, salvo que el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador es de 275 µl/min.

Estudio de la actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SI Se estudia el efecto de varios de los péptidos identificados sobre la presión arterial de ratas SHR. Los péptidos se sintetizan químicamente para este estudio. El estudio se realiza con ratas macho SHR, de 17-20 semanas de edad, y peso comprendido entre 300 y 350 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A. Las ratas se almacenan en jaulas de cinco en cinco, y se mantienen a una temperatura estable de 25°C, con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición. Se llevan a cabo medidas de presión arterial sistólica (PAS) y diastólica (PAD), y para ello se utiliza el método del manguito en la cola ("tail cuff') (RD. Buñag, Validation in awake rats of a tail-cuff method for measuring systolic pressure, J. Appl. Physiol. , 1973, 34: 279-282). El equipo que se utiliza (Le5001, Letica) proporciona valores digitales de la PAS y de la PAD automáticamente. Este equipo registra y facilita también la medida de la frecuencia cardiaca de los animales. Antes de colocar el manguito y el transductor en la cola de las ratas, éstas se exponen a una temperatura próxima a los 37°C para facilitar la dilatación de la arteria caudal. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbran al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión. El valor de la PAS y de la PAD se establece realizando 3 medidas consecutivas, y calculando la media de los tres valores correspondientes a cada una de estas dos variables. Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenían valores de PAS comprendidos entre 190 mm Hg y 220 mm Hg, y valores de PAD comprendidos entre 130 mm Hg y 180 mm Hg. La administración de los productos a ensayar se realiza mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 y las 10 h de la mañana, y la dosis ensayada se administra disuelta en 1 ml de agua destilada. Se toman medidas de la PAS y de la PAD antes de la administración, y se toman también medidas periódicas de estas variables cada 2 horas después de la administración, hasta 8 horas post-administración. Adicionalmente, se toman también medidas de la PAS y de la PAD 24 horas después de la administración de dichos productos. Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS y de la PAD en ratas sondadas) se utilizan las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ensayos semejantes con ratas a las que se administra mediante sonda intragástrica 1 ml de agua. Como control positivo, se utilizan las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ensayos semejantes con ratas a las que se administra mediante sonda intragástrica 50 mg/kg de captopril (fármaco IECA prototipo). Esta dosis de captopril se administra a cada rata disuelta en 1 ml de agua destilada. Los resultados se agrupan y se obtiene la media ± el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 6 ensayos homogéneos. Para compararlos se utiliza un análisis de varianza de una vía, seguido del test de Bonferroni. Se considera significativa la diferencia para valores de p<0.05.

Breve descripción del contenido de las figuras Figura 1 : cromatograma obtenido utilizando cromatografía de intercambio catiónico (FPLC), del hidrolizado de la as2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos, en el que se seleccionan 5 fracciones (FA-FE), que fueron recogidas manualmente. En el eje de abcisas se representa el tiempo en minutos.

Figura 2A: cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semipreparativa, de la fracción FC recogida a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos. Se seleccionan 4 subfracciones (FC1-FC4), que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

Figura 2B: cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semipreparativa, de la fracción FD recogida a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos. Se seleccionan 2 subfracciones (FD1-FD2), que fueron recogidas automáticamente. En el eje de abscisas se representa el tiempo en minutos.

Figura 3 : actividad antimicrobiana de las distintas subfracciones obtenidas a partir de las fracciones FC y FD mediante RP-HPLC a escala semipreparativa.

