JP3665663B2 - 血圧降下剤及びその製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血圧降下作用等を有し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できる新規なペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症には、レニン−アンジオテンシン系が深い関わりを持っていることが知られている。このレニン−アンジオテンシン系には、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと称す）が重要な役割を果たしており、主に肺や血管内皮細胞に存在する。ＡＣＥは、アンジオテンシノーゲンが腎臓で産生される酵素レニンにより分解されて生成したアンジオテンシンＩ(Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu)に対して作用して、アンジオテンシンＩのＣ末端からジペプチド(His Leu)を遊離し、強力な血圧上昇作用を有するアンジオテンシンII(Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe)を生成する。それと共に、ＡＣＥは、降圧性ペプチド（ブラジキニン）を分解、不活性化する作用も有するので、結果として両作用により血圧上昇作用を示す。従って、ＡＣＥが酵素活性を阻害することにより血圧上昇を抑制すること（降圧）が可能であり、これまでに種々のＡＣＥ活性阻害を有する物質が報告されている。
【０００３】
ＡＣＥ活性阻害物質としては、天然物、化学合成物が多数報告されており、例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名であり、既に経口用降圧剤として実用化されている。しかし、これらの化学合成医薬品は、常に安全性の問題に注意を払わなければならない。
【０００４】
また、天然物あるいは天然物由来の阻害物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁体等が知られている。特に食品原料由来のＡＣＥ阻害物質は、より安全性に優れた降圧剤となり得ることが期待できる。例えば獣乳カゼイン、魚肉蛋白質等の酵素分解物から得られるＡＣＥ阻害物質等が報告されており、特にプロティナーゼによるカゼイン分解ペプチドの血圧降下作用に関する報告がなされている（N. Yamamoto et, al. J. Daily Sci. 77: 917-922 (1994)、N. Yamamoto et, al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-778 (1994)）。
【０００５】
前記プロティナーゼにより獣乳カゼインを酵素加水分解する方法は従来知られており、例えばラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)産生プロティナーゼの性質と特異性について報告されている(Claude ZEVACO and J.C.GRIPON,Le Lait,68,393-408(1988))。更にラクトバチルス ラクティス サブスペシィーズクレモリス(Lactobacillus lactis subsp. cremoris)産生P1及びP3タイプのプロティナーゼによるβ−カゼイン加水分解の比較についても報告されている（Julian R. Reid et.al.,Applied Microbiology and Biotechnology,36,344-351(1991))。しかし、プロティナーゼ処理と、カルボキシペプチダーゼ処理とを併用した際に得られるペプチドについては知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、微量の経口投与で有効なＡＣＥ阻害活性を示す血圧降下剤及びその製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、下記アミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤が提供される。
(Ｒ)n Lys Val Leu Pro Val Pro（ＲはSerを示し、ｎは０又は１を示す）
また本発明によれば、獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理を行った後、カルボキシペプチダーゼ処理することを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提供される。
【０００８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いるペプチドは、前記アミノ酸配列で示されるものであって、具体的にはSer Lys Val Leu Pro Val Pro、Lys Val Leu Pro Val Proである。またその塩としては、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
【０００９】
本発明に用いるペプチドを調製するには、公知の有機化学合成法により得ることができる。また後述する獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理と、カルボキシペプチダーゼ処理とを併用して得られる処理物を、例えば逆相液体カラムクロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）等の公知の方法で精製することにより得ることができる。得られる目的とするペプチドは、獣乳蛋白質成分の１種であるβ-カゼインを構成するペプチド単位の一部である。
【００１０】
本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有する。本発明の血圧降下剤を調製するには、公知の有機化学合成法で調製したペプチドを含有させる方法、また獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理を行った後、カルボキシペプチダーゼ処理する酵素加水分解法等により製造することができる。
【００１１】
前記獣乳成分を原料とする酵素加水分解法において、原料としての獣乳成分としては、獣乳カゼイン、獣乳カゼイン塩等を用いることができる。
【００１２】
前記プロティナーゼとしては、微生物由来のプロティナーゼ、植物由来のプロティナーゼ、動物由来のプロティナーゼのいずれも使用することができる。
【００１３】
