ES2277571B1

ES2277571B1 - Procedimiento para producir un peptido bioactivo utilizando cepas de enterococcus faecalis.

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Publication number: ES2277571B1
Application number: ES200602229A
Authority: ES
Inventors: Begoña Muguerza Marquinez; Marco Antonio Delgado Delgado; Isidra Quiros Del Bosque; Ana Recio Sanchez; Mercedes Ramos Gonzalez; Maria Amaya Aleixandre De Artiñano
Original assignee: Grupo Leche Pascual S A; GRUPO LECHE PASCUAL SA
Current assignee: CALIDAD PASCUAL, S.A.U.
Priority date: 2003-05-21
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2023-05-21
Also published as: ES2277468B1; ES2277571A1; ES2277468A1; WO2004104182A1; EP1640447A1

Abstract

Procedimiento para producir un péptido bioactivo utilizando cepas de Enterococcus faecalis.

Se describe un procedimiento para producir un péptido bioactivo identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 o un derivado y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo con una cepa de Enterococcus faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.

Description

Campo de la invención

La invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido bioactivo de secuencia SEQ ID NO: 1 o un derivado y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo utilizando cepas E. faecalis así como el empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada de entre CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas para la obtención de un péptido con actividad inhibidora.

Dichas cepas de E. faecalis han sido depositadas el 10 de octubre de 2002 en la CECT, correspondiéndoles el número de acceso indicado y se encuentran descritas detalladamente en la solicitud de patente P200301186, de la cual es divisionaria la presente solicitud.

Antecedentes de la invención

La hipertensión arterial es un problema de gran importancia socio-sanitaria, cuya transcendencia está hoy día fuera de toda duda debido a razones de prevalencia, y debido también a que es uno de los principales factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares. Hoy día entre el 15% y el 20% de los adultos de los países occidentales la padecen, y numerosos estudios han demostrado la estrecha relación entre la hipertensión arterial no tratada y la aparición de hipertrofia ventricular, insuficiencia cardíaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas, por lo que su prevención y tratamiento constituye una de las estrategias más utilizadas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares (MacMahon S, Peto R, Cutler J y col. 1990. Lancet 335: 765-774). Todas estas enfermedades son también frecuentes en el mundo occidental. Estudios clásicos de epidemiología evidencian que la morbilidad cardiovascular aumenta significativamente a partir de unos determinados valores de presión arterial pero, además, las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares son las principales causas de muerte en las sociedades industrializadas.

Por otra parte, aunque la detección y control de la hipertensión arterial es relativamente sencilla, la realidad es que muchos pacientes hipertensos no tienen conocimiento de su enfermedad, ya que no presentan ningún tipo de síntomas, y otros están diagnosticados pero reciben un tratamiento inadecuado. Es por todo ello obvio el interés que siguen teniendo los estudios que intentan establecer nuevas estrategias para el control de la hipertensión arterial.

Se han desarrollado muchas hipótesis para explicar la elevación de los niveles de presión arterial que presentan los pacientes hipertensos. Sin embargo, la etiopatogenia de la hipertensión arterial sigue sin esclarecerse definitivamente. Son múltiples los mecanismos por los que se puede producir una elevación de la presión arterial, y a menudo estos mecanismos interactúan. En cualquier caso, el sistema renina-angiotensina-aldosterona juega un papel importante en el mantenimiento de la tensión arterial y en el daño orgánico secundario a la elevación de esta variable, y su implicación en la modulación del tono arterial de algunos pacientes hipertensos puede ser importante. Uno de los componentes principales de este sistema es la Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA) [EC 3.4.15.1] (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977. Science 196: 441-444), que cataliza la conversión de angiotensina I, un decapéptido inactivo, en angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora (Skeegs Lt, Kahn JE, Shumway NP. 1956. J Exp Med 103: 295-299). Además, la ECA cataliza la inactivación de la bradikinina, molécula que posee actividad vasodilatadora.

Por tanto, la ECA desempeña un papel muy importante en la regulación de la tensión arterial en el organismo, y su inhibición puede facilitar una vasodilatación y el control de la hipertensión arterial. De hecho, existe un grupo de fármacos inhibidores de la ECA, que se utilizan ampliamente como antihipertensivos. Entre ellos se incluyen Captopril, Enalapril y Lisinopril. La acción antihipertensiva de estos compuestos se potencia cuando se asocian con diuréticos. Aunque relativamente poco frecuentes, los efectos indeseables de los fármacos inhibidores de la ECA, pueden resultar un inconveniente para el tratamiento de algunos pacientes.

Por otro lado, las proteínas de la leche, además de su alto valor nutricional, pueden ser origen de péptidos bioactivos, es decir, péptidos capaces de modular actividades fisiológicas de importancia para la salud y bienestar de los consumidores. Estos péptidos o fragmentos proteicos son inactivos cuando se encuentran en el interior de la proteína nativa pero muestran su actividad biológica cuando son liberados por hidrólisis química o enzimática.

