BRPI0611729A2 - peptìdeo bioativo, método para produzir o mesmo, produto bioativo, composição farmacêutica, aditivo, ingrediente ou suplemento alimentìcio funcional, produto alimentìcio funcional, e utilização da composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
PEPTìDEO BIOATIVO, MéTODO PARA PRODUZIR O MESMO, PRODUTO BIOATIVO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, ADITIVO, INGREDIENTE OU SUPLEMENTO ALIMENTìCIO FUNCIONAL, PRODUTO ALIMENTìCIO FUNCIONAL, E UTILIZAçãO DA COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A invenção refere-se à produção de produtos bioativos que são derivados de proteínas de leite para a produção de produtos de leite bioativos derivados de proteínas de leite, com particularidade caseínas. Os 16 peptídeos da invenção podem ser obtidos quimicamente, biotecnologicamente ou por meio de tratamento enzímátíco a partir de proteínas que contêm os mesmos e dar origem a peptídeos com uma atividade anti-microbiana, uma atividade inibidora conversora de angiotensão in vitro e/ou atividade anti-hipertensiva e/ou atividade antioxídante. Os referidos produtos farmacêuticos são adequados para o uso nas indústrias de alimentos e farmacêuticas, tanto na forma de um hidrolisado quanto de peptideos bioativos.
Description
PEPTÍDEO BIOATIVO, MÉTODO PARA PRODÜZIR O MESMO,PRODUTO BIOATIVO, ÜSO DE PM PEPTÍDEO, COMPOSIÇÃOFARMACÊOTICA, SEÜ ÜSO, ADITIVO, INGREDIENTE OüSUPLEMENTO ALIMENTÍCIO FUNCIONAL, SEÜ ÜSO, PRODUTOALIMENTÍCIO FUNCIONAL E SEU ÜSO
Campo de Aplicação
A invenção consiste da produção de produtosbioativos derivados de proteínas de leite. Estasproteínas dão origem, em seguida a um tratamentoenzimático, a peptídeos com uma atividadeantimicrobiana e/ou atividade inibidora de conversor deangiotensão in vitro (atividade inibidora de ACE) e/ouatividade anti-hipertensão e/ou atividade antioxidanteque são adequados para o uso nas indústrias dealimentos e farmacêuticas.
Estado da Técnica
0 papel do leite na nutrição humana é essencialdesde o momento do nascimento e é um alimento de altovalor nutritivo e funcional. 0 recente desenvolvimentode novas técnicas de separação bio^ecnológica tornoupossível o fracionamento de diferentes componentes doleite para serem usados com novos propósitosalimentícios e não alimentícios, e deste modo estãoaparecendo novas aplicações que contribuem paraaumentar o seu consumo. Desta forma, diferentesempresas dedicadas à produção de proteínas isoladas apartir de frações do leite estão interessadas emaumentar e diversificar os usos de alguns componentes,tais como caseínas e proteínas de soro. Este é o casodas indústrias envolvidas na produção de lactoferrina,usada como um agente antimicrobiano e que já está sendousada em alimentos infantis, iogurtes, suplementosalimentícios, formulações especiais, e em produtosdentários e dermatológicos. A lactoferrina também éusada por sua atividade antimicrobiana como aditivo emleite fresco para prolongar a sua vida de prateleira.
Nos últimos anos, alimentos funcionais abriramcaminho na indústria alimentícia devido ao conhecimentocada vez maior dos consumidores quanto à relação queexiste entre a dieta e a saúde. Entre os ingredientesfuncionais, definidos como aqueles componentes que,incorporados ao alimento, exercem atividades biológicasespecíficas que vão além de uma mera funçãonutricional, um daqueles em uma posição proeminente,devido à sua diversidade e multifuncionalidade,compreende os peptídeos bioativos. Estes peptídeos sãofragmentos inativos dentro da proteína precursora, masque, em seguida à sua liberação por meio de processosde hidrólise in vivo e/ou in vitro, exercem diferentesfunções fisiológicas no corpo. Desde a sua descobertaem 1979, foram descritos peptídeos derivados dasproteínas alimentícias com diferentes atividadesbiológicas: antimicrobianas, anti-hipertensão,imunomoduladoras, anti-trômbicas, opióides,antioxidantes, e outras assemelhadas. Estes peptídeostêm uma utilização potencial em alimentos e/ou produtosfarmacêuticos e podem ser liberados por meio dediferentes estratégias, sendo atualmente a hidróliseenzimática e a fermentação microbiana aquelas maisutilizadas.
Alguns dos peptídeos bioativos dignos de notaespecial são aqueles que exercem propriedadesantimicrobianas (R. Floris, I. Recio, B. Berkhout andS. Visser, Antibacterial and antiviral effects ofproteínas do leite and derivatives thereof, CurrentPharmaceutical Design, 2003, 9:1257-1275). A atividadeantimicrobiana do leite vem sendo estudada há muitotempo e tem sido atribuída convencionalmente adiferentes proteínas com atividade antimicrobianapresentes neste alimento (imunoglobulinas,lactoferrina, lactoperoxidase, lisozima, e outras).
Entretanto, também foi provada recentemente a atividadeantimicrobiana de peptídeos derivados das proteínas doleite. Muito embora não existam até agora estudosconclusivos no mecanismo de ação dos peptídeosantimicrobianos derivados das proteínas do leite,descobertas preliminares descreveram a capacidade dealgumas destas seqüências bioativas em interagir epreparar as membranas bacterianas (D. Chapple, D.J.Mason, C.L. Joannou, E.W. Odell, V. Grant, R.W. Evans,Structure-function relationship of antibacterialsynthetic peptides homologous to a helical surfaceregion on human lactoferrin against Escherichia coliserotype 0111, Infection and Immunity, 1998, 66, 2434-2440). Já se descreveram peptídeos com atividadeantimicrobiana, obtidos a partir de hidrolisadosenzimáticos de caseínas provenientes de uma fontebovina, tal como aS2-caseína (EP1114060, Processo paraproduzir peptídeos catiônicos a partir de fluidosbiológicos) e β-caseína e κ-caseína (W099/26971,Peptídeos antimicrobianos). Por meio de processos dehidrólise assemelhados, peptídeos com propriedadesantimicrobianas derivados de proteínas de soro de leitecoalhado foram isolados e identificados, tais comolactoferrina (W02004/089986, Peptídeo antimicrobianoproveniente da família de transferrina).
Outro grupo de peptídeos bioativos de grandeimportância é aquele dos peptídeos que são dotados deatividade anti-hipertensão dada a alta incidência deenfermidades das coronárias relacionadas comhipertensão em países desenvolvidos. Muitos destespeptídeos atuam na regularização do sistema Iab-fermento angiotensor através da inibição da inibição daenzima conversora de angiotensão (ACE) (T. Takano, Milkderived peptides and hypertension reduction,International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381) muitoembora não esteja regulamentado que seu efeito pode serpor meio de outros mecanismos. Descobriram-sepeptídeos diferentes que têm uma atividade inibidora deACE (ACEIa) obtida a partir de hidrolisados enzimáticosde caseínas (US 6514941, Método de preparação de umhidrolisado de caseína enriquecido com peptídeos anti-hipertensão) e de proteínas de soro de leite coalhado(WOOl/85984, Tratamento enzimático de proteínas de sorode leite coalhado para a produção de peptídeos anti-hipertensão, os produtos resultantes e tratamento dehipertensão em mamíferos) . Estudos realizados sobre arelação de atividade estrutural dos peptídeos dotadosde atividade hipertensão revelaram o papel fundamentalde determinados aminoácidos na execução desta atividade(H.-S. Cheung, F.-L. Wang, M.A. Ondetti, E.F. Sabo andD. W. Cushman. Binding of peptide substrates andinhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importanceof the COOH-terminal dipeptide sequence. Journal ofBiological Chemistry 1980, 255: 401-407). A presençade alguns destes aminoácidos também foi consideradacomo sendo essencial a fim de que a atividadeantioxidante seja exercida, e esta atividade tomou amaior importância nos últimos anos (H.M. Chen, K,Muramoto, F. Yamauchi, K. Fujimoto and K. Nokihara,Antioxidative properties of histidine-containingpeptides designed from peptide fragments found in thedigests of a soybean protein, Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 1998, 46: 49-53). Diferentesenfermidades degenerativas, tais como câncer, doença deAlzheimer, cataratas ou seu envelhecimento estãorelacionadas com a oxidação dos componentes celulares,lipídios, proteínas ou DNA. Estas enfermidades podemocorrer como um resultado do desequilíbrio entreagentes de oxidação e os sistemas antioxidantes doorganismo, razão pela qual a ingestão de compostosantioxidantes na dieta poderá ser de utilidade naprevenção deste tipo de enfermidades. Adicionalmente,estes compostos antioxidantes presentes nos alimentosretardam os processos de oxidação de gorduras, os quaissão considerados responsáveis por deterioração e porestes alimentos tomarem odores e sabores desagradáveis.Investigações recentes revelaram a capacidade dediferentes proteínas do leite e seus derivadosexercerem uma atividade antioxidante por meio dediferentes mecanismos de ação. Portanto, descreveram-se peptídeos que têm a capacidade para quelação deradicais livres a partir de caseínas hidrolisadas (K.Suetsuna, H. Ukeda and H. Ochi, Isolation andcharacterization of free radical scavenging activitiespeptídeos derived from casein, Journal of NutritionalBiochemistry, 2000, 11: 128-131; EP1188767, Isolatedantioxidant peptides from casein and methods forpreparing, isolating and identifying antioxidantpeptides) e proteínas de soro de leite coalhado (B.Hernández-Ledesma, A. Dávalos, B. Bartolomé and L.Amigo, Preparation of antioxidant enzymatichydrolyzates from α-lactalbumin and β-lactoglobulin.Identification of active peptides by HPLC-MS/MS,Journal of Agricultural and Food chemistry 2005, 53,588-593) . Adicionalmente a isto, as caseínas tornaram-se uma fonte principal de peptídeos dotados de umaatividade inibidora nas enzimas que catalisam osprocessos de oxidação de gorduras (S.G. Rival,S.Fornaroli, C.G. Boeriu and H.J. Wichers, Caseins andcasein hidrolisados. I. Lipooxygenase inhibitoryproperties, Journal of Agricultural and Food Chemistryf2001, 49: 287-294) .
