ES2277468B1 - Peptidos bioactivos y derivados, procedimiento de produccion, cepas de enterococcus faecalis productoras de dichos peptidos bioactivos y sus aplicaciones. - Google Patents
Peptidos bioactivos y derivados, procedimiento de produccion, cepas de enterococcus faecalis productoras de dichos peptidos bioactivos y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Péptidos bioactivos y derivados, procedimiento de producción, cepas de enterococcus faecalis productoras de dichos péptidos bioactivos y sus aplicaciones. Se describen unos péptidos bioactivos, en particular, péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina y/o con actividad antihipertensiva in vivo, los cuales pueden obtenerse por fermentación de un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos con la bacteria Enterococcus faecalis. Dicha bacteria y dichos péptidos bioactivos pueden ser utilizados en la industria farmacéutica y alimentaria, en la elaboración de composiciones farmacéuticas, productos alimentarios, productos alimentarios funcionales y suplementos alimentarios.
Description
Péptidos bioactivos y derivados, procedimiento
de producción, cepas de Enterococcus faecalis productoras de
dichos péptidos bioactivos y sus aplicaciones.
La invención se relaciona con la bacteria
Enterococcus faecalis que tiene la capacidad de producir
péptidos bioactivos, en particular, péptidos que muestran actividad
Inhibidora de la Enzima Convertidora de la Angiotensina (actividad
IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva, y a su empleo
en la industria farmacéutica y alimentaria. La invención también se
refiere a dichos péptidos bioactivos y a su empleo en la industria
farmacéutica y alimentaria.
La hipertensión arterial es un problema de gran
importancia socio-sanitaria, cuya transcendencia
está hoy día fuera de toda duda debido a razones de prevalencia, y
debido también a que es uno de los principales factores de riesgo de
enfermedades cardiovasculares. Hoy día entre el 15% y el 20% de los
adultos de los países occidentales la padecen, y numerosos estudios
han demostrado la estrecha relación entre la hipertensión arterial
no tratada y la aparición de hipertrofia ventricular, insuficiencia
cardíaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía,
insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad
coronaria y enfermedades vasculares periféricas, por lo que su
prevención y tratamiento constituye una de las estrategias más
utilizadas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares
(MacMahon S, Peto R, Cutler J y col. 1990. Lancet 335:
765-774). Todas estas enfermedades son también
frecuentes en el mundo occidental. Estudios clásicos de
epidemiología evidencian que la morbilidad cardiovascular aumenta
significativamente a partir de unos determinados valores de presión
arterial pero, además, las enfermedades cardiovasculares y
cerebrovasculares son las principales causas de muerte en las
sociedades industrializadas.
Por otra parte, aunque la detección y control de
la hipertensión arterial es relativamente sencilla, la realidad es
que muchos pacientes hipertensos no tienen conocimiento de su
enfermedad, ya que no presentan ningún tipo de síntomas, y otros
están diagnosticados pero reciben un tratamiento inadecuado. Es por
todo ello obvio el interés que siguen teniendo los estudios que
intentan establecer nuevas estrategias para el control de la
hipertensión arterial.
Se han desarrollado muchas hipótesis para
explicar la elevación de los niveles de presión arterial que
presentan los pacientes hipertensos. Sin embargo, la etiopatogenia
de la hipertensión arterial sigue sin esclarecerse definitivamente.
Son múltiples los mecanismos por los que se puede producir una
elevación de la presión arterial, y a menudo estos mecanismos
interactúan. En cualquier caso, el sistema
renina-angiotensina-aldosterona
juega un papel importante en el mantenimiento de la tensión
arterial y en el daño orgánico secundario a la elevación de esta
variable, y su implicación en la modulación del tono arterial de
algunos pacientes hipertensos puede ser importante. Uno de los
componentes principales de este sistema es la Enzima Convertidora de
la Angiotensina (ECA) [EC 3.4.15.1] (Ondetti MA, Rubin B, Cushman
DW. 1977. Science 196: 441-444), que cataliza la
conversión de angiotensina I, un decapéptido inactivo, en
angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad
vasoconstrictora (Skeegs Lt, Kahn JE, Shumway NP. 1956. J Exp Med
103: 295-299). Además, la ECA cataliza la
inactivación de la bradikinina, molécula que posee actividad
vasodilatadora.
Por tanto, la ECA desempeña un papel muy
importante en la regulación de la tensión arterial en el organismo,
y su inhibición puede facilitar una vasodilatación y el control de
la hipertensión arterial. De hecho, existe un grupo de fármacos
inhibidores de la ECA, que se utilizan ampliamente como
antihipertensivos. Entre ellos se incluyen Captopril, Enalapril y
Lisinopril. La acción antihipertensiva de estos compuestos se
potencia cuando se asocian con diuréticos. Aunque relativamente poco
frecuentes, los efectos indeseables de los fármacos inhibidores de
la ECA, pueden resultar un inconveniente para el tratamiento de
algunos pacientes.
Por otro lado, las proteínas de la leche, además
de su alto valor nutricional, pueden ser origen de péptidos
bioactivos, es decir, péptidos capaces de modular actividades
fisiológicas de importancia para la salud y bienestar de los
consumidores. Estos péptidos o fragmentos proteicos son inactivos
cuando se encuentran en el interior de la proteína nativa pero
muestran su actividad biológica cuando son liberados por hidrólisis
química o enzimática.
Existen diversos mecanismos para originar cortes
en las proteínas lácteas con la consiguiente aparición de péptidos.
Estos mecanismos pueden actuar de manera complementaria. Se pueden
generar por hidrólisis producida por el propio procesado del
producto (aumentos de temperatura, cambios de pH...), por el empleo
de enzimas hidrolíticas comerciales o por el uso de microorganismos
proteolíticos vivos, capaces de liberar péptidos bioactivos durante
el propio proceso de fermentación de la leche, derivados lácteos o
cualquier sustrato proteico.
Las investigaciones realizadas hasta este
momento confirman diversas actividades biológicas encontradas en
péptidos derivados de proteínas lácteas y sus aplicaciones
potenciales (Kayser H, Meisel H. 1996. FEBS Letters 383:
18-20; Tome D, Debabbi H. 1998. Int Dairy J 8:
383-392; Gaucheron F, Mollé D, Briard V, Léonil J.
1999. Int Dairy J 9: 515-521; Cross ML, Gill HS.
2000. Br J Nutr 84: 81S-89S; Shah NP. 2000. Br J
Nutr 84: 3S-10S). Ente las actividades biológicas
descritas para estos péptidos destacan: actividad antihipertensiva,
actividad opiácea, efecto inmunomodulador, actividad
antimicrobiana, actividad antitrombótica y capacidad para unir
minerales. Los péptidos con actividad antihipertensiva se han
obtenido a partir de hidrolizados enzimáticos de distintas
proteínas alimentarias de origen animal y vegetal, pero las
proteínas lácteas, tanto caseínas como proteínas de suero,
constituyen la principal fuente de péptidos con actividad
antihipertensiva (Yamamoto N. 1997. Biopolymers 43:
129-134).
Dentro de las investigaciones sobre péptidos
funcionales con actividad Inhibidora de la ECA (actividad IECA) y/o
con actividad antihipertensiva, destacan los trabajos del grupo de
Yamamoto y colaboradores (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col.
1995. J Dairy Sci 78: 777-783; Nakamura Y, Yamamoto
N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78: 1253-1257).
Estos investigadores estudiaron el efecto que sobre la presión
arterial ejercía una leche fermentada por distintas cepas de
Lactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae.
Identificaron varios péptidos procedentes de la leche fermentada que
mostraban actividad IECA in vitro, y observaron que después
del proceso de fermentación, la leche fermentada disminuía la
presión arterial de las ratas espontáneamente hipertensas (SHR).
Por el contrario, la leche fermentada no modificaba la presión de
las ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control
normotenso de las ratas SHR. Más adelante, dichos investigadores
demostraron que la leche fermentada presentaba efectos
antihipertensivos en humanos (Hata Y, Yamamoto N, Ohni M, Y y col.
1996. Am J Clin Nutr 64: 767-771).
Recientemente se ha descrito el efecto de una
leche fermentada por Lactobacillus helveticus que disminuye
la presión arterial en ratas SHR (Sipola M, Finckenberg P, Korpela
R; Vapaatalo H, Nurminen Ml. 2002. J Dairy Res 69:
103-111) y en humanos hipertensos (Seppo LM,
Kerojoki O, Suomalainen H, Korpela R. 2002. Milchwissenschaft 57:
124-127; Seppo LM, Jauhiainen T, Poussa T, Korpela
R. 2003. Am J Clin Nutr 77: 326-330). Los
resultados de estas investigaciones se han traducido en la
comercialización de algunas leches fermentadas y productos lácteos
fermentados tipo yogur que contienen péptidos antihipertensivos
(Calpis®, Calpis Food Industry Co., Ltd, Tokio, Japón; Evolus®,
Valio, Finlandia).
