RU2415943C1 - Биологически активный пептид, полученный из молочного белка - Google Patents

Биологически активный пептид, полученный из молочного белка Download PDF

Info

Publication number
RU2415943C1
RU2415943C1 RU2010105589/10A RU2010105589A RU2415943C1 RU 2415943 C1 RU2415943 C1 RU 2415943C1 RU 2010105589/10 A RU2010105589/10 A RU 2010105589/10A RU 2010105589 A RU2010105589 A RU 2010105589A RU 2415943 C1 RU2415943 C1 RU 2415943C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
biologically active
peptide
peptides
active peptide
amino acid
Prior art date
Application number
RU2010105589/10A
Other languages
English (en)
Inventor
Оксана Васильевна Козлова (RU)
Оксана Васильевна Козлова
Ирина Сергеевна Разумникова (RU)
Ирина Сергеевна Разумникова
Ольга Олеговна Бабич (RU)
Ольга Олеговна Бабич
Александр Юрьевич Просеков (RU)
Александр Юрьевич Просеков
Марина Геннадьевна Курбанова (RU)
Марина Геннадьевна Курбанова
Original Assignee
Оксана Васильевна Козлова
Ирина Сергеевна Разумникова
Ольга Олеговна Бабич
Александр Юрьевич Просеков
Марина Геннадьевна Курбанова
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Оксана Васильевна Козлова, Ирина Сергеевна Разумникова, Ольга Олеговна Бабич, Александр Юрьевич Просеков, Марина Геннадьевна Курбанова filed Critical Оксана Васильевна Козлова
Priority to RU2010105589/10A priority Critical patent/RU2415943C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2415943C1 publication Critical patent/RU2415943C1/ru