A maior parte dos estudos realizados até agoragiraram em torno da atividade biológica de peptídeosderivados de caseínas bovinas. Entretanto, existempoucos ou nenhuns dados publicados sobre as atividadesbiológicas exercidas pelos peptídeos provenientes decaseínas de outros tipos, tais como caseínas ovinas ecaprinas. J.A. Gómez-Ruiz, I. Recio, e A. Pihlanto(Antimicrobial activity of ovine casein hydrolizates. Apreliminary study: Milchwissenschaft- Milk ScienceInternational 2005, 60:41-45) descreveram o potenteefeito inibidor, dependente de dose, na atividademetabólica de Escherichia coli JM103 exercido porhidrolisados de β-caseína. Entretanto, nenhumaidentificação foi realizada neste estudo dos peptídeosresponsáveis para este efeito. Pelo contrário,diversas seqüências liberadas a partir de caseínasovinas durante os processos de fermentação eenvelhecimento característicos de preparação de queijoManchego, alguns dos quais exibiram atividade inibidorade ACE, foram na verdade identificados (J. A. Gómez-Ruiz, M. Ramos and I. Recio, Identification andformation of angiotensin-converting enzyme-inhibitorypeptídeos in Manchego cheese by high-performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry, Journal ofChromatography A, 2004, 1054: 269:277). Os valoresIC50 (inibição de concentração da atividade de enzimaem 50%) destas seqüências variaram de 24,1 a 1275,4 μΜ.
Neste estudo, o peptídeo que exibiu a maior atividadeinibidora de ACE foi aquele do fragmento de asi-caseínaf (205-208) da seqüência VRYL (SEQ. ID. No. 11), quemostrou um valor IC50 de 24,1 μΜ. (J.A. Gómez-Ruiz, M.Ramos and I. Recio, Angiotensin converting enzyme-inhibitory activity of peptides isolated from Manchegocheese. Stability under simulated gastrointestinaldigestion. Int. Dairy Journal 2004, 1075-1080).Entretanto, não existem dados publicados sobre acapacidade de estes peptídeos passarem pela barreiraintestinal e na sua capacidade de exercerem o efeitoanti-hipertensão in vivo. Deve ser salientado quemuitos peptídeos que exibem atividade de inibição ACEin vitro freqüentemente perdem toda ou parte de suaatividade quando são testados in vivo, ou mesmopeptídeos que não exibem qualquer atividade inibidorade ACE importante in vitro adquirem esta atividade invivo devido à ação de enzimas digestivas (M. Maeno, N.Yamamoto and T. Takano, Identification of an anti-hypertensive peptide from casein hydrolysate producedby a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790,Journal of Dairy Science, 1996, 79: 1316-1321). Nemexistem quaisquer estudos publicados sobre ascapacidades multifuncionais dos peptídeos liberados apartir das caseínas de diferentes tipos para exerceremvárias atividades biológicas, tais como a atividadeanti-hipertensão, a atividade antimicrobiana e/ou aatividade antioxidante.
Existem determinadas áreas dentro da seqüência deproteínas alimentícias que, uma vez liberadas porhidrólise, podem exibir atividades biológicas. Estesfragmentos, conhecidos como peptídeos bioativos, podemser gerados in vivo durante a hidrólise das proteínasatravés da ação das enzimas gastrintestinais, ou invitro por meio da ação de enzimas específicas oudurante o processo de preparação de determinadosalimentos. Dada a alta qualidade biológica dasproteínas do leite, é um fator do maior interesseobterem-se peptídeos bioativos a partir dessasproteínas, que, quando tomadas como parte da dieta,além de exercerem suas funções nutricionais básicas,são capazes de produzir efeitos metabólicos oufisiológicos de utilidade na manutenção da saúde e naprevenção de enfermidades. A produção de peptídeosbioativos a partir de proteínas do leite possibilitaráencontrar novos usos para este alimento, além de seuvalor nutricional convencional, incluindo a produção deprodutos farmacêuticos e nutricionais. Istocontribuiria para o desenvolvimento de alimentossaudáveis, seguros, de alta qualidade, contribuindopara fazer o melhor uso do que os produtos de leite têmpara oferecer e de serem mais altamente apreciados.DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Descrição breve da invenção
A invenção consiste na produção de produtosderivados de proteínas do leite que contêm peptídeosbioativos dotados de atividade antimicrobiana e/ouinibidora de ACE in vitro e/ou atividade anti-hipertensora e/ou atividade antioxidante por meio dehidrólise enzimática da fração de caseína.
Os peptídeos bioativos são produzidos por meio dahidrólise de uma ou mais proteínas, peptídeos oufragmentos dos mesmos que contêm a seqüência deaminoácidos dos referidos peptídeos bioativos peloemprego de enzimas proteolíticas (preferentementepepsina e, onde for aplicável, também Corolase PP*) econdições de hidrólise permitindo a ruptura da cadeiaprotéica nos locais apropriados para a sua liberação.
No caso de se utilizarem as duas enzimas para simulardigestão gastrintestinal, serão obtidas as unidadespeptídicas funcionais mínimas que estarão em condiçãode ser assimiláveis gastrintestinalmente e de passarpara a corrente sangüínea. Esta propensão abre aaplicação destes peptídeos a outras formas deadministração diferentes da administração oral ou- aumenta a sua taxa de absorção. Eles também podem serproduzidos por meio de síntese química ou por meio demétodos de recombinação, e assemelhados. Estespeptídeos podem ser ingeridos como tais ou a partir dehidrolisados brutos, a partir de concentrados de baixopeso molecular, ou a partir de outras sub-fraçõesativas obtidas por meio de métodos de separaçãobaseados em dimensão ou por meio de métodoscromatográficos.
Estes hidrolisados, suas frações ou os peptideospoderão formar parte dos produtos alimentícios,servindo como preservativos alimentícios e, ao seremtomados, favorecendo as defesas naturais do corpo,adicionalmente ao serem também usados na preparação deprodutos farmacêuticos para o tratamento deenfermidades, sendo particularmente capazes defacilitarem o controle de pressão sangüínea e/ouinfecções bacterianas. A invenção amplia as aplicaçõesde proteínas do leite pela contribuição para fazermelhor utilização de tudo o que elas têm a oferecer epor serem mais altamente valiosas.
-Descrição detalhada da Invenção
A invenção proporciona um método para produzirpeptideos bioativos a partir de caseínas do leite.
Estes peptideos bioativos são aqueles identificados comas seqüências de aminoácidos ilustradas na SEQ. ID No.1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. IDNo. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8,SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10, SEQ. ID No. 12, SEQ. IDNo. 13, SEQ. ID No. 14, SEQ. ID No. 15, SEQ. ID No. 16,SEQ. ID No. 17, (Tabela 1) , algumas das quais exercematividade antimicrobiana e/ou atividade inibidora deACE in vitro e/ou atividade anti-hipertensão e/ouantioxidante.
0 material de partida desta invenção será qualquersubstrato apropriado que seja compreendido de uma oumais proteínas ou peptídeos de origem animal ouvegetal, ou que provém de microorganismos, que contéma seqüência de aminoácidos dos peptídeos bioativos deinteresse. Aqueles que pertencem à seqüência de as2-caseína, (SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3,SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. IDNo. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10,Tabela 1) , qualquer preparado que contenha as2-caseínade diferentes tipos, suas frações ou peptídeos ou seusfragmentos de qualquer dimensão poderão obviamente serusados, seja sozinhos ou em combinação com outrasproteínas. Aqueles pertencentes à asi-caseína (SEQ. IDNo. 12, SEQ. ID No. 13), qualquer preparado quecontenha asi~caseína de diferentes tipos, suas fraçõesou peptídeos ou seus fragmentos da dimensão requeridapoderão obviamente ser usados, seja sozinhos ou emcombinação com outras proteínas. Aqueles pertencentesà β-caseína (SEQ. ID No. 14, SEQ. ID No. 16 e SEQ. IDNo. 17) , qualquer preparado que contenha β-caseina dediferentes tipos, suas frações, ou peptídeos ou seusfragmentos da dimensão requerida poderão obviamente serusados, seja sozinhos ou em combinação com outrasproteínas. Desta maneira, na dependência do peptídeoou dos peptídeos procurados, será possível utilizarCisl-Caseina pura, as2-caseína pura, β-caseína pura,caseína integral, caseinatos e leite nas suasdiferentes formas de apresentação, produtos de leitefermentado, hidrolisados de proteína de leite,subprodutos de leite, derivados de leite paraalimentação de animais e outros.
O dito material de partida é dissolvido oudispersado, sob uma concentração apropriada, em água ouem uma solução amortecedora, sob um pH apropriado paraa ação da enzima proteolítica. Qualquer enzimaproteolítica capaz de dissolver a proteína presente nomaterial de partida e de proporcionar os peptídeos deinteresse poderá ser empregada, mas preferentementepepsina sob pH 2,0-3,0. Microorganismos proteolíticoscapazes de realizarem uma fermentação do substrato e ahidrólise da proteína poderão ser igualmente usados.
As condições de hidrólise: pH, temperatura,relação de enzima-substrato, interrupção da reação eassemelhados são otimizados para o propósito deselecionar os hidrolisados mais ativos. De acordo comuma concretização particular, os peptídeos bioativossão produzidos por meio do emprego de pepsina sob um pH3,0 em uma relação de enzima-substrato de 3,7/100 (p/p)e executando-se a hidrólise a 370C durante um períodode tempo variável de 10 minutos a 24 horas, maspreferentemente por um período menor do que 3 0 minutos.
Os peptídeos bioativos identificados como SEQ.IDNo. 15, SEQ. ID. No. 17, (Tabela 1) que são dotados deatividade inibidora de ACE in vitro e/ou atividadeanti-hipertensão, devido à sua estrutura e resistênciaàs enzimas gastrintestinais, serão as unidades depeptídeo funcionais mínimas que, em seguida à digestãogastrintestinal, estarão em condição de serassimiláveis gastrintestinalmente e de passar nacorrente sangüínea. O material de partida seráqualquer substrato apropriado que seja compreendido deuma ou mais proteínas ou peptídeos de origem animal ouvegetal ou que provenham de microorganismos quecontenham a seqüência de aminoácidos dos peptídeosbioativos de interesse (SEQ.ID No. 15, SEQ. ID. No. 17,(Tabela 1) , preferentemente as2-caseína e β-caseína.Qualquer preparado que contenha as2-caseína ou β-caseína de diferentes tipos, ou peptídeos ou seusfragmentos de qualquer dimensão poderão ser obviamenteusados, seja sozinho ou em combinação com outrasproteínas. Por exemplo: as2-caseína pura, β-caseínapura, caseína integral, caseínatos e leite nas suasdiferentes formas de apresentação, produtos de leitefermentado, hidrolisados de proteína de leite,subprodutos de leite, derivados de leite paraalimentação de animais e outros.