前記プロティナーゼの調製は、公知の方法で行うことができ、例えば微生物由来のプロティナーゼとして、乳酸菌産生プロティナーゼを例にして説明すると、使用する乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチルス属乳酸菌を用いることができる。更に好ましくはラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003（Lactobacillus helveticus JCM-1003）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス JCM-1002（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM-1002）、ラクトバチルス・アシドフィラス JCM-1132（Lactobaticillus acidophilus JCM-1132）等を挙げることができる。また培地としては、牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳、更に乳酸菌用培地、例えばＢＬ培地、Briggs liver broth培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＴＴＹ培地、ＭＧＬＰ培地等が好ましい。
【００１４】
発酵条件としては、発酵温度２０〜５０℃、更に好ましくは３０〜４０℃。発酵時間３〜２０時間、更に好ましくは８〜１２時間の条件下で行うことができる。また、得られる発酵液は、通常ｐＨ３〜４を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるためには、前記発酵液を中性域のｐＨに保持して行うのが好ましい。
【００１５】
乳酸菌産生プロティナーゼの回収は、公知の方法(Yamamoto,N.et.al.,J.Biochem 14.p740-745(1993)等)に従って行うことができるが、好ましくは対数増殖期に集菌し、次いでカルシウムイオンを含むリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等により洗浄した後、カルシウムイオンを含まないリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等により抽出する方法、または、更にＤＥＡＥセファロースカラム、ゲル濾過カラム等により精製する方法を好ましく挙げることができる。前記プロティナーゼの抽出は、好ましくは５〜４０℃にて１０〜６０分抽出する工程、若しくはこの工程を２〜５回繰り返すことにより行うことができる。
【００１６】
前記プロティナーゼ処理は、獣乳カゼイン等の獣乳成分をプロティナーゼにより酵素加水分解する処理であって、例えばまずプロティナーゼと、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解した獣乳成分とを混合し、３０〜５０℃にて、１〜１２時間反応させる。この際プロティナーゼと獣乳成分との混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であるのが好ましい。次いで、そのまま、若しくは９０℃、５分間程度の処理等でプロティナーゼを失活させた後、好ましくは分子量分画１００００〜５００００の限外濾過膜等で限外濾過する処理方法等により行うことができる。
【００１７】
前記カルボキシペプチダーゼ処理は、前記プロティナーゼ処理により得られた濾過液と、カルボキシペプチダーゼとを混合し、好ましくは３０〜５０℃にて２〜２０時間反応させ、酵素加水分解させる方法等によって行うことができる。このカルボキシペプチダーゼ処理により、目的のペプチドを含む混合液を調製することができる。この際カルボキシペプチダーゼと前記濾過液との混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であるのが好ましい。
【００１８】
本発明の血圧降下剤は、ACE阻害活性を示し血圧降下作用を有する前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、ヒトをはじめとする哺乳動物の高血圧の治療、予防に有効である。
【００１９】
本発明の血圧降下剤の投与方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。剤形は、乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。前記ペプチド及びその塩は、それ自体を前記種々の剤形と成るように調製して使用することができるが、前記ペプチド及びその塩は、後述するように微量でも血圧降下作用を発揮するので、前記プロティナーゼ処理とカルボキシペプチダーゼ処理との併用により得られる酵素加水分解物溶液を、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定保健用食品及び健康食品等として用いることができる。
【００２０】
本発明の血圧降下剤の投与量は、患者の年齢、症状により異なるが、前記ペプチド及びその塩の含有量に換算して、０．１ｍｇ／体重ｋｇ・日以上で有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・日前後で使用するのが望ましい。
【００２１】
前記ペプチドを正常血圧値を示すＷＫＹラット（１５週令、体重約３００ｇ、ｎ＝５）へ１０ｍｇ／ｋｇ・日、１か月間経口投与したが、ラットの行動、外観、血圧値、剖検所見に異常は認められず、本発明のペプチドの安全性が確認された。
【００２２】
【発明の効果】
本発明に用いるペプチドは、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤等として利用可能な安全性が高く、副作用のない新規なペプチドであり、種々の医薬品、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待できる。また本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、ヒト並びに哺乳動物の血圧を有効に降下させることができる。また有効成分であるペプチドは、獣乳成分を原料として、容易にしかも安価に製造することができる。
【００２３】
【実施例】
以下実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】
β−カゼイン内の乳酸菌プロティナーゼによる切断部位及びβ−カゼイン配列を参考にして、ペプチドLys Val Leu Pro Val Proを以下に示す有機化学合成法により合成した。またその配列を基本にして表１に示す種々のペプチドを設計し、同様に有機化学合成法により合成した。
【００２５】