Links

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биологически активному пептиду, который обладает антигипертонической активностью. Предложенное изобретение может быть использовано для профилактики гипертонических заболеваний. Биологически активный пептид характеризуется аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV. Данный пептид получают из белка молока ферментативным гидролизом. После чего осуществляют очистку и ультрафильтрацию полученных гидролизатов с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Предложенное изобретение позволяет получать биологически активный пептид, который обладает антигипертонической активностью.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой чистый пептид, который может быть использован для лечебных целей, в том числе для профилактики гипертонической болезни, характеризуемый аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV, полученный из молочного белка.
В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям низкомолекулярных пептидов, полученных в результате направленного ферментативного гидролиза полноценных белков молока, выполняющих в организме ряд специфических биологических функций.
Биологически активные пептиды в организме человека оказывают влияние на функции центральной нервной системы, проявляют иммуномодулирующее действие, оказывают влияние на процессы агрегации тромбоцитов и высвобождение вазоактивных простагландинов, регуляцию эндокринной функции поджелудочной железы, желудочной секреции и моторики, проявляют пребиотическое действие, стимулируя рост нормальной симбиотической микрофлоры и одновременно подавляя рост в кишечнике условно патогенных, в том числе потенциально патогенных микроорганизмов. Ряд биологически активных пептидов, образующихся при ферментативном гидролизе белков молока, могут проявлять in vivo свойства ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента и, как следствие, способствовать снижению кровяного давления. Эти пептиды имеют потенциальное использование в продуктах или фармацевтических препаратах и могут быть получены посредством различных способов ферментативного гидролиза и микробного брожения, в настоящее время являющихся наиболее распространенными.
Известны способы получения пептидов путем конденсации блочных фрагментов, кристаллизации, гидролиза и фильтрования, упаривания с последующей очисткой конечного продукта (Deigin V.I., Yarova E.R. "Synthesis of dermorphin and its analogs' // In: Peptides 1984, p.325-328).
Известно, что при протеолитическом расщеплении казеина молока образуются регуляторные пептиды (β-казоморфины и фосфопептиды), которые могут выступать как физиологические модуляторы метаболизма. Например, казеинфосфопептиды являются переносчиками различных микроэлементов, особенно кальция, и обладают цитомодулирующими эффектами, стимулируя активность иммунокомпетентных клеток (Meisel Н., FitzGerald R.J. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. Р.1289-1295). Казоморфины участвуют в обеспечении всасывания питательных веществ и последующем синтезе гормонов, иммунопептиды и казокинины обеспечивают иммунную защиту и перенос информации между эндокринной и нервной системой.
Известно изобретение на способ получения пептида, обладающего антибактериальным действием, полученного из гидролизата казеина (αs2-казеин) (ЕР 1114060, Process for producing cationic peptides from biological fluids) и р-казеин и к-казеин (WO 99/26971, Antimicrobial peptides).
Другая важная группа биологически активных пептидов относится к пептидам, обладающим противогипертоническим действием, способным снизить рост гипертонических заболеваний в развитых странах. Механизм действия таких пептидов основан на ингибировании ангиотензинконвертирующего фермента АКФ - неспецифической дипептидилкарбоксипептидазы, играющей ключевую роль в регуляции давления в системе кровообращения путем модуляции ренинангиотензиновой системы (РАС) (Т Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381). Антигипертензивные пептиды могут быть выделены из гидролизатов казеина (казеокинины) (US 6514941, Method of preparing a casein hydrolyzate enriched in antihypertensive peptides) и белков сыворотки (лактокинины) (WOO 1/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals).
Наиболее близким к заявляемым пептидам по структуре и свойствам является амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений (патент РФ №2346001, МПК С07К 7/06, А61К 38/08, А61Р 9/04. Амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений, опубл. 10.09.2009). Полученный пептид и композиция на его основе обладает широкими функциональными возможностями, однако получение его отличается значительной сложностью из-за высокого молекулярного веса, что удорожает его производство.
Технической задачей является получение биологически активного пептида, обладающего антигипертоническим действием и характеризующегося аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV.
Технический результат достигается за счет использования в качестве биологической системы белка молока β-казеин, проведения целенаправленного гидролиза белков при помощи энзиматической системы, состоящей из смеси ферментных препаратов (концентрация составляет 0,01-0,05% от массы белка), обеспечивающих разделение полипептидной цепи на короткие пептиды и очистку полученного пептида с необходимой аминокислотной последовательностью из полученных гидролизатов с помощью мембранных фильтров с последующей стерилизацией полученного фильтрата, его сгущением и сушкой. Таким образом, достигается получение заданного пептида из биологической системы.
Способ получения биологически активного пептида с аминокислотной последовательностью реализуют следующим образом: подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С и проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.
Пример
Выделение пептида из молока
Подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С. Затем проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.
Установление аминокислотной последовательности пептида
Идентификацию пептида (определение аминокислотной последовательности) проводили на газофазном секвенаторе 477А и Pth-анализаторе 120А фирмы «Applied Biosystems» (США). Для этого фракции, содержавшие заявляемый пептид, после стадии очистки диализовали против воды, лиофилизовали и растворяли в 0.1% ТФА. Объем колонки 1.9 см, скорость элюции составила 0.2 мл/мин. На секвенирование пептиды отбирали по результатам аминокислотного анализа.
В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность, состоящую из 19 аминокислотных остатков: LLYQQPVLGPVRGPFPIIV
Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val.
Определение относительной молекулярной массы пептида
Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл в 50%-ном ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную трифторуксусную кислоту). Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов и белков с диапазоном молекулярных масс 700-66000 Да (Sigma, США).
Измеренная моноизотопная молекулярная масса пептида LLYQQPVLGPVRGPFPIIV составляет 2107,23 Да и в пределах точности MALDI-масс-спектрометра (0,01%) не отличается от расчетной (2125,13 Да).
Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получить из молочного белка β-казеина биологически активные пептиды обладающие антигипертоническим действием.