Figura 4: disminución de la presión arterial sistólica (PAS), y la disminución de la presión arterial diastólica (PAD), obtenidas en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (a), 3 mg/kg de PYVRYL (A), y 3 mg/kg de LKKISQ( ). T(h) representa el tiempo transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 6 animales. aP<0.05 vs agua; bP<0.05 vs Captopril; CP<0.05 vs PYVRYL. Figura 5: disminución de la presión arterial sistólica (PAS), y la disminución de la presión arterial diastólica (PAD), obtenidas en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (D), 400 mg/kg de caseína (F), 400 mg/kg de hidrolizado de caseína (?) y 200 mg/kg de F<3000 Da del hidrolizado de caseína (m). T(h) representa el tiempo transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 4 animales. aP<0.05 vs agua; bP<0.05 vs captopril; cP<0.05 vs caseína 400 mg/kg Figura 6A.: cromatograma obtenido mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) a escala semipreparativa, de la fracción menor de 3000 Da obtenida a partir del hidrolizado de caseína con pepsina durante 3 horas. En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas el tiempo en minutos. La figura 6B corresponde a la actividad inhibidora de la enzima convertidora de angiotensina (actividad IECA) de las fracciones cromagráficas obtenidas mediante RP-HPLC. Por su potente actividad IECA, se seleccionaron 3 fracciones que fueron recogidas automáticamente (F3, F5 y F6).

Figura 7: cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético PYVRYL SEQ. ID. N°. 7, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y Corolasa PP . En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas el tiempo en minutos.

Figura 8: disminución de la presión arterial sistólica (PAS), y la disminución de la presión arterial diastólica (PAD), obtenidas en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (D), 3 mg/kg de PYVRYL (*) y 2 mg/kg de PYV (a). T(h) representa el tiempo transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 4 animales. aP<0.05 vs agua; bP<0.05 vs captopril; cP<0.05 vs PYVRYL 3 mg/kg.

Figura 9: cromatograma obtenido utilizando cromatografía de líquidos de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) del péptido sintético HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14, antes y después de la hidrólisis secuencial con pepsina y Corolasa PP . En el eje de ordenadas se representa la absorbancia a 214 nm y en el eje de abscisas el tiempo en minutos.

Figura 10: disminución de la presión arterial sistólica (PAS), y la disminución de la presión arterial diastólica (PAD), obtenidas en ratas espontáneamente hipertensas, tras la administración mediante sonda intragástrica de 1 ml de agua (o), 50 mg/kg de Captopril (D), 7 mg/kg de HLPLP (ß). T(h) representa el tiempo transcurrido desde la administración expresado en horas. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 4 animales. aP<0.05 vs agua; bP<0.05 vs captopril.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos ilustran la invención, aunque no deben considerarse como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1. Obtención de péptidos bioactñvos, con actividad aratimicrobiaipia, IECA, antihipertensiva y antioxidante, a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina. El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato aS2-caseína ovina, obtenida tras la separación del resto de las caseínas mediante el método de H. J. Vreeman, J. A. M. van Riel (The large-scale isolation of aS2-casein from bovine casein. Netherlands Milk and Dairy Journal, 1990, 44:43-48). Como enzima se utilizó pepsina porcina (E.C. 3.4.23.1. 570 U/mg de proteína), procedente de estómago de cerdo (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Se preparó una disolución acuosa de la S2-caseína ovina al 0,5% y el pH se ajustó a 3,0 con HCl 1 M. Se añadió pepsina (relación enzima/sustrato 3,7/100, p/p). La hidrólisis se llevó a cabo a 37°C durante 30 minutos. La inactivación de la pepsina se consiguió por calentamiento a 80°C durante 15 minutos y posterior ajuste del pH a 7,0 con NaOH 1 M. El sobrenadante recogido tras la centrifugación del hidrolizado a 16000 g durante 15 minutos a 5°C se analizó mediante FPLC (Figura 1), se separaron cinco fracciones (FA-FE), que se recogieron manualmente y posteriormente se liofílizaron. Se midió la actividad antimicrobiana de estas cinco fracciones a una concentración de 2,5 mg/mL, empleando como control E. coli a 5,9 x 105 UFC/mL. Los resultados revelaron que las fracciones FC y FD presentaban actividad antimicrobiana, reduciendo el número de microorganismos en 2,54 y 0,6 órdenes de magnitud, respectivamente.

Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad antimicrobiana las fracciones FC y FD se analizaron mediante RP-HPLC a escala semipreparativa. En la Figura 2 se muestra el perfil cromatográfico de la fracción FC (Figura 2A) y la fracción FD (Figura 2B). A partir de la fracción FC se separaron cuatro subfracciones (FC1-FC4) y a partir de la fracción FD dos subfracciones (FD1-FD2). Cada una de estas subfracciones se recogieron y, tras la evaporación del acetonitrilo, se liofilizaron. Se midió la actividad antimicrobiana de estas subfracciones a una concentración de 2,5 mg/mL contra E. coli (6,2 x 106 UFC/mL). En la Figura 3 se muestran los valores de actividad antimicrobiana frente a E. coli de estas subfracciones. De todas las subfracciones, cabe destacar la FC1, que fue la que exhibía mayor actividad antimicrobiana, ya que tuvo efecto bactericida a la concentración ensayada (log Nf No mayor de 6). Las subfracciones FC4, FD1 y FD2 mostraron una moderada actividad antimicrobiana, con valores de reducción del número de microorganismos de 1 ,24, 1 ,31 y 1,64 órdenes de magnitud, respectivamente. Las subfracciones FC1 , FC4, FD1 y FD2 se analizaron por espectrometría de masas, utilizando un analizador de trampa iónica siguiendo la metodología previamente descrita. Los péptidos identificados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 2. Péptidos identificados en las subfracciones FC1, FC4, FD1 y FD2 obtenidas a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos Subfr. Masa Masa Protei'na Posición Aminoácidos Secuencia N° N°. exp.. teórica FC1 715.4 715.4 as2-caseína 165-170 LK ISQ SEQ. ID. N°.

FC4 301 1 8 301 1.5 as2-caseína 184-208 VDQHQ AMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N°.

FC4 2203.2 2203.1 as2-caseína 165-181 LKKISQYYQKFAWPQYL SEQ. ID. N°.

FC4 2089.8 2090 1 as2-caseína 165-180 LKKJSQYYQKFAWPQY SEQ. ID. N°. • FC4 31 1 1.3 31 12 6 as2-caseína 183-208 TVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N° 5 FD1 3354.3 3353 8 as2-caseína 181 -208 LKTVDQHQ A M PWTQPKTN AIPY VRYL SEQ. ID. N°. i FD1 809 4 809.4 as2-caseína 203-208 PYVRYL SEQ. ID. N°.

FD1 3240.3 3240.7 as2-caseína 182-208 TVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. : FD1 2433.0 2432 3 as2-caseína 165-183 LK ISQYYQ FAWPQYLKT SEQ. ID. N°. ' FD2 4566.8 4565.3 as2-caseína 172-208 YQKFAWPQYLKTVDQHQKAMKPWTQPKTNAIPYVRYL SEQ. ID. N°. 1 Ejemplo 2. Péptidos obtenidos mediante síntesis química con antimicrobiana Se sintetizaron químicamente los péptidos mayoritarios presentes en las subfracciones obtenidas del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos (SEQ. ID. N°. 1 ; SEQ. ID. N°. 2; SEQ. ID. N°. 3 y SEQ. ID. N° 7). Estos péptidos se sintetizaron mediante el método Fmoc en fase sólida y su pureza se verificó mediante RP-HPLC-MS/MS.

Se midió la actividad antimicrobiana de los péptidos sintéticos a una concentración de 0,5 mM, frente a Escherichia coli, Serratia marcescens, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis y Listeria innocua. Los resultados de actividad se muestran en la tabla 2.