合成は島津製作所製のペプチド自動合成装置（型式ＰＰＳＭ−８型）を用いた固相法によって行った。固相担体としてベンジルオキシベンジルアルコールタイプのポリスチレン樹脂であって、アミノ基をフルオレニルメトキシカルボニル基（以下Fmocと略記する）で保護されたプロリンが結合した樹脂２０μｍｏｌを使用した。前記アミノ酸配列に従って、アミノ基がFmoc基で保護されたFmoc-Val、Fmoc-Pro、Fmoc-Leu、Fmoc-Lysを１００μｍｏｌずつ、常法に従い、ペプチド配列通り順次反応させてペプチド結合樹脂を得た。次にこのペプチド結合樹脂１ｍｌの反応液（１重量％エタンジチオール、５重量％アニソール、９５重量％トリフルオロ酢酸）に懸濁し、室温で２時間反応させてペプチドを樹脂から切り離し、同時に側鎖保護基を外した。次に反応混合液をガラスフィルターで濾過した後、無水エーテル１０ｍｌを加えて生成したペプチドを沈澱させて、３０００回転、５分間遠心して分離した。その沈澱を無水エーテルにて数回洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドを０．１規定のＨＣｌ水溶液２ｍｌに溶解した後に全量をＣ18の逆相カラムを用いたＨＰＬＣで、以下の条件に従って精製した。
【００２６】
ポンプ：型式Ｌ６２００インティリジェントポンプ（日立製作所製）
検出器：２１５ｎｍの紫外部吸収、型式Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所製） カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ18（ウオーターズ社製）
（Ｂ／Ａ＋Ｂ）×１００（％）：０％→４０％（６０分）
流速：１ｍｌ／分。
【００２７】
２１５ｎｍで最大吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することにより目的とする合成ペプチドを５．６ｍｇ得た。精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、更にアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。
【００２８】
Ser Lys Val Leu Pro Val Pro及び表１に示すその他のペプチドについても、上記合成方法に準じて固相法によりそれぞれＣ末端側から反応させて合成した。また合成ペプチドの精製法も上記方法に準じて行い、それぞれの精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、更にアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。
【００２９】
次に、合成した種々のペプチドについてＡＣＥ阻害活性を以下の条件で測定した。化学合成したペプチドについて、CheungとCushmanの方法「D.W.Cushman and H. S. Cheung,Biochem. Pharmacol.,20,1637(1971)」に準じ、ＡＣＥの阻害活性を測定した。即ち、前記ペプチドを含む試料８０μｌと、基質として０．１Ｍホウ酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）を用いて５ｍＭに調製したヒプリルヒスチジルロイシン（Hip His Leu、シグマ社製)２００μｌを加えた後、更にＡＣＥ水溶液（０．１Ｕ／ｍｌ、シグマ社製）２０μｌを添加し、３７℃、３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸２５０μｌを添加して反応を停止させた後、１．７ｍｌの酢酸エチルを加えて２０秒間撹拌した。次いで３０００回転で１０分間遠心して酢酸エチル層１．４ｍｌを採取した後、１２０℃、４０分間加熱して溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加え、抽出されたヒプリル酸の２２８ｎｍにおける吸光度を測定し、これをＡＣＥ阻害活性とした。ＡＣＥ阻害活性は下記式より算出した。
【００３０】
ＡＣＥ阻害率＝［（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）］×１００（％）
Ａ：試料を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度
Ｂ：試料を添加した場合の２２８ｎｍの吸光度
Ｃ：酵素及び試料を添加しない場合の２２８ｎｍの吸光度
ＡＣＥの酵素活性を５０％阻害するために必要な試料の濃度（μＭ）をＩＣ50として表１に示す。その結果Ser Lys Val Leu Pro Val ProおよびLys Val Leu Pro Val Proに強い活性を得た。またVal Leu Pro Val Pro GlnおよびVal Leu Pro
Val Proにも若干の活性が見られた。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【実施例２】
実施例１で合成した２種のペプチドSer Lys Val Leu Pro Val ProおよびLys Val Leu Pro Val Proについて下記に示す方法に従い、それぞれの降圧作用を測定した。
【００３３】
各々のペプチド１ｍｇ／ｋｇを、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ：日本チャールス・リバー社）の雄、１９〜２５週令、１群５匹に対して、胃ゾンデにて強制投与し、６時間後にコントロール群（０．０５％カゼイン投与群）との血圧降下値を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（型式ＰＥ−３００、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail-cuff法で最高血圧値を求めた。その結果、ペプチドLys Val Leu Pro Val ProおよびSer Lys Val Leu Pro Val Proが有意に血圧降下作用を示すことが確認された。血圧降下値は、それぞれ−32.2±2.9***、及び−24.5±11.1**で、コントロール群に対して有意差があった（**；P<0.01、***；P<0.001）。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）±S.E.として表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【実施例３】
ペプチドSer Lys Val Leu Pro Val Pro 及び Lys Val Leu Pro Val Pro について、投与量と血圧降下度に関するドーズレスポンスを調べた結果を図１及び図２に示す。動物及び血圧測定方法は、実施例１に準じて行った。即ち、各々のペプチド０．１、０．３、１．０ｍｇ／体重ｋｇをラットに経口投与した後、Ser Lys Val Leu Pro Val Pro においては４時間後、Lys Val Leu Pro Val Pro においては６時間後の最高血圧値を測定し、コントロール群（０．０５％カゼイン投与群）と比較した。その結果、Ser Lys Val Leu Pro Val Pro、Lys Val Leu Pro Val Pro共に、０．１〜１．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、用量依存的な効果が認められた。