Existen diversos mecanismos para originar cortes en las proteínas lácteas con la consiguiente aparición de péptidos. Estos mecanismos pueden actuar de manera complementaria. Se pueden generar por hidrólisis producida por el propio procesado del producto (aumentos de temperatura, cambios de pH...), por el empleo de enzimas hidrolíticas comerciales o por el uso de microorganismos proteolíticos vivos, capaces de liberar péptidos bioactivos durante el propio proceso de fermentación de la leche, derivados lácteos o cualquier sustrato proteico.

Las investigaciones realizadas hasta este momento confirman diversas actividades biológicas encontradas en péptidos derivados de proteínas lácteas y sus aplicaciones potenciales (Kayser H, Meisel H. 1996. FEBS Letters 383: 18-20; Tome D, Debabbi H. 1998. Int Dairy J 8: 383-392; Gaucheron F, Mollé D, Briard V, Léonil J. 1999. Int Dairy J 9: 515-521; Cross MIL, Gill HS. 2000. Br J Nutr 84: 81S-89S; Shah NP. 2000. Br J Nutr 84: 3S-10S). Ente las actividades biológicas descritas para estos péptidos destacan: actividad antihipertensiva, actividad opiácea, efecto inmunomodulador, actividad antimicrobiana, actividad antitrombótica y capacidad para unir minerales. Los péptidos con actividad antihipertensiva se han obtenido a partir de hidrolizados enzimáticos de distintas proteínas alimentarias de origen animal y vegetal, pero las proteínas lácteas, tanto caseínas como proteínas de suero, constituyen la principal fuente de péptidos con actividad antihipertensiva (Yamamoto N. 1997. Biopolymers 43: 129-134).

Dentro de las investigaciones sobre péptidos funcionales con actividad Inhibidora de la ECA (actividad IECA) y/o con actividad antihipertensiva, destacan los trabajos del grupo de Yamamoto y colaboradores (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78: 777-783; Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78: 1253-1257). Estos investigadores estudiaron el efecto que sobre la presión arterial ejercía una leche fermentada por distintas cepas de Lactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae. Identificaron varios péptidos procedentes de la leche fermentada que mostraban actividad IECA in vitro, y observaron que después del proceso de fermentación, la leche fermentada disminuía la presión arterial de las ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Por el contrario, la leche fermentada no modificaba la presión de las ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las ratas SHR. Más adelante, dichos investigadores demostraron que la leche fermentada presentaba efectos antihipertensivos en humanos (Hata Y, Yamamoto N, Ohni M, Y y col. 1996. Am J Clin Nutr 64: 767-771).

Recientemente se ha descrito el efecto de una leche fermentada por Lactobacillus helveticus que disminuye la presión arterial en ratas SHR (Sipola M, Finckenberg P, Korpela R; Vapaatalo H, Nurminen Ml. 2002. J Dairy Res 69: 103-111) y en humanos hipertensos (Seppo LM, Kerojoki O, Suomalainen H, Korpela R. 2002. Milchwissenschaft 57: 124-127; Seppo LM, Jauhiainen T, Poussa T, Korpela R. 2003. Am J Clin Nutr 77: 326-330). Los resultados de estas investigaciones se han traducido en la comercialización de algunas leches fermentadas y productos lácteos fermentados tipo yogur que contienen péptidos antihipertensivos (Calpis®, Calpis Food Industry Co., Ltd, Tokio, Japón; Evolus®, Valio, Finlandia).

Adicionalmente, se han aislado y caracterizado péptidos con actividad IECA en leches fermentadas con Lactobacillus delbrueckii y Lactococcus lactis (Gobbetti M, Ferranti P, Smacchi E y col. 2000. Appl Environ Microbiol 66: 3898-3904) y también en quesos manchegos (Gómez-Ruiz JA, Ramos M, Recio I. 2002. Int Dairy J 12: 697-706).

El péptido LHLPLP ha sido descrito como un péptido que presenta actividad IECA cuando dicha actividad se valora in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado su actividad antihipertensiva (Kohmura M, Nio N, Kubo K y col. 1989. Agric Biol. Chem 53:2107-2114). En relación con esto, merece la pena destacar que muchos péptidos que in vitro se caracterizan como potentes inhibidores de la ECA, muestran, sin embargo, un efecto muy pequeño, o nulo, sobre esta enzima cuando se ensayan in vivo (Maruyama S, Mitachi H, Awaya J y col. 1987. Agric Biol Chem 51: 2557-2561; Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Puede asimismo suceder el caso contrario; es decir, que péptidos que presentan in vitro poca actividad IECA sean capaces de adquirir in vivo esta actividad gracias a la actuación sobre ellos de las enzimas digestivas (Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Todos estos resultados ponen de relieve la necesidad de probar la eficacia antihipertensiva de los péptidos que muestran actividad IECA in vitro, inicialmente se debe estudiar el efecto de estos péptidos sobre la presión arterial de animales hipertensos, y si procede, se intentará después corroborar su efecto antihipertensivo en humanos (Darragh AJ. 2002. Bull IDF 375:25-31).