Claims (1)

  1. Биологически активный пептид, обладающий антигипертонической активностью, имеющий следующую аминокислотную последовательность LLYQQPVLGPVRGPFPIIV, полученный из белка молока ферментативным гидролизом с концентрацией фермента 0,01-0,05% от массы белка с последующей очисткой и ультрафильтрацией полученных гидролизатов с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5.
RU2010105589/10A 2010-02-16 2010-02-16 Биологически активный пептид, полученный из молочного белка RU2415943C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010105589/10A RU2415943C1 (ru) 2010-02-16 2010-02-16 Биологически активный пептид, полученный из молочного белка

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010105589/10A RU2415943C1 (ru) 2010-02-16 2010-02-16 Биологически активный пептид, полученный из молочного белка

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2415943C1 true RU2415943C1 (ru) 2011-04-10

Family

ID=44052147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010105589/10A RU2415943C1 (ru) 2010-02-16 2010-02-16 Биологически активный пептид, полученный из молочного белка

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2415943C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108017707A (zh) * 2017-12-12 2018-05-11 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽qpvlgpvrgp及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEISEL H ET AL. Biofunctional peptides from milk proteins: mineral binding and cytomodulatory effects, Curr Pharm Des., 2003, v.9, no.16, p.1289-95. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108017707A (zh) * 2017-12-12 2018-05-11 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽qpvlgpvrgp及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101343904B1 (ko) 우유 카제인의 효소 가수분해물에서 식별된 생물활성펩티드 및 그것을 얻는 방법
Jiang et al. Production, analysis and in vivo evaluation of novel angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from bovine casein
Rho et al. Purification and identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract
Pihlanto-Leppälä et al. Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from bovine milk proteins
Ko et al. A novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from a marine Chlorella ellipsoidea and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats
JP5763203B2 (ja) トウモロコシ降圧活性ペプチドを調製するための工業的方法
del Mar Contreras et al. Novel casein-derived peptides with antihypertensive activity
Quirós et al. Identification of novel antihypertensive peptides in milk fermented with Enterococcus faecalis
US11524977B2 (en) Ultrasound-assisted simulated digestion method of milk protein active peptide and application thereof in health foods
Wu et al. Simultaneous production of multi-functional peptides by pancreatic hydrolysis of bovine casein in an enzymatic membrane reactor via combinational chromatography
CN110724178B (zh) 一种金枪鱼白肉ace抑制肽及其制备方法
CN107964034B (zh) 酪蛋白活性肽的超声辅助模拟消化方法及保健食品应用
EP1661913B1 (en) Bioactive peptides derived from the proteins of egg white by means of enzymatic hydrolysis
Wang et al. Purification and identification of an ACE-inhibitory peptide from walnut protein hydrolysate
CN109206483A (zh) 一种贻贝来源的ace抑制及抗肿瘤活性肽
RU2415943C1 (ru) Биологически активный пептид, полученный из молочного белка
Lee et al. The antihypertensive activity of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide containing in bovine lactoferrin
US20230097644A1 (en) Ultrasound-assisted simulated digestion method of casein active peptide and application there of in health foods
CN114349849A (zh) 一种具有降血糖功效的胶原蛋白酶解物及其制备方法和应用
ES2277571B1 (es) Procedimiento para producir un peptido bioactivo utilizando cepas de enterococcus faecalis.
CN1994464A (zh) 一种血管紧张素i转换酶抑制剂及其应用
US20090075896A1 (en) Novel antihypertensive peptide and use thereof
Recio et al. Bioactive peptides identified in enzymatic hydrolyzates of milk caseins and method of obtaining same.
EA016808B1 (ru) ПРИМЕНЕНИЕ ТРИПЕПТИДОВ Val Pro Pro И Ile Pro Pro ДЛЯ СУПРЕССИИ УТОЛЩЕНИЯ СТЕНКИ СЕРДЦА
DE102011005288B4 (de) Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats mit ACE-hemmenden tryptophanhaltigen Dipeptiden

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20120217