Tabla 3. Actividad antimicrobiana de los péptidos sintéticos identificados en las subfracciones FC1, FC4 y FD1 obtenidas a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos SEQ E. S. S. S. E. L. Aminoácidos ID coli marcescens carnosus epidermidis faecalis innocua N° 1 LKKISQ 0.33 0 > 6 3.6 0 1.1 1 N° 2 VDQHQKA KPWTQPKTNAIPYVRYL 0.07 0 > 6 0.61 0 1.71 N° 3 L KISQYYQ FAWPQYL 4.63 0.38 > 6 > 6 3.32 > 6 N° 7 PYVRYL 0.27 0 2.23 2.06 0 1.13 La actividad antimicrobiana de estos péptidos contra bacterias Gram positivas es elevada, sobre todo frente a las especies ensayadas del género Staphylococcus. Tres de estos péptidos SEQ. ID. N°. 1 ; SEQ. ID. N° 2 y SEQ. ID. N°. 3 presentaron actividad bactericida frente a S. carnosus. Sin embargo, las bacterias Gram negativas (E. coli y S. marcescens) son muy resistentes a la acción de todos estos péptidos, aunque cabe destacar que el péptido identificado como SEQ. ID. N°. 3 mostró una elevada actividad antimicrobiana frente a E. coli. Ejemplo 3. Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad IECA y antihipertensiva Se midió la actividad IECA de dos de los péptidos sintetizados químicamente, concretamente las secuencias SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N° 7, mencionados en el ejemplo 1. Los resultados de actividad, expresada como IC50, o concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la enzima se muestran en la Tabla 3. Los dos péptidos presentan una potente actividad IECA. Tabla 4. Actividad IECA de los péptidos sintéticos identificados en las subfracciones FCl y FD1 obtenidas a partir del hidrolizado de aS2-caseína ovina con pepsina durante 30 minutos Secuencia N° Aminoácidos IC50 (µM) SEQ. ID. N°. 1 LKKISQ 2.10 SEQ. ID. N°. 7 PYVRYL 1.94 Se ensayó la actividad antihipertensiva de los péptidos SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N°. 7, para lo cual se administraron dichos péptidos (3 mg/kg) a ratas SHR. Los péptidos se disolvieron en agua destilada y la dosis correspondiente se administró a cada rata en un volumen de 1 mL.

La Figura 4 muestra las disminuciones de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas SHR, en distintos momentos, tras la administración de 3 mg/kg de los péptidos SEQ. ID. N°. 1 y SEQ. ID. N°. 7. Se puede observar que la administración del péptido SEQ ID N° 7 ocasiona una disminución significativa de la PAS y de la PAD en estos animales. La disminución de estas variables es máxima 4 horas después de la administración de este péptido La disminución presenta, además, un curso temporal semejante al de la disminución de PAS y de PAD producida por la administración de captopril, que es un compuesto de probada actividad antihipertensiva. Estos resultados demuestran que el péptido identificado por la secuencia SEQ. ID. N°. 7 tiene un claro y pronunciado efecto antihipertensivo cuando se administra de forma aguda por vía oral.

Ejemplo 4. Péptidos obtenidos mediante síntesis química con actividad antioxidante Se midió la actividad antioxidante de la secuencia SEQ. ID. N°. 7, mencionada en el ejemplo 1. El valor de actividad quelante de radicales peroxilo se muestra a continuación: 1 -82 µmol Trolox equivalentes/µmol péptido Los resultados muestran, por tanto, que el péptido PYVRYL (SEQ. ID. N°. 7) presenta una actividad antioxidante 1.82 veces superior a la actividad de 1 µmol de Trolox.

Ejemplo 5: Obtención de péptidos bioactivos con actividad IECA a partir de caseína bovina con pepsina. El hidrolizado se obtuvo empleando como sustrato caseína bovina, obtenida mediante precipitación isoeléctrica a partir de leche cruda de vaca. Como enzima se utilizó pepsina porcina (E.C. 3.4.23.1. 570 U/mg de proteína) procedente de estómago de cerdo (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Se preparó una disolución acuosa de caseína bovina al 0,5% y el pH se ajustó a 2,0 con HCl 1 M. Se añadió pepsina (relación enzima/sustrato 3,7/100 p/p). La hidrólisis se llevó a cabo a 37°C durante 3 horas. La inactivación de la pepsina se realizó por calentamiento a 80°C durante 20 min y posterior ajuste del pH a 7,0 con NaOH 1 M. El sobrenadante recogido tras la centrifugación del hidrolizado a 16000 x g durante 15 minutos a 5°C se sometió a un proceso de ultrafiltración a través de una membrana hidrofílica de 3000 Da de tamaño de poro (Centripep, Amicon Inc, Beverly, MA, EEUU). Se determinó la actividad IECA y antihipertensiva en SHR (según lo descrito previamente en procedimientos analíticos) del hidrolizado total y del permeado (fracción del hidrolizado con peso molecular menor de 3000 Da). En la tabla 4 se muestran los valores de actividad IECA, expresados como IC50 o concentración de proteína necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la enzima, y el contenido en proteína determinado por el método Kjeldahl. La Figura 5 muestra las disminuciones de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas SHR, en distintos momentos, tras la administración de hidrolizado de caseína, y tras la administración de la fracción del hidrolizado de caseína con peso molecular menor de 3000 Da. Puede observarse que la administración de hidrolizado de caseína ocasiona una disminución significativa de la PAS y de la PAD en estos animales. La administración de la fracción del hidrolizado de caseína con peso molecular menor de 3000 Da, ocasiona disminuciones de la PAS y de la PAD en las ratas SHR muy parecidas a las que se observan después de administrar el hidrolizado de caseína. La disminución de estas variables es máxima 2 horas después de la administración de estos productos. La administración de caseína sin hidrolizar no modifica significativamente la PAS de las ratas SHR, y ocasiona una disminución mucho menor de la PAD que los compuestos anteriores en estos animales. Estos resultados demuestran que el hidrolizado de caseína, y la fracción del hidrolizado de caseína con peso molecular menor de 3000 Da, tienen un claro efecto antihipertensivo cuando se administran de forma aguda por vía oral.