【００３６】
【実施例４】
ラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003のスターター発酵液３００ｇを用い、９重量％の脱脂粉乳１０ｋｇに植菌した。次いで３Ｎ ＮａＯＨを自動的に加えて、ｐＨ６．０に保ちながら、濁度１．０になるまで３７℃、５時間培養した（濁度測定方法は、培養液１０ｍｌへクエン酸ナトリウムを終濃度１重量％になるように加え、乳蛋白質を可溶化した後、５９０ｎｍの吸光度を測定した）。次にクエン酸ナトリウムを全発酵液に１重量％となるように添加して乳蛋白質を可溶化した。続いて５０００回転、２０分間の遠心分離を行い集菌し、菌体を２０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍｌ加えて、３７℃で３０分間保持した。次いで１００００回転、１０分間の遠心分離を行い上清液を採取し、粗抽出液とした。この粗抽出液を予め５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８、ＴＥ緩衝液）で平衡にしたＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｍｌ）に通した。カラムを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液３０ｍｌで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液１５ｍｌで溶出し、乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして約１５０μｇ得た。
【００３７】
次にカゼイン２ｇを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに溶解し、上記で得られた乳酸菌産生プロティナーゼ１００μｇと混合し、４２℃で１５時間反応させた。その反応液を１００００回転、１０分間の遠心後に上清を回収し、限外濾過膜処理（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ １５０」、限外濾過膜分画分子量１００００、富士フィルター工業株式会社製）を行ったところ、カゼイン２ｇからプロティナーゼ分解ペプチド約１４００ｍｇ（収率約７０％）のペプチドが限外濾過膜透過液１８０ｍｌ中に得られた。
【００３８】
次いで得られた限外濾過膜透過液９０ｍｌを、実施例１に従いＨＰＬＣを用いて溶出し、合成ペプチドと同じ溶出時間のペプチドを回収した。得られた限外濾過膜透過液９０ｍｌからLys Val Leu Pro Val Pro Glnを２．７ｍｇ精製回収できた。
【００３９】
次に精製回収ペプチド５０μｇを１５０μｌの３５０ｍＭ ＫＣｌ−４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、カルボキシペプチダーゼＡ（シグマ社製）１０ユニットと混合した後、３７℃、１０時間反応させた。反応液を実施例１の条件に従ってＨＰＬＣ分析した。その結果を図３に示す。新たに生じたピークを精製し、そのアミノ酸配列を全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０システム、島津製作所社製）およびアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）で分析した結果、アミノ酸配列はLys Val Leu Pro Val Proであることが確認できた。反応回収率は約４０％であった。前記精製回収ペプチドを含む溶液にカルボキシペプチダーゼＡを混合直後の試料の溶出時間と吸光度との関係を図３に、１０時間反応後の試料の溶出時間と吸光度との関係を図４に示す。
【００４０】
また前記カルボキシペプチダーゼＡを混合反応させた反応液について、実施例１と同様にＡＣＥ阻害活性を測定したところ、強い活性が認められた。更に実施例２と同様に降圧作用を測定したところ、有意な血圧降下作用が得られた。
【００４１】
【実施例５】
実施例４で得られたプロティナーゼ分解ペプチド約７００ｍｇを含む限外濾過液９０ｍｌを凍結後、真空凍結乾燥機（ＦＤＵ−８３０型 東京理化社製）で乾燥した。得られた乾燥粉末６７０ｍｇを、４０ｍｌの３５０ｍＭ ＫＣｌ−４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、カルボキシペプチダーゼＡ（シグマ社製）５００ユニットと混合した後、３７℃、１０時間反応させた。反応液を実施例１の条件に従ってＨＰＬＣ分析し、合成ペプチドLys Val Leu Pro Val Proと同じ溶出時間のペプチドを回収した。
【００４２】
得られたペプチドのアミノ酸配列を全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０システム、島津製作所社製）およびアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）で分析した結果、アミノ酸配列はLys Val Leu Pro Val Proであることが確認できた。乾燥粉末６５０ｍｇをカルボキシペプチダーゼ処理することで、Lys Val Leu Pro Val Proを０．９ｍｇ精製回収できたた（回収率約３３％）。
【００４３】
また前記カルボキシペプチダーゼＡを混合反応させた反応液について、実施例１と同様にＡＣＥ阻害活性を測定したところ、強い活性が認められた。更に実施例２と同様に降圧作用を測定したところ、有意な血圧降下作用が得られた。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
【００４５】
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３で行った Ser Lys Val Leu Pro Val Pro の投与量と血圧降下度の関係を示すグラフである。
【図２】実施例３で行った Lys Val Leu Pro Val Pro の投与量と血圧降下度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例４において得られた Lys Val Leu Pro Val Pro Glnを含む溶出液にカルボキシペプチダーゼＡを混合した直後の試料の溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図４】実施例４において得られた Lys Val Leu Pro Val Pro Glnを含む溶出液にカルボキシペプチダーゼＡを混合し、１０時間反応させた後の試料の溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１：Lys Val Leu Pro Val Pro Glnのピーク