As condições de hidrólise: pH, temperatura,relação de enzima-substrato, interrupção da reação eassemelhados são otimizados para o propósito deselecionar os hidrolisados mais ativos. De acordo comuma concretização particular, isto é conseguido pormeio de hidrólise da caseína de pepsina-hidrolisada ouda sua fração de menos que 3 000 Da, ou dos peptídeossintéticos que contêm (PVYRYL SEQ. ID No. 7, HLPLPLLSEQ. ID. No. 14) , com Corolase PP®, sob pH 7-8, em umarelação de enzima-substrato 1:25 p/p a 37 0C duranteaproximadamente 2,5 horas. A reação é interrompida poraquecimento a 95 0C durante 10 minutos em um banho deágua. Corolase PPe é um preparado de enzimaspancreáticas de porco que contêm amino ecarboxipeptidase adicionalmente a tripsina equimiotripsina.
Em seguida, na eventualidade de se desejarconcentrar os peptídeos bioativos, e dado que ospeptídeos com atividade antimicrobiana são de naturezacatiônica, a separação das frações que contêm ospeptídeos bioativos pode ser realizada por meio decromatografia de troca de íons (FPLC) . A partir dasfrações mais altamente catiônicas, sub-frações ativaspodem ser isoladas por meio de uma outra varredurautilizando-se cromatografia de permute de cátions,cromatografia hidrofóbica, e assemelhadas, oupreferentemente cromatografia de líquido de altodesempenho de fase inversa (RP-HPLC).
Alternativamente, os peptídeos bioativos podem serconcentrados a partir do hidrolisado por meio demétodos tais como ultrafiltragem, diálise, eletro-diálise com o poro de membrana apropriado,cromatografia de gel-filtro e assemelhadas.Adicionalmente aos hidrolisados completos e àssuas frações, os peptídeos ilustrados na Tabela 1marcados como SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No.3, SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. IDNo. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10,SEQ. ID No. 12, SEQ. ID No. 13, SEQ. ID No. 14 exibempropriedades bioativas, principalmente atividadeantimicrobiana e/ou atividade inibidora de ACE e/ouatividade anti-hipertensão e/ou atividade antioxidanteconstituem também um objeto desta invenção.
Especificamente, os peptideos identificados com asseqüências SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3,SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. IDNo. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10exibem bactérias Gram-positivas de atividadeantimicrobiana, e pelo menos a seqüência SEQ. ID. No. 3exerce adicionalmente um efeito antimicrobiano potentecontra Escherichia coli. Adicionalmente a isto, ospeptídeos identificados com as seqüências SEQ. ID. No.Ie SEQ. ID. No. 7 exibem uma potente atividade invitro inibidora de ACE, e a seqüência SEQ. ID. No. 7exibe atividade anti-hipertensão em ratosespontaneamente hipertensos (SHR) quando administradosoralmente a estes animais. Além disto, pelo menos opeptídeo identificado como SEQ. ID. No. 7 tem umaatividade antioxidante considerável por meio de ummecanismo de quelação de radical de oxigênio. De umaforma assemelhada, o peptídeo identificado nocertificado de alteração como SEQ. ID. No. 14, a partirdas β-caseínas, também exibe uma alta atividadeinibidora de ACE. Adicionalmente à caseina hidrolisadapor pepsina e Corolase PP®, os peptídeos ilustrados naTabela 1 e assinalados por SEQ. ID. No. 15 e SEQ. IDNo. 17 têm atividade anti-hipertensão em ratosespontaneamente hipertensos (SHR) e constituem tambémum objeto desta invenção. Deve ser feita mençãoespecial ao fato de que estes são peptídeos naturaisprovenientes de produtos altamente consumidos a partirdos quais são de se esperar poucos efeitos colaterais euma boa tolerância.
De uma forma assemelhada, os peptídeos bioativosidentificados nos hidrolisados de pepsina (SEQ. ID No.1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. IDNo. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8,SEQ. ID No. 9, SEQ. ID No. 10, SEQ. ID No. 12, SEQ. IDNo. 13, SEQ. ID No. 14) e, adicionalmente, com CorolasePP®, (SEQ. ID No. 15, SEQ. ID No. 16, SEQ. ID No. 17,Tabela 1) , conhecendo-se a sua seqüência, tecnologiaatualmente disponível torna possível a obtenção dosmesmos por síntese de peptídeo enzimática e/ou química.
Tabela 1. Seqüências dos peptídeos bioativosidentificados
<table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>
A produção de peptídeos bioativos a partir de as2-caseína ovina hidrolisada por pepsina não foi descritaanteriormente, muito embora certamente já tivessem sidodescritos peptídeos antimicrobianos derivados destaproteína de origem bovina (EP1114060, Processo paraproduzir peptídeos catiônicos a partir de fluidosbiológicos). Alguns peptídeos derivados de as2-caseínae de outra caseína ovina em queijo Manchego comatividade inibidora de ACE também foram anteriormenteidentificados (J.A. Gómez-Ruiz, M. Ramos and I. Recio,Identification and formation of angiotensin-convertingenzima-inhibitory peptides in Manchego cheese by high-performance liquid chromatography-tandem massspectrometry, Journal of Chromatography A, 2004, 1054:269:277), muito embora nenhum estudo tenha sidorealizado quanto à sua atividade anti-hipertensão invivo. Um dos peptideos que é dotado de atividadeinibidora de ACE previamente identificados é ofragmento 205-208 da as2-caseína ovina de seqüênciaVRYL (SEQ. ID. No. 11) (IC50 24, 1 -μΜ) . Entretanto, aseqüência SEQ. ID. No. 7 desta invenção, PYVRYL (IC501,94) possui uma atividade inibidora de ACE 12 vezesmais potente do que aquela anteriormente descrita o quejustifica a necessidade da seqüência integralencontrada nesta invenção a fim de exercer umaconsiderável atividade anti-hipertensão e/ouantioxidante e/ou antimicrobiana. A totalidade daseqüência SEQ.ID.No. 7 também é requerida a fim deexercer a atividade anti-hipertensão e/ou antioxidantee/ou antimicrobiana. Adicionalmente, também é mostradoque, em seguida à simulação gastrintestinal daseqüência SEQ. ID. No. 7 desta invenção, o fragmentoativo mínimo é aquele da seqüência PYV SEQ. ID. No. 15.
Por outro lado, este método torna possível obteros peptideos bioativos (SEQ. ID No. 15, SEQ. ID No. 16,SEQ. ID No. 17, Tabela 1) mediante o emprego depreparados enzimáticos e condições que simulam digestãogastrintestinal. Desta maneira, é provável que osfragmentos que são obtidos sejam os produtos finais dahidrólise, capazes de serem absorvidos no tratogastrintestinal e de serem aqueles diretamenteresponsáveis pela ação anti-hipertensão. Entretanto,não pode ser excluída uma outra hidrólise pelaspeptidases de plasma. A produção de pequenosfragmentos ativos é vantajosa porque estes fragmentosseriam mais fáceis de administrar por diferentes vias,e quando administrados oralmente seriam de ação maisrápida.
Estes produtos de leite: leite integral, fraçõesde leite, caseínas, caseinatos, e assemelhadosconstituem um substrato facilmente disponível, barato,para produzir peptídeos bioativos que poderiam serusados como substâncias terapêuticas com atividadeantimicrobiana e/ou atividade inibidora de ACE e/ouatividade anti-hipertensão e/ou antioxidante. Estesprodutos de leite podem ser colocados através de umtratamento térmico, tal como pasteurização, oualternativamente ser colocados através de um processode secagem ou congelamento-secagem, e outros, a fim deser usado como produtos alimentícios funcionais,aditivos ou ingredientes alimentícios, ou produtosfarmacêuticos para o tratamento e/ou prevenção deinfecções e/ou hipertensão arterial em todas as suasformas, principalmente em seres humanos, muito emboratambém em animais. A quantidade de hidrolisado, fraçãode baixo peso molecular, peptídeos, seus derivados ousais farmaceuticamente aceitáveis e as suascombinações, bem como a sua dosagem para o tratamentode qualquer enfermidade, serão variáveis na dependênciade numerosos fatores, tais como idade, seriedade daenfermidade ou distúrbio, via de administração efreqüência da dose. Estes compostos poderão serapresentados em qualquer forma de administração, sejaela sólida ou liquida, e ser administrados por meio dequalquer via apropriada, seja ela oral, respiratória,retal ou tópica, muito embora eles sejamparticularmente concebidos para administração oral naforma sólida ou liquida.
De uma maneira geral, o método para a produçãodestes produtos: os hidrolisados integrais, as suasfrações e os seus peptídeos constituintes, podem serotimizados pela focalização dos mesmos na produção damaior quantidade possível de peptídeos bioativos oupara controlar sabor amargo penetrante na maiorextensão possível, normalmente resultante da altaconcentração de peptídeos hidrofóbicos de médio oubaixo peso molecular.
Métodos analíticos
Medição da atividade antimicrobiana
A atividade antimicrobiana é determinada de acordocom o método de A. Pellegrini, C. Deltting, U. Thomas,P. Hunziker (Isolation and characterization de fourbactericidal domains in the bovine β-IactoglobulinBiochimica et Biophysica Acta, 2001, 1526:131-140)utilizando-se como microorganismos Escherichia coli[American Type Culture Collection (ATCC) , Rockville,MD, USA] ATCC 25922, Listeria innocua [ColecciónEspanola de Cultivos Tipo (CECT) Valencia, Spain] CECT910T, Staphylococcus epidermidis CECT 231, Enterococcusfaeealis CECT 795, Serratia mareeseens CECT 854 eStaphyloeoceus earnosus CECT 4491T.
As suspensões bacterianas são inoculadas a 1%em Tryptose Soy Broth (TSB) para Eseheriehia eoli,Serratia mareeseens e as variedades da espécieStaphylococcus, ou no caldo de infusão cérebro-coração(BHI) para Enteroeoceus faeealis e Listeria innoeua. Aincubação é realizada a 37°C, com exceção do caso deSerratia mareeseens, que é a 30°C.
