WO2004104182A1 - Cepas de enterococcus faecalis productoras de péptidos bioactivos, péptidos bioactivos y sus aplicaciones - Google Patents

Cepas de enterococcus faecalis productoras de péptidos bioactivos, péptidos bioactivos y sus aplicaciones Download PDF

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WO2004104182A1
WO2004104182A1 PCT/ES2004/000227 ES2004000227W WO2004104182A1 WO 2004104182 A1 WO2004104182 A1 WO 2004104182A1 ES 2004000227 W ES2004000227 W ES 2004000227W WO 2004104182 A1 WO2004104182 A1 WO 2004104182A1
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peptide
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Begoña MUGUERZA MARQUINEZ
Marco Antonio Delgado Delgado
Ana Quiros Del Bosque
Isidra Recio Sanchez
Mercedes Ramos Gonzalez
Ma Amaya ALEIXANDRE DE ARTIÑANO
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Grupo Leche Pascual, S.A.
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    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Definitions

  • the invention relates to the Enterococcus faecalis bacterium which has the ability to produce bioactive peptides, in particular, peptides showing Angiotensin-converting Enzyme Inhibitor activity (ACEI activity) in vitro and / or antihypertensive activity, since its employment in the pharmaceutical and food industry.
  • ACEI activity Angiotensin-converting Enzyme Inhibitor activity
  • the invention also relates to said bioactive peptides and their use in the pharmaceutical and food industry.
  • the renin-angiotensin-aldosterone system plays an important role in maintaining blood pressure and in organic damage secondary to the elevation of this variable, and its implication in the modulation of the arterial tone of some hypertensive patients may be important.
  • ECA Angiotensin Converting Enzyme
  • ACE inhibitor drugs which are widely used as antihypertensives. They include Captopril, Enalapril and Lisinopril. The antihypertensive action of these compounds is enhanced when they are associated with diuretics. Although relatively rare, the undesirable effects of ACE inhibitor drugs may be inconvenient for the treatment of some patients.
  • milk proteins in addition to their high nutritional value, can be the origin of bioactive peptides, that is, peptides capable of modulating physiological activities of importance for the health and well-being of consumers. These peptides or protein fragments are inactive when they are inside the native protein but show their biological activity when they are released by chemical or enzymatic hydrolysis.
  • the biological activities described for these peptides include: antihypertensive activity, opioid activity, immunomodulatory effect, antimicrobial activity, antithrombotic activity and the ability to bind minerals.
  • Peptides with antihypertensive activity have been obtained from enzymatic hydrolysates of different food proteins of animal and vegetable origin, but dairy proteins, both casein and whey proteins, constitute the main source of peptides with antihypertensive activity (Yamamoto N. 1997. Biopolymers 43: 129-134).
  • peptides with ACEI activity have been isolated and characterized in milks fermented with Lactobacillus delbrueckii and Lactococcus lactis (Gobbetti M, Ferranti P, Smacchi E et al. 2000. Appl Environ Microbiol 66: 3898-3904) and also in Manchego cheeses (Gómez -Ruiz JA, Ramos M, Recio I. 2002. Int Dairy J 12: 697-706).
  • the LHLPLP peptide has been described as a peptide that exhibits ACEI activity when said activity is assessed in vitro. However, its antihypertensive activity has not been demonstrated (Kohmura M, Nio N, Kubo K et al. 1989. Agrie Biol. Chem 53: 2107-214). In relation to this, it is worth noting that many peptides that in vitro are characterized as potent ACE inhibitors, show, however, a very small or no effect on this enzyme when tested in vivo (Maruyama S, Mitachi H, Awaya J et al. 1987. Agrie Biol Chem 51: 2557-2561; Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996.
  • the antihypertensive potential of orally administered peptides depends on their ability to reach their sites of action without being degraded, and consequently inactivated, by digestive tract enzymes. Therefore, resistance to said enzymes is a prerequisite for an antihypertensive effect in vivo after oral ingestion of said peptides.