Tabla 5: Actividad IECA del hidrolizado de caseínas bovina con pepsina y del permeado (fracción < 3000 Da) y retenido (F > 3000 Da) obtenido tras el proceso de ultrafiltración.

IC50 (µg/ml) % proteína (p/p) (Kjeldahl) Hidrolizado de caseína 52.8 0.45 Permeado (F < 3000 Da) 5.5 0.03 Retenido (F > 3000 Da) 242.0 3.29 Con objeto de identificar los péptidos responsables de la actividad IECA y antihipertensiva, el permeado tras la ultrafiltración se sometió a un proceso de separación mediante RP-HPLC a escala semi-preparativa en el que se recogieron 8 fracciones. Tras la evaporación del acetonitrilo, estas fracciones cromatográficas se liofílizaron y se determinó la actividad IECA y el contenido en proteína mediante el método del ácido bicinconínico. En la figura 6 se muestra el perfil cromatográfico y las fracciones obtenidas, así como los valores de actividad IECA, expresados como IC50 de cada una de las fracciones cromatográficas. Las fracciones denominadas F3, F5 y F6 en la Figura 6 son las que presentaron mayor actividad IECA, es decir, menores valores de IC 0. Estas fracciones se analizaron mediante RP-HPLC acoplado on line a espectrometría de masas en tándem (RP-HPLC-MS/MS), utilizando la metodología previamente descrita. Los péptidos mayoritarios identificados se muestran en la tabla 5.

Tabla 6: Péptidos activos mayoritarios identificados en las fracciones F3, F5 y F6 obtenidas a partir del permeado del hidrolizado de caseína bovina con pepsina durante 3 horas.

Subfr. N°. Masa exp.. Masa teórica Proteína Posición Aminoácidos SecuenciaN0.

F3 670,5 670,35 as,-caseína 90-94 RYLGY SEQ. ID. N°. 12 F5 901 ,5 901 ,43 asl-caseína 143-149 AYFYPEL SEQ. ID. N°. 13 F6 801 ,6 801 ,52 ß-caseína 134-140 HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14 Los péptidos mayoritarios obtenidos en estas fracciones cromatográficas se sintetizaron químicamente mediante el método Fmoc en fase sólida y su pureza se verificó mediante RP-HPLC-MS/MS. Se determinó la actividad IECA de los péptidos sintetizados químicamente, concretamente de las secuencias SEQ ID. N° 12, SEQ ID. N° 13 y SEQ ID.

N° 14. Los resultados de actividad, expresada como IC50, o concentración proteica necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la enzima se muestran en la Tabla 6. Al menos, dos de los tres péptidos mayoritarios identificados presentaron potente actividad IECA.