Por otra parte, el potencial antihipertensivo de los péptidos administrados por vía oral depende de su capacidad para alcanzar sus lugares de actuación sin ser degradados, y consecuentemente inactivados, por las enzimas del tracto digestivo. Por tanto, la resistencia a dichas enzimas es un prerrequisito para un efecto antihipertensivo in vivo tras la ingestión oral de dichos péptidos.

Compendio de la invención

Aunque se conocen péptidos bioactivos procedentes de diferentes sustratos, y también procedimientos para producir tales péptidos bioactivos basados en la fermentación de un sustrato por determinados microorganismos, debido al creciente interés y demanda de productos alimentarios funcionales que incorporan péptidos bioactivos, resulta oportuna, conveniente, y casi necesaria, el desarrollo de procedimientos alternativos para producir dichos péptidos. Ventajosamente, dichos péptidos bioactivos deben ser resistentes a la acción de las enzimas del tracto digestivo o bien precursores de formas activas (que posteriormente puedan ser liberados por acción de las enzimas gastrointestinales) con el fin de que puedan ser administrados por vía oral.

Esta invención proporciona un procedimiento para producir un péptido bioactivo identificado por SEQ ID Nº: 1, por fermentación de un sustrato que contiene una proteína, péptido o fragmento de los mismos que contiene dicho péptido bioactivo por E. faecalis. En una realización particular, dicha bacteria se selecciona entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728 en la obtención del péptido identificado por la SEQ ID Nº: 1 que muestra actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una gráfica que representa el porcentaje de inhibición de la ECA que se obtiene según el volumen añadido de sobrenadante o suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (\medbullet) o con E. faecalis CECT 5728 (\ding{115}).

La Figura 2A es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (\medcirc), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (\medbullet), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5727.

La Figura 2B es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (\Delta), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (\ding{115}), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5728.

La Figura 3 es un cromatograma de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa del sobrenadante activo que se obtiene tras la centrifugación y ultrafiltración, a través de un membrana de 3.000 Da de tamaño de poro, de productos lácteos fermentados por E. faecalis CECT 5727 o por E. faecalis CECT 5728. Los péptidos con actividad IECA eluyen con tiempos de retención superiores a 47 minutos.

La Figura 4 es un cromatograma de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa de la fracción activa que se obtiene de la primera separación mediante HPLC. Los péptidos con actividad IECA se recogieron en 7 fracciones que eluyen entre el minuto 12 y el minuto 42.

La Figura 5A es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (\medbullet), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\ding{115}) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales. Salvo indicación en contrario, todas las dosis indicadas en esta descripción se refieren al peso corporal del animal.

La Figura 5B es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (\medbullet), 5 ml/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\ding{115}) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales.

La Figura 6A es una gráfica que muestra la variación de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (\medbullet), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\ding{115}) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales.

La Figura 6B es una gráfica que muestra la variación de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (\medbullet), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\ding{115}) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales.

La Figura 7A es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X) ó 2 mg/kg del péptido LHLPLP (\blacklozenge), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales.

La Figura 7B es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X) ó 2 mg/kg del péptido LHLPLP (\blacklozenge), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9 animales.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido bioactivo identificado por SEQ ID Nº: 1, que comprende fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo con una cepa de E. faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.

En otra realización particular, dicha cepa de E. faecalis se selecciona del grupo formado por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas. Dicha cepa puede utilizarse como un cultivo puro o sustancialmente puro o como un cultivo mixto, en forma de una preparación bacteriana que contiene E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728, junto con, opcionalmente, uno o más microorganismos diferentes tales como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus helveticus o cualquier otra bacteria láctica. Dicha preparación bacteriana, en adelante preparación bacteriana de la invención, que contiene E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728 y, opcionalmente, uno o más de dichos microorganismos diferentes, constituye un aspecto adicional de esta invención. La preparación bacteriana de la invención puede presentarse en cualquier forma apropiada; no obstante, en una realización particular, dicha preparación bacteriana se encuentra en forma deshidratada, de polvo liofilizado o en una cápsula.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "derivado" incluye cualquier derivado químico de dichos péptidos que contiene una modificación química que no afecta adversamente a su actividad biológica, por ejemplo, su actividad IECA y/o antihipertensiva; ventajosamente, dicha modificación química será una modificación tal que aumente su actividad biológica. En una realización particular, dicho derivado es un derivado peptídico que contiene una fosforilación o un grupo sulfhidrilo en el extremo amino terminal o cualquier otra modificación química que no disminuya la actividad biológica del péptido. Como es conocido, la presencia de un grupo sulfhidrilo o fosfórico aumenta, en general, la actividad de los péptidos inhibidores de la ECA (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977. Science 196: 441-444). Los derivados de los péptidos proporcionados por esta invención pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el péptido proporcionado por la invención con un reactivo que proporciona la modificación química deseada.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido proporcionado por esta invención puede obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido o base apropiado con el péptido proporcionado por la invención.