  • bioactive peptides from different substrates are known, and also methods for producing such bioactive peptides based on the fermentation of a substrate by certain microorganisms, due to the growing interest and demand for functional food products incorporating bioactive peptides, it is timely , convenient, and almost necessary, the search for new bioactive peptides, as well as the development of alternative procedures to produce said peptides.
  • said bioactive peptides must be resistant to the action of the enzymes of the digestive tract or be precursors of active forms (which can subsequently be released by the action of the gastrointestinal enzymes) so that they can be administered orally.
  • bioactive peptides in particular, peptides that show ACEI activity in vitro and / or with antihypertensive activity when administered by intragastric tube. Therefore, they can be administered orally and used in the preparation of functional food products and / or in the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment and / or prophylaxis of arterial hypertension. It has also been found that Enterococcus faecalis bacteria is capable of producing said bioactive peptides by proteolysis of proteins whose amino acid sequences contain the amino acid sequences of said bioactive peptides.
  • one aspect of this invention relates to the Enterococcus faecalis bacterium which has the ability to produce bioactive peptides, in particular, peptides that show ACEI activity in vitro and / or antihypertensive activity.
  • said bacterium is an E. faecalis strain deposited in the CECT (Spanish Type Culture Collection) selected from the strain identified as E. faecalis CECT 5727, the strain identified as E. faecalis CECT 5728, the strain identified as E. faecalis CECT 5826 and the strain identified as E. faecalis CECT 5827.
  • Such bacteria can be used in the production of bioactive peptides useful in the food and pharmaceutical industry.
  • the invention in another aspect, relates to a bacterial preparation containing E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E. faecalis CECT 5827 and, optionally, one or more different microorganisms.
  • said bacterial preparation may be in the form of lyophilized powder or in a capsule.
  • the invention relates to a process for producing a bioactive peptide by fermentation of a substrate containing a protein, peptide or fragment thereof containing said bioactive peptide by E. faecalis.
  • said bioactive peptide is a peptide that shows ACEI activity in vitro and / or antihypertensive activity, selected from the group consisting of the peptides. identified by the SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID.
  • the invention relates to the use of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 and mixtures thereof.
  • the invention relates to the use of E. faecalis CECT 5727,
  • the invention relates to the use of said strains in the preparation of a food product, for example, a dairy product, optionally fermented and / or subjected to a heat treatment, or a beverage.
  • a food product for example, a dairy product, optionally fermented and / or subjected to a heat treatment, or a beverage.
  • Food products that comprise said bacterial or bacterial preparation, or that have been prepared using said bacterial or bacterial preparation also constitute a further aspect of this invention.
  • the invention relates to the use of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E. faecalis CECT 5827 as a therapeutic substance, in particular, to the use of said bacteria in the treatment and / or prevention of arterial hypertension in all its forms in a human being or in an animal, as well as with its use in the treatment and / or prevention of any disorder associated with arterial hypertension in a human being or in an animal.
  • the invention relates to the use of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E. faecalis CECT 5827 in obtaining bioactive peptides, in particular, in obtaining of peptides that show ACEI activity in vitro and / or antihypertensive activity.
  • said bioactive peptide is selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof.
  • the invention relates to the use of E. faecalis CECT 5727,
  • said antihypertensive product comprises the antihypertensive peptide identified by SEQ. ID. N °: 1, its derivatives and / or its pharmaceutically acceptable salts.
  • the invention relates to a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives and pharmaceutically acceptable salts.
  • the invention relates to a composition comprising a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID.
  • said pharmaceutical composition is an antihypertensive pharmaceutical composition.
  • the invention relates to the use of a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof, in the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of arterial hypertension in all its forms in a human being or in an animal, as well as with its use in the treatment and / or prevention of any disorder associated with hypertension in a human being or in an animal.
  • the invention relates to obtaining functional foods with antihypertensive activity, for example, fermented milks, which contain an antihypertensive peptide, such as the peptide identified by SEQ. ID. N °: 1, its derivatives and / or its pharmaceutically acceptable salts.