Adicionalmente, se han aislado y caracterizado
péptidos con actividad IECA en leches fermentadas con
Lactobacillus delbrueckii y Lactococcus lactis
(Gobbetti M, Ferranti P, Smacchi E y col. 2000. Appl Environ
Microbiol 66: 3898-3904) y también en quesos
manchegos (Gómez-Ruiz JA, Ramos M, Recio 1. 2002.
Int Dairy J 12: 697-706).
El péptido LHLPLP ha sido descrito como un
péptido que presenta actividad IECA cuando dicha actividad se
valora in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado su
actividad antihipertensiva (Kohmura M, Nio N, Kubo K y col. 1989.
Agric Biol. Chem 53:2107-2114). En relación con
esto, merece la pena destacar que muchos péptidos que in
vitro se caracterizan como potentes inhibidores de la ECA,
muestran, sin embargo, un efecto muy pequeño, o nulo, sobre esta
enzima cuando se ensayan in vivo (Maruyama S, Mitachi H,
Awaya J y col. 1987. Agric Biol Chem 51: 2557-2561;
Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79:
1316-1321). Puede asimismo suceder el caso
contrario; es decir, que péptidos que presentan in vitro poca
actividad IECA sean capaces de adquirir in vivo esta
actividad gracias a la actuación sobre ellos de las enzimas
digestivas (Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79:
1316-1321). Todos estos resultados ponen de relieve
la necesidad de probar la eficacia antihipertensiva de los péptidos
que muestran actividad IECA in vitro, inicialmente se debe
estudiar el efecto de estos péptidos sobre la presión arterial de
animales hipertensos, y si procede, se intentará después corroborar
su efecto antihipertensivo en humanos (Darragh AJ. 2002. Bull IDF
375:25-31).
Por otra parte, el potencial antihipertensivo de
los péptidos administrados por vía oral depende de su capacidad
para alcanzar sus lugares de actuación sin ser degradados, y
consecuentemente inactivados, por las enzimas del tracto digestivo.
Por tanto, la resistencia a dichas enzimas es un prerrequisito para
un efecto antihipertensivo in vivo tras la ingestión oral de
dichos péptidos.
Aunque se conocen péptidos bioactivos
procedentes de diferentes sustratos, y también procedimientos para
producir tales péptidos bioactivos basados en la fermentación de un
sustrato por determinados microorganismos, debido al creciente
interés y demanda de productos alimentarios funcionales que
incorporan péptidos bioactivos, resulta oportuna, conveniente, y
casi necesaria, la búsqueda de nuevos péptidos bioactivos, así como
el desarrollo de procedimientos alternativos para producir dichos
péptidos. Ventajosamente, dichos péptidos bioactivos deben ser
resistentes a la acción de las enzimas del tracto digestivo o bien
precursores de formas activas (que posteriormente puedan ser
liberados por acción de las enzimas gastrointestinales) con el fin
de que puedan ser administrados por vía oral.
Esta invención proporciona unos péptidos
bioactivos, en particular, unos péptidos que muestran actividad
IECA in vitro y/o con actividad antihipertensiva cuando se
administran mediante sonda intragástrica. Por ello, pueden ser
administrados por vía oral y utilizarse en la elaboración de
productos alimentarios funcionales y/o en la elaboración de
composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o profilaxis de la
hipertensión arterial. También se ha encontrado que la bacteria
Enterococcus faecalis es capaz de producir dichos péptidos
bioactivos por proteolisis de proteínas cuyas secuencias de
aminoácidos contienen las secuencias de aminoácidos de dichos
péptidos bioactivos.
Por tanto, un aspecto de esta invención se
relaciona con la bacteria Enterococcus faecalis que tiene la
capacidad de producir péptidos bioactivos, en particular, unos
péptidos que muestran actividad TECA in vitro y/o con
actividad antihipertensiva. En una realización particular, dicha
bacteria es una cepa de E. faecalis depositada en la CECT
(Colección Española de Cultivos Tipo) seleccionada entre la cepa
identificada como E. faecalis CECT 5727 y la cepa
identificada como E. faecalis CECT 5728. Dicha bacteria
puede ser utilizada en la producción de péptidos bioactivos útiles
en la industria alimentaria y farmacéutica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una preparación bacteriana que contiene E. faecalis CECT
5727 y/o E. faecalis CECT 5728 y, opcionalmente, uno o más
microorganismos diferentes. En una realización particular, dicha
preparación bacteriana puede encontrarse en forma de polvo
liofilizado o en una cápsula.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir un péptido bioactivo por
fermentación de un sustrato que contiene una proteína, péptido o
fragmento de los mismos que contiene dicho péptido bioactivo por
E. faecalis. En una realización particular, dicho péptido
bioactivo es un péptido que muestra actividad IECA in vitro
y/o actividad antihipertensiva, seleccionado del grupo formado por
los péptidos identificados por la, SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3,
SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados y sus mezclas, y dicha bacteria se selecciona entre E.
faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus
mezclas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis
CECT 5728 en la industria alimentaria. En una realización
particular, la invención se relaciona con el empleo de dichas cepas
en la preparación de un producto alimentario, por ejemplo, un
producto lácteo, opcionalmente fermentado y/o sometido a un
tratamiento térmico, o una bebida. Los productos alimentarios que
comprenden dicha bacteria o preparación bacteriana, o que han sido
preparados utilizando dicha bacteria o preparación bacteriana,
también constituyen un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis
CECT 5728 como sustancia terapéutica, en particular, con el empleo
de dichas bacterias en el tratamiento y/o la prevención de la
hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un
animal, así como con su empleo en el tratamiento y/o la prevención
de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un
ser humano o en un animal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis
CECT 5728 en la obtención de péptidos bioactivos, en particular, en
la obtención de péptidos que muestran actividad IECA in vitro
y/o actividad antihipertensiva. En una realización particular,
dicho péptido bioactivo se selecciona del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus
mezclas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis
CECT 5728 en la preparación de un producto antihipertensivo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la, SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº:
4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados y
sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición que comprende un péptido seleccionado del grupo
formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ.
ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID.
Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus
mezclas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende un péptido seleccionado
del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID.
Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº:
6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas. En una realización particular, dicha
composición farmacéutica es una composición farmacéutica
antihipertensiva.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, en
la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la
prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un
ser humano o en un animal, así como con su empleo en el tratamiento
y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la
hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
la obtención de alimentos funcionales con actividad
antihipertensiva, por ejemplo, leches fermentadas, que contienen un
péptido antihipertensivo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un producto alimentario funcional que comprende un producto
alimentario y un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus
mezclas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un aditivo alimentario o con un suplemento alimentario que
comprende un péptido seleccionado entre los péptidos identificados
por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº:
5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales
farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
Finalmente, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un método para tratar y/o prevenir la hipertensión
arterial en todas sus formas, o los desórdenes asociados con la
hipertensión arterial, en un sujeto, tal como un ser humano o un
animal, que comprende la administración a dicho sujeto de una
cantidad efectiva de una composición farmacéutica antihipertensiva
proporcionada por esta invención.
Otras características de la invención serán
desarrolladas posteriormente en la descripción de la invención que
se detallará más adelante.
La Figura 1 es una gráfica que representa el
porcentaje de inhibición de la ECA que se obtiene según el volumen
añadido de sobrenadante o suero de leche fermentada con E.
faecalis CECT 5727 (\bullet) o con E. faecalis CECT
5728 (\blacktriangle).
La Figura 2A es una gráfica que muestra la
evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada
como mg peptona/mL (o), y la actividad de la dilución de suero que
produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada
en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (\bullet), según
el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E.
faecalis CECT 5727.
La Figura 2B es una gráfica que muestra la
evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada
como mg peptona/mL (\Delta), y la actividad de la dilución de
suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima
expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL),
(\blacktriangle), según el tiempo de fermentación para la leche
fermentada por E. faecalis CECT 5728.
La Figura 3 es un cromatograma de HPLC en fase
reversa a escala semipreparativa del sobrenadante activo que se
obtiene tras la centrifugación y ultrafiltración, a través de un
membrana de 3.000 Da de tamaño de poro, de productos lácteos
fermentados por E. faecalis CECT 5727 o por E.
faecalis CECT 5728. Los péptidos con actividad IECA eluyen con
tiempos de retención superiores a 47 minutos.
La Figura 4 es un cromatograma de HPLC en fase
reversa a escala semipreparativa de la fracción activa que se
obtiene de la primera separación mediante HPLC. Los péptidos con
actividad IECA se recogieron en 7 fracciones que eluyen entre el
minuto 12 y el minuto 42.