Tabla 7: Actividad IECA de los péptidos sintéticos identificados en las fracciones Secuencia N° Aminoácidos IC50 (µM) SEQ. ID. N°. 12 RYLGY nd SEQ. ID. N°. 13 AYFYPEL 7,5 SEQ. ID. N°. 14 HLPLPLL 34,2 nd, no determinado Ejemplo 6: Actividad IECA y antihipertensiva de los péptidos tras simular la digestión gastrointestinal de los fragmentos obtenidos por hidrólisis de aS2-caseína PYVRYL SEQ. ID. N°. 7, El péptido PYVRYL SEQ. ID. N°. 7 que previamente se habían identificado en los hidrolizados de aS2-caseína y se sintetizó químicamente y se sometió a un proceso de hidrólisis en dos etapas que simula la digestión gastrointestinal (Alting, A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incomplete eliminación of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under simulated gastrointestinal conditions of infants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). Para ello, se hidrolizan disoluciones acuosas de los péptidos sintéticos (10 mg/ml), primero con pepsina (E.C. 3.4.4.1, 570 U/mg de proteína) (Sigma) (relación enzima:sustrato, 1 :50, p/p) a pH 2,0 y 37°C, durante 90 minutos y, posteriormente, con Corolasa PP® (relación enzima:sustrato 1 : 25, p/p) (Rohm, Darmstadt, Germany) a pH 7-8 y 37°C, durante 2,5 horas. La reacción se interrumpe calentando a 95°C durante 10 minutos en un baño de agua. La figura 7 muestra que el péptido PYVRYL SEQ. ID. N°. 7 se hidroliza totalmente tras la incubación con pepsina y Corolasa PP . El principal fragmento resultante identificado por RP-HPLC-MS/MS es el tripéptido PYV SEQ. ID. N°. 15. Este péptido se sintetizó químicamente y se determinó su actividad IECA, obteniéndose un valor de IC50 de 741.3 µM, es decir, 370 veces menor actividad IECA que el péptido de partida. Se determinó la actividad antihipertensiva de este tripéptido PYV SEQ. ID. N°. 15, mediante la administración del mismo a SHR. Los péptidos se disuelven en agua destilada y la dosis correspondiente se administra a cada rata en un volumen de 1 ml. La figura 8 muestra las disminuciones de la PAS y PAD obtenidas en ratas SHR en distintos momentos, tras la administración de PYV SEQ. ID. N°. 15, a una dosis de 2 mg/kg, y del péptido PYVRYL SEQ. ID. N°. 7, a una dosis de 3 mg/kg, donde se puede observar que la administración de ambos péptidos produce una disminución significativa de la PAS y PAD de estos animales. Mientras que el efecto máximo sobre la PAS del PYV SEQ. ID. N°. 15 ocurre a las 2 horas tras su administración, el máximo efecto de del péptido PYVRYL SEQ. ID. N°. 7 no tiene lugar hasta 4 horas tras su administración. La aparición más rápida del efecto antihipertensivo en el caso de la SEQ. ID. N°. 15 podría deberse a que cuando se administra esta secuencia se obvia el proceso de digestión enzimática que debe ocurrir para su producción in vivo. Estos resultados demuestran la actividad antihipertensiva de la SEQ. ID. N°. 15 aunque en principio no puede ser atribuida a su actividad IECA. Es importante destacar que hasta el momento, no se había descrito la potente actividad antihipertensiva del péptido PYV SEQ. ID. N°. 15.

