JPH04202198A - 新規ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を有する新規なペプチドを提供する
ものであり、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等として
有用なペプチドに関する。

Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒ。

［従来の技術］ アンギオテンシン変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンシンＩ（Ａｓ
ｐ　−Ａｒｇ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｈｉｓ
−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ）に作用して、
アンギオテンシンＩのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉｓ９
−Ｌｅｕ”）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有する
アンギオテンシン■を生成させる酵素である。また、こ
の酵素は生体内降圧物質であるプラジキニンを破壊し不
活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与している。

、　従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻害
すれば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療
に有効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトプリルが合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンノ　
　′ン変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天
然物からの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンンン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることが期待されるからである。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチド。

５Ｑ２０８８＋）等や、ストレプトミセス属に属する放
線菌の代謝産物ｌ５８３　（特開昭５８−１７７９２０
号公報）が知られているに過ぎない。また、天然物を酵
素処理して得られたアンギオテンシン変換酵素阻害物質
としては、牛乳カゼインをトリプトシンにより分解して
得たペプチド類等が知られているが（特開昭５８−１０
９４２５号、同５９−４４３２３号、同５９−４４３２
４号、同６１−３６２２６号、同６１−３６２２７号）
新規な阻害物質の開発が望まれているところである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副作
用の少ないアンギオテンシン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、アルブミンを特定の酵素で加水分解した組
成物中にアンギオテンンン変換酵素阻害活性を有する物
質の存在をつきとめ、該物質がＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
を骨格とするペプチドであることを知見し、本発明を完
成した。

本発明のＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏを骨格とするペプチド
は文献未載の新規なペプチドであり、アルブミン等の蛋
白質をペプシンによって加水分解することによって製造
され、実用にあたっては組成物をそのまま用いても良く
、あるいは必要に応じて精製して使用される。更にはペ
プチド合成の常套手段を適用して合成することによって
製造することもできる。

上記でいうＶａｌはバリン、Ｓｅｒはセリン、Ｐｒ。

はプロリンを意味し、かかるアミノ酸はいずれもＩ、一
体である。

本発明のペプチドは蛋白質をペプシンで加水分解するこ
とによっても、ペプチド合成法でも取得できる。蛋白質
をペプシンで加水分解するには、蛋白質の性状により処
決は異なるが、難溶性の場合には熱水に蛋白質を混合し
強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のペプシンを加え
温度１゛０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、ＰＨＯ
。

１〜４．０でＩＯ分〜３日門静置又は撹拌反応を行う。

蛋白質としては、アルブミンが有用である。アルブミン
としては動物や植物の体液及び組織中に広く分布してい
る可溶性蛋白質例えば、卵白アルブミン、血清アルブミ
ン、乳アルブミン、筋アルブミン等が任意に用いられる
が、特に卵白アルブミンが有用である。加水分解液中に
は本発明のペプチド結合に、他のペプチドが存在してる
が、これらは混合物のままで各種の用途に用いられても
良く、又、本発明のペプチドのみを単離して用いても差
し支えない。

単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方−
ζ− 法、即ち液相法または同相法でペプチド結合の任意の位
置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反
応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメン
トに相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジ
イミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成す
る縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去させ
ることによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばベンジルオキシアルボニル、ｔ−ブチルオキシ
カルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボ
ニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙
げられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙
げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基
はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

６一 縮合反応終了後、保護基は除去されるが、同相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投
与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが
、通常１回０．００１〜１０００ｎ＋９、好ましくは０
．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。本発明
のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤
の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野にお
いて常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質
が用いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マ
ンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプ
ン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケ
イ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロギシプロピルデンブン、カルボキシメチル
セルロ−スカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロ
ース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキンプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケ
イ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント
、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂
肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、
脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼ
ラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ
、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、
非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙
げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロ
ップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティン
グしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水
あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤
や保与剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、
好ましくは０．５〜７０％の割合で含有することができ
る。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含
有していてもよい。

［作　　用］ 本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れたアン
ギオテンンン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
プラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎
性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤
、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられ
る血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少
、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であ
る。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

生卵白を蒸留水で５倍に希釈溶解した後、ｌＮ−ＨＣｌ
でＰＨ１，６に調整した溶解液（２０ｍｇ／　ｒｎＱの
蛋白を含　゛む）にペプシン０．２ｍｇ／ｍρ（ングマ
社製）を添加して３７℃、３時間静置反応を行い１００
　℃、１０分間煮沸して反応を停止させた。この反応液
を１１０００Ｏｒｐで５分間遠心分離を行い、濃縮した
後高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ−、ＰＩ−１＝
及びＣＮ−カラム）により精製し、ペプチドを得た。

本島を気相プロテインンーケンサー（アプライド　バイ
オシステムズ社製　４７７　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