  • a functional food product comprising a food product and a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °:
  • the invention relates to a food additive or to a food supplement comprising a peptide selected from the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof.
  • the invention relates to a method for treating and / or preventing arterial hypertension in all its forms, or the disorders associated with arterial hypertension, in a subject, such as a human being or an animal, which it comprises administering to said subject an effective amount of an antihypertensive pharmaceutical composition provided by this invention.
  • Figure 1 is a graph that represents the percentage of ACE inhibition obtained according to the added volume of supernatant or whey fermented with E. faecalis CECT 5727 (•), with E. faecalis CECT 5728 (A), with E. faecalis CECT 5826 (m) or with E. faecalis CECT 5827 ( • *).
  • Figure 2A is a graph showing the evolution of hydrolysis, measured by the OPA method and expressed as mg peptone / mL (o), and serum dilution activity that produces a 50% inhibition of the activity of the enzyme expressed in volume inhibition units (IU / mL), (•), according to the fermentation time for milk fermented by E. faecalis CECT 5727.
  • Figure 2B is a graph showing the evolution of hydrolysis, measured by the OPA method and expressed as mg peptone / mL ( ⁇ ), and serum dilution activity that produces a 50% inhibition of the activity of the enzyme expressed in volume inhibition units (IU / mL), (A), according to the fermentation time for milk fermented by E. faecalis CECT 5728.
  • Figure 2C is a graph showing the evolution of hydrolysis, measured by the OPA method and expressed as mg peptone / mL (D), and serum dilution activity that produces a 50% inhibition of the activity of the enzyme expressed in volume inhibition units (IU / mL), (m), according to the fermentation time for milk fermented by E. faecalis CECT 5826.
  • Figure 2D is a graph showing the evolution of hydrolysis, measured by the OPA method and expressed as mg peptone / mL (0), and the activity of serum dilution that produces a 50% inhibition of the activity of the enzyme expressed in units of volume inhibition (IU mL), (4), according to the fermentation time for fermented milk by E. faecalis CECT 5827.
  • Figure 3 is a reverse phase HPLC chromatogram on a semi-preparative scale of the active supernatant obtained after centrifugation and ultrafiltration, through a membrane of 3,000 Da pore size, of the milk fermented by E. faecalis CECT
  • Figure 4 is a reverse phase semi-preparative scale HPLC chromatogram of the active fraction obtained from the first HPLC separation. Peptides with ACEI activity were collected in 7 fractions eluting between minute 12 and minute
  • Figure 5A is a graph showing the decrease in systolic blood pressure (SBP) obtained in spontaneously hypertensive rats to which 1 mL of water (X), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT is administered 5727 (•), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL / kg of whey milk fermented with E. faecalis CECT 5827 () or 50 mg / kg of Captopril (-), depending on the time spent after administration.
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 7 animals. Unless otherwise indicated, all doses indicated in this description refer to the body weight of the animal.
  • Figure 5B is a graph showing the decrease in diastolic blood pressure (PAD) obtained in spontaneously hypertensive rats to which 1 mL of water (X), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT is administered 5727 (•), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL / kg of whey fermented milk with
  • PID diastolic blood pressure
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 7 animals.
  • Figure 6A is a graph showing the variation of systolic blood pressure
  • PES Wistar-Kyoto rats given 1 mL of water (X), 5 mL / kg of fermented whey with E. faecalis CECT 5727 (•), 5 mL / kg of fermented whey with E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5827 (* •>) or 50 mg / kg of Captopril (-), depending on the time spent after administration.
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 7 animals.
  • Figure 6B is a graph showing the variation of diastolic blood pressure (PAD) obtained in Wistar-Kyoto rats to which 1 mL of water (X), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis is administered CECT 5727 (•), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL / kg of whey fermented with E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL / kg of whey of milk fermented with E.
  • PID diastolic blood pressure
  • FIG. 7A is a graph showing the decrease in systolic blood pressure (SBP) obtained in spontaneously hypertensive rats to which 1 mL of water (X) or 2 mg / kg of the LHLPLP (• ») peptide is administered, depending on of the time after administration.