La Figura 5A es una gráfica que muestra la
disminución de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en
ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de
agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E.
faecalis CECT 5727 (\bullet), 5 mL/kg de suero de leche
fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\blacktriangle) ó 50
mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la
administración. Los datos representan la media \pm ESM para un
mínimo de 9 animales. Salvo indicación en contrario, todas las
dosis indicadas en esta descripción se refieren al peso corporal del
animal.
La Figura 5B es una gráfica que muestra la
disminución de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en
ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de
agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E.
faecalis CECT 5727 (\bullet), 5 ml/kg de suero de leche
fermentada con E. faecalis CECT 5728 (\blacktriangle) ó 50
mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la
administración. Los datos representan la media \pm ESM para un
mínimo de 9 animales.
La Figura 6A es una gráfica que muestra la
variación de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas
Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua
(X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis
CECT 5727 (\bullet), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con
E. faecalis CECT 5728 (\blacktriangle) ó 50 mg/kg de
Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración.
Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9
animales.
La Figura 6B es una gráfica que muestra la
variación de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas
Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua
(X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis
CECT 5727 (\bullet), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con
E. faecalis CECT 5728 (\blacktriangle) ó 50 mg/kg de
Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración.
Los datos representan la media \pm ESM para un mínimo de 9
animales.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con cepas de Enterococcus faecalis con actividad
proteolítica y capacidad para producir péptidos bioactivos, en
particular, péptidos que muestran actividad IECA in vitro y/o
con actividad antihipertensiva. En una realización particular, la
invención proporciona una cepa de E. faecalis depositada en
la CECT seleccionada entre la cepa identificada como E.
faecalis CECT 5727 y la cepa identificada como E.
faecalis CECT 5728. Dichas cepas de E. faecalis han sido
depositadas el 10 de octubre de 2002 en la CECT, correspondiéndoles
el número de acceso indicado.
Las cepas E. faecalis CECT 5727 y E.
faecalis CECT 5728 han sido seleccionadas a partir de
microorganismos aislados de leche bovina cruda de diferentes
procedencias, tras haber sido sometidas a un proceso de selección en
base a la presencia de actividad IECA superior al 70% en los
sobrenadantes tras centrifugación (suero) de leches fermentadas con
dichos microorganismos. Las cepas fueron aisladas y caracterizadas
posteriormente por su perfil fermentativo y bioquímico. En el
Ejemplo 1 se describe de forma detallada el aislamiento y
caracterización de dichas cepas E. faecalis CECT 5727 y
E. faecalis CECT 5728.
\newpage
La cepa E. faecalis CECT 5727 presenta,
entre otras, las siguientes características:
- \bullet
- Características de la colonia:
- 1)
- Crecimiento en M17, facultativamente en MRS
- 2)
- Forma: circular
- 3)
- Tamaño: 1 mm (en 24 horas)
- 4)
- Color: blanca
- 5)
- Aspecto: brillante
- 6)
- Elevación: lisa
- 7)
- Borde: irregular
- \bullet
- Características morfológicas:
- 1)
- Forma: coco
- 2)
- Motilidad: ninguna
- 3)
- Formación de esporas: no
- 4)
- Tinción GRAM: positiva
- \bullet
- Propiedades fisiológicas:
- 1)
- Producción de catalasa: negativo
- 2)
- Crecimiento aeróbico, anaerobiosis facultativa
- 3)
- Perfil bioquímico:
- Arginina Dihidrolasa: +
- \beta-Glucosidasa: +
- \beta-Glucuronidasa: -
- \alpha-Galactosidasa: -
- \beta-galactosidasa: -
- Fosfatasa Alcalina: -
- Ribosa (Acidificación): +
- Manitol (Acidificación): +
- D-sorbitol (Acidificación): +
- Lactosa (Acidificación): +
- Trehalosa (Acidificación): +
- Rafinosa (Acidificación): -
- Sacarosa (Acidificación): +
- L-arabinosa (Acidificación): -
- D-arabitol (Acidificación): -
- Ciclodextrina (Acidificación): +
- Producción de Acetoina: +
- Alanil-Fenilalanil-Prolina Arilamidasa: -
- Acido Piroglutámico Arilamidasa: +
- N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: +
- Glicil- Triptófano Arilamidasa: +
- Hidrólisis Hipurato: -
- Glicógeno (Acidificación): -
- Pululano (Acidificación): -
- D-maltosa (Acidificación): +
- Melibiosa (Acidificación): -
- Melezitosa (Acidificación): +
- Metil \beta-D-glucopiranosido (Acidificación): +
- Tagatosa (Acidificación): +
- \beta-manosidasa: +
- Ureasa: -
La cepa E. faecalis CECT 5728 presenta un
perfil fermentativo y bioquímico similar al de la cepa E.
faecalis CECT 5727 con las excepciones siguientes:
- \beta-Glucosidasa: -
- N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: -
- Metil \beta-D-glucopiranosido (Acidificación): -
- \beta-manosidasa: -
Las cepas E. faecalis CECT 5727 y E.
faecalis CECT 5728 son cepas proteolíticas con capacidad para
producir péptidos bioactivos, en particular, péptidos con actividad
TECA y/o con actividad antihipertensiva, a partir de un sustrato
apropiado que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos
de dichas proteínas y péptidos, que contienen la secuencia de
aminoácidos de dichos péptidos bioactivos de interés, mediante
digestión proteolítica. En general, dicho sustrato es una fuente de
proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, de origen animal,
vegetal, o procedentes de microorganismos, que comprende una o más
proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la
secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos de interés.
La actividad proteolítica de las cepas E. faecalis CECT 5727
y E. faecalis CECT 5728 ha sido ensayada por el método OPA
(o-phtaldialdehído) usando peptona de caseína para
la recta de calibrado (Church FC, Swaisgood HE, Porter DH, Catgnani
L. 1983. J Dairy Sci 66: 1219-1227) [Ejemplo 2]. La
actividad IECA de los sustratos fermentados con dichas cepas puede
ser determinada mediante el método descrito en el Ejemplo 1.2.
En una realización particular, dichos péptidos
bioactivos producidos por las cepas E. faecalis CECT 5727 y
E. faecalis CECT 5728 son los péptidos identificados con las
secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID.
Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6 y SEQ. ID.
Nº: 7, algunos de los cuales presentan actividad IECA y/o actividad
antihipertensiva (Ejemplos 3 y 4).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis, en
particular, una cepa de E. faecalis seleccionada entre E.
faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas
en la obtención de péptidos bioactivos, en particular, péptidos con
actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, seleccionados
del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables y sus mezclas.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "derivado" incluye cualquier derivado químico de
dichos péptidos que contiene una modificación química que no afecta
adversamente a su actividad biológica, por ejemplo, su actividad
IECA y/o antihipertensiva; ventajosamente, dicha modificación
química será una modificación tal que aumente su actividad
biológica. En una realización particular, dicho derivado es un
derivado peptídico que contiene una fosforilación o un grupo
sulfhidrilo en el extremo amino terminal o cualquier otra
modificación química que no disminuya la actividad biológica del
péptido. Como es conocido, la presencia de un grupo sulfhidrilo o
fosfórico aumenta, en general, la actividad de los péptidos
inhibidores de la ECA (Ondetti MA, Rubín B, Cushman DW. 1977.
Science 196: 441-444). Los derivados de los péptidos
proporcionados por esta invención pueden obtenerse por métodos
convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia
haciendo reaccionar el péptido proporcionado por la invención con un
reactivo que proporciona la modificación química deseada.
El término "sales farmacéuticamente
aceptables" incluye las sales habitualmente utilizadas para
formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza
de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente
aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos
proporcionados por esta invención pueden obtenerse a partir de
ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden
obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos
en la materia haciendo reaccionar el ácido o base apropiado con el
péptido proporcionado por la invención.
De forma más concreta, la invención proporciona
un procedimiento para producir un péptido bioactivo que comprende
fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o
fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos
de dicho péptido bioactivo con una cepa de E. faecalis y, si
se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un
derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular, dicho péptido
bioactivo es un péptido con actividad IECA y/o con actividad
antihipertensiva, tal como un péptido seleccionado del grupo
formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ.
ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID.
Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus
mezclas.
En otra realización particular, dicha cepa de
E. faecalis se selecciona del grupo formado por E.
faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas.