２：Lys Val Leu Pro Val Proのピーク
【産業上の利用分野】
本発明は、血圧降下作用等を有し、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に利用できる新規なペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症には、レニン−アンジオテンシン系が深い関わりを持っていることが知られている。このレニン−アンジオテンシン系には、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと称す）が重要な役割を果たしており、主に肺や血管内皮細胞に存在する。ＡＣＥは、アンジオテンシノーゲンが腎臓で産生される酵素レニンにより分解されて生成したアンジオテンシンＩ(Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu)に対して作用して、アンジオテンシンＩのＣ末端からジペプチド(His Leu)を遊離し、強力な血圧上昇作用を有するアンジオテンシンII(Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe)を生成する。それと共に、ＡＣＥは、降圧性ペプチド（ブラジキニン）を分解、不活性化する作用も有するので、結果として両作用により血圧上昇作用を示す。従って、ＡＣＥが酵素活性を阻害することにより血圧上昇を抑制すること（降圧）が可能であり、これまでに種々のＡＣＥ活性阻害を有する物質が報告されている。
【０００３】
ＡＣＥ活性阻害物質としては、天然物、化学合成物が多数報告されており、例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有名であり、既に経口用降圧剤として実用化されている。しかし、これらの化学合成医薬品は、常に安全性の問題に注意を払わなければならない。
【０００４】
また、天然物あるいは天然物由来の阻害物質としては、蛇毒ペプチド及びその類縁体等が知られている。特に食品原料由来のＡＣＥ阻害物質は、より安全性に優れた降圧剤となり得ることが期待できる。例えば獣乳カゼイン、魚肉蛋白質等の酵素分解物から得られるＡＣＥ阻害物質等が報告されており、特にプロティナーゼによるカゼイン分解ペプチドの血圧降下作用に関する報告がなされている（N. Yamamoto et, al. J. Daily Sci. 77: 917-922 (1994)、N. Yamamoto et, al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-778 (1994)）。
【０００５】
前記プロティナーゼにより獣乳カゼインを酵素加水分解する方法は従来知られており、例えばラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)産生プロティナーゼの性質と特異性について報告されている(Claude ZEVACO and J.C.GRIPON,Le Lait,68,393-408(1988))。更にラクトバチルス ラクティス サブスペシィーズクレモリス(Lactobacillus lactis subsp. cremoris)産生P1及びP3タイプのプロティナーゼによるβ−カゼイン加水分解の比較についても報告されている（Julian R. Reid et.al.,Applied Microbiology and Biotechnology,36,344-351(1991))。しかし、プロティナーゼ処理と、カルボキシペプチダーゼ処理とを併用した際に得られるペプチドについては知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、微量の経口投与で有効なＡＣＥ阻害活性を示す血圧降下剤及びその製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、下記アミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤が提供される。
(Ｒ)n Lys Val Leu Pro Val Pro（ＲはSerを示し、ｎは０又は１を示す）
また本発明によれば、獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理を行った後、カルボキシペプチダーゼ処理することを特徴とする前記血圧降下剤の製造法が提供される。
【０００８】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明に用いるペプチドは、前記アミノ酸配列で示されるものであって、具体的にはSer Lys Val Leu Pro Val Pro、Lys Val Leu Pro Val Proである。またその塩としては、薬理学上許容される塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることができる。
【０００９】
本発明に用いるペプチドを調製するには、公知の有機化学合成法により得ることができる。また後述する獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理と、カルボキシペプチダーゼ処理とを併用して得られる処理物を、例えば逆相液体カラムクロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）等の公知の方法で精製することにより得ることができる。得られる目的とするペプチドは、獣乳蛋白質成分の１種であるβ-カゼインを構成するペプチド単位の一部である。
【００１０】
本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有する。本発明の血圧降下剤を調製するには、公知の有機化学合成法で調製したペプチドを含有させる方法、また獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理を行った後、カルボキシペプチダーゼ処理する酵素加水分解法等により製造することができる。
【００１１】
前記獣乳成分を原料とする酵素加水分解法において、原料としての獣乳成分としては、獣乳カゼイン、獣乳カゼイン塩等を用いることができる。
【００１２】
前記プロティナーゼとしては、微生物由来のプロティナーゼ、植物由来のプロティナーゼ、動物由来のプロティナーゼのいずれも使用することができる。
【００１３】