O inóculo bacteriano, a partir do qual é iniciadoo trabalho, é obtido depois de incubação de uma colôniadesenvolvida em TSB-Agar ou BHI-Agar em 10 ml de TSB ouBHI durante a noite a 37° ou 30°C. A suspensãobacteriana (1 ml) é diluída 1/50 com o correspondentemeio de cultura, sendo incubado à temperaturaapropriada para cada variedade até a obtenção de umadensidade populacional de 1-4x1O8 unidades de formaçãode colônia (CFU) por ml. A cultura é centrifugada a2000 χ g durante 10 minutos, as bactérias sedimentadassão lavadas duas vezes com 15 ml de amortecedor defosfato (pH 7,4) e a população é ajustada para IO6CFU/ml. Em uma placa de múltiplas cavidades estéril(Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Germany), 50 μΐda suspensão bacteriana, 50 μΐ da substância a sertestada e 100 μΐ do amortecedor de fosfato sãomisturados com 2% do meio de cultura apropriado em cadacaso, e a mistura é incubada a 37°C ou 30°C durante 2horas. Depois deste período, a mistura é diluída paraIO"5, adicionam-se 100 μΐ de cada uma das diluições aplacas de TSB-Agar ou BHI-Agar e as placas sãoincubadas durante 24 horas, período este depois do qualse efetua a contagem da colônia.
A equação seguinte é usada para se calcular aatividade antimicrobiana:
<formula>formula see original document page 24</formula>
onde
N0 é o número de partida de CFU/ml
Nf é o número final de CFU/ml
Medição da atividade inibidora de enzima conversora deangiotensin (ACEIa)
A atividade inibidora de ACE é medida in vitro pormeio do método de D.W. Cushman e H.S. Cheung(Spectrophotometric assay and properties deangiotensin-converting enzyme in rabbit Iung.Biochemical Pharmacology, 1971, 20:1637-1648)posteriormente modificado por Y.K. Kim, S. Yoon, D. Y.Yu, B. Lõnnerdal e B.H. Chung (Novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived fromrecombinant human asl-casein expressed in Escherichiacoli. Journal de Dairy Research 1999, 66,431-439).
O substrato, hipuril histidil leucina (HHL, Sigma,Chemical Co, St. Louis, MO, USA), é dissolvido emamortecedor de borato 0,1 M com 0,3 M NaCl, pH 8,3,para se obter uma concentração final de 5mM.
Adicionam-se 40 μΐ de cada uma das amostras cujaatividade inibidora de ACE se destina a ser ensaiada a100 μΐ de substrato. A enzima ACE (CE 3.4.5.1, Sigma)é adicionada, dissolvida em glicerol a 50% e diluída nahora de realizar o teste em água bidestilada 1/10. Areação é realizada a 370C durante 3 0 minutos em banhode água. A enzima é desativada por redução do pH com150 μΐ de HCL IN. 0 ácido hipúrico formado é extraídocom 1000 μΐ de etil acetato. Depois de agitação emvórtice durante 20 segundos, é centrifugado a 3000 χ gdurante 10 minutos sob temperatura ambiente. Recolhem-se 750 μΐ a partir da fase orgânica que é evaporada aquente a 95°C durante 10 minutos. O resíduo de ácidohipúrico é re-dissolvido em 800 μΐ de água bidestiladae, depois de agitação durante 20 segundos, efetua-se amedição de absorvência a 228 nm em um espectrofotômetroDur-70 proveniente da Beckman Instruments, Inc.,Fullerton, USA.
A equação seguinte é usada para se calcular apercentagem de atividade inibidora de ACE:
<formula>formula see original document page 25</formula>
O modelo é usado para corrigir a absorvência defundo. Este modelo contém substrato, enzima e 2 0 μΐ deágua bidestilada em vez de amostra, e a reação é paradeno tempo zero. 0 controle acarretou cem por cento daação enzimática no substrato na ausência de inibidorese contém 20 μΐ de água no lugar da amostra e é incubadodurante o mesmo espaço de tempo que é usado para aamostra.
Os resultados são expostos como IC50 (μΜ) ouconcentração sob a qual a atividade da enzima é inibidapor 50%. A concentração de proteína é determinada pormeio do teste de ácido bicincônico (Pierce-Rockord, IL,USA), utilizando-se soroalbumina bovino como um padrão.
Medição da atividade antioxidante
A capacidade de absorção de radical de oxigênio(ORAC) é determinada pelo método desenvolvido por B.X.Ou, M. Hampsch-Woodill, RL. Prior (Development andvalidation de an improved oxygen radical absorbancecapacity assay using fluorosceína as the fluorescentprobe, 2001, 49:4619-4626). Este método é baseado naoxidação da fluoresceína pelos radicais de peroxilproduzidos in si tu por decomposição térmica dodiidrocloreto de 2,2'azo-bis 2-amidinopropano a Xexo =493 nm e Xcm = 515 nm. A presença de antioxidantesprevine ou retarda a decomposição da fluoresceína.
A solução normal de fluoresceína é preparadadiariamente para uma concentração de 60 nM a partir de100 μΜ de uma solução-mãe de fluoresceína em 75 nM deamortecedor de fosfato (pH 7,5). Como um antioxidantede controle utiliza-se ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (Trolox), que épreparado para uma concentração de 20 nM (solução-mãe)em amortecedor de fosfato e é armazenado a -20°C. Umacurva de calibragem de Trolox é marcada pela análisedas soluções padrão de concentrações de 12,5, 25, 40,50 e 100 pM, preparadas a partir da solução-mãe. 0AAPH é dissolvido no amortecedor de fosfato para umaconcentração final de 143 mM, mantendo-o a uma baixatemperatura para impedir a sua decomposição.
Para a realização do ensaio, misturam-se 375 μΐ daamostra com 375 μΐ de AAPH e 2,225 ml de fluoresceína,incubando-se esta mistura a 37°C. A cada 5 minutos afluorescência é medida (Xexo = 493 nm e Xcm = 515 nm) nofluorimetro RF-1501 (Shimadzu). Conduzem-se controlesno ensaio que consistem de um modelo que contémfluorosceína e amortecedor de fosfato para verificação,para assegurar a estabilidade da fluorescência durantea experiência, e um controle de oxidação máximapositiva que contém fluorosceína, AAPH e amortecedorde fosfato. Como um controle da atividade antioxidantemáxima, uma solução de Trolox 40 μΜ é incluída em cadaconjunto de amostras a serem analisadas. Todas asamostras foram analisadas em triplicata.
A atividade antioxidante é quantificada por meioda medição da "área sob curva" (AUC) da curvadescendente de fluorescência de fluorosceína e é dadaem equivalentes Trolox (valor 0RAC). A AUC é calculadautilizando-se a seguinte equação:AUC = (0,5 + U/U + 1IO/ -lO + J-15 /f0 +....+ f3o/fo
onde f0 é a f luorescência no tempo zero e f0 é afluorescência no tempo "i".
O valor de ORAC relativo para os peptídeos édeterminado utilizando-se a seguinte equação:
ORAC = [ (AUCamostra - AUCmodelo ) / (AUCtroiox - AUCmodeio) ] x[(molaridade / molaridade de amostra]
Isolamento de frações de peptídeos por cromatografia detroca de íons (FPLC)
O isolamento das frações de peptídeos do tipocatiônico é realizado pelo método de I. Recio, S.
Visser (Identification of two distinct antibacterialdomains within the sequence of bovine as2-caseína.Biochimica et Biophysica Acta 1999, 1428:314-326) comalgumas modificações, em um sistema de FPLC,utilizando-se uma coluna de permuta de cátions HiLoad™26/10 SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala,Sweden) . As fases AeB são compreendidas de NH4HCO310 nM (ajustado para pH 7,0 com HC00H) , e NH3 1,5 M,respectivamente. As amostras são dissolvidas na fase Apreparada para uma concentração de 5 mg/ml, em umvolume de 5 ml, sendo injetadas por meio de umSuperloop™ (Pharmacia) de 50 ml. 0 hidrolisado éeluído sob uma taxa de fluxo de 5 ml/min. Depois de 20minutos com solvente A 100%, um gradiente de 0% a 50%de solvente B em A é aplicado em 60 minutos, seguidopor 20 minutos com o solvente B a 50%. A detecção éexecutada sob uma absorvência de 214 nm. A temperaturada coluna e das fases móveis é de 9°C. As frações sãocoletadas em seguida a diversas análises decromatografia.
Isolamento de frações de peptídeos por meio decromatograf ia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RF-HPLC) em uma escala semipreparatória.
Utiliza-se um sistema compreendido de duas bombasprogramáveis modelo Waters Delta 600, um detector desistema de diodos Mod. 966, um injetor automático Mod.717 plus e um coletor de frações automático (WatersCorp., Milford, MA, USA). Utiliza-se uma coluna Ci8Prep NovaPack® HR, 7,8 χ 300 mm e uma dimensão de porode 6 μπι (Waters) , com um cartucho Ci8 (Waters) como umaproteção de coluna. As análises são realizadas a 30°C,e a detecção a 214 e 280 nm. A aquisição de dados éefetuada com o Software Millennium versão 3.2 (Waters).
As amostras de as2-caseína são preparadas sob umaconcentração de 2,5 mg/ml e, antes da injeção sãocentrifugadas a 16 000 χ g durante 10 minutos. Para aeluição das amostras, utiliza-se vim gradiente de águaMilliQe binário (fase A) e acetonitrilo (fase B) comácido trifluoroacético 0,1% e 0,08%, respectivamente,sob uma velocidade de fluxo de 4 ml/min. 0 gradientede fase B varia de 0% a 40% em 50 minutos e de 40% a70% durante 5 minutos, sendo a coluna lavada com 70% deB durante 5 minutos e recondicionamento da coluna paraas condições de partida durante 25 minutos. 0 volumeda amostra injetado é de 300 μΐ. As amostras de totalcaseínas são preparadas sob uma concentração delOOmg/ml e, antes da injeção, são passadas através deum filtro com uma dimensão de poro de 0,45 pm. Para aeluição das amostras, são utilizados um gradiente deágua MilliQ® binário (fase A) e de acetonitrilo (faseB) com ácido trifluoroacético 0,1% e 0,08%,respectivamente, sob uma velocidade de fluxo 4 ml/min.
O gradiente da fase B varia de 0% a 35% em 70 minutos ede 35% a 70% durante 5 minutos, sendo a coluna lavadacom 70% de B durante 5 minutos e recondicionamento dacoluna para as condições de partida durante 20 minutos.O volume de amostra injetado é de 50 μΐ.
Análise por espectrometria de massa em tandem (fora de linha)
Utiliza-se um sistema interceptador de ínosEsquire 3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).
As amostras são preparadas para uma concentração de 2mg/ml em uma solução a 50% de água:aceto-nitrilo (v/v)com ácido fórmico a 0,01% (v/v). A amostra é injetadano nebulizador de spray eletrostático sob umavelocidade de fluxo de 4 μΐ/min utilizando-se uma bombade seringa modelo 22 (Harvard Apparatus, South Natick,MA, USA) . O sistema utiliza nitrogênio como gás denebulização e secagem e opera sob uma pressão de héliode 5 χ IO"3 bar. Os espectros de massa são adquiridosem um intervalo de 100-2000 m/z sob uma velocidade de13 000 Da/segundo. A interpretação para os espectros demassa em tandem para a identificação das seqüências depeptídeos é realizada com o programa Biotools 2.1(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany).
Análise por RP-HPLC conectado em linha paraespectrometria de massa em tandem (RP-HPLC-MS/MS)
Utiliza-se um sistema Esquire-LC (Bruker DaltonikGmbH, Bremen, Germany). 0 sistema HPLC (série 1100) écompreendido de uma bomba quaternária, um injetorautomático, um sistema desgaseificador de eluente e umdetector de ultravioleta de comprimento de ondavariável. (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)conectado em linha a um espectrômetro de massainterceptador de íons Esquire 3000 (Bruker Daltonik).
A coluna é uma coluna Hi-Pore C18 (250 χ 4,6 mm i.d., 5μπι dimensão de partícula) (Bio-Rad Laboratories,Richmond, CA, USA). 0 solvente A é uma mistura de águae ácido trifluoroacético (1000:0,37) e o solvente B umamistura de acetonitrilo e ácido trifluoroacético(1000:0,27). Injetam-se 50 μΐ de amostra preparadapara uma concentração de 4,5 mg/ml. Utiliza-se umavelocidade de fluxo de 0,8 ml/min, com um gradientelinear de 0% a 50% de solvente B em A em 60 minutos. 0eluente monitorado a 214 nm por meio de espectrometriade massa sob as mesmas condições que foramestabelecidas na seção imediatamente precedente, com aexceção de que a velocidade de fluxo da injeção daamostra através do nebulizador foi de 275 μΐ /min.
Estudo da atividade anti-hipertensora em ratosespontaneamente hipertensos (SHR)
Estudou-se o efeito de diversos dos peptídeosidentificados na pressão sangüínea de ratosespontaneamente hipertensos (SHR). Para este estudo ospeptídeos são sintetizados quimicamente.
O estudo é realizado com ratos SHR machos de 17-20semanas de idade, pesando 300 a 350 g, provenientes deCharles River Laboratories Espana S.A. Os ratos sãomantidos em gaiolas, cinco por gaiola, mantendo-se umatemperatura estável de 25°C, com ciclos de iluminação-escuridão de 12-horas, dando-se água e alimento àvontade. Tiram-se medições de pressão sangüíneasistólica (SBP) e de pressão sangüínea diastólica(DBP) , propósito esse para o qual se utiliza o métodode pancada na cauda (R.D. Bunag, Validation in awakerats de tail-cuff method for measuring systolicpressure, J. Appl. Physiol., 1973, 34: 279-282). Ouso de equipamento (Le5001, Letica) proporcionouvalores digitais de SBP e DBP automaticamente. Esteequipamento registra e também facilita a freqüênciacardíaca dos animais. Antes da aplicação de pancada nacauda e do transdutor na posição nas caudas dos ratos,os ratos foram expostos a uma temperatura próxima de37°C de maneira a facilitar a dilatação da artériacaudal. Adicionalmente, com a finalidade de seassegurar a confiabilidade da medição, os animais foramhabituados ao procedimento 2 semanas antes darealização do teste em questão. Os valores de SBP eDBP são determinados pela realização de 3 mediçõesconsecutivas e calculando-se a média dos três valorespara cada uma destas duas variáveis.
Os ratos espontaneamente hipertensos (SHR) usadospara o estudo têm valores de SBP variáveis de 190 mm Hgaté 220 mm Hg, e valores de DBP variáveis de 13 0 mm Hgaté 180 mm Hg.
Os produtos a serem testados são administrados pormeio de um cateter intragástrico durante um período queabrange de 9 a.m. até 10 a.m., e a dosagem testada éadministrada dissolvida em 1 ml de água destilada.
Tomam-se leituras da SBP e da DBP antes daadministração, e medições periódicas destas variáveistambém são realizadas a cada 2 horas em seguida àadministração, até 8 horas após-administração.
Adicionalmente também são tomadas medições da SBP e daDBP 24 horas após a administração dos produtos emquestão. Como um controle negativo (para estabelecer avariação circadiana da SBP e da DBP nos ratoscateterizados) utilizam-se as medidas de SBP e DBPtomadas em testes assemelhados com ratos aos quais éadministrado 1 ml de água por cateter intragástrico.Como um controle positivo, utilizam-se as medições deSBP e DBP tomadas em testes assemelhados com ratos aosquais foram administrados 50 mg/kg de captopril(protótipo de droga inibidora de ACE) . Esta dose dacaptopril é administrada a cada rato dissolvida em 1 mlde água destilada.
Os resultados são agrupados e calcula-se a média +do erro padrão da medição (SEM) para um mínimo de 6testes homogêneos. Para compará-los, utiliza-se umaanálise de variação de uma via, seguida pelo teste deBonferroni. A diferença em valores de p<0,05 éconsiderada significativa.
Descrição breve do que está incluído nas figuras
Figura 1: Cromatograma tomado utilizando-secromatografia permutadora de íons (FPLC) da as2-caseínaovina hidrolisada por pepsina durante 30 minutos, emque são selecionadas 5 frações (FA-FE) , que foramcoletadas manualmente. 0 tempo, dado em minutos, estámarcado no eixo X.
Figura 2A: Cromatograma tomado utilizando-secromatografia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RP-HPLC) em uma escala semi-preparatória dafração FC coletada a partir da as2-caseína ovinahidrolisada por pepsina durante 30 minutos.Selecionam-se quatro (4) subfrações (FC1-FC4), queforam coletadas manualmente. 0 tempo, dado em minutos,está marcado no eixo X.
Figura 2B: Cromatograma tomado utilizando-secromatografia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RP-HPLC) em uma escala semi-preparatória dafração FD coletada a partir da as2-caseína ovinahidrolisada por pepsina durante 30 minutos. Sãoselecionadas duas (2) subfrações (FD1-FD2), que foramcoletadas manualmente. 0 tempo, dado em minutos, estámarcado no eixo X.
Figura 3: Atividade antimicrobiana das diferentessubfrações obtidas a partir das frações FC e FD por RP-HPLC em uma escala semi-preparatória.
Figura 4: Abaixamento da pressão sangüíneasistólica (SBP) e o abaixamento da pressão sangüíneadiastólica (DBP) encontrada em ratos espontaneamentehipertensos em seguida à administração por cateterintragástricô de 1 ml de água (o) , 50 mg/kg deCaptopril (□) , 3 mg/kg de PYVRYL (Á) e 3 mg/kg deLKKISQ (♦). T (h) indica o intervalo de tempo quedecorreu desde a administração, dado em horas. Osdados mostram a média + SEM para um mínimo de 6animais. aP<0,05 contra água; bP<0,05 contraCaptopril; CP<0,05 contra PYVRYL.
Figura 5: Abaixamento da pressão sangüíneasistólica (SBP) e o abaixamento da pressão sangüíneadiastólica (DBP) encontrados em ratos espontaneamentehipertensos em seguida à administração por cateterintragástrico de 1 ml de água (o), 50 mg/kg deCaptopril (□), 400 mg/kg de caseina (A) , 400 mg/kg dehidrolisado de caseina (♦) e 200 mg/kg de F<3 000 Da dohidrolisado de caseina (■). T(h) indica o espaço detempo decorrido desde a administração, dado em horas.Os dados mostram a média + SEM para um mínimo de 4animais. aP<0,05 contra água; bP<0,05 contracaptopril; cP<0,05 contra 400 mg/kg caseína.
Figura 6A: Cromatograma tomado utilizando-secromatograf ia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RP-HPLC) em uma escala semi-preparatória dafração menor de 3000Da obtida a partir da caseínahidrolisada por caseína durante 3 horas. A absorvênciaem 214 nm é marcada no eixo Yeo tempo, em minutos, noeixo X. A Figura 6B corresponde à atividade inibidorade enzima conversora de angiotensina (ACEIa) dasfrações cromatográficas obtidas por RP-HPLC. Devido àsua potente atividade inibidora de ACE, selecionaram-se3 frações, as quais foram coletadas automaticamente(F3 , F5 e F6) .
Figura 7: Cromatograma tomado utilizando-secromatografia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RP-HPLC) do peptídeo sintético PYVRYL SEQ.ID. No. 7, antes e depois da hidrólise seqüencial compepsina e Corolase PP®. A absorvência a 214 nm estámarcada no eixo Yeo tempo, em minutos, no eixo X.
Figura 8: Abaixamento da pressão sangüíneasistólica (SBP) e o abaixamento da pressão sangüíneadiastólica (DBP) encontrados em ratos espontaneamentehipertensos em seguida à administração por cateterintragástricô de 1 ml de água (o), 50 mg/kg deCaptopril (□) , 3 mg/kg de PYVRYL (♦) e 2 mg/kg PYV(■). T(h) indica o intervalo de tempo que decorreudesde a administração, dado em horas. Os dados mostrama média + SEM para um mínimo de 4 animais. aP<0,05contra água; bP<0,05 contra captopril; cP<0,05 contra 3mg/kg de PYVRYL.
Figura 9: Cromatograma tomado utilizando-secromatografia de líquido de alto desempenho de faseinvertida (RP-HPLC) do peptídeo sintético HLPLPLL SEQ.ID. No. 14, antes e depois da hidrólise seqüencial compepsina e Corolase PPs. A absorvência a 214 nm estámarcada no eixo Yeo tempo, em minutos, no eixo X.
Figura 10: Abaixamento da pressão sangüíneasistólica (SBP) e o abaixamento da pressão sangüíneadiastólica (DBP) obtidos em ratos espontaneamentehipertensos em seguida ã administração por cateterintragástrico de 1 ml de água (o) , 50 mg/kg deCaptopril (□) , 7 mg/kg de HLPLP (·) . T(h) indica oespaço de tempo decorrido desde a administração, dadoem horas. Os dados mostram a média ± SEM para ummínimo de 4 animais. aP<0,05 contra água; bP<0,05contra captopril.
EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÃO DA INVENÇÃO
Os exemplos seguintes ilustram a invenção, muitoembora eles não devam ser considerados como limitativosdo seu escopo.