En una realización del primer aspecto de la invención, el sustrato a fermentar es una fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo.

En otra realización del primer aspecto de la invención dicho sustrato puede ser de origen animal, por ejemplo, leche, huevos, músculos de aves, peces o mamíferos, etc., o bien de origen vegetal, por ejemplo, extractos proteicos de soja, maíz, trigo, frutos secos, etc., o, incluso, puede proceder de un microorganismo, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos, etc. En una realización particular, dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene caseína, por ejemplo, \beta-caseína, tal como, leche cruda, leche entera, desnatada o semidesnatada, leche en polvo (previa reconstitución de la misma), yogur, mantequilla, queso, etc., o, alternativamente, un extracto proteico de soja. Cuando el sustrato es leche, ésta puede proceder de cualquier mamífero, por ejemplo, vaca, oveja, cabra, búfala, etc. La secuencia del péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 puede encontrarse en la secuencia de la \beta-caseína bovina (véase Ejemplo 3).

Las condiciones para la fermentación de dicho sustrato por E. faecalis se seleccionan de manera que sean las adecuadas para que dicha bacteria pueda ejercer su actividad proteolítica sobre el sustrato, de manera que se produzcan los péptidos bioactivos. El proceso de fermentación se puede terminar por cualquier método apropiado, por ejemplo, modificando el pH del medio, aplicando un tratamiento térmico, etc. La selección de las condiciones apropiadas, tales como temperatura, pH y/o aireación, así como de las condiciones para terminar la fermentación, forman parte del conocimiento general de un experto en la materia. En general, cuando el sustrato es líquido, por ejemplo, leche, se adiciona al sustrato un inóculo bacteriano, con una densidad bacteriana apropiada, y se deja fermentar, durante un periodo de tiempo adecuado a la temperatura y pH apropiados. Cuando el sustrato es sólido o sustancialmente sólido, el sustrato se mezcla con un líquido apropiado, tal como agua esterilizada, se mezcla hasta obtener una mezcla homogénea, se añade el inóculo bacteriano y se deja fermentar en las condiciones apropiadas. El pH del medio de fermentación se ajusta para favorecer la actividad proteolítica bacteriana bien antes de iniciar la fermentación o bien durante la fermentación, por adición de un ácido o una base, dependiendo de lo que sea necesario. La fermentación puede repetirse un número variable de veces añadiendo inóculos bacterianos bien frescos o bien procedentes de las fermentaciones anteriores sobre el sustrato.

Tras la fermentación del sustrato se obtiene una mezcla de péptidos bioactivos. La medida de la actividad IECA de los productos fermentados se puede realizar por métodos convencionales tal y como se describe en el Ejemplo 1.2. El péptido bioactivo identificado por SEQ ID Nº: 1 se aísla y purifica por métodos convencionales y/o se convierte en derivados y/o sales farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales.

En una realización particular, la fermentación del sustrato con E. faecalis se realiza mediante un procedimiento que comprende una primera fermentación a una temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC, típicamente alrededor de 30ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas, típicamente alrededor de 24 horas, con una carga de inóculo con una densidad bacteriana comprendida entre 10 y 10^{12}, preferentemente, entre 10^{7} y 10^{9}, bacterias por cada 100 mL de sustrato, seguida de una segunda fermentación a una temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC, típicamente alrededor de 30ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas, típicamente alrededor de 48 horas, con una carga de inóculo procedente de la primera fermentación comprendida entre 0,01% y 90% en peso, típicamente, alrededor del 3% en peso. En el Ejemplo 3 se describe el aislamiento y la caracterización del péptido bioactivo con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva identificado por SEQ. ID. Nº: 1, y sus mezclas, por fermentación de leche bovina con E. faecalis CECT 5727 o con E. faecalis CECT 5728.

El sustrato fermentado, que contiene el péptido bioactivo, en particular, el sustrato fermentado que contiene un péptido con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva identificado por la SEQ. ID. Nº: 1, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, puede ser utilizado como un agente antihipertensivo. Dicho producto fermentado, si se desea, puede ser pasteurizado, o bien puede ser secado y utilizado en forma de un polvo o de una preparación liofilizada, y puede ser utilizado en la elaboración de diversos productos, entre ellos, productos alimentarios, incluyendo productos alimentarios funcionales. El sustrato fermentado, opcionalmente, pasteurizado, constituye un aspecto adicional de esta invención.

Por tanto, en un segundo aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis, en particular, una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas en la obtención de un péptidos bioactivo, con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva identificado por SEQ ID Nº: 1, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.

El péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 ha sido obtenido anteriormente mediante síntesis química y exhibía actividad IECA (Kohmura M, Nio N, Kubo K y col. 1989. Agric Biol. Chem 53:2107-2114). Sin embargo, no se ha descrito previamente su obtención por digestión proteolítica de un sustrato con E. faecalis.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Medida de la actividad Inhibitoria de la ECA (actividad IECA)

La medida de la actividad ECA se realizó según el método descrito por Cushman y Cheung (Cushman DW, Cheung HS. 1971. Biochem Pharmacol 20:1637-1648) y modificado posteriormente por Nakamura (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78:777-783). Este método se basa en el empleo de Hipuril-L-Histidil-L-Leucina (Hip-His-Leu) como sustrato ya que la actuación de la ECA sobre dicho sustrato produce la liberación del ácido hipúrico, fácilmente cuantificable mediante espectrofotometría por lectura de la absorbancia a 228 nm (A_{228}) tras su extracción con acetato de etilo. Si en el tubo de reacción además de la ECA y del sustrato se añade la muestra a ensayar, se puede determinar la actividad IECA de la muestra ensayada. La muestra usada para medir la actividad IECA fue el sobrenadante de la leche fermentada, sometida a centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos, y posteriormente diluido a la mitad con agua destilada.

El ensayo se realiza pipeteando en tubos tipo Eppendorf los reactivos indicados en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

La solución de sustrato estaba formada por borato sódico 0,1 M, cloruro sódico 300 mM, Hip-His-Leu (Sigma, St. Louis, MO) 5 mM, pH 8,3 a 37ºC. La solución del enzima ECA (Sigma, St. Louis, MO) se ajustó a una actividad de 0,1 U/mL.

Las distintas mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y, a continuación, a cada tubo de ensayo se añadieron 150 \muL de ácido clorhídrico 0,1M con el fin de parar la reacción y, posteriormente, 1.000 \muL de acetato de etilo para extraer el ácido hipúrico. Las mezclas resultantes se agitaron vigorosamente durante 20 segundos y se centrifugaron a 1.500 x g durante 10 minutos, para separar y recoger de cada tubo la fase superior (acetato de etilo). 750 \muL, de cada fase superior se pipetearon en tubos individuales, los cuales se introdujeron en un baño con agua en ebullición hasta evaporar el disolvente, bajo campana extractora. Una vez eliminado el acetato de etilo, se añadieron 800 \muL de agua destilada a cada uno de los tubos para disolver suavemente y sin agitación el residuo seco. Por último el contenido de cada tubo se transfirió a cubetas de cuarzo para leer su absorbancia a 228 nm. El porcentaje de inhibición (% Inhibición) se calculó aplicando la siguiente fórmula:

% \ Inhibición = \frac{(A) - (B)}{(C) - (D)}

donde (A), (B), (C) y (D) corresponden a las absorbancias a 228 nm de las soluciones indicadas en la tabla 2.

Ejemplo 2 Producción de leche fermentada con actividad IECA mediante el uso de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728

Para la realización de este ejemplo de fermentación se puede utilizar indistintamente E. faecalis CECT 5727 o E. faecalis CECT 5728. El sustrato es leche bovina desnatada en polvo reconstituida en agua al 10% y autoclavada (100ºC durante 20 minutos). En primer lugar se fabricó un starter liquido, inoculando el sustrato con un asa de cultivo de manera que la población inicial fuera 10^{5}-10^{7} UFC/mL e incubando durante 24 horas. Un 3% en peso de este cultivo se utilizó como inóculo de la segunda fermentación que se mantuvo durante 48 horas. Ambas fermentaciones se realizaron a 30ºC. El proceso de fermentación se paró mediante pasteurización de la leche fermentada [75ºC durante 1 minuto], y el producto final pasteurizado fue utilizado para medir la actividad IECA según el protocolo descrito en el Ejemplo 1 si bien en este caso las leches fermentadas habían sido sometidas al tratamiento de pasteurización mencionado antes de ser centrifugadas a 20.000 x g durante 10 minutos. La Figura 1 muestra el ensayo de la actividad IECA para diferentes volúmenes de sobrenadante, diluidos adecuadamente con agua destilada con el fin de mantener un volumen constante de reacción (en el Ejemplo la dilución era a la mitad). Por lo tanto, el volumen final de reacción es siempre de 160 \muL [100 \muL de la solución de sustrato, 20 \muL de la solución de la ECA y 40 \muL de la muestra a ensayar (sobrenadante a la dilución correspondiente con agua destilada)]. Los resultados obtenidos muestran que las leches fermentadas producidas por ambos microorganismos presentan una potente actividad IECA, ya que con volúmenes de muestra pequeños se obtienen inhibiciones del 100% de la actividad.

Adicionalmente, se estudió la aparición en el tiempo de la actividad IECA en leches fermentadas con las cepas E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728 así como el grado de hidrólisis de dichas cepas. Las fermentaciones se realizaron según el protocolo explicado en este mismo Ejemplo 2 pero extrayendo alícuotas de la segunda fermentación a diversos tiempos: 8, 12, 24 y 48 horas.