Dicha cepa puede utilizarse como un cultivo puro o sustancialmente
puro o como un cultivo mixto, en forma de una preparación
bacteriana que contiene E. faecalis CECT 5727 y/o E.
faecalis CECT 5728, junto con, opcionalmente, uno o más
microorganismos diferentes tales como Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei,
Lactobacillus acidofilus, Lactobacillus helveticus o cualquier
otra bacteria láctica. Dicha preparación bacteriana, en adelante
preparación bacteriana de la invención, que contiene E.
faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728 y,
opcionalmente, uno o más de dichos microorganismos diferentes,
constituye un aspecto adicional de esta invención. La preparación
bacteriana de la invención puede presentarse en cualquier forma
apropiada; no obstante, en una realización particular, dicha
preparación bacteriana se encuentra en forma deshidratada, de polvo
liofilizado o en una cápsula.
En general, el sustrato a fermentar es una
fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que
comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos
que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido
bioactivo. Dicho sustrato puede ser de origen animal, por ejemplo,
leche, huevos, músculos de aves, peces o mamíferos, etc., o bien de
origen vegetal, por ejemplo, extractos proteicos de soja, maíz,
trigo, frutos secos, etc., o, incluso, puede proceder de un
microorganismo, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos, etc. En
una realización particular, dicho sustrato comprende leche o un
producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene caseína, por
ejemplo, \beta-caseína, tal como, leche cruda,
leche entera, desnatada o semidesnatada, leche en polvo (previa
reconstitución de la misma), yogur, mantequilla, queso, etc., o,
alternativamente, un extracto proteico de soja. Cuando el sustrato
es leche, ésta puede proceder de cualquier mamífero, por ejemplo,
vaca, oveja, cabra, búfala, etc. La secuencia de los péptidos SEQ.
ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID.
Nº: 6 y SEQ. ID. Nº: 7, puede encontrarse en la secuencia de la
(\beta-caseína bovina (véase la Tabla 3, Ejemplo
3).
Las condiciones para la fermentación de dicho
sustrato por E. faecalis se seleccionan de manera que sean
las adecuadas para que dicha bacteria pueda ejercer su actividad
proteolítica sobre el sustrato, de manera que se produzcan los
péptidos bioactivos. El proceso de fermentación se puede terminar
por cualquier método apropiado, por ejemplo, modificando el pH del
medio, aplicando un tratamiento térmico, etc. La selección de las
condiciones apropiadas, tales como temperatura, pH y/o aireación,
así como de las condiciones para terminar la fermentación, forman
parte del conocimiento general de un experto en la materia. En
general, cuando el sustrato es líquido, por ejemplo, leche, se
adiciona al sustrato un inóculo bacteriano, con una densidad
bacteriana apropiada, y se deja fermentar, durante un periodo de
tiempo adecuado a la temperatura y pH apropiados. Cuando el
sustrato es sólido o sustancialmente sólido, el sustrato se mezcla
con un líquido apropiado, tal como agua esterilizada, se mezcla
hasta obtener una mezcla homogénea, se añade el inóculo bacteriano
y se deja fermentar en las condiciones apropiadas. El pH del medio
de fermentación se ajusta para favorecer la actividad proteolítica
bacteriana bien antes de iniciar la fermentación o bien durante la
fermentación, por adición de un ácido o una base, dependiendo de lo
que sea necesario. La fermentación puede repetirse un número
variable de veces añadiendo inóculos bacterianos bien frescos o
bien procedentes de las fermentaciones anteriores sobre el
sustrato.
Tras la fermentación del sustrato se obtiene una
mezcla de péptidos bioactivos. En una realización particular, dicho
péptido bioactivo es un péptido con actividad IECA y/o con
actividad antihipertensiva, tal como un péptido seleccionado del
grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2,
SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. 1 ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, y sus mezclas. La medida de la actividad IECA de
los productos fermentados se puede realizar por métodos
convencionales tal y como se describe en el Ejemplo 1.2. Si se
desea, dichos péptidos bioactivos se pueden aislar y purificar por
métodos convencionales y/o convertirlos en derivados y/o sales
farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales.
En una realización particular, la fermentación
del sustrato con E. faecalis se realiza mediante un
procedimiento que comprende una primera fermentación a una
temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC, típicamente alrededor de
30ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas,
típicamente alrededor de 24 horas, con una carga de inóculo con una
densidad bacteriana comprendida entre 10 y 10^{12},
preferentemente, entre 10^{7} y 10^{9}, bacterias por cada 100
mL de sustrato, seguida de una segunda fermentación a una
temperatura comprendida entre 10ºC y 50ºC, típicamente alrededor de
30ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas,
típicamente alrededor de 48 horas, con una carga de inóculo
procedente de la primera fermentación comprendida entre 0,01% y 90%
en peso, típicamente, alrededor del 3% en peso. En el Ejemplo 3 se
describe el aislamiento y caracterización de péptidos bioactivos
con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, seleccionados
del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID.
Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº:
6, SEQ. M. Nº: 7, y sus mezclas, por fermentación de leche bovina
con E. faecalis CECT 5727 o con E. faecalis
CECT 5728.
CECT 5728.
El sustrato fermentado, que contiene los
péptidos bioactivos, en particular, el sustrato fermentado que
contiene un péptido con actividad IECA y/o con actividad
antihipertensiva seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº:
4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados,
sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, puede ser
utilizado como un agente antihipertensivo. Dicho producto
fermentado, si se desea, puede ser pasteurizado, o bien puede ser
secado y utilizado en forma de un polvo o de una preparación
liofilizada, y puede ser utilizado en la elaboración de diversos
productos, entre ellos, productos alimentarios, incluyendo
productos alimentarios funcionales. El sustrato fermentado,
opcionalmente, pasteurizado, constituye un aspecto adicional de esta
invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis
seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis
CECT 5728 y sus mezclas como sustancia terapéutica, en particular,
como sustancia terapéutica para el tratamiento y/o prevención de la
hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un
animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier
desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o
en un animal, tal como hipertrofia ventricular, insuficiencia
cardiaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía,
insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad
coronaria y enfermedades vasculares periféricas.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis, en
particular, con una cepa de E. faecalis seleccionada entre
E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus
mezclas, o de una preparación bacteriana de la invención, en la
industria alimentaria, por ejemplo, en la preparación de un producto
alimentario. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona
un producto alimentario que comprende una cepa de E.
faecalis, en particular, una cepa de E. faecalis
seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis
CECT 5728 y sus mezclas, o bien una preparación bacteriana de la
invención, o bien un producto alimentario que ha sido preparado
utilizando dicha cepa de E. faecalis de la invención o dicha
preparación bacteriana de la
invención.
invención.
El término "producto alimentario" se
utiliza en esta descripción en su sentido más amplio, incluyendo
todo tipo de producto, en cualquier forma de presentación, por
ejemplo, en forma sólida, líquida o gelificada, que puede ser
ingerido por un mamífero, por ejemplo, un alimento o una sustancia
nutricional. El término "alimento", tal como se utiliza en
esta descripción, incluye sustancias y composiciones que pueden ser
utilizadas o preparadas para su empleo como alimento de seres
humanos y animales, incluyendo sustancias que pueden ser utilizadas
para su preparación, por ejemplo, aceites, ingredientes y aditivos
alimentarios. A modo ilustrativo, el término "alimento" incluye
bebidas (por ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, etc.),
alimentos en infusión (por ejemplo, vegetales, etc.), salsas,
condimentos, aliños para ensaladas, zumos de frutas, jarabes o
siropes, postres (por ejemplo, puddings, gelatinas, rellenos,
productos cocinados, postres congelados, tales como helados,
sorbetes, etc.), helados, productos congelados suaves, dulces (por
ejemplo, caramelos, etc.), chicles, etc.
En una realización particular, dicho producto
alimentario es un producto lácteo, opcionalmente fermentado y/o
sometido a un tratamiento térmico, por ejemplo, pasteurizado, de
manera que esté libre de microorganismos viables, por ejemplo,
leche, yogures, etc. o una bebida, por ejemplo, una bebida con
suero lácteo, una bebida de frutas, una cerveza, etc.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
péptido bioactivo seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº:
4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados y
sus sales farmacéuticamente aceptables. Los términos
"derivados" y "sales farmacéuticamente aceptables" han
sido definidos previamente.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6 y
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables,
son productos nuevos y constituyen un aspecto adicional de esta
invención. Por otra parte, y del mismo modo que péptidos con una
potente actividad inhibitoria in vitro no siempre actúan
como agentes antihipertensivos, también puede suceder el caso
contrario, es decir que péptidos que in vitro no presentan
gran actividad como inhibidores de la ECA, adquieran in vivo
esa capacidad gracias a la actuación sobre ellos de las enzimas
digestivas (Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79:
1316-1321). Todos estos resultados ponen de relieve
la necesidad de probar in vivo la eficacia de péptidos con
actividad IECA, inicialmente en un modelo animal para finalmente
corroborar los resultados en humanos (Darragh AJ. 2002. Bull IDF
375:25-31).
Ahora se ha encontrado que los péptidos
bioactivos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3,
SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6 y SEQ. W. Nº: 7
tienen actividad IECA y/o actividad antihipertensiva, por lo que
pueden ser utilizados, en particular, los péptidos
antihipertensivos, en la elaboración de composiciones alimentarias
o farmacéuticas con actividad IECA y/o actividad antihipertensiva.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que
comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus
mezclas.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende un péptido seleccionado del
grupo formado por los péptidos identificados por la, SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable. En una realización particular, dicha composición
farmacéutica es una composición farmacéutica antihipertensiva que
comprende, al menos, un péptido antihipertensivo seleccionado del
grupo formado por los péptidos identificados por la, SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
La composición farmacéutica proporcionada por
esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un
péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4,
SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus
sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas. La cantidad de
péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que
puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada
por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo,
típicamente, entre 0,05% y 100% en peso, preferentemente, entre
0,16% y 99% en peso. Dicha composición farmacéutica es útil para su
administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal,
preferiblemente en el ser humano. La cantidad de péptido que debe
administrarse así como su dosificación para tratar un estado
patológico dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad,
estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, la
ruta y frecuencia de administración y del péptido concreto a
utilizar.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas
por esta invención pueden presentarse en cualquier forma de
administración apropiada, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden
administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía
oral, sublingual, respiratoria, parenteral, rectal o tópica, para
lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables
necesarios para la formulación de la forma de administración
deseada. En una realización particular, dicha forma farmacéutica de
administración de dichos péptidos es una forma sólida o líquida
diseñada para su administración por vía oral. Una revisión de las
distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y
de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede
encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica",
C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
En otro aspecto, la invención se refiere al
empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas,
en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser
humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de
cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser
humano o en un animal, por ejemplo, la hipertrofia ventricular, la
insuficiencia cardiaca congestiva, los accidentes
cerebrovasculares, la retinopatía, la insuficiencia renal
progresiva, los aneurismas disecantes, la enfermedad coronaria y
las enfermedades vasculares periféricas.
La invención también proporciona un producto
alimentario funcional que comprende un producto alimentario y un
péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4,
SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus
sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas. Dicho producto
alimentario funcional constituye un aspecto adicional de esta
invención. En una realización particular, dicho producto alimentario
funcional es un producto con actividad antihipertensiva y resulta
útil como coadyuvante en el tratamiento y/o prevención de la
hipertensión arterial en un mamífero, tal como el ser humano, o de
estados derivados de la misma. Aunque prácticamente cualquier
producto alimentario puede ser utilizado en la elaboración del
producto alimentario funcional de la invención, en una realización
particular dicho producto alimentario comprende bebidas (por
ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, etc.), alimentos en
infusión (por ejemplo, vegetales, etc.), salsas, condimentos, aliños
para ensaladas, zumos de frutas, jarabes o siropes, postres (por
ejemplo, puddings, gelatinas, rellenos, productos cocinados,
postres congelados, tales como helados, sorbetes, etc.), helados,
productos congelados suaves, dulces (por ejemplo, caramelos, etc.),
chicles, etc. La cantidad de péptido o péptidos presente en el
producto alimentario funcional puede variar dentro de un amplio
intervalo; no obstante, en una realización particular, la cantidad
de péptido o péptidos presente en el producto alimentario funcional
está comprendida entre 0,001% y 1% en peso respecto al total,
preferentemente, entre 0,01% y 0,5%
en peso.
en peso.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas, también pueden ser ingeridos por los
seres humanos y animales como un aditivo o suplemento alimentario
contenido en alimentos y bebidas. Dichos péptidos pueden ser
formulados junto con una o más sustancias nutricionales, por
ejemplo, vitaminas y/o minerales, e incorporados en composiciones
sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leche, leche
de soja, sopas, etc., o en composiciones sustancialmente sólidas; o
en gelatinas. Alternativamente, dichos péptidos pueden ser
preparados en forma de polvo e incorporados como tal en un
alimento. La cantidad de péptido proporcionado por esta invención
que puede estar presente en dichos alimentos o bebidas puede ser
similar a la dosis contenida en un composición farmacéutica típica
proporcionada por esta invención.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6 y
SEQ. ID. Nº: 7 pueden ser obtenidos por cualquier procedimiento
adecuado, por ejemplo, por fermentación de un sustrato que comprende
una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que
contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos con E.
faecalis, por ejemplo, con E. faecalis CECT 5727 y/o
E. faecalis CECT 5728, tal como se ha mencionado previamente,
o bien por digestión enzimática de dicho sustrato utilizando una
enzima con actividad proteolítica. Alternativamente, dichos
péptidos pueden obtenerse por métodos recombinantes o,
ventajosamente, por síntesis química de péptidos. Información sobre
métodos de síntesis química de péptidos puede encontrarse, por
ejemplo, en WO 01/68113. Los derivados y las sales
farmacéuticamente aceptables de dichos péptidos identificados por la
SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5,
SEQ. ID. Nº: 6 y SEQ. ID. Nº: 7, pueden obtenerse por métodos
convencionales tal como se ha mencionado previamente.
En general, cuando se desee obtener un producto
alimentario funcional antihipertensivo, se realizarán todas las
modificaciones necesarias en el proceso de fermentación previamente
descrito para obtener una buena actividad IECA en el producto
fermentado, pero controlando la producción de amargor, producido
típicamente por la aparición de péptidos hidrófobos de bajo peso
molecular, cuya incidencia es alta tras la hidrólisis de las
caseínas, debido a que sus secuencias contienen una gran cantidad de
aminoácidos hidrófobos. Por otra parte, en caso de que los péptidos
antihipertensivos proporcionados por esta invención se utilicen como
ingredientes de cualquier tipo de producto alimentario para
convertirlo en un producto alimentario funcional con actividad
antihipertensiva, la obtención de productos fermentados con buenas
características organolépticas carecería de importancia ya que lo
que se pretende es la obtención de la mayor cantidad posible del
péptido antihipertensivo o de la máxima actividad IECA con el fin
de obtenerlo en cantidad suficiente como para utilizarlo como
ingrediente. Finalmente, en caso de utilizar uno de dichos
péptidos, como fármaco antihipertensivo, la fermentación iría
dirigida a la obtención de la mayor concentración posible del
péptido para posteriormente proceder a su aislamiento y
purificación por métodos convencionales, por ejemplo, mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Aunque, en general, los péptidos
antihipertensivos proporcionados por esta invención no presentan
una actividad IECA tan potente como la del fármaco Captopril
(IC_{50} = 0,006 \muM, siendo IC_{50} la concentración del
inhibidor que disminuye en un 50% la actividad enzimática), son
péptidos naturales con los que cabe esperar pocos efectos
secundarios y buena tolerancia. Serían por ello útiles como
coadyuvantes en el tratamiento y/o la prevención de la hipertensión
arterial y, en consecuencia, en la lucha contra la enfermedad
cardiovascular.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención
pero no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
Se ensayaron 231 microorganismos, aislados a
partir de leche bovina cruda recogida de diferentes procedencias,
comprobándose su capacidad para producir leches fermentadas con
actividad IECA mediante el procedimiento que se describe a
continuación.
Alícuotas de leche bovina cruda, de diferentes
procedencias, se sembraron en placas conteniendo medio MRS (Oxoid
Ltd, Basingstoke, UK) (selectivo para el género
Lactobacillus) o medio M17 (Biokar Diagnostics, Beauvais,
France) (selectivo para el género Streptococcus) y se
incubaron durante 48 horas a 42ºC en atmósfera anaeróbica
(AnaeroGen^{TM}, Oxoid Ltd, Basingstoke, UK), con una cantidad de
oxígeno menor del 1% y un nivel de dióxido de carbono comprendido
entre el 9% y el 13% (medio MRS) o bien a 30ºC y en condiciones de
aerobiosis (medio M17). Cuando en una misma placa se observó
crecimiento de más de una colonia diferente de microorganismos se
procedió al aislamiento de las distintas colonias mediante
resiembras consecutivas en los mismos medios.
Utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo
2, se seleccionaron, entre los organismos aislados, aquéllos con
capacidad de producir leches fermentadas con actividad IECA. Al
finalizar la fermentación, las leches fermentadas se centrifugaron a
20.000 x g durante 10 minutos para obtener el suero en donde se
ensayó la actividad IECA. El ensayo de la actividad enzimática se
realizó inmediatamente o, en caso contrario, los sobrenadantes se
mantuvieron congelados a -20ºC.
La actividad IECA de los sobrenadantes se
determinó mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 1.2. Se
desecharon las bacterias cuyos sobrenadantes no mostraban
actividades IECA o actividades IECA inferiores al 70%, cuando se
ensayaba el sobrenadante diluido a la mitad. Se seleccionaron un
total de 47 bacterias que fueron identificadas por su perfil
fermentativo y bioquímico mediante el empleo de tiras API
(BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, Francia), e incorporadas a la
Colección de Cultivos del Grupo Leche Pascual, S.A. (Tabla 1). Las
cepas más prometedoras han sido depositadas el 10 de octubre de
2002 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjasot,
Valencia, y entre ellas las cepas de Enterococcus faecalis
identificadas con los números de acceso CECT 5727 y CECT 5728.
Estas cepas pueden crecer en medio M17 en aerobiosis a 30ºC.
Los resultados obtenidos con las bacterias
seleccionadas por su capacidad de producir leche fermentada con
actividad TECA superior al 70% medida en el sobrenadante diluido a
la mitad e incorporadas a la Colección de Cultivos del Grupo
Pascual, S.A. se recogen en la Tabla 1. En la mayoría de los casos
aparecen dos valores de actividad IECA debido a que se hicieron
repeticiones para confirmar los resultados. La ultima columna se
refiere a la cantidad necesaria de sobrenadante para producir una
disminución enzimática del 50% (IC_{50}) expresada en
microgramos/mL. Para conocer la concentración de péptidos en las
leches fermentadas se usó el método Kjeldhal (Norma
FIL-DF 20B
1993).
1993).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La medida de la actividad ECA se realizó según
el método descrito por Cushman y Cheung (Cushman DW, Cheung HS.
1971. Biochem Pharmacol 20:1637-1648) y modificado
posteriormente por Nakamura (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col.
1995. J Dairy Sci 78:777-783). Este método se basa
en el empleo de
Hipuril-L-Histidil-L-Leucina
(Hip-His-Leu) como sustrato ya que
la actuación de la ECA sobre dicho sustrato produce la liberación
del ácido hipúrico, fácilmente cuantificable mediante
espectrofotometría por lectura de la absorbancia a 228 nm
(A_{228}) tras su extracción con acetato de etilo. Si en el tubo
de reacción además de la ECA y del sustrato se añade la muestra a
ensayar, se puede determinar la actividad IECA de la muestra
ensayada. Tal como se menciona en el Ejemplo 1.1, durante la
selección de las bacterias, la muestra usada para medir la
actividad IECA fue el sobrenadante de la leche fermentada, sometida
a centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos, y posteriormente
diluido a la mitad con agua destilada.
El ensayo se realiza pipeteando en tubos tipo
Eppendorf los reactivos indicados en la Tabla 2.
La solución de sustrato estaba formada por
borato sódico 0,1 M, cloruro sódico 300 mM,
Hip-His-Leu (Sigma, St. Louis, MO) 5
mM, pH 8,3 a 37ºC. La solución del enzima ECA (Sigma, St. Louis,
MO) se ajustó a una actividad de 0,1 U/mL.
Las distintas mezclas de reacción se incubaron
durante 30 minutos a 37ºC y, a continuación, a cada tubo de ensayo
se añadieron 150 \muL de ácido clorhídrico 0,1 M con el fin de
parar la reacción y, posteriormente, 1.000 \muL de acetato de
etilo para extraer el ácido hipúrico. Las mezclas resultantes se
agitaron vigorosamente durante 20 segundos y se centrifugaron a
1.500 x g durante 10 minutos, para separar y recoger de cada tubo la
fase superior (acetato de etilo). 750 \muL de cada fase superior
se pipetearon en tubos individuales, los cuales se introdujeron en
un baño con agua en ebullición hasta evaporar el disolvente, bajo
campana extractora. Una vez eliminado el acetato de etilo, se
añadieron 800 \muL de agua destilada a cada uno de los tubos para
disolver suavemente y sin agitación el residuo seco. Por último el
contenido de cada tubo se transfirió a cubetas de cuarzo para leer
su absorbancia a 228 nm. El porcentaje de inhibición (% Inhibición)
se calculó aplicando la siguiente fórmula:
% \ Inhibición
\ =
\frac{(A)-(B)}{(C)-(D)}
donde (A), (B), (C) y (D)
corresponden a las absorbancias a 228 nm de las soluciones
indicadas en la tabla
2.
Para la realización de este ejemplo de
fermentación se puede utilizar indistintamente E. faecalis
CECT 5727 o E. faecalis CECT 5728. El sustrato es leche
bovina desnatada en polvo reconstituida en agua al 10% y autoclavada
(100ºC durante 20 minutos). En primer lugar se fabricó un
starter liquido, inoculando el sustrato con un asa de
cultivo de manera que la población inicial fuera
10^{5}-10^{7} UFC/mL e incubando durante 24
horas. Un 3% en peso de este cultivo se utilizó como inóculo de la
segunda fermentación que se mantuvo durante 48 horas. Ambas
fermentaciones se realizaron a 30ºC. El proceso de fermentación se
paró mediante pasteurización de la leche fermentada [75ºC durante 1
minuto], y el producto final pasteurizado fue utilizado para medir
la actividad IECA según el protocolo descrito en el Ejemplo 1.2 si
bien en este caso las leches fermentadas habían sido sometidas al
tratamiento de pasteurización mencionado antes de ser centrifugadas
a 20.000 x g durante 10 minutos. La Figura 1 muestra el ensayo de
la actividad IECA para diferentes volúmenes de sobrenadante,
diluidos adecuadamente con agua destilada con el fin de mantener un
volumen constante de reacción (en el Ejemplo 1 la dilución era a la
mitad). Por lo tanto, el volumen final de reacción es siempre de
160 \muL [100 \muL de la solución de sustrato, 20 \muL de la
solución de la ECA y 40 \muL de la muestra a ensayar (sobrenadante
a la dilución correspondiente con agua destilada)]. Los resultados
obtenidos muestran que las leches fermentadas producidas por ambos
microorganismos presentan una potente actividad IECA, ya que con
volúmenes de muestra pequeños se obtienen inhibiciones del 100% de
la actividad.
Adicionalmente, se estudió la aparición en el
tiempo de la actividad IECA en leches fermentadas con las cepas
E. faecalis CECT 5727 y/o E. faecalis CECT 5728 así
como el grado de hidrólisis de dichas cepas. Las fermentaciones se
realizaron según el protocolo explicado en este mismo Ejemplo 2
pero extrayendo alícuotas de la segunda fermentación a diversos
tiempos: 8, 12, 24 y 48 horas.
La actividad IECA se determinó siguiendo el
protocolo previamente descrito y se representa como actividad de la
dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad
de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen
(UI/mL), entendiendo por una unidad de inhibición a aquella capaz
de inhibir el 50% de la actividad de la enzima ECA.
Para el estudio del grado de hidrólisis se
realizó un análisis cuantitativo de los péptidos según el método
OPA (Church FC, Swaisgood HE, Porter DH., Catigna GL. 1983. J Dairy
Sci 66: 1219-1227). Para la curva de calibración se
usó peptona de caseína (Fluka, Steinheim, Suiza).
Los resultados mostraron que la actividad IECA y
la actividad proteolítica, medida mediante OPA, siguen un patrón
típico de un metabolito primario, con un aumento inicial
pronunciado, asociado al crecimiento exponencial del cultivo, hasta
llegar a una meseta final (Figura 2).
Para llevar a cabo este trabajo se utilizaron
equipos de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) analítica y
preparativa, así como un equipo de espectrometría de masas (MS) en
tándem que permitió la secuenciación de los péptidos. Se realizaron
las etapas que se mencionan a continuación.
Siguiendo el procedimiento descrito en el
Ejemplo 2 se obtuvieron unos productos lácteos fermentados por las
cepas de E. faecalis CECT 5727 y E. faecalis CECT 5728
(por separado). Brevemente, leche bovina en polvo reconstituida en
agua al 10% y autoclavada (100ºC durante 20 minutos), se sometió a
una primera fermentación de 24 horas con una cantidad de bacterias
aproximada de 10^{7}-10^{9} por cada 100 mL de
leche reconstituida, y una segunda fermentación de 48 horas con un
inóculo de la primera fermentación del 3% en peso, realizando ambas
fermentaciones a 30ºC y parando el proceso de fermentación mediante
pasteurización de la leche fermentada a 75ºC durante 1 minuto. Los
productos resultantes se centrifugaron a 20.000 x g durante 10
minutos. Los sobrenadantes obtenidos se ultrafiltraron a través de
una membrana hidrofilica de 3.000 Da de tamaño de poro (Centripep,
Amicon Inc, Beverly, MA, EEUU). Los permeados obtenidos se
congelaron, liofilizaron y mantuvieron a -20ºC hasta su
posterior
fraccionamiento.
fraccionamiento.
El equipo empleado (Waters Series 600 HPLC;
Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) consta de una bomba (modelo delta
600), un controlador de gradiente (modelo 600), un inyector (modelo
717 plus), un detector de ultravioleta de longitud de onda variable
(modelo 996), un colector de fracciones y un software de adquisición
y procesado de datos (Millenium 3.2). La columna es una Prep Nova
Pak® HR C_{18} (300 x 7,8 mm d.i., 6 \mum de tamaño de
partícula, 60 \ring{A} de tamaño de poro) (Waters). El disolvente
A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:1) y el
disolvente B es una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético
(1000:0,8). Las muestras se eluyeron con un flujo de 4 mL/minuto
con un gradiente lineal del 0% al 35% del disolvente B en A en 70
minutos. La absorbancia del disolvente se monitorizó a 214 nm y 280
nm.
Brevemente, cada permeado liofilizado [obtenido
en 3.A] se disolvió en agua en una concentración de 100 mg/mL y, en
cada separación, el volumen de muestra inyectado fue de 500 \muL.
Las fracciones que se iban separando eran ensayadas para determinar
la existencia de actividad IECA, según el protocolo descrito en el
Ejemplo 1.2, observándose que los péptidos con actividad TECA
eluían al final del cromatograma con tiempos de retención
superiores a 47 minutos (Figura 3). Esta fracción se sometió a un
segundo análisis mediante HPLC en fase reversa a escala preparativa
utilizando el mismo equipo, columna y disolventes pero eluyendo la
muestra con un gradiente lineal del 20% al 35% del disolvente B en
A en 40 minutos (Figura 3). En esas condiciones, se observó
actividad IECA en fracciones que eluían entre los minutos 12 y 42
(Figura 4, fracciones 1 a 7). Dichas fracciones, que contenían
péptidos con actividad IECA, se recogieron, liofilizaron y se
mantuvieron a -20ºC hasta su posterior identificación.
El análisis mediante espectrometría de masas se
realizó en un equipo de trampa iónica Esquire3000 (Bruker Daltonik
GmbH, Bremen, Alemania). Los péptidos recogidos de HPLC y
liofilizados [procedentes de 3.B] se disolvieron en una
concentración de 5-10 \mug/ml en una mezcla de
50% de acetonitrilo en agua conteniendo 0,3% de ácido fórmico. La
muestra se inyectó en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4
\muL/min utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard
Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como
gas nebulizador y de secado y opera con una presión de helio de 5 x
10^{-3} bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo
de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13.000
Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tándem para
la identificación de las secuencias peptídicas se realizó con el
programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Se
identificaron los péptidos que se recogen en la Tabla 3.
A continuación, se sintetizaron químicamente los
péptidos con actividad IECA previamente identificados. La síntesis
de dichos péptidos con actividad IECA se realizó mediante el método
Fmoc en fase sólida con un sintetizador (modelo 431A; Applied
Biosystems Inc., Überlingen, Alemania). La pureza de los péptidos
sintéticos se verificó mediante HPLC en fase reversa a escala
analítica y espectrometría de masas usando un equipo
Esquire-LC (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania).
El equipo (serie 1100) constaba de una bomba cuaternaria, un
inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y
un detector de ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent
Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un
espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker
Daltonik). La columna era una columna Hi-Pore
C_{18} (250 x 4,6 mm d.i., 5 \mum de tamaño de partícula)
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El
disolvente A era una mezcla de agua y ácido trifluoroacético
(1000:0,37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido
trifluoroacético (1000:0,27). Las muestras se eluyeron con un flujo
de 0,8 mL/minuto con un gradiente lineal del 0% al 30% del
disolvente B en A en 25 minutos. El eluyente se monitorizó a 214 nm,
mediante espectrometría de masas, bajo las mismas condiciones que
las indicadas en 3.C, salvo que el flujo de inyección de la muestra
a través del nebulizador era de 60 \muL/min.
\newpage
En las leches fermentadas con E. faecalis
CECT 5727 y/o con E. faecalis CECT 5728 y en los péptidos
sintetizados (que se correspondían con los péptidos aislados en la
leche fermentada) se determinó la concentración necesaria para
producir una disminución de la actividad enzimática de la ECA del
50% (IC_{50}, expresado en \muM en el caso de los péptidos y en
\mug/mL en el caso de las leches fermentadas). Los valores
obtenidos se muestran en la
Tabla 4.
Tabla 4.
Los péptidos que presentaron actividad IECA por
debajo de 700 \muM fueron seleccionados inicialmente para ensayar
su actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas
(SHR) y en ratas Wistar-Kyoto (WHY).
Debido a la elevada actividad IECA que mostraban
la leche bovina fermentada con E. faecalis CECT 5727 y la
leche bovina fermentada con E. faecalis CECT 5728, así como
algunos de los péptidos identificados se procedió a estudiar el
efecto de dichas leches fermentadas y de dichos péptidos (SEQ. ID.
N^{os}: 2-7) sobre la presión arterial de ratas
espontáneamente hipertensas (SHR) y de ratas
Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso
de las ratas SHR.
Las leches fermentadas se prepararon según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los péptidos ensayados se
sintetizaron químicamente siguiendo el protocolo descrito en el
Ejemplo 3.D.
Se utilizaron ratas macho SHR y WKY de
17-20 semanas de vida y peso comprendido entre 250
y 300 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A.. Las
ratas permanecían con una temperatura ambiental estable de 23ºC, y
con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas, ingiriendo
agua y comida a libre disposición. La medida de la presión arterial
en estos animales se llevó a cabo mediante una modificación de la
técnica del manguito en la cola (tail-cuff),
originalmente descrita por Buñag (Buñag RD. 1973. J Appl Physiol
34:79). Habitualmente, esta técnica permite obtener únicamente
medidas de la presión arterial sistólica (PAS); no obstante, el
equipo utilizado en este estudio (modelo Le50001 Letica) permite
diferenciar la PAS y la presión arterial distólica (PAD) de los
animales, ya que facilita automáticamente el valor digital de ambos
parámetros. Por este motivo, en este estudio, se evaluaron la
modificación de la PAS y de la PAD producida por la administración
aguda de las leches fermentadas y los péptidos. Antes de colocar el
manguito en la cola de las ratas, éstas se exponían a una
temperatura próxima a los 30ºC para facilitar la dilatación de la
arteria caudal, y se anestesiaban suavemente con éter dietílico,
según el procedimiento descrito por Dietz et al. (Dietz R,
Schömig A, Haebara H y col. 1978. Circ Res
43:I98-I106), para minimizar el efecto del estrés
sobre la medida. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida,
los animales se acostumbraban al procedimiento 2 semanas antes de
llevar a cabo el ensayo en cuestión.
La administración de los productos a ensayar se
realizó mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo
comprendido entre las 9 h y las 10 h de la mañana. Las ratas SHR
utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS y de
PAD comprendidos respectivamente entre 240 y 290 mm Hg, y entre 200
y 250 mm Hg. Las ratas WKY utilizadas para el estudio tenían en ese
momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre
160 y 200 mm Hg, y entre 100 y 140 mm Hg. Se tomaron medidas de la
PAS y de la PAD en los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta
8 horas post-administración de los productos a
ensayar; adicionalmente se tomó una medida de ambas variables (PAS
y PAD) 24 horas después de la administración de dichos
productos.
En el caso de las leches fermentadas, como
producto de administración se usó el sobrenadante (suero) obtenido
por centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos de la leche
fermentada y pasteurizada a 75ºC durante 1 minuto siguiendo el
procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Del correspondiente
sobrenadante se llevó a cabo una administración única de 5 ml/kg de
peso corporal del animal.
De los péptidos de SEQ. ID. N^{os}:
2-7 se administró una dosis única de 10 mg/kg. Los
péptidos se disolvieron siempre en agua destilada, y la dosis
correspondiente se administraba siempre a cada rata en un volumen
de 1 mL, ya que dicho volumen era equiparable al volumen de leche
fermentada que recibía cada animal.
Como control negativo (para establecer la
variación circadiana de la PAS y de la PAD en ratas sondadas), se
utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a
las que se les administraba mediante sonda intragástrica 1 mL de
agua. Como control positivo (para establecer el efecto sobre la PAS
y sobre la PAD de un fármaco IECA prototipo, tal como Captopril) se
utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a
las que se les administraba mediante sonda intragástrica 50 mg /kg
de Captopril. Esta dosis de Captopril se administraba a cada rata
en un volumen de 1 mL.
Asimismo, se llevaron a cabo ensayos semejantes
a los descritos anteriormente, en los que los animales se trataban
por el mismo procedimiento con 1 mL de leche bovina (testigo).