Ejemplo 7: Actividad IECA y antihipertensiva de los péptidos tras digestión gastrointestinal de los fragmentos obtenidos por hidrólisis de caseína total HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14. El péptido HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14 que previamente se habían identificado en la fracción de peso molecular menor de 3000 Da de los hidrolizados de caseína total, y se sintetizó químicamente y se sometió a un proceso de hidrólisis en dos etapas que simula la digestión gastrointestinal (Alting, A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incomplete eliminación of the ABBOS epitope of bovine serum albumin under simulated gastrointestinal conditions of infants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). Para ello, se hidrolizan disoluciones acuosas de los péptidos sintéticos (10 mg/ml), primero con pepsina (E.C. 3.4.4.1, 570 U/mg de proteína) (Sigma) (relación enzima:sustrato, 1:50, p/p) a pH 2,0 y 37°C, durante 90 minutos y, posteriormente, con Corolasa PP® (relación enzima: sustrato 1 : 25, p/p) (Rohm, Darmstadt, Germany) a pH 7-8 y 37°C, durante 2,5 horas. La reacción se interrumpe calentando a 95°C durante 10 minutos en un baño de agua. La figura 9 muestra los péptidos que se obtienen tras la hidrólisis del péptido HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14 identificados mediante RP-HPLC-MS/MS, y que corresponden al hexapéptido HLPLPL SEQ. ID. N°. 16 y el pentapéptido HLPLP SEQ. ID. N°. 17. La secuencia HLPLPL SEQ. ID. N°. 16 se trata de un fragmento intermediario, mientras que el pentapéptido HLPLP SEQ. ID. N°. 17 es resistente a la acción de las enzimas gastrointestinales y probablemente se trate del producto final de proteolisis del péptido HLPLPLL SEQ. ID. N°. 14. Se evaluó la actividad IECA del pentapéptido HLPLP SEQ. ID. N°. 17 y resultó un valor de IC50 de 21 µM. Asimismo, se determinó la actividad antihipertensiva en SHR del péptido final resultante de la hidrólisis, HLPLP SEQ. ID. N°. 17 cuando se administra a una dosis de 7 mg/kg. Las disminuciones de la PAS y PAD se muestran en la figura 10. Se observa una disminución significativa la PAS y PAD en estos animales pero en este caso el efecto antihipertensivo sí puede ser atribuido, al menos parcialmente, a la actividad IECA del mismo.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Péptido bioactpvo caracterizado por a. poseer actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante b. presentes en hidrolizados enzimáticos de caseínas lácteas con pepsina y c. las secuencias de aminoácidos del grupo siguiente: SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N° 2, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, SEQ. ID. N° 9 y SEQ. ID. N° 10; SEQ. ID. N° 13, SEQ. ID. N°. 14. Péptido bioactivo según la reivindicación 1 de secuencias SEQ. ID. N°. 2, SEQ. ID. N°. 5, SEQ. ID. N°. 6, SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N°. 8, o SEQ. ID. N° 10 caracterizados por comprender la SEQ. ID. N°. 7. y derivarse de la aS2-caseína Péptido bioactivo derivados de los péptidos bioactivos la reivindicación 2 caracterizados por la SEQ. ID. N°. 15 y por ser la unidades finales obtenidas tras simular la digestión gastrointestinal de la SEQ. ID. N°. 7 Péptido bioactivo según la reivindicación 1 de secuencias SEQ. ID. N°. 1, SEQ. ID. N°. 3, SEQ. ID. N°. 4, o SEQ. ID. N° 9 caracterizados por comprender la SEQ. ID. N°. 1.y derivarse de la aS2-caseína. Péptido bioactivo según la reivindicación 1 de secuencias SEQ. ID. N°. 13, caracterizados por derivarse de la as? -caseína. 6. Péptido bioactivo según la reivindicación 1 de secuencias SEQ. ID. N°. 14, caracterizados por derivarse de la ß-caseína. 7. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por presentar actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas 8. Péptido bioactivo de secuencia de aminoácidos SEQ. ID. N° 3 según la reivindicación 1 caracterizados por presentar actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram-negativas como Escherichia coli. 9. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 6 caracterizados por la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. N° 1 , SEQ. ID. N°. 7, SEQ. ID. N° 13, SEQ. ID. N°. 14, SEQ. ID. N° 15, y presentar actividad IECA in vitro 10. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 7, SEQ. ID. N° 13 y SEQ. ID. N°. 14 SEQ. ID. N° 15, y por presentar actividad antihipertensiva. 11. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizados por la secuencia de aminoácidos SEQ ID N° 7 y por presentar actividad antioxidante mediante quelación de radicales de oxígeno. 12. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por obtenerse mediante un procedimiento de síntesis química o enzimática o mediante métodos recombinantes. 