Exemplo 1. Produção de peptídeos bioativos comatividade antimicrobiana, inibidora de ACE, anti-hipertensora e antioxidante, a partir de as2-caseínaovina hidrolisada por pepsina
O hidrolisado foi obtido pelo emprego de as2-caseína ovina na forma de um substrato, obtido emseguida à separação do restante das caseinas por meiodo método de H.J. Vreeman, J.A.M. van Riel (The large-scale isolation of as2-caseina from bovine caseina.Netherlands Milk and Dairy Journal, 1990, 44:43-48).
Como uma enzima, utilizou-se pepsina de suíno (E.C.3.4.23.1.570 ü/mg protein) proveniente do estômago desuíno (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Preparou-seuma solução aquosa a 0,5% da aS2_caseína ovina, e o pHfoi ajustado para 3,0 com 1 M HCl. Adicionou-sepepsina (relação de enzima-substrato 3,7/100, p/p). Ahidrólise foi realizada a 370C durante 30 minutos. Adesativação da pepsina foi conseguida por aquecimento a800C durante 15 minutos e então ajustando-se o pH para7, 0 com 1 M NaOH. 0 sobrenadante coletado em seguida àcentrifugação do hidrolisado a 16000 g durante 15minutos a 50C foi analisado por FPLC (Figura 1), tendosido separadas cinco frações (FA-FE) , as quais foramcoletadas manualmente e então secadas por congelamento.
A atividade antimicrobiana destas cinco fraçõesfoi medida sob uma concentração de 2,5 mg/ml,utilizando-se E. coli a 5,9 χ IO3 CFU/ml como controle.
Os resultados revelaram que as frações FC e FD possuíamatividade antimicrobiana, reduzindo o número demicroorganismos por 2,54 e 0,6 ordens de grandeza,respectivamente.Para o propósito de identificar os peptideosresponsáveis pela atividade antimicrobiana, as fraçõesFC e FD foram analisadas por RP-HPLC em uma escalasemi-preparatória. A Figura 2 mostra o perfilcromatográfico da fração FC (Figura 2A) e da fração FD(Figura 2B) . Quatro sub-frações (FC1-FC4) foramseparadas da fração FC1 e duas sub-frações (FD1-FD2) apartir da fração FD. Cada uma destas sub-frações foicoletada e, em seguida à evaporação do acetonitrilo,foram secadas por congelamento. A atividadeantimicrobiana destas sub-frações foi medida sob umaconcentração de 2,5 mg/ml, contra E. coli (6,2 χ IO6CFU/ml). A Figura 3 mostra os valores da atividadeantimicrobiana contra E. coli. destas sub-frações. Detodas as sub-frações, menção especial deve ser feitaquanto à FCl, a qual foi uma que exibiu a maioratividade antimicrobiana, dado que ela tinha um efeitobactericida sob a concentração testada (log Nf/N0 maiordo que 6). As sub-frações FC4, FDl e FD2 exibiram umaatividade antimicrobiana moderada, com valores para aredução de microorganismos de ordens de grandeza de1,24, 1,31 e 1,64, respectivamente.
As sub-frações FCl, FC4, FDl e FD2 foramanalisadas por espectrometria de massa, utilizando-seum analisador interceptor de íons em seguida àmetodologia anteriormente descrita. Os peptideosidentificados estão ilustrados na Tabela 1.
Tabela 2. Peptideos identificados nas sub-frações FCl,FC4, FDl e FD2 obtidas a partir da as2-caseína ovinahidrolisada por pepsina durante 30 minutos.<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>
Exemplo 2. Peptídeos quimicamente sintetizados quepossuem atividade antimicrobiana
Os peptídeos principalmente presentes nas sub-trações obtidas a partir da ovina hidrolisada porpepsina foram as2-caseína sintetizada quimicamentedurante 3 0 minutos (SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2,SEQ. ID. No. 3 e SEQ. ID. No. 7) . Estes peptídeosforam sintetizados pelo método de fase sólida Fmoc, esua pureza foi verificada por RP-HPLC-MS/MS.
A atividade antimicrobiana dos peptídeossintéticos foi medida sob uma concentração de 0,05 mMcontra Escherichia coli, Serratia marcescens,Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis,Enteroeoceus faeealis e histeria innoeua. Osresultados da atividade estão ilustrados na Tabela 2.
Tabela 3. Atividade antimicrobiana dos peptídeossintéticos identificados nas sub-frações FCl, FC4 e FDlobtidas a partir de as2-caseína ovina hidrolisada porpepsina durante 30 minutos,
<table>table see original document page 43</column></row><table>
Estes peptídeos exibem um alto grau de atividadeantimicrobiana contra bactérias Gram-positivas,especialmente contra a variedade testada da espécieStaphylococcus. Três destes peptídeos SEQ. ID. No. 1,SEQ. ID. No. 2 e SEQ. ID. No. 3 exibiram atividadebactericida contra S. carnosus. Entretanto, asbactérias Gram-negativas (E. coli e S. marcesens) sãoaltamente resistentes à ação de todos estes peptídeos,muito embora menção especial possa ser feita ao fato deque o peptídeo identificado como SEQ. ID. No. 3 exibiuum alto grau de atividade antimicrobiana contra o E.coli.
Exemplo 3. Peptxdeos quimicamente sintetizados quepossuem atividade inibidora de ACE e anti-hipertensora
A atividade inibidora de ACE apresentada por doisdos peptídeos sintetizados quimicamente foi medida,especificamente as seqüências SEQ. ID. No. 1 e SEQ. ID.No. 7, mencionadas no Exemplo 1. Os resultados deatividade, dados como IC50, ou concentração de proteínanecessária para inibir a atividade enzimática por 50%,estão ilustrados na Tabela 3. Estes dois peptídeosexibem uma potente atividade inibidora de ACE.
Tabela 4. Atividade inibidora de ACE dos peptídeossintéticos identificados nas sub-frações FCl e FDlobtidas a partir de as2-caseína hidrolisada por pepsinadurante 3 0 minutos.
<table>table see original document page 44</column></row><table>
A atividade anti -hipertensão dos peptídeos SEQ.ID. No. 1 e SEQ. ID. No. 7 foi testada, propósito estepara o qual estes peptídeos (3 mg/kg) foramadministrados a ratos espontaneamente hipertensos(SHR). Os peptídeos foram dissolvidos em águadestilada, e a dose correspondente foi administrada acada rato em um volume de 1 ml.
A Figura 4 mostra os graus para os quais a SBP e aDBP foram abaixadas em ratos espontaneamentehipertensos (SHR) em diferentes pontos no tempo emseguida à administração de 3 mg/kg dos peptídeos SEQ.ID. No. 1 e SEQ. ID. No. 7. A administração dopeptideo SEQ. ID. No. 7 pode ser observada comocausadora de um abaixamento significativo da SBP e daDBP nestes animais. 0 abaixamento destas variáveisalcança seu pico em 4 horas em seguida à administraçãodeste peptideo. Este abaixamento também mostra um10 curso durante o tempo semelhante àquele do abaixamentoda SBP e DBP causado pela administração de Captopril,que é um composto de atividade anti-hipertensãocomprovada. Estes resultados mostram que o peptideoidentificado pela seqüência SEQ. ID. No. 7 é dotado deum efeito anti-hipertensão marcante, evidente, quandoadministrado oralmente em uma base aguda.
Exemplo 4. Peptídeos sintetizados quimicamente quepossuem atividade antioxidante
Mediu-se a atividade antioxidante da seqüênciaSEQ. ID. No. 7 mencionada no Exemplo 1. A atividade dequelação de radical de peroxil está ilustrada emseguida:
ORACpyvRYI= 1,82 μπιοί Trolox equivalentes/ pmol peptideoPortanto, os resultados mostram que o PYVRYL (SEQ.ID. No. 7) possui uma atividade antioxidante 1,82 vezesmaior do que a atividade de 1 pmol Trolox.
Exemplo 5: Produção de peptídeos bioativos que possuematividade inibidora de ACE a partir de caseína bovinacom pepsina.
A hidrólise foi conseguida pelo emprego de umsubstrato de caseína bovina obtido por meio deprecipitações isoelétricas a partir de leite de vacacru. Utilizou-se como enzima peptídeo de suíno (E.C.3.4.23.1. 570 U/mg proteína) proveniente de estômagode suíno (Sigma Chemical, St. Louis, USA). Preparou-se uma solução de caseína bovina aquosa a 0,5% e o pHajustado para 2,0 com 1 M HCl. Adicionou-se pepsina(relação de enzima-substrato 3,7/100 p/p). A hidrólisefoi realizada a 370C durante 3 horas. A pepsina foidesativada por aquecimento a 800C durante 20 minutos eentão ajustado o pH para 7,0 com IM NaOH. 0sobrenadante coletado em seguida à centrifugação dohidrolisado a 16000 χ g durante 15 minutos a 50C foiultrafiltrado através de uma membrana hidrófila com umadimensão de poro de 3 000 Da (Centripep, Amicon Inc,Beverly, MA, USA) . A atividade inibidora de ACE eanti-hipertensão foi determinada em SHR (de acordo como anteriormente descrito nos métodos analíticos) dohidrolisado total e do permeato (fração do hidrolisadode um peso molecular mais baixo do que 3 000 Da). ATabela 4 mostra os valores da atividade inibidora deACE, dados como IC50 ou concentração de proteínasnecessária para inibir a atividade de enzima em 50%, eo teor de proteína determinado pelo método de Kjeldahl.
A Figura 5 mostra o abaixamento da SBP e DBP encontradoem ratos espontaneamente hipertensos (SHR) emdiferentes pontos no tempo em seguida à administraçãode caseína hidrolisada e em seguida à administração dafração de caseína hidrolisada com um peso molecularmais baixo do que 3 000 Da. Conforme ilustrado naTabela, a administração de caseína hidrolisada provocaum abaixamento significativo da SBP e da DBP nestesanimais. A administração da fração de caseínahidrolisada de um peso molecular mais baixo do que 3000Da faz com que a SBP e a DBP sejam abaixadas nos ratosespontaneamente hipertensos em graus semelhantesàqueles observados depois da administração da caseínahidrolisada. 0 abaixamento destas variáveis alcançaseu pico 2 horas em seguida à administração destesprodutos. A administração de caseína não-hidrolisadanão modifica de forma significativa a SBP dos ratosespontaneamente hipertensos (SHR) e abaixa a DBP paraum grau muito menor do que os compostos anterioresnestes animais. Estes resultados mostram que a caseínahidrolisada e a fração de caseína hidrolisada de umpeso molecular mais baixo do que 3 00 Da têm um efeitoanti-hipertensão evidente quando são administradasoralmente em uma base aguda.