Ｈ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＩ−ｒ該ペプチドの物
性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ［ｎ−ブタノール・酢酸：ピリジン：水＝１５・
３：ｌＯ・１２］ （シリカゲルプレート、ニンヒドリン発色）Ｒｆ：０．
４３ ｍ、ｐ：９１°Ｃ 元素分析　ＣＩ！ＩＨ２！ＩＮ　ｓｏ　ｓ・０．５Ｈ２
０としてＣＨＮ 計算値　５０．３１　７．７９　１３．５４測定値　５
０．１９　７．６９　１３．５２−１０＝ 〔ペプチドの合成〕 市販のＢｏｃ（ブトキシカルボニル）−Ｐｒｏ−０−Ｒ
ｅｓｉｎ　　Ｏ，８３ｆｊをバイオサーチ社のペプチド
合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のように合成
を行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２．５％アニソールを含む塩
化メチレン中、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去
したのち、塩化メチレンによる洗浄、１０％ジイソプロ
ピルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び
塩化メチレンによる洗浄を行った。

これと５ｍｌの０．４Ｍ　Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ　Ｉ）
（ベンジル基）のジメチルホルムアミド溶液、５ｍｌの
０．４Ｍジイソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン
溶液とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹
拌反応させた。

得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩化メチレン、
１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメチルホルムア
ミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚ　ｌ）
　−Ｐｒｏ樹脂を得た。引き続き同様のＢｏｃ基の除去
、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰り返しＶａｌ−
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ樹脂を得た。

該樹脂を２０ｍ１の１０％アニソールを含むフッ化水素
中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させ
た。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽出
し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラ
ム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ　　５　Ｃ＋ｓ）による逆相クロ
マトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｒｏ−ＯＨ（収量１００＋ｎ９）を得た。

本島を前記と同一のプロティンシーケンサ−により分析
した結果、上記の組成であることが判明した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。

Ｒｆ：Ｑ、４３ 元素分析　Ｃ＋３ＨｔａＮ３０ｓ・０．６Ｈ２０として
ＣＨＮ 計算値　５０．０２　７．８１　１３．４６測定値　５
０．０５　７．７３　１３．５９比旋光０度［α］”；
　（Ｃ＝０．５　　水）；−８１，３７又、目的とする
ペプチドのアミノ酸種に応じて反応薬剤を変更した以外
は上記の合成例に準じてＨ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＨを合成
した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ：０．６０ ｍ、ｐ：１６５°Ｃ 元素分析　Ｃ４５Ｈ６ＢＮ＋２０　Ｉｔｓ　２・０．８
Ｈ２０としてＣＨＮ　　　　　　　　Ｓ 計算値　５１．６９　６．５２　１６．０８　６．１３
測定値　５１，６０　６．４８　　＋６．００　６．１
８比旋光度［α］”；　（Ｃ＝０．５　　水）、−８２
，６３実施例１〜２ （アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンシン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕｓｈｍａｎの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａ
ｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０　。

＋６３７（＋９７１））に準じて以下の方法で行った。

酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈ４ｓ−Ｌｅｕ
（８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵　索；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）
（ｌｉｐを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍ１中で粉砕し
た後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μρ、酵素溶液を１２μＣ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｅとした後、３７℃で３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μρを用いて終了させた
。

反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れＶ　ｏｒｔｅ
ｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１．ｏｍｌをとり出して、酢酸エチル
を留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し
、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２’８ｎｍの値（ＯＤ
２２８）を測定した。

阻害率は阻害剤なしで反応したときのＯＤ２．ｓを１０
０％とし、反応時間０分のときの０Ｄｔ２ｓを０％とし
て求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド）
の濃度ＩＣ５ｏ（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

第１表 （注）Ｐｈｅ；フェニルアラニン Ｇｌｙ　、グリシン Ａｒｇ　；アルギニン Ｃｙｓ　；システィン ［効　　果］ 本発明ではアンギオテンシン変換酵素阻害剤として有用
な、新規なペプチドが得られる。

特許出願人　　　日本合成化学工業株式会社手続補正書 平成３年２月８日 ｌ、事件の表示 平成２年特許願第３３４３１４号 ２、発明の名称 新規ペプチド、その製造法及び用途 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　大阪市北区野崎町９番６号（郵便番号５３０）
４、補正の対象 特許願及び明細書の発明の詳細な説明の欄５、補正の内
容 （１）本願特許願を別紙の如く補正する。

（２）明細書第２頁第１１行の「プラジキニン」を１ブ
ラジキニン」と訂正する。

（３）明細書第３頁第１１行の「トリプトシン」を１ト
リブンン」と訂正する。

（４）明細書第６頁第１Ｏ行の 「ベンジルオキシアルボニル」を 「ベンジルオキシカルボニル」と訂正する。

（５）明細書第９頁第９行の 「プラジキニン不活化抑制作用」を 「プラジキニン不活化抑制作用」と訂正する。

（６）明細書第１３頁第１６行の「２０」をｒ２０Ｊと
訂正する。

（７）明細書第１５頁の第１表の実施例２の阻害剤ｒＨ
−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ３／５−Ｖａｌ
−９ｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＨＪを ｒＨ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａ’ｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖ
ａｌ−９ｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＨＪと訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ骨格をもつ新規ペプチド。 ２、蛋白質をペプシンで加水分解することを特徴とする
   Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ骨格をもつ新規ペプチドの製造
   法。 ３、蛋白質としてアルブミンを使用する請求項２記載の
   製造法。 ４、アルブミンとして卵白アルブミンを使用する請求項
   ３記載の製造法。 ５、Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ骨格をもつペプチドを有効
   成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤。