JP3465920B2 - 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 - Google Patents
新規ペプチド、それを製造する方法及び用途Info
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- JP3465920B2 JP3465920B2 JP09255093A JP9255093A JP3465920B2 JP 3465920 B2 JP3465920 B2 JP 3465920B2 JP 09255093 A JP09255093 A JP 09255093A JP 9255093 A JP9255093 A JP 9255093A JP 3465920 B2 JP3465920 B2 JP 3465920B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、下記構造を有する新規
なペプチドを提供するものであり、アンギオテンシン変
換酵素阻害剤等として有用なペプチドに関する。 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ
なペプチドを提供するものであり、アンギオテンシン変
換酵素阻害剤等として有用なペプチドに関する。 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ
【０００２】
【従来の技術】アンギオテンシン変換酵素は、主として
肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテ
ンシンI（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用し
て、アンギオテンシンIのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉ
ｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンIIを生成させる酵素である。ま
た、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破
壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与して
いる。従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻
害すれば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治
療に有効であると考えられている。最近ではプロリン誘
導体であるカプトプリルが合成され、降圧活性が確認さ
れて以来、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害物質の
合成研究が盛んであり、又天然物からの取得も試みられ
ているところである。天然物由来のアンギオテンシン変
換酵素阻害剤は食品あるいは食品原料から得られるので
低毒性で安全性の高い降圧剤となることが期待されるか
らである。
肺や血管内皮細胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテ
ンシンI（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用し
て、アンギオテンシンIのＣ末端よりジペプチド（Ｈｉ
ｓ9−Ｌｅｕ10）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有
するアンギオテンシンIIを生成させる酵素である。ま
た、この酵素は生体内降圧物質であるブラジキニンを破
壊し不活化する作用も併有し、昇圧系に強力に関与して
いる。従来より、アンギオテンシン変換酵素の活性を阻
害すれば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治
療に有効であると考えられている。最近ではプロリン誘
導体であるカプトプリルが合成され、降圧活性が確認さ
れて以来、種々のアンギオテンシン変換酵素阻害物質の
合成研究が盛んであり、又天然物からの取得も試みられ
ているところである。天然物由来のアンギオテンシン変
換酵素阻害剤は食品あるいは食品原料から得られるので
低毒性で安全性の高い降圧剤となることが期待されるか
らである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、天然物
中に見出されるアンギオテンシン変換酵素阻害物質は極
めてまれで、僅かにブラジル産や日本産蛇毒より得られ
たテプロタイド（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等
や、ストレプトミセス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ
８３（特開昭５８−１７７９２０号公報）が知られてい
るに過ぎない。また、天然物を酵素処理して得られたア
ンギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼイ
ンをトリプシンにより分解して得たペプチド類等が知ら
れているが（特開昭５８−１０９４２５号、同５９−４
４３２３号、同５９−４４３２４号、同６１−３６２２
６号、同６１−３６２２７号）新規な阻害物質の開発が
望まれているところである。
中に見出されるアンギオテンシン変換酵素阻害物質は極
めてまれで、僅かにブラジル産や日本産蛇毒より得られ
たテプロタイド（ノナペプチド，ＳＱ２０８８１）等
や、ストレプトミセス属に属する放線菌の代謝産物ＩＳ
８３（特開昭５８−１７７９２０号公報）が知られてい
るに過ぎない。また、天然物を酵素処理して得られたア
ンギオテンシン変換酵素阻害物質としては、牛乳カゼイ
ンをトリプシンにより分解して得たペプチド類等が知ら
れているが（特開昭５８−１０９４２５号、同５９−４
４３２３号、同５９−４４３２４号、同６１−３６２２
６号、同６１−３６２２７号）新規な阻害物質の開発が
望まれているところである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決すべく天然物質で副作用の少ないアンギオテン
シン変換酵素阻害物質を鋭意探索した結果、魚肉、カツ
オブシを特定の酵素で加水分解した組成物中にアンギオ
テンシン変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつきと
め、該物質がＨ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨよりな
るペプチドであることを知見し、本発明を完成した。
題を解決すべく天然物質で副作用の少ないアンギオテン
シン変換酵素阻害物質を鋭意探索した結果、魚肉、カツ
オブシを特定の酵素で加水分解した組成物中にアンギオ
テンシン変換酵素阻害活性を有する物質の存在をつきと
め、該物質がＨ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨよりな
るペプチドであることを知見し、本発明を完成した。
【０００５】本発明のＨ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｏ
Ｈよりなるペプチドは文献未載の新規なペプチドであ
り、カツオブシ等の魚肉をサーモライシンによって加水
分解することによって製造され、実用にあたっては組成
物をそのまま用いても良く、あるいは必要に応じて精製
して使用される。更にはペプチド合成の常套手段を適用
して合成することによって製造することもできる。上記
でいうＩｌｅはイソロイシン、Ｔｒｐはトリプトファ
ン、Ｈｉｓはヒスチジンを意味し、かかるアミノ酸はい
ずれもＬ−体である。
Ｈよりなるペプチドは文献未載の新規なペプチドであ
り、カツオブシ等の魚肉をサーモライシンによって加水
分解することによって製造され、実用にあたっては組成
物をそのまま用いても良く、あるいは必要に応じて精製
して使用される。更にはペプチド合成の常套手段を適用
して合成することによって製造することもできる。上記
でいうＩｌｅはイソロイシン、Ｔｒｐはトリプトファ
ン、Ｈｉｓはヒスチジンを意味し、かかるアミノ酸はい
ずれもＬ−体である。
【０００６】本発明のペプチドは魚肉をサーモライシン
で加水分解することによっても、ペプチド合成法でも取
得できる。魚肉をサーモライシンで加水分解するには、
魚肉の性状により処法は異なるが、難溶性の場合には熱
水に蛋白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定
量のサーモライシンを加え温度１０〜８５℃程度で０．
１〜４８時間反応を行う。加水分解液中には本発明のペ
プチド以外に、他のペプチドが存在してるが、これらは
混合物のままで各種の用途に用いられても良く、又、本
発明のペプチドのみを単離して用いても差し支えない。
単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。
で加水分解することによっても、ペプチド合成法でも取
得できる。魚肉をサーモライシンで加水分解するには、
魚肉の性状により処法は異なるが、難溶性の場合には熱
水に蛋白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定
量のサーモライシンを加え温度１０〜８５℃程度で０．
１〜４８時間反応を行う。加水分解液中には本発明のペ
プチド以外に、他のペプチドが存在してるが、これらは
混合物のままで各種の用途に用いられても良く、又、本
発明のペプチドのみを単離して用いても差し支えない。
単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。
【０００７】本発明のペプチドはペプチド合成に通常用
いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合
の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方の
フラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
をカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を除去させることによっても製造し得る。
いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合
の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に
相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方の
フラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
をカルボジイミド法、活性エステル法等を用いて縮合さ
せ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基
を除去させることによっても製造し得る。
【０００８】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロ
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成
し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカ
ルボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、
Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合
している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存
在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペ
プチド活性エステルを用いて実施する。
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピロ
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル等が挙げられる。カルボキシル基の保護基として
は例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成
し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカ
ルボキシル基はクロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、
Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合
している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存
在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペ
プチド活性エステルを用いて実施する。
【０００９】縮合反応終了後、保護基は除去されるが、
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。本発明で使用するペプチド
の投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投
与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明の
ペプチドの投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の
症状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１
０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当た
り１〜３回である。本発明のペプチドは通常、製剤用担
体と混合して調製した製剤の形で投与される。
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。本発明で使用するペプチド
の投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投
与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明の
ペプチドの投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の
症状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１
０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当た
り１〜３回である。本発明のペプチドは通常、製剤用担
体と混合して調製した製剤の形で投与される。
【００１０】製剤用担体としては、製剤分野において常
用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用い
られる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニッ
ト、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶
糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸ア
ルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、
ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベン
トナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸
グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチ
ン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流
動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イ
オン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げら
れる。
用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用い
られる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニッ
ト、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶
糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸ア
ルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、
ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、
ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベン
トナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エ
ステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸
グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチ
ン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流
動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イ
オン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げら
れる。
【００１１】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製
剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、好ましくは
０．５〜７０％の割合で含有することができる。これら
の製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していて
もよい。
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸
濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方
法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発
明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応
じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよ
く、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製
剤は、本発明のペプチドを０．０１％以上、好ましくは
０．５〜７０％の割合で含有することができる。これら
の製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していて
もよい。
【００１２】
【作用】本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優
れたアンギオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降
下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示し本態性高血
圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、
治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用
いられる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞
の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤として有
用である。
れたアンギオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降
下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示し本態性高血
圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、
治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用
いられる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞
の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤として有
用である。
【００１３】
（Ａ）カツオブシ５ｇに水４０ｍｌを加え充分ホモジナ
イズし、サーモライシンを２０ｍｇ加え３７℃、ｐＨ７
で３時間加水分解反応を行った。１００℃で１０分間煮
沸し、冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＯＤＳ−，Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）により
精製し、ペプチドを得た。本品を気相プロテインシーケ
ンサー（アブライド バイオシステムズ社製 ４７７
Ａ型）を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸
配列を分析し、下記の構造を得た。 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ
イズし、サーモライシンを２０ｍｇ加え３７℃、ｐＨ７
で３時間加水分解反応を行った。１００℃で１０分間煮
沸し、冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＯＤＳ−，Ｐｈ−及びＣＮ−カラム）により
精製し、ペプチドを得た。本品を気相プロテインシーケ
ンサー（アブライド バイオシステムズ社製 ４７７
Ａ型）を用いる自動エドマン分解法を適用してアミノ酸
配列を分析し、下記の構造を得た。 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ
【００１４】該ペプチドの物性値はつぎのとうりであ
る。 ＴＬＣ［ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１５：
３：１０：１２］ （シリカゲルプレート、ニンヒドリン発色） Ｒｆ：０．２５
る。 ＴＬＣ［ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１５：
３：１０：１２］ （シリカゲルプレート、ニンヒドリン発色） Ｒｆ：０．２５
【００１５】〔ペプチドの合成〕市販のＢｏｃ（ブトキ
シカルボニル）−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）（トシル基）−Ｏ−
Ｒｅｓｉｎ（置換率０．７ｍｅｑ／ｇ）０．４３ｇをバ
イオサーチ社のペプチド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分
取し、以下のように合成を行った。４５％トリフルオロ
酢酸、２．５％アニソールを含む塩化メチレン中、２５
分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩化メチ
レンによる洗浄、１０％ジイソプロピルエチルアミンを
含む塩化メチレンによる中和、及び塩化メチレンによる
洗浄を行った。これと５ｍｌの０．４Ｍ Ｂｏｃ−Ｔｒ
ｐのジメチルホルムアミド溶液、５ｍｌの０．４Ｍジイ
ソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液とを混合
した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させ
た。
シカルボニル）−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）（トシル基）−Ｏ−
Ｒｅｓｉｎ（置換率０．７ｍｅｑ／ｇ）０．４３ｇをバ
イオサーチ社のペプチド合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分
取し、以下のように合成を行った。４５％トリフルオロ
酢酸、２．５％アニソールを含む塩化メチレン中、２５
分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去したのち、塩化メチ
レンによる洗浄、１０％ジイソプロピルエチルアミンを
含む塩化メチレンによる中和、及び塩化メチレンによる
洗浄を行った。これと５ｍｌの０．４Ｍ Ｂｏｃ−Ｔｒ
ｐのジメチルホルムアミド溶液、５ｍｌの０．４Ｍジイ
ソプロピルカルボジイミドの塩化メチレン溶液とを混合
した後、反応槽に加え、室温にて２時間撹拌反応させ
た。
【００１６】得られた樹脂をジメチルホルムアミド、塩
化メチレン、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む
塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメ
チルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ
−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。引き続き同様のＢｏ
ｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰り返
しＩｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。該
樹脂を２０ｍｌのフッ化水素（１０％アニソール及び
０．５ｇのインドールを含む）中で０℃、１時間撹拌
し、ペプチドを樹脂から遊離させた。フッ化水素を減圧
留去し、残渣を３０％酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペ
プチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ18）による逆相クロマトグラフィーにより精製
し、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ（収量６８．２
ｍｇ）を得た。本品を前記と同一のプロテインシーケン
サーにより分析した結果、上記の組成であることが判明