  • SBP systolic blood pressure
  • Figure 7B is a graph showing the decrease in diastolic blood pressure (PAD) obtained in spontaneously hypertensive rats to which 1 mL of water (X) or 2 mg / kg of the LHLPLP (• ») peptide is administered, depending on of the time after administration.
  • Data represent the mean ⁇ ESM for a minimum of 9 animals.
  • the invention relates to strains of Enterococcus faecalis with proteolytic activity and ability to produce bioactive peptides, in particular, peptides showing ACEI activity in vitro and / or with antihypertensive activity.
  • the invention provides a strain of E. faecalis deposited in the CECT selected from the strain identified as E. faecalis CECT 5727, the strain identified as E. faecalis CECT 5728, the strain identified as E. faecalis CECT 5826 and the strain identified as E. faecalis CECT 5827.
  • E. faecalis CECT 5827 have been selected from microorganisms isolated from raw bovine milk from different sources, after having been subjected to a selection process based on the presence of ACEI activity greater than 70% in supernatants after centrifugation (serum) of the fermented milks with said microorganisms.
  • the strains were isolated and subsequently characterized by their fermentative and biochemical profile.
  • Example 1 describes in detail the isolation and characterization of said E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and E. faecalis CECT 5827 strains.
  • E. faecalis CECT 5727 strain has, among others, the following characteristics: • Characteristics of the colony:
  • Ureasa - E. faecalis CECT 5728 strain has morphological characteristics, physiological properties and fermentative and biochemical profile similar to E. faecalis CECT 5727 strain with the following exceptions: Appearance of the colony: creamy
  • Colony size 2-3 mm (in 24 hours)
  • Colony edge smooth.
  • Colony size 4 mm (in 24 hours) Appearance of the colony: creamy. Elevation of the colony: high.
  • N-Acetyl-beta Glucosaminidase .: - Glycyl-Tryptophan Arylamidase: - Methyl ⁇ -D-glucopyranoside (Acidification): - ⁇ -manosidase: - Strains E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 Y
  • E. faecalis CECT 5827 are proteolytic strains capable of producing bioactive peptides, in particular, peptides with ACEI activity and / or with antihypertensive activity, from an appropriate substrate comprising one or more proteins, peptides or fragments of said proteins and peptides , which contain the amino acid sequence of said bioactive peptides of interest, by proteolytic digestion.
  • said substrate is a source of proteins, peptides or fragments thereof, of animal, plant, or microorganism origin, comprising one or more proteins, peptides or fragments thereof containing the amino acid sequence of said bioactive peptides of interest.
  • said bioactive peptides produced by strains E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and E. faecalis CECT 5827 are the peptides identified with the amino acid sequences shown in SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. N °: 8, some of which have ACEI activity and / or antihypertensive activity (Examples 3 and 4).
  • the invention relates to the use of an E. faecalis strain, in particular, an E. faecalis strain selected from E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and E. faecalis CECT 5827 and mixtures thereof in obtaining bioactive peptides, in particular, peptides with ACEI activity and / or with antihypertensive activity, selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof.
  • the term "derivative" includes any chemical derivative of said peptides that contains a chemical modification that does not adversely affect its biological activity, for example, its ACEI and / or antihypertensive activity; advantageously, said chemical modification will be a modification such that it increases its biological activity.
  • said derivative is a peptide derivative containing a phosphorylation or a sulfhydryl group at the amino terminal end or any other chemical modification that does not decrease the biological activity of the peptide.
  • the presence of a sulfhydryl or phosphoric group generally increases the activity of ACE inhibitor peptides (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977.
  • Derivatives of the peptides provided by this invention can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art by reacting the peptide provided by the invention with a reagent that provides the desired chemical modification.
  • pharmaceutically acceptable salts includes salts commonly used to form metal salts or acid addition salts. The nature of the salt is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the peptides provided by this invention can be obtained from acids or bases, organic or inorganic. Said salts can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art by reacting the appropriate acid or base with the peptide provided by the invention.
  • the invention provides a method for producing a bioactive peptide comprising fermenting a substrate comprising one or more proteins, peptides or fragments thereof containing the amino acid sequence of said bioactive peptide with an E. faecalis strain. and, if desired, isolate the bioactive peptide and / or convert it into a derivative and / or a pharmaceutically acceptable salt.
  • said bioactive peptide is a peptide with ACEI activity and / or with antihypertensive activity, such as a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof.
  • said E. faecalis strain is selected from the group consisting of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and E. faecalis CECT 5827 and mixtures thereof.
  • Said strain can be used as a pure or substantially pure culture or as a mixed culture, in the form of a bacterial preparation containing E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E.
  • faecalis CECT 5827 together with, optionally, one or more different microorganisms such as Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus or any other lactic bacteria.
  • Said bacterial preparation, hereinafter bacterial preparation of the invention, containing E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E. faecalis CECT 5827 and, optionally, one or more of said different microorganisms constitutes an additional aspect of this invention.
  • the bacterial preparation of the invention may be presented in any appropriate form; however, in a particular embodiment, said bacterial preparation is in dehydrated form, lyophilized powder or in a capsule.
  • the substrate to be fermented is a source of proteins, peptides or fragments thereof, comprising one or more proteins, peptides or fragments thereof containing the amino acid sequence of said bioactive peptide.
  • Said substrate can be of animal origin, for example, milk, eggs, muscles of birds, fish or mammals, etc., or of vegetable origin, for example, protein extracts of soy, corn, wheat, nuts, etc., or may even come from a microorganism, for example, bacteria, yeasts, fungi, etc.
  • said substrate comprises milk or an optionally fermented milk product, containing casein, for example, ⁇ -casein, such as raw milk, whole, skimmed or semi-skimmed milk, powdered milk (prior reconstitution thereof) ), yogurt, butter, cheese, etc., or, alternatively, a soy protein extract.
  • casein for example, ⁇ -casein
  • the substrate can come from any mammal, for example, cow, sheep, goat, buffalo, etc.
  • the sequence of SEQ peptides. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. N °: 8 can be found in the bovine ⁇ -casein sequence (see Table 3, Example 3).
  • the conditions for the fermentation of said substrate by E. faecalis are selected so that they are suitable for said bacterium to exert its proteolytic activity on the substrate, so that bioactive peptides are produced.
  • the fermentation process can be terminated by any appropriate method, for example, by modifying the pH of the medium, applying a heat treatment, etc.
  • the selection of the appropriate conditions, such as temperature, pH and / or aeration, as well as the conditions for finishing the fermentation are part of the general knowledge of a person skilled in the art.
  • a bacterial inoculum with an appropriate bacterial density, is added to the substrate and allowed to ferment, for a period of time suitable at the appropriate temperature and pH.
  • the substrate is solid or substantially solid
  • the substrate is mixed with an appropriate liquid, such as sterilized water, mixed until a homogeneous mixture is obtained, the bacterial inoculum is added and allowed to ferment under the appropriate conditions.
  • the pH of the fermentation medium is adjusted to favor bacterial proteolytic activity either before starting the fermentation or during fermentation, by adding an acid or a base, depending on what is necessary.
  • the fermentation can be repeated a variable number of times by adding bacterial inoculums either fresh or from previous fermentations on the substrate.
  • bioactive peptide is a peptide with ACEI activity and / or with antihypertensive activity, such as a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, and its mixtures.
  • Measure IECA activity of fermented products can be carried out by conventional methods as described in Example 1.2.
  • said bioactive peptides can be isolated and purified by conventional methods and / or converted into pharmaceutically acceptable derivatives and / or salts by conventional methods.
  • the fermentation of the substrate with E. faecalis is carried out by a process comprising a first fermentation at a temperature between 10 ° C and 50 ° C, typically around 30 ° C, for a period of time between 5 and 72 hours, typically around 24 hours, with an inoculum load with a bacterial density between 10 and 10, preferably between 10 and 10 9 , bacteria per 100 mL of substrate, followed by a second fermentation at a temperature between 10 ° C and 50 ° C, typically around 30 ° C, for a period of time between 5 and 72 hours, typically around 48 hours, with an inoculum charge from the first fermentation between 0.01 % and 90% by weight, typically, about 3% by weight.
  • Example 3 describes the isolation and characterization of bioactive peptides with ACEI activity and / or with antihypertensive activity, selected from the group formed by the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, and mixtures thereof, by fermentation of bovine milk with E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 or with E. faecalis CECT 5827.
  • the fermented substrate which contains the bioactive peptides, in particular, the fermented substrate containing a peptide with ACEI activity and / or with antihypertensive activity selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof, can be used as an antihypertensive agent.
  • Said fermented product if desired, can be pasteurized, or it can be dried and used in the form of a powder or a lyophilized preparation, and it can be used in the production of various products, including food products, including food products functional.
  • the fermented substrate optionally, pasteurized, constitutes an additional aspect of this invention. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of an E. faecalis strain selected from E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E.
  • any disorder associated with arterial hypertension in a human being or in an animal such as ventricular hypertrophy, congestive heart failure, strokes, retinopathy, progressive renal failure, dissecting aneurysms, coronary heart disease and peripheral vascular diseases.
  • the invention relates to the use of an E. faecalis strain, in particular, with an E. faecalis strain selected from E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 E. faecalis CECT 5827 and mixtures thereof, or of a bacterial preparation of the invention, in the food industry, for example, in the preparation of a food product. Therefore, in another aspect, the invention provides a food product comprising an E. faecalis strain, in particular, an E. faecalis strain selected from E. faecalis CECT 5727, E.
  • food product is used in this description in its broadest sense, including all types of products, in any form of presentation, for example, in solid, liquid or gelled form, which can be ingested by a mammal, for example , a food or a nutritional substance.
  • food includes substances and compositions that can be used or prepared for use as food for humans and animals, including substances that can be used for its preparation, for example, oils, food ingredients and additives.
  • the term "food” includes beverages (for example, soft drinks, carbonated beverages, etc.), infused foods (for example, vegetables, etc.), sauces, condiments, salad dressings, fruit juices, syrups or syrups, desserts (for example, puddings, jellies, fillings, cooked products, frozen desserts, such as ice cream, sorbets, etc.), ice cream, soft frozen products, sweets (for example, candies, etc.), chewing gum, etc. .
  • said food product is a dairy product, optionally fermented and / or subjected to a heat treatment, for example, pasteurized, so that it is free of viable microorganisms, for example, milk, yogurts, etc.
  • the invention relates to a bioactive peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °:
  • SEQ. ID. N °: 2 SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. N °: 8, its derivatives and pharmaceutically acceptable salts, as well as the pharmaceutically acceptable derivatives and salts of the peptide identified by SEQ. ID. N °: 1, are new products and constitute an additional aspect of this invention.
  • the peptide identified by SEQ. ID. No. 1 was previously obtained by chemical synthesis and exhibited ACEI activity (Kohmura M, Nio N, Kubo K et al. 1989. Agrie Biol. Chem 53: 2107-2114).
  • bioactive peptides identified by the SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. N °: 8, have ACEI activity and / or antihypertensive activity, so that antihypertensive peptides can be used, in particular, in the preparation of food or pharmaceutical compositions with ACEI activity and / or antihypertensive activity.
  • N °: 1 is an antihypertensive peptide that shows strong ACEI activity in vitro, as well as antihypertensive activity tested in spontaneously hypertensive rats (SHR) and has no activity antihypertensive tested in normotensive rats Wistar-Kyoto (WKY) when administered orally (Example 4).
  • SHR spontaneously hypertensive rats
  • WKY normotensive rats
  • the invention in another aspect, relates to a composition
  • a composition comprising a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof.
  • the invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • said pharmaceutical composition is an antihypertensive pharmaceutical composition comprising at least one antihypertensive peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID.
  • said antihypertensive peptide is the peptide identified by the SEQ. ID. N °: 1 and / or a derivative thereof and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention comprises a therapeutically effective amount of a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts and mixtures thereof.