Tabela 5: Atividade inibidora de ACE das caseínasbovinas hidrolisadas por pepsina e do permeato (fração< 300 Da) e do retenato (F> 3000 Da) obtidos em seguidaao processo de ultrafiltragem.<table>table see original document page 48</column></row><table>
Para o propósito de identificação dos peptídeosresponsáveis pela atividade inibidora de ACE eatividade anti-hipertensão, em seguida àultrafiltragem, fez-se passar o permeato através de umprocesso de separação por RP-HPLC em uma escala semi-preparatória na qual foram coletadas 8 frações. Emseguida à evaporação do acetonitrilo, estas fraçõescromatográficas foram secadas por congelamento e aatividade inibidora de ACE e o teor de proteína foramdeterminados por meio do método de ácido bicincônico.
A Figura 6 mostra o perfil cromatográfico e as fraçõesobtidas, bem como os valores de atividade inibidora deACE, dados como IC50 para cada uma das fraçõescromatográficas. As frações indicadas como F3, F5 e F6na Figura 6 são aquelas que exibem maior atividadeinibidora de ACE, em outras palavras, valores de IC50mais baixos. Estas frações foram analisadas por RP-HPLC conectados em linha a espectrometria de massa emtandem (RP-HPLC-MS/MS) utilizando-se a metodologiadescrita anteriormente. Os peptídeos principaisidentificados estão ilustrados na Tabela 5.
Tabela 6: Peptídeos ativos principais identificados nasfrações F3, F5 e F6 obtidas a partir do permeato dacaseína bovina hidrolisada por pepsina durante 3 horas.
<table>table see original document page 49</column></row><table>
Os peptídeos principais obtidos nestas fraçõescromatogrãficas foram sintetizados quimicamente pelométodo Fmoc de fase sólida e sua pureza verificada porRP-HPLC-MS/MS. A atividade inibidora de ACE dospeptídeos sintetizados quimicamente, especificamentedas seqüências SEQ. ID No. 12, SEQ. ID. No. 13 e SEQ.ID. No. 14, foi determinada. Os resultados deatividade, dados como IC50, ou concentração de proteínanecessária para inibir a atividade de ACE em 50%, estãoilustrados na Tabela 6. Pelo menos dois dos trêspeptídeos principais identificados exibiram potenteatividade inibidora de ACE.
Tabela 7: Atividade inibidora de ACE dos peptídeossintéticos identificados nas frações
<table>table see original document page 50</column></row><table>
Exemplo 6: Atividade inibidora de ACE e anti-hipertensão dos peptídeos depois de simulação deDIGestão gastrintestinal dos fragmentos obtidos pelahidrólise de as2-caseína PYVRYL SEQ. ID. No. 7.
0 peptídeo PYVRYL SEQ. ID. No. 7 que foipreviamente identificado nos hidrolisados de as2-caseína e foi sintetizado quimicamente e levado apassar através de um processo de hidrólise de doisestágios simulando digestão gastrointestinal (Alting,A.C., Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H.Incomplete elimination of the ABBOS epitope of bovineserum albumin under simulated gastrointestinalconditions de infants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). Para este propósito, soluções aquosas dospeptídeos sintéticos (10 mg/ml) são hidrolisadas,primeiro com pepsina (E.C. 3.4.4.1, 570 U/mg proteína)(Sigma) (relação de enzima-substrato, 1:50, p/p) sob pH2,0 e 37°C durante 90 minutos e depois disso comCorolase PP® (relação de enzima-substrato 1:25, p/p)(Rõhm, Darmstadt, Germany) sob pH 7-8 e 37°C durante2,5 horas. A reação é interrompida por aquecimento a950C durante 10 minutos em um banho de água.
A Figura 7 mostra que o peptideo PYVRYL SEQ. ID.No. 7 hidrolisa-se completamente depois da incubaçãocom pepsina e Corolase PP® . O fragmento resultanteprincipal identificado por RP-HPLC-MS/MS é otripeptídeo PVY SEQ. ID. No. 15. Este peptideo foisintetizado quimicamente e sua atividade inibidora deACE determinada, foi obtido um valor de IC50 de 741,3μΜ, em outras palavras, 370 vezes menos atividadeinibidora de ACE do que o peptideo de partida. Aatividade anti-hipertensão deste tripeptídeo PVY SEQ.ID. No. 15 foi determinada por meio da suaadministração a SHR. Os peptídeos são dissolvidos emágua destilada e a dose correspondente administrada acada rato em um volume de 1 ml. A Figura 8 mostra oabaixamento da SBP e da DBP encontradas em ratos SHR emdiferentes pontos no tempo em seguida à administraçãode PYV SEQ. ID. No. 15 sob uma dose de 2 mg/kg e dopeptideo PYVRYL SEQ. ID No. 7 sob uma dose de 3 mg/kg,em que é mostrado que a administração destes doispeptídeos ocasiona um abaixamento significativo das SBPe DBP destes animais. Enquanto o efeito de pico na SBPda PYV SEQ. ID. No. 15 ocorre 2 horas depois da suaadministração, o efeito de pico do peptideo PYVRYL SEQ.ID. No. 7 não ocorre até 4 horas depois da suaadministração. 0 início mais rápido do efeito anti-hipertensão no caso da SEQ. ID. No. 15 poderá serdevido ao fato de que quando esta seqüência éadministrada, o processo de digestão enzimático quedeve ocorrer para que ele seja causado in vivo êevitado. Estes resultados demonstram a atividade anti-hipertensão da SEQ. ID. No. 15 muito embora, emprincípio, isto não possa ser atribuído à sua atividadeinibidora de ACE. É importante salientar que, atéagora, a potente atividade anti-hipertensão do peptídeoPYV SEQ. ID. No. 15 não tinha sido descrita.
Exemplo 7: Atividade inibidora de ACE e anti-hipertensora dos peptídeos depois da simulação dadigestão gastrintestinal dos fragmentos obtidos pelahidrólise da caseína completa HLPLPLL SEQ. ID. No. 14.
O peptídeo HLPLPLL SEQ. ID. No. 14 que foipreviamente identificado na fração tendo um pesomolecular sob 3 000 Da dos hidrolisados caseína total efoi quimicamente sintetizado, foi levado a passaratravés de um processo de hidrólise de dois estágiossimulando digestão gastrintestinal (Alting, A.C.,Meijer, R.J.G.M., Van Beresteijn, E.C.H. Incompleteelimination of the ABBOS epitope of bovine serumalbumin under simulated gastrointestinal conditions ofinfants. Diabetes Care, 1997, 20:875-880). Para estepropósito, soluções aquosas dos peptídeos sintéticos(10 mg/ml) são hidrolisadas, primeiro com pepsina (E.C.3.4.4.1, 570 U/mg proteína) (Sigma) (relação de enzima-substrato, 1:50, p/p) sob pH 2,0 e 37 0C durante 90minutos e depois disso com Corolase PP® (relação deenzima-substrato 1:25, p/p) (Rõhm, Darmstadt, Germany)sob pH 7-8 e 37°C durante 2,5 horas. A reação éinterrompida por aquecimento a 950C durante 10 minutosem um banho de água.
A Figura 9 mostra os peptídeos que são obtidos emseguida à hidrólise do peptídeo HLPLPLL SEQ. ID. No. 14identificado por meio de RP-HPLC-MS/MS que correspondeao hexa-peptídeo HLPLPL SEQ. ID. No. 16 e ao penta-peptídeo HLPLP SEQ. ID. No. 17. O HLPLPL SEQ. ID. No.16 é um fragmento intermediário, enquanto o penta-peptídeo HLPLP SEQ. ID. No. 17 é resistente à ação dasenzimas gastrointestinal e é provavelmente o produto deproteólise final do peptídeo HLPLPLL SEQ. ID. No. 14.
A atividade inibidora de ACE do penta-peptídeo HLPLPSEQ. ID. No. 17 foi ensaiada e encontrada como sendo umvalor IC50 de 21 μΜ. De forma assemelhada, foideterminada a atividade anti-hipertensão em SHR dopeptídeo final resultante da hidrólise de HLPLP SEQ.ID. No. 17 quando é administrada uma dose de 7 mg/kg.0 abaixamento da SBP e da DBP estão ilustrados naFigura 10. Um abaixamento significativo da SBP e daDBP é encontrado nestes animais, mas neste caso, oefeito anti-hipertensão pode ser atribuído certamente,pelo menos em parte, à sua atividade inibidora de ACE.SEQÜÊNCIA DE LISTAGEM
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
<120> PEPTÍDEOS BIOATIVOS IDENTIFICADOS POR HIDROLIZADOSENZIMÁTICOS DE PROTEÍNAS DE LEITE E MÉTODO PARA SUA PRODUÇÃO
<130> PNPOOlOOO
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<170> PatenteIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(6)
<400> 1
Leu Lys Lys Ile Ser Gln1 5
<210> 2<211> 25<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220><223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (20)..(25)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 7<400> 2
Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys Thr1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu20 25
<210> 3<211> 17<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína
<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(6)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 1<400> 3
Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr1 5 10 15
Leu
<210> 4<211> 16<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(6)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 1<400> 4Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr1 5 10 15
<210> 5<211> 26<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseina<220>
<221> PEPTIDEO<222> (21)..(26)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 7<400> 5
Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys1 5 10 15
Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu20 25
<210> 6<211> 28<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseina<220>
<221> PEPTIDEO<222> (23)..(28)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 7<400> 6
Leu Lys Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln1 5 10 15
Pro Lys Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu20 25
<210> 7<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(3)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 15<400> 7
Pro Tyr Val Arg Tyr Leu1 5
<210> 8<211> 27<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (22)..(27)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 7<400> 8
Lys Thr Val Asp Gln His Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro1 5 10 15
Lys Thr Asn Ala Ile Pro Tyr Val Arg Tyr Leu20 25
<210> 9<211> 19<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(6)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 1<400> 9
Leu Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr1 5 10 15
Leu Lys Thr
<210> 10<211> 37<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (32)..(37)
<223> Peptideo definido por SEQ. ID. NO.: 7<400> 10
Tyr Gln Lys Phe Ala Trp Pro Gln Tyr Leu Lys Thr Val Asp Gln His1 5 10 15
Gln Lys Ala Met Lys Pro Trp Thr Gln Pro Lys Thr Asn Ala Ile Pro20 25 30
Tyr Val Arg Tyr Leu35
<210> 11<211> 4<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína ovina<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(4)
<400> 11Val Arg Tyr Leu1
<210> 12<211> 5<212> PRT<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(5)
<400> 12
Arg Tyr Leu Gly Tyr1 5
<210> 13<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína ovina<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(7)
<400> 13
Ala Tyr Phe Tyr Pro Glu Leu1 5
<210> 14<211> 7<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína
<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(5)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 17<400> 14
His Leu Pro Leu Pro Leu Leu1 5
<210> 15<211> 3<212> PRT
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(3)
<400> 15Pro Tyr Val1
<210> 16<211> 6<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(5)
<223> Peptídeo definido por SEQ. ID. NO.: 17<400> 16
His Leu Pro Leu Pro Leu1 5
<210> 17<211> 5<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Derivado de caseína<220>
<221> PEPTIDEO<222> (1)..(5)
<400> 17
His Leu Pro Leu Pro1 5
Claims (29)
1. - Peptídeo bioativo, caracterizado pelo fato de:a. possuir atividade antimicrobiana e/ou atividadeIECA in vitro e/ou atividade anti-hipertensãoin vivo e/ou atividade antioxidante;b. estar presente em hidrolisados enzimáticos decaseínas lácteas com pepsina, ec. as seqüências de aminoácidos do seguinte grupo:SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3,SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6,SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8, SEQ. ID No. 9,SEQ. ID No. 10, SEQ. ID No. 12, SEQ. ID No. 13,SEQ. ID No. 14.
2. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 1, das seqüências: SEQ. ID No. 2, SEQ. IDNo. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7, SEQ. ID No. 8 ouSEQ. ID No. 10, caracterizado pelo fato de incluir aSEQ. ID. No. 7 e de ser derivado da as2-caseína.
3. - Peptídeo bioativo derivado dos peptídeosbioativos, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pela SEQ. ID. NO. 15 e por as unidadesfinais serem obtidas depois da simulação da digestãogastrintestinal da SEQ. ID. No. 7.
4. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 1, das seqüências SEQ. ID. No. 1, SEQ.ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4 ou SEQ. ID. No. 9,caracterizado pelo fato de incluir a SEQ. ID. No. 1 ede ser derivado da as2- casei na.
5. - Peptideo bioativo, de acordo com areivindicação 1, das seqüências SEQ. ID. No. 12, SEQ.ID. No. 13, caracterizado pelo fato de ser derivado deasl-caseína.
6. - Peptideo bioativo, de acordo com areivindicação 1, das seqüências SEQ. ID. No. 14,caracterizado pelo fato de ser derivado da β-caseína.
7. - Peptideo bioativo, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de apresentaratividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas.
8. - Peptideo bioativo da seqüência deaminoácidos SEQ. ID. No. 3, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por apresentar atividadeantimicrobiana contra bactérias Gram-negativas, taiscomo Escherichia coli.
9. - Peptideo bioativo, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pela seqüência deaminoácidos SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID.No. 12, SEQ. ID. No. 13, SEQ. ID. No. 14, SEQ. ID. No.-15, e por apresentar atividade inibidora de ACE inVitro.
10. - Peptideo bioativo, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pela seqüência deaminoácidos SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 12, SEQ. ID.No. 13, e SEQ. ID. No. 14, SEQ. ID. No. 15, e porapresentar atividade anti-hipertensão.
11. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pela seqüência deaminoácidos SEQ. ID. No. 7 e por apresentar atividadeantioxidante por meio de quelação de radicais oxigênio.
12. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser obtidopor meio de um método de síntese química ou enzimáticaou por métodos de recombinação.
13. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser obtidopor um método de hidrólise enzimática de asi-caseina,Cis2-caseina, β-caseina ou a caseína ou leite integralnas suas diferentes formas de apresentação, subprodutosde leite ou produtos lácteos fermentados.
14. - Método para produzir qualquer um dospeptídeos bioativos conforme descrito na reivindicação-1, caracterizado por:a. ser obtido por hidrólise do material departida que será qualquer substratoapropriado contendo uma ou mais proteínas oupeptídeos de origem animal ou vegetal, ouprocedentes de microorganismos,preferentemente caseína ou leite integral,cuja seqüência de aminoácidos compreende aseqüência de aminoácidos de qualquer dospeptídeos bioativos de interesse indicados nareivindicação 1,b. sendo o dito material de partida dissolvidoou dispersado, em uma concentraçãoapropriada, em água ou em uma soluçãoamortecedora, sob um pH apropriado para aatuação da enzima proteolítica,c. empregar qualquer enzima proteolítica capazde romper a proteína presente no material departida e proporcionar os peptídeos deinteresse que são usados, mas preferentementepepsina sob pH 3,0; ou microorganismosproteolíticos que executam uma fermentação dosubstrato, ed. com o tempo de reação variando entre 10minutos até 24 horas, mas variandopreferencialmente entre 30 minutos e 3 horas.
15. - Método para produzir qualquer um dospeptídeos bioativos conforme descrito em areivindicação 3, e os peptídeos da seqüência deaminoácidos SEQ. ID. No. 12, SEQ. ID. No. 16 e SEQ. ID.No. 17, caracterizado por:a. ser obtido por hidrólise do material departida que será qualquer substratoapropriado que contém uma ou mais proteínasou peptídeos de origem animal ou vegetal, ouprocedentes de microorganismos,preferentemente caseína ou leite integral,cuja seqüência de aminoácidos compreende aseqüência de aminoácidos de qualquer dospeptídeos bioativos de interesse conformedescrito na reivindicação 3,b. sendo o dito material de partida dissolvidoou dispersado, sob uma concentraçãoapropriada, em água ou em uma soluçãoamortecedora, sob um pH apropriado para aatuação da enzima proteolitica,c. qualquer enzima proteolitica capaz de rompera proteína presente no material de partida eproporcionar os peptídeos de interesse, porémpreferentemente pepsina sob pH 3,0 em umarelação enzima-substrato de 3,7/100 (p/p) erealizando-se a hidrólise a 37°C; CorolasePP® sob pH a pH 7-8, em uma relação deenzima-substrato 1:25 p/p a 37°C; oumicroorganismos proteolíticos que realizaramuma fermentação do substrato, ed. com o tempo de reação variando entre 10minutos e 24 horas, mas preferentemente seráde 3 0 minutos para o caso de pepsina edurante um tempo de aproximadamente 2,5 horaspara o caso da Corolase PPe, cuja reação éinterrompida mediante aquecimento a 95 0Cdurante 10 minutos em um banho de água.
16. - Peptídeo bioativo, de acordo com aivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, para asua produção, empregam-se os métodos estabelecidos nareivindicação 14 anterior.
17. - Peptídeo bioativo, de acordo com areivindicação 3, caracterizado pelo fato de que, para asua produção, empregam-se os métodos conforme definidosna reivindicação 15.
18. - Produto bioativo, caracterizado pelofato de que contém pelo menos um dos peptídeos conformedescrito na reivindicação 1, ao ser o própriohidrolisado enzimático, qualquer uma de suas frações ouuma purificação dos mesmos.
19. - Uso de um peptídeo, caracterizado pelasseqüências de aminoácidos SEQ. ID. No. 16 e SEQ. ID. No-17 e por ser a unidade final obtida depois da simulaçãoda digestão gastrintestinal com pepsina e Corolase PP®da SEQ. ID. No. 14 para a preparação de um produtofuncional (alimento ou aditivo) favorável paracontrolar ou abaixar pressão sangüínea e/ou droga parao tratamento de hipertensão arterial.
20. - Uso de um peptídeo, conforme definido nareivindicação 19, caracterizado por:a. possuir atividade inibidora de AEC invitro e/ou atividade anti-hipertensão invivo,b. ser derivado da β-caseína, ec. serem empregados os métodos mencionados nareivindicação 15 para a produção deste.
21. - Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de incluir pelo menos um dos produtosbioativos com atividade antimicrobiana e/ou atividadeinibidora de AEC in vitro e/ou atividade anti-hipertensão in vivo e/ou atividade antioxidanteconforme definido na reivindicação 1 e/ou o produtobioativo, conforme definido na reivindicação 18.
22. - Aditivo, ingrediente ou suplementoalimentício funcional, caracterizado pelo fato deincluir pelo menos um dos peptídeos bioativos comatividade antimicrobiana, inibidora de AEC in vitroe/ou atividade anti-hipertensão in vivo e/ouantioxidante, conforme definido na reivindicação 1 e/ouo produto bioativo, conforme definido na reivindicação 18.
23. - Produto alimentício funcional,caracterizado por incluir pelo menos um dos peptídeosbioativos dotados de atividade antimicrobiana,inibidora de AEC in vitro e/ou atividade anti-hipertensora in vivo e/ou antioxidante conformedefinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, 16ou 17 e/ou o aditivo, ingrediente ou suplementoalimentício funcional, conforme definido nareivindicação 22.
24. — Uso da composição farmacêutica conformedescrita na reivindicação 21, caracterizado por serpara a preparação de uma droga para a prevenção e/outratamento de infecções microbianas.
25. - Uso da composição farmacêutica, conformedescrita na reivindicação 21, caracterizado pelo fatode ser para a preparação de uma droga para a prevençãoe/ou tratamento de hipertensão.
26. - Uso da composição farmacêutica conformedescrita na reivindicação 25, caracterizada pelo fatode:a) a seqüência de aminoácido SEQ. ID No. 12,b) possuir atividade inibidora de AEC in vitroe/ou atividade anti-hipertensão in vivo, ec) ser derivado da asi-caseína, ed) serem empregados os métodos mencionados nareivindicação 14 ou 15 para a produção deste.
27. - Uso de aditivo, ingrediente alimentíciofuncional conforme descrito na reivindicação 23,caracterizado pelo fato de ser para a preparação de umproduto alimentício favorável para a prevenção deinfecções microbianas.
28. - Uso de aditivo, ingrediente alimentíciofuncional, uso, conforme descrito na reivindicação 23,caracterizado pelo fato de ser para a preparação de umproduto alimentício favorável para aliviar hipertensão.
29. - Uso da composição farmacêutica conformedescrita na reivindicação 28, caracterizada pelo fato de:e) a seqüência de aminoácido SEQ. ID No. 12,f) possuir atividade inibidora de AEC in vitroe/ou atividade anti-hipertensão in vivo, eg) ser derivado da asi-caseína, eh) serem empregados os métodos mencionados nareivindicação 14 ou 15 para a produção deste.
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