JP2010018552A - ソヤサポニンiを含有するレニン阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ダイズの胚軸を加熱処理し、胚軸由来の抽出液をクロマトグラフィー処理したソヤサポニンIまたは医薬として許容されるその塩よりなるレニン阻害剤およびソヤサポニンIを有効成分として含有する血圧降下剤。
【選択図】図1
Description
図1は、ソヤサポニンIのレニン阻害効果を示したグラフである。本発明によって、ダイズ由来レニン阻害物質(Soybean Renin Inhibitor;以下、「SRI」ともいう)の実体がソヤサポニンIであることが明らかになった。図1をみると、ソヤサポニンI(SRI)の濃度が増加するにつれて、相対レニン活性(%)が低下していることがわかる。
図2は、ソヤサポニンIを含むダイズ抽出液の生成方法を示したフローチャートである。ソヤサポニンIは、第1に、マメ類、特に、ダイズ、またはダイズの子葉部位もしくは胚軸部位(以下、ダイズ材料という)を準備する工程(21)と、第2に、ダイズ材料を加熱抽出する工程(22)と、第3に、加熱抽出液をクロマトグラフィー処理し、ソヤサポニンIを分離し取得する工程(23)から製造される。
図3は、ダイズ由来レニン阻害物質(SRI)の精製方法を示したフローチャートである。上述したソヤサポニンIを含むダイズ抽出液から、ソヤサポニンIを精製するために、多段階からなるクロマトグラフィー処理が行われる。具体的には、例えば、胚軸熱水抽出液を調製し(31)、セップパックカラム(Sep-Pak Vac C18, 35cc)で処理を行う(32)。ここまでは、前記ソヤサポニンIを含むダイズ抽出液の調製手順と同じである。その後、ゲル濾過クロマトグラフィー(Bio-Gel P-2)処理によってレニン阻害活性画分を回収し(33)、最後に、逆相クロマトグラフィー(ODS column)処理を行い(34)、前記レニン阻害活性画分からダイズ由来レニン阻害物質(SRI)であるソヤサポニンIを精製する(35)。逆相クロマトグラフィーによる処理では、高速タンパク分離装置(FPLC, Fast Protein Liquid Chromatography)を用いて吸着した阻害物質を0%〜100%メタノールの直線濃度勾配で溶出し、最後に、阻害活性画分を減圧乾燥することによってソヤサポニンIが精製される。
組換え型ヒトレニンは、高橋らの方法1)によって調製した。
(1)レニン阻害活性の測定
蛍光消光基質のLeu-ValおよびLeu-Leu結合の分解は、蛍光分光光度系を用いて計測した。反応溶液は、39μlの50 mMリン酸緩衝液(pH 6.5)、0.1 M NaCl、0.02% NaN3、0.02% ツイーン20、ジメチルスルフォキシドに溶解した1μlの1mMの蛍光消光基質、5μlの組換え型ヒトレニンもしくは精製ブタ腎臓レニン、および5μlの阻害剤溶液の計50μlの系で反応した。
ペプシン活性は、(7-メトキシクマリン 4-リル)アセチル(MOCAc)-アラニル(Ala)-プロリル(Pro)-アラニル(Ala)-リシルLys)-フェニルアラニル(Phe)-フェニルアラニル(Phe)-アルギニル(Arg)-ロイシル(Leu)-[Nε-(2, 4-ジニトロフェニル)-リシル](Lys(Dnp)-アミド(NH2)を基質として使用し、近藤らの方法6)によって測定した。
(1)ダイズの胚軸からのレニン阻害物質の精製
先ず、750 gのダイズの胚軸を4,500 mlの蒸留水に浸漬し、一夜室温で放置した。次に、この胚軸を121℃で15分間にわたってオートクレーブした(加熱処理)。放冷後、加熱処理された胚軸をフードプロセッサーで粉砕し、粉砕液を得た。次に、この粉砕液を10,000×gで30分間にわたって遠心分離し(遠心処理)、上清を回収した。そして、この回収した上清(100 ml)を逆相カラム (Sep-Pak Vac C18, 35cc, ウォーターズ社製)に添加し、蒸留水と50%メタノールで十分洗浄した後、吸着画分を100 mlの100%メタノールで溶出した。この操作を繰り返し行うことによって全量を処理した。
(1)ダイズ由来のレニン阻害物質(SRI)の構造解析
精製したSRIの1Hおよび13C NMRスペクトルより、SRIはソヤサポゲノールB(Soyasapogenol B)部分と3糖(グルクロン酸、ガラクトース、ラムノース)糖鎖をもつことが示唆された。そこで、標準のソヤサポニンI(Soyasaponin I)とダイズ由来レニン阻害物質(SRI)の[α]D、混合融点、IRおよび1HNMRスペクトルを比較した。その結果、SRIはソヤサポニンIと同定された。ソヤサポニンIの構造は、図5に示した。
図1にソヤサポニンIによるヒトレニンの阻害曲線を示した。この阻害曲線より、IC50値は30μg/mlと算出された。一方、阻害様式は部分的非拮抗阻害 (partial non-competitive inhibition)であることが明らかとなった。
図4は、ソヤサポニンIの各種酵素に対する阻害結果を示した表である。ソヤサポニンIは、ヒトレニンの活性だけではなく、ブタレニンの活性も強く阻害し、そのIC50値はヒトレニンの場合と同様に30μg/mlと算出された。また、阻害定数(Ki)は、37μMと算出された。最終濃度0.1 mg/mlのソヤサポニンIでは、ヒトレニンの活性を74%、ブタレニンの活性を85%阻害し、極めて高い阻害能を示した。一方、同濃度のソヤサポニンIは、ブタペプシン、パパイン、およびブロメラインの活性に対しても阻害能を示したが、その活性阻害能はそれぞれ15%、25.5%、および22%と低く、レニン活性の阻害能には及ばなかった。そして、ウシトリプシン、ヒト尿カリクレイン、ウサギ肺由来アンギオテンシン変換酵素、およびアミノペプチダーゼの活性に対する阻害能はいずれも認められなかった。以上の結果から、ソヤサポニンIは、ヒトおよびブタレニンを特異的に阻害することが示された。
(1)実験方法
(試料の調製)
大豆胚軸を蒸留水に浸漬し、一夜室温で放置した。その試料を121℃、15分間オートクレーブし、放冷後、フードプロセッサーで粉砕した。粉砕液を10,000×g、30分間遠心分離し、上清を回収した。100m1上清を逆相カラム(Sep-Pak Vac C18, 35cc, ウォーターズ社製)に添加し、蒸留水と50%メタノールで十分洗浄した後、吸着画分を100m1の100%メタノールで溶出した。ソヤサポニンIを含むメタノール溶出画分を減圧乾固し、40mg/mlとなるように蒸留水に溶解し、これを動物実験用ダイズ抽出液とした。
5週齢の雄性高血圧自然発症ラット(SHR)を市販固形飼料で7週間飼育した。飼育期間中、対照群には体重1kgあたり1m1の蒸留水を、試験群には体重1kgあたり1mlの大豆抽出液を1日1回経口投与した。大豆抽出液には、40mg/m1の抽出物が含まれているため、試験群には体重1kgあたり40mgの抽出物を毎日投与していることになる。対照群および試験群としてそれぞれ7匹のSHRを用いた。
結果を図5に示す。ソヤサポニンIを含むダイズ抽出液を7週間投与後のSHRの体重および脈拍数は、対照群と有意差は認められなかった。血圧に関しては、大豆抽出液投与群(217±3.6mmHg、平均値±標準誤差)が対照群(228±1.8mmHg、平均値±標準誤差)に比べ有意に低下が認められた。したがって、ソヤサポニンIを含むダイズ抽出液が血圧降下作用を持つことが確認された。
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3) Takahashi, S., Irie, A., and Miyake, Y., Primary structure of human urinary prokallikrein. J. Biochem., 104, 22-29 (1988).
4) Kitagawa, I., Yoshikawa, M., Wang, H. K., Saito, M., Tosirisuk, V., Fujiwara, T., and Tomita K-I., Reversed structures of soyasapogenol A, B, and E, oleanene-sapogenols from soybean. Structure of soyasaponins I, II, and III. Chem. Pharm. Bull., 30, 2294-2297 (1982).
5) Kitagawa, I., Wang, H. K., Taniyama, T., and Yoshikawa, M., Saponin and sapogenol. XLI. Reinvestigation of the structures of soyasapogenol A, B. and E oleanene- sapogenols from soybean. Structures of soyasaponin I, II, and III. Chem. Pharm. Bull., 36, 153-161 (1988).
6) Kondo, H., Shibano, Y., Amachi, T., Cronin, N., Oda, K., and Dunn, B. M., Substrate specificities and kinetic properties of proteinase A from yeast Sccharomyces cerevisiae and the development of a novel substrate. J. Biochem., 124, 141-147 (1998).
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9) Pfleiderer, G., Particle-bound aminopeptidase from pig kidney. Methods Enzymol. 19, 514-521 (1970).
Claims (6)
- ソヤサポニンIまたは医薬として許容されるその塩を有効成分として含有するレニン阻害剤。
- 前記ソヤサポニンIが、マメ類から抽出されたものである、請求項1に記載のレニン阻害剤。
- 前記ソヤサポニンIが、ダイズから抽出されたものである、請求項1に記載のレニン阻害剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のレニン阻害剤を有効成分として含有する血圧降下剤。
- ダイズの胚軸を準備する工程と、
前記胚軸を加熱処理し、胚軸由来の抽出液を得る工程と、
前記抽出液をクロマトグラフィー処理し、ソヤサポニンIを得る工程と、
を含む、レニン阻害剤を製造する方法。 - ダイズの胚軸を準備する工程と、
前記胚軸を加熱処理し、胚軸由来の抽出液を得る工程と、
前記抽出液をクロマトグラフィー処理し、ソヤサポニンIを得る工程と、
を含む、血圧降下剤を製造する方法。
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