13. Péptido bioactivo según la reivindicación 12, caracterizado por obtenerse por un procedimiento de hidrólisis enzimática de as? -caseína, aS2-caseína, ß-caseína o caseína entera o leche en sus diferentes formas de presentación, subproductos lácteos, o productos lácteos fermentados. 14. Procedimiento para producir cualquiera de los péptidos bioactivos según la reivindicación 1 a 13, caracterizado por: a. obtenerse por hidrólisis del material de partida que sería cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal o vegetal, o procedentes de microoganismos, preferiblemente caseína o leche entera, cuya secuencia de aminoácidos comprendiese la secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en la reivindicación 1, b. disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica, c. emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 3,0; o microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato, y d. el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero que preferiblemente fuera entre 30 minutos y 3 horas. 15. Procedimiento para producir cualquiera de los péptidos bioactivos según la reivindicación 3, 9,10,12,13, y los péptidos de secuencia de aminoácidos SEQ. ID. N°. 12, SEQ. ID. N° 16 y SEQ. ID. N°. 17 caracterizado por: a. obtenerse por hidrólisis del material de partida que sería cualquier sustrato apropiado que contenga una o más proteínas o péptidos, de origen animal o vegetal, o procedentes de microoganismos, preferiblemente caseína o leche entera, cuya secuencia de aminoácidos comprendiese la secuencia de aminoácidos de alguno de los péptidos bioactivos de interés indicados en la reivindicaciones 3 y 7, b. disolverse o dispersarse dicho material de partida, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolítica, c. emplearse cualquier enzima proteolítica capaz de romper la proteína presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 3,0 en una relación enzima/sustrato 3,7/100 (p/p) y realizando la hidrólisis a 37°C; Corolasa PP® a pH a pH 7-8, en una relación enzima/sustrato 1 :25 p/p a 37°C„o microorganismos proteolíticos que llevaran a cabo una fermentación del sustrato, y d. el tiempo de reacción estaría comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero que preferiblemente fuera de 30 minutos para el caso de la pepsina y durante un tiempo de, aproximadamente, 2.5 horas para el caso de la Corolasa PP® cuya reacción se intemimpe calentando a 95°C durante 10 minutos en un baño de agua. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque para su obtención se emplean los procedimientos indicados en la reivindicación 15. 17. Péptido bioactivo según las reivindicaciones 3 y 7 caracterizado porque para su obtención se emplean los procedimientos indicados en la reivindicación 16. 18. Producto bioactivo caracterizado porque contiene al menos alguno de los péptidos indicados en las reivindicaciones 1 a 13, 16 y 17 al tratarse del propio hidrolizado enzimático, cualquiera de sus fracciones, o una purificación de los mismos. 19. Uso de un péptido caracterizado por las secuencias de aminoácidos: SEQ. ID. N°. 16 y SEQ. ID. N°. 17 y por ser la unidades finales obtenidas tras simular la digestión gastrointestinal con pepsina y Corolasa PP de la SEQ. ID. N°. 14 para la elaboración de un producto funcional (alimento o aditivo) favorable para controlar o disminuir la presión arterial y/o medicamento para el tratamiento de la hipertensión arterial. 20. Composición farmacéutica caracterizada por comprender al menos alguno de los péptido bioactivos con actividad antimicrobiana y/o actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 a 13 ,16 y 17 y/o el producto bioactivo según la reivindicación 18. 21. Aditivo, ingrediente, o suplemento alimentario funcional caracterizado por comprender al menos alguno de los péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana, IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 a 13 ,16 y 17 y/o el producto bioactivo según la reivindicación 18 22. Producto alimentario funcional caracterizado por comprender al menos alguno de los péptidos bioactivos con actividad antimicrobiana, IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva in vivo y/o actividad antioxidante según las 1 a 13 ,16 y 17 y/o el producto bioactivo según la reivindicación 18 y/o el aditivo, ingrediente, o suplemento alimentario funcional según la reivindicación 21 Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la elaboración de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de infecciones microbianas. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la hipertensión. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario funcional según la reivindicación 22 en la elaboración de un producto alimentario funcional favorable para prevenir infecciones microbianas. Uso de aditivo, ingrediente, alimentario funcional según la reivindicación 22 en la elaboración de un producto alimentario funcional favorable para mitigar la hipertensión.