前記プロティナーゼの調製は、公知の方法で行うことができ、例えば微生物由来のプロティナーゼとして、乳酸菌産生プロティナーゼを例にして説明すると、使用する乳酸菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチルス属乳酸菌を用いることができる。更に好ましくはラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003（Lactobacillus helveticus JCM-1003）、ラクトバチルス・デルブルィキィ・サブスペシィーズ・ブルガリカス JCM-1002（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus JCM-1002）、ラクトバチルス・アシドフィラス JCM-1132（Lactobaticillus acidophilus JCM-1132）等を挙げることができる。また培地としては、牛乳、山羊乳、馬乳又はこれらの脱脂乳、更に乳酸菌用培地、例えばＢＬ培地、Briggs liver broth培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＴＴＹ培地、ＭＧＬＰ培地等が好ましい。
【００１４】
発酵条件としては、発酵温度２０〜５０℃、更に好ましくは３０〜４０℃。発酵時間３〜２０時間、更に好ましくは８〜１２時間の条件下で行うことができる。また、得られる発酵液は、通常ｐＨ３〜４を示すが、目的とするプロティナーゼの収率を増加させるためには、前記発酵液を中性域のｐＨに保持して行うのが好ましい。
【００１５】
乳酸菌産生プロティナーゼの回収は、公知の方法(Yamamoto,N.et.al.,J.Biochem 14.p740-745(1993)等)に従って行うことができるが、好ましくは対数増殖期に集菌し、次いでカルシウムイオンを含むリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等により洗浄した後、カルシウムイオンを含まないリン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液等により抽出する方法、または、更にＤＥＡＥセファロースカラム、ゲル濾過カラム等により精製する方法を好ましく挙げることができる。前記プロティナーゼの抽出は、好ましくは５〜４０℃にて１０〜６０分抽出する工程、若しくはこの工程を２〜５回繰り返すことにより行うことができる。
【００１６】
前記プロティナーゼ処理は、獣乳カゼイン等の獣乳成分をプロティナーゼにより酵素加水分解する処理であって、例えばまずプロティナーゼと、リン酸緩衝液等の緩衝液に溶解した獣乳成分とを混合し、３０〜５０℃にて、１〜１２時間反応させる。この際プロティナーゼと獣乳成分との混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であるのが好ましい。次いで、そのまま、若しくは９０℃、５分間程度の処理等でプロティナーゼを失活させた後、好ましくは分子量分画１００００〜５００００の限外濾過膜等で限外濾過する処理方法等により行うことができる。
【００１７】
前記カルボキシペプチダーゼ処理は、前記プロティナーゼ処理により得られた濾過液と、カルボキシペプチダーゼとを混合し、好ましくは３０〜５０℃にて２〜２０時間反応させ、酵素加水分解させる方法等によって行うことができる。このカルボキシペプチダーゼ処理により、目的のペプチドを含む混合液を調製することができる。この際カルボキシペプチダーゼと前記濾過液との混合割合は、重量比で１：１００〜１：５０００であるのが好ましい。
【００１８】
本発明の血圧降下剤は、ACE阻害活性を示し血圧降下作用を有する前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、ヒトをはじめとする哺乳動物の高血圧の治療、予防に有効である。
【００１９】
本発明の血圧降下剤の投与方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。剤形は、乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。前記ペプチド及びその塩は、それ自体を前記種々の剤形と成るように調製して使用することができるが、前記ペプチド及びその塩は、後述するように微量でも血圧降下作用を発揮するので、前記プロティナーゼ処理とカルボキシペプチダーゼ処理との併用により得られる酵素加水分解物溶液を、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定保健用食品及び健康食品等として用いることができる。
【００２０】
本発明の血圧降下剤の投与量は、患者の年齢、症状により異なるが、前記ペプチド及びその塩の含有量に換算して、０．１ｍｇ／体重ｋｇ・日以上で有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・日前後で使用するのが望ましい。
【００２１】
前記ペプチドを正常血圧値を示すＷＫＹラット（１５週令、体重約３００ｇ、ｎ＝５）へ１０ｍｇ／ｋｇ・日、１か月間経口投与したが、ラットの行動、外観、血圧値、剖検所見に異常は認められず、本発明のペプチドの安全性が確認された。
【００２２】
【発明の効果】
本発明に用いるペプチドは、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤等として利用可能な安全性が高く、副作用のない新規なペプチドであり、種々の医薬品、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待できる。また本発明の血圧降下剤は、前記ペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、ヒト並びに哺乳動物の血圧を有効に降下させることができる。また有効成分であるペプチドは、獣乳成分を原料として、容易にしかも安価に製造することができる。
【００２３】
【実施例】
以下実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】
β−カゼイン内の乳酸菌プロティナーゼによる切断部位及びβ−カゼイン配列を参考にして、ペプチドLys Val Leu Pro Val Proを以下に示す有機化学合成法により合成した。またその配列を基本にして表１に示す種々のペプチドを設計し、同様に有機化学合成法により合成した。
【００２５】