Dichos ensayos permitían establecer el efecto de la leche no
fermentada sobre la presión arterial de los animales. Los
resultados de estos ensayos no se representan en las figuras, ya
que los valores de PAS y de PAD correspondientes fueron semejantes a
los valores de PAS y de PAD de los animales a los que se
administraba agua.
Los resultados obtenidos se agruparon y se
obtuvo la media \pm el error estándar de la media (ESM) para un
mínimo de 9 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados
se compararon siempre con los datos considerados como control
negativo. Para compararlos y obtener la significación estadística se
utilizó el test de la "t de Student" para datos no apareados, y
se consideró significativa la diferencia para valores de
p<0,05.
Las Figuras 5A y 5B muestran, respectivamente,
la disminución de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a
distintos tiempos, tras la administración de la leche fermentada con
E. faecalis CECT 5727 y tras la administración de la leche
fermentada con E. faecalis CECT 5728. Dichas figuras
incluyen, además, la disminución de la PAS y de la PAD observada
tras la administración de Captopril. Como era previsible, el
Captopril produjo una pronunciada disminución de la PAS y de la PAD
en las ratas SHR. La disminución de la PAS fue máxima 6 horas
después de la administración del fármaco, mientras que la
disminución de la PAD fue máxima 4 horas después de su
administración. Los sueros de las leches fermentadas ocasionaron una
disminución de la PAS y de la PAD en los animales que fue menor que
la disminución producida por Captopril, pero que también fue
significativa. Los valores menores de PAS después de administrar la
leche fermentada con E. faecalis CECT 5727, se observaron 2
horas después de su administración. En ese momento también se
obtuvieron valores muy bajos de PAD, y los valores de esta variable
permanecieron bajos y sin modificar prácticamente hasta 6 horas
después de la administración. Los valores menores de la PAS y de la
PAD después de administrar la leche fermentada con E.
faecalis CECT 5728, se observaron 4 horas después de su
administración. Los valores de la PAS y de la PAD observados 24
horas después de las distintas administraciones eran semejantes a
los que tenían los animales antes de las mismas.
Las Figuras 6A y 6B muestran respectivamente los
cambios de la PAS y de la PAD obtenidos en ratas WKY a distintos
tiempos, tras la administración del suero de la leche fermentada la
leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 y tras la
administración del suero de leche fermentada con E. faecalis
CECT 5728. También se incluyen los resultados obtenidos tras la
administración de Captopril. Puede apreciarse que ni las leches
fermentadas, ni el Captopril, modificaron la PAS o la PAD de los
animales tratados. Estos resultados permiten descartar posibles
efectos indeseables de los productos fermentados ensayados sobre la
presión arterial de sujetos normotensos.
<110> Grupo Leche Pascual, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Cepas de Enterococcus
faecalis productoras de péptidos bioactivos, péptidos bioactivos
y sus aplicaciones
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu His Leu Pro Leu Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Val Pro Pro Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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\sa{Leu Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro
Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile
Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (36)
1. Un péptido seleccionado del grupo formado por
los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3,
SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Un procedimiento para producir un péptido
bioactivo o un derivado y/o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende fermentar
un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o
fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos
de dicho péptido bioactivo con una cepa de Enterococcus
faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o
convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente
aceptable.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicha cepa de E. faecalis se selecciona del grupo
formado por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT
5728 y sus mezclas.
4. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho sustrato a fermentar es una fuente de proteínas,
péptidos o fragmentos de los mismos, que comprende una o más
proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la
secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho sustrato es de origen animal, vegetal o procedente de
un microorganismo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo,
opcionalmente fermentado, que contiene una o más proteínas lácteas,
o un extracto proteico de soja.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo,
opcionalmente fermentado, que contiene caseína.
8. Una cepa de Enterococcus faecalis
depositada en la CECT seleccionada entre la cepa identificada como
E. faecalis CECT 5727 y la cepa identificada como E.
faecalis CECT 5728.
9. Una preparación bacteriana que contiene una
cepa de E. faecalis de acuerdo con la reivindicación 8,
seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis
CECT 5728 y sus mezclas.
10. Preparación bacteriana según la
reivindicación 9, que contiene, además, uno o más microorganismos
diferentes.
11. Preparación bacteriana según cualquiera de
las reivindicaciones 9 ó 10, en forma de polvo liofilizado o en una
cápsula.
12. Un producto alimentario que comprende una
cepa de Enterococcus faecalis según la reivindicación 8, o
una preparación bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones
9 a 11, o preparado utilizando dicha cepa o preparación
bacteriana.
13. Producto alimentario según la reivindicación
12, seleccionado entre un producto lácteo, opcionalmente fermentado
y/o sometido a un tratamiento térmico, y una bebida.
14. Producto alimentario según la reivindicación
13, seleccionado entre un producto lácteo fermentado y
pasteurizado, una bebida con suero lácteo, una bebida de frutas y
una cerveza.
15. Una composición que comprende un péptido
seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por
la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5,
SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados y sus sales
farmacéuticamente aceptables.
16. Una composición farmacéutica que comprende
un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la, SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº:
4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados,
sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición farmacéutica
antihipertensiva que comprende, al menos, un péptido
antihipertensivo seleccionado del grupo formado por los péptidos
identificados por la, SEQ. W. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº:
4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados,
sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
18. Un producto alimentario funcional que
comprende un producto alimentario y un péptido seleccionado del
grupo formado por los péptidos identificados por la, SEQ. ID. Nº:
2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6,
SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas.
\newpage
19. Producto alimentario funcional según la
reivindicación 18, en el que dicho producto alimentario comprende
bebidas, alimentos en infusión, salsas, condimentos, aliños para
ensaladas, zumos de frutas, jarabes o siropes, postres, helados,
productos congelados suaves, dulces o chicles.
20. Producto alimentario funcional según la
reivindicación 18 ó 19, que comprende, además, una o más sustancias
nutricionales.
21. Producto alimentario funcional según
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho
producto alimentario funcional es sustancialmente líquido.
22. Producto alimentario funcional según
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho
producto alimentario funcional es sustancialmente sólido.
23. Producto alimentario funcional según
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho
producto alimentario funcional es una gelatina.
24. Producto alimentario funcional según
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho
producto alimentario funcional es un producto lácteo.
25. Un aditivo alimentario que comprende un
péptido seleccionado entre los péptidos identificados por la, SEQ.
ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID.
Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas.
26. Un suplemento alimentario que comprende un
péptido seleccionado entre los péptidos identificados por la, SEQ.
ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID.
Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente
aceptables, y sus mezclas.
27. Empleo de una cepa de E. faecalis
según la reivindicación 8, seleccionada entre E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas, en la
industria alimentaria.
28. El uso de una cepa de E. faecalis
según la reivindicación 8, seleccionada entre E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas, para la
fabricación de un medicamento.
29. El uso de una cepa de E. faecalis
según la reivindicación 8, seleccionada entre E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas, para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de
la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en
un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier
desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en
un animal.
30. El uso según la reivindicación 29, en el que
dicho desorden asociado con la hipertensión arterial se selecciona
entre hipertrofia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva,
accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal
progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y
enfermedades vasculares periféricas.
31. Empleo de una cepa de E. faecalis
según la reivindicación 8, seleccionada entre E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas, en la
obtención de péptidos bioactivos.
32. Empleo de una cepa de E. faecalis
según la reivindicación 8, seleccionada entre E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728 y sus mezclas en la
obtención de péptidos con actividad inhibitoria de la enzima
convertidora de angiotensina y/o con actividad
antihipertensiva.
33. Empleo según la reivindicación 31 ó 32, en
el que dichos péptidos se seleccionan del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3, SEQ.
ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID. Nº: 7, sus
derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus
mezclas.
34. Empleo de un péptido seleccionado del grupo
formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. Nº: 2, SEQ.
ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID.
Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus
mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o
prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un
ser humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención
de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un
ser humano o en un animal.
35. Empleo de un péptido seleccionado del grupo
formado por los péptidos identificados por la, SEQ. ID. Nº: 2, SEQ.
ID. Nº: 3, SEQ. ID. Nº: 4, SEQ. ID. Nº: 5, SEQ. ID. Nº: 6, SEQ. ID.
Nº: 7, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus
mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o
prevención en un ser humano o en un animal de un desorden asociado
con la hipertensión arterial seleccionado entre hipertrofia
ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, accidentes
cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva,
aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades
vasculares periféricas.
36. Empleo según cualquiera de las
reivindicaciones 34 ó 35, en donde dicho medicamento se administra
por vía oral.
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2004
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Title |
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YAMAMOTO, N. et al. "{}Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790". JOURNAL OF DAIRY SCIENCES. 1994. Vol. 77, Nº. 4, páginas 917-922. Todo el documento. * |
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