した。
化メチレン、１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む
塩化メチレン、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメ
チルホルムアミドとの混合液で洗浄し、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ
−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。引き続き同様のＢｏ
ｃ基の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰り返
しＩｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。該
樹脂を２０ｍｌのフッ化水素（１０％アニソール及び
０．５ｇのインドールを含む）中で０℃、１時間撹拌
し、ペプチドを樹脂から遊離させた。フッ化水素を減圧
留去し、残渣を３０％酢酸で抽出し、凍結乾燥して粗ペ
プチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ18）による逆相クロマトグラフィーにより精製
し、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨ（収量６８．２
ｍｇ）を得た。本品を前記と同一のプロテインシーケン
サーにより分析した結果、上記の組成であることが判明
した。
【００１７】該ペプチドの物性値はつぎのとうりであ
る。尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。 Ｒｆ： ０．２５
る。尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。 Ｒｆ： ０．２５
【００１８】（アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測
定）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈ
ｅｕｎｇとＣｕｓｈｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７
(１９７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ （８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
定）アンギオテンシン変換酵素阻害活性の測定は、Ｃｈ
ｅｕｎｇとＣｕｓｈｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ ２０，１６３７
(１９７１)〕に準じて以下の方法で行った。 酵素基質；Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ （８６ｍｇを水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した
溶液） 酵 素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製） （１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した
後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
【００１９】反応は１Ｎ−ＨＣｌ ２５０μｌを用いて
終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れ
Ｖｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢
酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを
留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、
抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（Ｏ
Ｄ228）を測定した。阻害率は阻害剤なしで反応したと
きのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯ
Ｄ228を０％として求め阻害率５０％の時の阻害剤（本
発明のペプチド）の濃度ＩＣ50（μＭ）で活性を表示す
ると３．５であった。
終了させた。反応終了液に酢酸エチル１．５ｍｌを入れ
Ｖｏｒｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢
酸エチル層から１．０ｍｌをとり出して、酢酸エチルを
留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、
抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（Ｏ
Ｄ228）を測定した。阻害率は阻害剤なしで反応したと
きのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯ
Ｄ228を０％として求め阻害率５０％の時の阻害剤（本
発明のペプチド）の濃度ＩＣ50（μＭ）で活性を表示す
ると３．５であった。
【００２０】
【発明の効果】本発明ではアンギオテンシン変換酵素阻
害剤として有用な、新規なペプチドが得られる。
害剤として有用な、新規なペプチドが得られる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 1/12 Ｃ１２Ｐ 21/06
Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64
Ｃ１２Ｐ 21/06 37/18
(56)参考文献 特開 平４−304896（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−112465（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−1095（ＪＰ，Ａ)
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．56，Ｎｏ．10,
ｐ．1541−1545
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 5/08
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨより
なる新規ペプチド。 - 【請求項２】 魚肉をサーモライシンで加水分解するこ
とを特徴とするＨ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨより
なる新規ペプチドを製造する方法。 - 【請求項３】 魚肉としてカツオブシを使用する請求項
２記載の製造法。 - 【請求項４】 Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−ＯＨより
なるペプチドを有効成分とするアンギオテンシン変換酵
素阻害剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09255093A JP3465920B2 (ja) | 1993-03-26 | 1993-03-26 | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09255093A JP3465920B2 (ja) | 1993-03-26 | 1993-03-26 | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06279490A JPH06279490A (ja) | 1994-10-04 |
| JP3465920B2 true JP3465920B2 (ja) | 2003-11-10 |
Family
ID=14057515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09255093A Expired - Lifetime JP3465920B2 (ja) | 1993-03-26 | 1993-03-26 | 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3465920B2 (ja) |
-
1993
- 1993-03-26 JP JP09255093A patent/JP3465920B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１０，ｐ．１５４１−１５４５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06279490A (ja) | 1994-10-04 |
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