合成は島津製作所製のペプチド自動合成装置（型式ＰＰＳＭ−８型）を用いた固相法によって行った。固相担体としてベンジルオキシベンジルアルコールタイプのポリスチレン樹脂であって、アミノ基をフルオレニルメトキシカルボニル基（以下Fmocと略記する）で保護されたプロリンが結合した樹脂２０μｍｏｌを使用した。前記アミノ酸配列に従って、アミノ基がFmoc基で保護されたFmoc-Val、Fmoc-Pro、Fmoc-Leu、Fmoc-Lysを１００μｍｏｌずつ、常法に従い、ペプチド配列通り順次反応させてペプチド結合樹脂を得た。次にこのペプチド結合樹脂１ｍｌの反応液（１重量％エタンジチオール、５重量％アニソール、９５重量％トリフルオロ酢酸）に懸濁し、室温で２時間反応させてペプチドを樹脂から切り離し、同時に側鎖保護基を外した。次に反応混合液をガラスフィルターで濾過した後、無水エーテル１０ｍｌを加えて生成したペプチドを沈澱させて、３０００回転、５分間遠心して分離した。その沈澱を無水エーテルにて数回洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドを０．１規定のＨＣｌ水溶液２ｍｌに溶解した後に全量をＣ18の逆相カラムを用いたＨＰＬＣで、以下の条件に従って精製した。
【００２６】
ポンプ：型式Ｌ６２００インティリジェントポンプ（日立製作所製）
検出器：２１５ｎｍの紫外部吸収、型式Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所製） カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ18（ウオーターズ社製）
流速：１ｍｌ／分。
【００２７】
２１５ｎｍで最大吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することにより目的とする合成ペプチドを５．６ｍｇ得た。精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、更にアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。
【００２８】
Ser Lys Val Leu Pro Val Pro及び表１に示すその他のペプチドについても、上記合成方法に準じて固相法によりそれぞれＣ末端側から反応させて合成した。また合成ペプチドの精製法も上記方法に準じて行い、それぞれの精製ペプチドを全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により、ペプチドのＮ末端から分析し、更にアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）にて分析した結果、設計通りであることが確認できた。
【００２９】
次に、合成した種々のペプチドについてＡＣＥ阻害活性を以下の条件で測定した。化学合成したペプチドについて、CheungとCushmanの方法「D.W.Cushman and H. S. Cheung,Biochem. Pharmacol.,20,1637(1971)」に準じ、ＡＣＥの阻害活性を測定した。即ち、前記ペプチドを含む試料８０μｌと、基質として０．１Ｍホウ酸緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌを含む、ｐＨ８．３）を用いて５ｍＭに調製したヒプリルヒスチジルロイシン（Hip His Leu、シグマ社製)２００μｌを加えた後、更にＡＣＥ水溶液（０．１Ｕ／ｍｌ、シグマ社製）２０μｌを添加し、３７℃、３０分間反応させた。その後、１Ｎ塩酸２５０μｌを添加して反応を停止させた後、１．７ｍｌの酢酸エチルを加えて２０秒間撹拌した。次いで３０００回転で１０分間遠心して酢酸エチル層１．４ｍｌを採取した後、１２０℃、４０分間加熱して溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｌを加え、抽出されたヒプリル酸の２２８ｎｍにおける吸光度を測定し、これをＡＣＥ阻害活性とした。ＡＣＥ阻害活性は下記式より算出した。
【００３０】
ＡＣＥ阻害率＝［（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）］×１００（％）
Ａ：試料を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度
Ｂ：試料を添加した場合の２２８ｎｍの吸光度
Ｃ：酵素及び試料を添加しない場合の２２８ｎｍの吸光度
ＡＣＥの酵素活性を５０％阻害するために必要な試料の濃度（μＭ）をＩＣ50として表１に示す。その結果Ser Lys Val Leu Pro Val ProおよびLys Val Leu Pro Val Proに強い活性を得た。またVal Leu Pro Val Pro GlnおよびVal Leu Pro
Val Proにも若干の活性が見られた。
【００３１】
【表１】
【実施例２】
実施例１で合成した２種のペプチドSer Lys Val Leu Pro Val ProおよびLys Val Leu Pro Val Proについて下記に示す方法に従い、それぞれの降圧作用を測定した。
【００３３】
各々のペプチド１ｍｇ／ｋｇを、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ：日本チャールス・リバー社）の雄、１９〜２５週令、１群５匹に対して、胃ゾンデにて強制投与し、６時間後にコントロール群（０．０５％カゼイン投与群）との血圧降下値を比較した。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（型式ＰＥ−３００、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail-cuff法で最高血圧値を求めた。その結果、ペプチドLys Val Leu Pro Val ProおよびSer Lys Val Leu Pro Val Proが有意に血圧降下作用を示すことが確認された。血圧降下値は、それぞれ−32.2±2.9***、及び−24.5±11.1**で、コントロール群に対して有意差があった（**；P<0.01、***；P<0.001）。結果を（投与前最高血圧値−投与後最高血圧値）±S.E.として表２に示す。
【００３４】
【表２】
【実施例３】
ペプチドSer Lys Val Leu Pro Val Pro 及び Lys Val Leu Pro Val Pro について、投与量と血圧降下度に関するドーズレスポンスを調べた結果を図１及び図２に示す。動物及び血圧測定方法は、実施例１に準じて行った。即ち、各々のペプチド０．１、０．３、１．０ｍｇ／体重ｋｇをラットに経口投与した後、Ser Lys Val Leu Pro Val Pro においては４時間後、Lys Val Leu Pro Val Pro においては６時間後の最高血圧値を測定し、コントロール群（０．０５％カゼイン投与群）と比較した。その結果、Ser Lys Val Leu Pro Val Pro、Lys Val Leu Pro Val Pro共に、０．１〜１．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で、用量依存的な効果が認められた。
【００３６】
【実施例４】
ラクトバチルス・ヘルベティカス JCM-1003のスターター発酵液３００ｇを用い、９重量％の脱脂粉乳１０ｋｇに植菌した。次いで３Ｎ ＮａＯＨを自動的に加えて、ｐＨ６．０に保ちながら、濁度１．０になるまで３７℃、５時間培養した（濁度測定方法は、培養液１０ｍｌへクエン酸ナトリウムを終濃度１重量％になるように加え、乳蛋白質を可溶化した後、５９０ｎｍの吸光度を測定した）。次にクエン酸ナトリウムを全発酵液に１重量％となるように添加して乳蛋白質を可溶化した。続いて５０００回転、２０分間の遠心分離を行い集菌し、菌体を２０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍｌ加えて、３７℃で３０分間保持した。次いで１００００回転、１０分間の遠心分離を行い上清液を採取し、粗抽出液とした。この粗抽出液を予め５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８、ＴＥ緩衝液）で平衡にしたＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｍｌ）に通した。カラムを０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液３０ｍｌで洗浄後、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液１５ｍｌで溶出し、乳酸菌産生プロティナーゼをほぼ単一なものとして約１５０μｇ得た。
【００３７】
次にカゼイン２ｇを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌに溶解し、上記で得られた乳酸菌産生プロティナーゼ１００μｇと混合し、４２℃で１５時間反応させた。その反応液を１００００回転、１０分間の遠心後に上清を回収し、限外濾過膜処理（商品名「アドバンテック東洋ＵＨＰ １５０」、限外濾過膜分画分子量１００００、富士フィルター工業株式会社製）を行ったところ、カゼイン２ｇからプロティナーゼ分解ペプチド約１４００ｍｇ（収率約７０％）のペプチドが限外濾過膜透過液１８０ｍｌ中に得られた。
【００３８】
次いで得られた限外濾過膜透過液９０ｍｌを、実施例１に従いＨＰＬＣを用いて溶出し、合成ペプチドと同じ溶出時間のペプチドを回収した。得られた限外濾過膜透過液９０ｍｌからLys Val Leu Pro Val Pro Glnを２．７ｍｇ精製回収できた。
【００３９】
次に精製回収ペプチド５０μｇを１５０μｌの３５０ｍＭ ＫＣｌ−４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、カルボキシペプチダーゼＡ（シグマ社製）１０ユニットと混合した後、３７℃、１０時間反応させた。反応液を実施例１の条件に従ってＨＰＬＣ分析した。その結果を図３に示す。新たに生じたピークを精製し、そのアミノ酸配列を全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０システム、島津製作所社製）およびアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）で分析した結果、アミノ酸配列はLys Val Leu Pro Val Proであることが確認できた。反応回収率は約４０％であった。前記精製回収ペプチドを含む溶液にカルボキシペプチダーゼＡを混合直後の試料の溶出時間と吸光度との関係を図３に、１０時間反応後の試料の溶出時間と吸光度との関係を図４に示す。
【００４０】
また前記カルボキシペプチダーゼＡを混合反応させた反応液について、実施例１と同様にＡＣＥ阻害活性を測定したところ、強い活性が認められた。更に実施例２と同様に降圧作用を測定したところ、有意な血圧降下作用が得られた。
【００４１】
【実施例５】
実施例４で得られたプロティナーゼ分解ペプチド約７００ｍｇを含む限外濾過液９０ｍｌを凍結後、真空凍結乾燥機（ＦＤＵ−８３０型 東京理化社製）で乾燥した。得られた乾燥粉末６７０ｍｇを、４０ｍｌの３５０ｍＭ ＫＣｌ−４０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、カルボキシペプチダーゼＡ（シグマ社製）５００ユニットと混合した後、３７℃、１０時間反応させた。反応液を実施例１の条件に従ってＨＰＬＣ分析し、合成ペプチドLys Val Leu Pro Val Proと同じ溶出時間のペプチドを回収した。
【００４２】
得られたペプチドのアミノ酸配列を全自動タンパク質一次構造分析装置（型式ＰＰＳＱ−１０システム、島津製作所社製）およびアミノ酸組成分析装置（型式８００シリーズ、日本分光社製）で分析した結果、アミノ酸配列はLys Val Leu Pro Val Proであることが確認できた。乾燥粉末６５０ｍｇをカルボキシペプチダーゼ処理することで、Lys Val Leu Pro Val Proを０．９ｍｇ精製回収できたた（回収率約３３％）。
【００４３】
また前記カルボキシペプチダーゼＡを混合反応させた反応液について、実施例１と同様にＡＣＥ阻害活性を測定したところ、強い活性が認められた。更に実施例２と同様に降圧作用を測定したところ、有意な血圧降下作用が得られた。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３で行った Ser Lys Val Leu Pro Val Pro の投与量と血圧降下度の関係を示すグラフである。
【図２】実施例３で行った Lys Val Leu Pro Val Pro の投与量と血圧降下度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例４において得られた Lys Val Leu Pro Val Pro Glnを含む溶出液にカルボキシペプチダーゼＡを混合した直後の試料の溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図４】実施例４において得られた Lys Val Leu Pro Val Pro Glnを含む溶出液にカルボキシペプチダーゼＡを混合し、１０時間反応させた後の試料の溶出時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１：Lys Val Leu Pro Val Pro Glnのピーク
２：Lys Val Leu Pro Val Proのピーク
Claims (2)
- 下記アミノ酸配列で示されるペプチド及びその塩を有効成分として含有する血圧降下剤。
(Ｒ)n Lys Val Leu Pro Val Pro（ＲはSerを示し、ｎは０又は１を示す） - 獣乳成分を原料として、プロティナーゼ処理を行った後、カルボキシペプチダーゼ処理することを特徴とする請求項１記載の血圧降下剤の製造法。
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