La actividad IECA se determinó siguiendo el protocolo previamente descrito y se representa como actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), entendiendo por una unidad de inhibición a aquella capaz de inhibir el 50% de la actividad de la enzima ECA.

Para el estudio del grado de hidrólisis se realizó un análisis cuantitativo de los péptidos según el método OPA (Church FC, Swaisgood HE, Porter DH., Catigna GL. 1983. J Dairy Sci 66: 1219-1227). Para la curva de calibración se usó peptona de caseína (Fluka, Steinheim, Suiza).

Los resultados mostraron que la actividad IECA y la actividad proteolítica, medida mediante OPA, siguen un patrón típico de un metabolito primario, con un aumento inicial pronunciado, asociado al crecimiento exponencial del cultivo, hasta llegar a una meseta final (Figura 2).

Ejemplo 3 Identificación, aislamiento y síntesis del péptido con actividad IECA

Para llevar a cabo este trabajo se utilizaron equipos de cromatografia líquida de alta eficacia (HPLC) analítica y preparativa, así como un equipo de espectrometría de masas (MS) en tandem que permitió la secuenciación de los péptidos. Se realizaron las etapas que se mencionan a continuación.

3.A Obtención de la fracción soluble de productos lácteos fermentados

Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 se obtuvieron unos productos lácteos fermentados por las cepas de E. faecalis CECT 5727 y E. faecalis CECT 5728 (por separado). Brevemente, leche bovina en polvo reconstituida en agua al 10% y autoclavada (100ºC durante 20 minutos), se sometió a una primera fermentación de 24 horas con una cantidad de bacterias aproximada de 10^{7}-10^{9} por cada 100 mL de leche reconstituida, y una segunda fermentación de 48 horas con un inóculo de la primera fermentación del 3% en peso, realizando ambas fermentaciones a 30ºC y parando el proceso de fermentación mediante pasteurización de la leche fermentada a 75ºC durante 1 minuto. Los productos resultantes se centrifugaron a 20.000 x g durante 10 minutos. Los sobrenadantes obtenidos se ultrafiltraron a través de una membrana hidrofilica de 3.000 Da de tamaño de poro (Centripep, Amicon Inc, Beverly, MA, EEUU). Los permeados obtenidos se congelaron, liofilizaron y mantuvieron a -20ºC hasta su posterior fraccionamiento.

3.B Fraccionamiento mediante HPLC en fase reversa a escala semipreparativa

El equipo empleado (Waters Series 600 HPLC; Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) consta de una bomba (modelo delta 600), un controlador de gradiente (modelo 600), un inyector (modelo 717 plus), un detector de ultravioleta de longitud de onda variable (modelo 996), un colector de fracciones y un software de adquisición y procesado de datos (Millenium 3.2). La columna es una Prep Nova Pak® HR C_{18} (300 x 7,8 mm d.i., 6 \mum de tamaño de partícula, 60 \ring{A} de tamaño de poro) (Waters). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:1) y el disolvente B es una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0,8). Las muestras se eluyeron con un flujo de 4 mL/minuto con un gradiente lineal del 0% al 35% del disolvente B en A en 70 minutos. La absorbancia del disolvente se monitorizó a 214 nm y 280 nm.

Brevemente, cada permeado liofilizado [obtenido en 3.A] se disolvió en agua en una concentración de 100 mg/mL y, en cada separación, el volumen de muestra inyectado fue de 500 \muL. Las fracciones que se iban separando eran ensayadas para determinar la existencia de actividad IECA, según el protocolo descrito en el Ejemplo 1, observándose que los péptidos con actividad IECA eluían al final del cromatograma con tiempos de retención superiores a 47 minutos (Figura 3). Esta fracción se sometió a un segundo análisis mediante HPLC en fase reversa a escala preparativa utilizando el mismo equipo, columna y disolventes pero eluyendo la muestra con un gradiente lineal del 20% al 35% del disolvente B en A en 40 minutos (Figura 3). En esas condiciones, se observó actividad IECA en fracciones que eluían entre los minutos 12 y 42 (Figura 4, fracciones 1 a 7). Dichas fracciones, que contenían péptidos con actividad IECA, se recogieron, liofilizaron y se mantuvieron a -20ºC hasta su posterior identificación.

3.C Identificación del péptido con actividad IECA mediante espectrometría de masas en tandem (MS/MS)

El análisis mediante espectrometría de masas se realizó en un equipo de trampa iónica Esquire3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Los péptidos recogidos de HPLC y liofilizados [procedentes de 3.B] se disolvieron en una concentración de 5-10 \mug/ml en una mezcla de 50% de acetonitrilo en agua conteniendo 0,3% de ácido fórmico. La muestra se inyectó en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4 \muL/min utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado y opera con una presión de helio de 5 x 10^{-3} bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13.000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tandem para la identificación de la secuencia peptídica se realizó con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). De esta manera se identificó el péptido de secuencia SEQ ID NO: 1

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TABLA 3

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3.D Síntesis de los péptidos con actividad IECA

A continuación, se sintetizaron químicamente los péptidos con actividad IECA previamente identificados. La síntesis de dichos péptidos con actividad IECA se realizó mediante el método Fmoc en fase sólida con un sintetizador (modelo 431A; Applied Biosystems Inc., Überlingen, Alemania). La pureza de los péptidos sintéticos se verificó mediante HPLC en fase reversa a escala analítica y espectrometría de masas usando un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). El equipo (serie 1100) constaba de una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector de ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna era una columna Hi-Pore C_{18} (250 x 4,6 mm d.i., 5 \mum de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A era una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0,37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0,27). Las muestras se eluyeron con un flujo de 0,8 mL/minuto con un gradiente lineal del 0% al 30% del disolvente B en A en 25 minutos. El eluyente se monitorizó a 214 nm, mediante espectrometría de masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en 3.C, salvo que el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador era de 60 \muL/min.

En las leches fermentadas con E. faecalis CECT 5727 y/o con E. faecalis CECT 5728 y en el péptido sintetizado (que se correspondía con el péptido aislado en la leche fermentada) se determinó la concentración necesaria para producir una disminución de la actividad enzimática de la ECA del 50% (IC_{50}, expresado en \muM en el caso del péptido y en \mug/mL en el caso de las leches fermentadas). Los valores obtenidos se muestran en la Tabla 4.

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TABLA 4 Valores de IC_{50} del péptido aislado de la leche fermentada por E. faecalis CECT 5727 y/o por E. faecalis CECT 5728

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Los péptidos que presentaron actividad IECA por debajo de 700 \muM fueron seleccionados inicialmente para ensayar su actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y en ratas Wistar-Kyoto (WHY).

Ejemplo 4 Estudio de la actividad antihipertensiva de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727, leche fermentada con E. faecalis CECT 5728, y péptidos con actividad IECA identificados en dichas leches

Debido a la elevada actividad LECA que mostraban la leche bovina fermentada con E. faecalis CECT 5727 y la leche bovina fermentada con E. faecalis CECT 5728, así como el péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1, se procedió a estudiar el efecto de dichas leches fermentadas y de dicho péptido (SEQ. ID. NO: 1) sobre la presión arterial de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y de ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las ratas SHR.

Las leches fermentadas se prepararon según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Los péptidos ensayados se sintetizaron químicamente siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 3.D.

Se utilizaron ratas macho SHR y WKY de 17-20 semanas de vida y peso comprendido entre 250 y 300 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A.. Las ratas permanecían con una temperatura ambiental estable de 23ºC, y con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición. La medida de la presión arterial en estos animales se llevó a cabo mediante una modificación de la técnica del manguito en la cola (tail-cuff), originalmente descrita por Buñag (Buñag RD. 1973. J Appl Physiol 34:79). Habitualmente, esta técnica permite obtener únicamente medidas de la presión arterial sistólica (PAS); no obstante, el equipo utilizado en este estudio (modelo Le50001 Letica) permite diferenciar la PAS y la presión arterial distólica (PAD) de los animales, ya que facilita automáticamente el valor digital de ambos parámetros. Por este motivo, en este estudio, se evaluaron la modificación de la PAS y de la PAD producida por la administración aguda de las leches fermentadas y los péptidos. Antes de colocar el manguito en la cola de las ratas, éstas se exponían a una temperatura próxima a los 30ºC para facilitar la dilatación de la arteria caudal, y se anestesiaban suavemente con éter dietílico, según el procedimiento descrito por Dietz et al. (Dietz R, Schómig A, Haebara H y col. 1978. Circ Res 43:I98-I106), para minimizar el efecto del estrés sobre la medida. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbraban al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión.

La administración de los productos a ensayar se realizó mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 h y las 10 h de la mañana. Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 240 y 290 mm Hg, y entre 200 y 250 mm Hg. Las ratas WKY utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 160 y 200 mm Hg, y entre 100 y 140 mm Hg. Se tomaron medidas de la PAS y de la PAD en los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta 8 horas post-administración de los productos a ensayar; adicionalmente se tomó una medida de ambas variables (PAS y PAD) 24 horas después de la administración de dichos productos.

En el caso de las leches fermentadas, como producto de administración se usó el sobrenadante (suero) obtenido por centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos de la leche fermentada y pasteurizada a 75ºC durante 1 minuto siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Del correspondiente sobrenadante se llevó a cabo una administración única de 5 ml/kg de peso corporal del animal.

En los ensayos con el péptido SEQ. ID. Nº: 1 se llevó a cabo también una única administración, y la dosis utilizada (2 mg/kg) era equivalente en unidades de actividad IECA a la dosis de 5 mL/kg de sobrenadante de las leches fermentadas por CECT 5727 y CECT 5728. El péptido se disolvieron siempre en agua destilada, y la dosis correspondiente se administraba siempre a cada rata en un volumen de 1 mL, ya que dicho volumen era equiparable al volumen de leche fermentada que recibía cada animal. Los resultados más significativos se obtuvieron con el péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1.

Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS y de la PAD en ratas sondadas), se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a las que se les administraba mediante sonda intragástrica 1 mL de agua. Como control positivo (para establecer el efecto sobre la PAS y sobre la PAD de un fármaco IECA prototipo, tal como Captopril) se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a las que se les administraba mediante sonda intragástrica 50 mg/kg de Captopril. Esta dosis de Captopril se administraba a cada rata en un volumen de 1 mL.

Asimismo, se llevaron a cabo ensayos semejantes a los descritos anteriormente, en los que los animales se trataban por el mismo procedimiento con 1 mL de leche bovina (testigo). Dichos ensayos permitían establecer el efecto de la leche no fermentada sobre la presión arterial de los animales. Los resultados de estos ensayos no se representan en las figuras, ya que los valores de PAS y de PAD correspondientes fueron semejantes a los valores de PAS y de PAD de los animales a los que se administraba agua.

Los resultados obtenidos se agruparon y se obtuvo la media \pm el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 9 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados se compararon siempre con los datos considerados como control negativo. Para compararlos y obtener la significación estadística se utilizó el test de la "t de Student" para datos no apareados, y se consideró significativa la diferencia para valores de p<0,05.

Las Figuras 5A y 5B muestran, respectivamente, la disminución de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administración de la leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 y tras la administración de la leche fermentada con E. faecalis CECT 5728. Dichas figuras incluyen, además, la disminución de la PAS y de la PAD observada tras la administración de Captopril. Como era previsible, el Captopril produjo una pronunciada disminución de la PAS y de la PAD en las ratas SHR. La disminución de la PAS fue máxima 6 horas después de la administración del fármaco, mientras que la disminución de la PAD fue máxima 4 horas después de su administración. Los sueros de las leches fermentadas ocasionaron una disminución de la PAS y de la PAD en los animales que fue menor que la disminución producida por Captopril, pero que también fue significativa. Los valores menores de PAS después de administrar la leche fermentada con E. faecalis CECT 5727, se observaron 2 horas después de su administración. En ese momento también se obtuvieron valores muy bajos de PAD, y los valores de esta variable permanecieron bajos y sin modificar prácticamente hasta 6 horas después de la administración. Los valores menores de la PAS y de la PAD después de administrar la leche fermentada con E. faecalis CECT 5728, se observaron 4 horas después de su administración. Los valores de la PAS y de la PAD observados 24 horas después de las distintas administraciones eran semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas.

Las Figuras 6A y 6B muestran respectivamente los cambios de la PAS y de la PAD obtenidos en ratas WKY a distintos tiempos, tras la administración del suero de la leche fermentada la leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 y tras la administración del suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728. También se incluyen los resultados obtenidos tras la administración de Captopril. Puede apreciarse que ni las leches fermentadas, ni el Captopril, modificaron la PAS o la PAD de los animales tratados. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables de los productos fermentados ensayados sobre la presión arterial de sujetos normotensos.

Las Figuras 7A y 7B muestran, respectivamente, los cambios de la disminución de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administración del péptido SEQ. ID. Nº: 1, a una dosis de 2 mg/kg de peso corporal. Se puede observar que la administración de dicha dosis de ese péptido ocasiona una disminución significativa de la PAS en estos animales. La disminución de la PAS fue ya muy acusada 2 horas después de la administración, obteniéndose los valores menores de PAS 4 horas después de la administración del péptido. El péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 fue capaz de disminuir aún más la PAD de las ratas SHR que la PAS de estos animales. Además, su efecto sobre la PAD de las ratas SHR fue muy rápido y, 2 horas después de su administración, se observaron los valores menores de esta variable (PAD). Cabe resaltar que las disminuciones máximas de la PAS y de la PAD producidas por el péptido, fueron incluso mayores que las disminuciones máximas de estas variables producidas por las leches fermentadas ensayadas (representadas en las Figuras 5A y 5B). Sin embargo, 8 horas después de la administración del péptido, las ratas SHR habían recuperado valores de PAS y de PAD semejantes a los que tenían estos animales antes de su administración. Estos resultados demuestran que el péptido identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 tiene un claro y pronunciado efecto antihipertensivo que, tras su administración aguda, aparece y desaparece antes que el efecto antihipertensivo de las leches fermentadas que lo contienen.

Claims

1. Un procedimiento para producir un péptido bioactivo identificado por la SEQ. ID. Nº: 1 o un derivado y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo con una cepa de Enterococcus faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha cepa de E. faecalis se selecciona del grupo formado por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato a fermentar es una fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho sustrato es de origen animal, vegetal o procedente de un microorganismo.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene una o más proteínas lácteas, o un extracto proteico de soja.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene caseína.

7. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada de entre CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas en la obtención de un péptido con actividad inhibidora de la enzima convertidota de angiotensina y/o con actividad antihipertensiva identificado por la SEQ. ID. Nº: 1, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.