  • the amount of peptide, derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof that may be present in the pharmaceutical composition provided by this invention may vary within a wide range, typically, between 0.05% and 100% by weight, preferably, between 0, 16% and 99% by weight.
  • Said pharmaceutical composition is useful for administration and / or application in the human or animal body, preferably in the human being.
  • the amount of peptide to be administered as well as its dosage to treat a pathological state will depend on numerous factors, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, the route and frequency of administration and the particular peptide to be used.
  • compositions provided by this invention can be presented in any appropriate administration form, for example, solid or liquid, and can be administered by any appropriate route, for example, orally, sublingually, respiratoryly, parenterally, rectally or topically, for which will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form.
  • said pharmaceutical form of administration of said peptides is a solid or liquid form designed for oral administration.
  • the invention relates to the use of a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID.
  • N °: 8 its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof, in the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of arterial hypertension in all its forms in a human being or in an animal, and for the treatment and / or prevention of any disorder associated with arterial hypertension in a human being or an animal, for example, ventricular hypertrophy, congestive heart failure, strokes, retinopathy, progressive renal failure, dissecting aneurysms , coronary heart disease and peripheral vascular diseases.
  • the invention also provides a functional food product comprising a food product and a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof.
  • Said functional food product constitutes an additional aspect of this invention.
  • said functional food product is a product with antihypertensive activity and is useful as an adjunct in the treatment and / or prevention of arterial hypertension in a mammal, such as humans, or from states derived from it.
  • said food product comprises beverages (for example, soft drinks, carbonated beverages, etc.), infused foods (for example, vegetables, etc.), sauces, condiments, salad dressings, fruit juices, syrups or syrups, desserts (for example, puddings, jellies, fillings, cooked products, frozen desserts, such as ice cream, sorbets, etc.), ice cream, products frozen soft, sweet (for example, candy, etc.), chewing gum, etc.
  • the amount of peptide or peptides present in the functional food product may vary within a wide range; however, in a particular embodiment, the amount of peptide or peptides present in the functional food product is comprised between 0.001% and 1% by weight with respect to the total, preferably between 0.01% and 0.5% by weight.
  • Peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7, SEQ. ID. N °: 8, its derivatives, pharmaceutically acceptable salts, and mixtures thereof, can also be ingested by humans and animals as an additive or food supplement contained in food and beverages.
  • Such peptides may be formulated together with one or more nutritional substances, for example, vitamins and / or minerals, and incorporated into substantially liquid compositions such as nutritional drinks, milk, soy milk, soups, etc., or in substantially solid compositions; or in jellies.
  • said peptides can be prepared in powder form and incorporated as such in a food.
  • the amount of peptide provided by this invention that may be present in said foods or beverages may be similar to the dose contained in a typical pharmaceutical composition provided by this invention.
  • the invention provides a method for the treatment and / or prophylaxis of arterial hypertension of a subject, such as a human being or an animal, and for the treatment and / or prevention of any disorder associated with arterial hypertension.
  • a human being or in an animal such as ventricular hypertrophy, congestive heart failure, strokes, retinopathy, progressive renal failure, dissecting aneurysms, coronary heart disease and peripheral vascular diseases, which includes administration to said subject of a quantity effective of an antihypertensive pharmaceutical composition provided by this invention, in an amount appropriate to produce an antihypertensive effect.
  • Peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. No. 8 may be obtained by any suitable method, for example, by fermentation of a substrate comprising one or more proteins, peptides or fragments thereof containing the amino acid sequence of said peptides with E. faecalis, for example, with E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E.
  • faecalis CECT 5827 as previously mentioned, or by enzymatic digestion of said substrate using an enzyme with proteolytic activity.
  • said peptides can be obtained by recombinant methods or, advantageously, by chemical peptide synthesis. Information on methods of chemical synthesis of peptides can be found, for example, in WO 01/68113.
  • Derivatives and pharmaceutically acceptable salts of said peptides identified by SEQ. ID. N °: 1, SEQ. ID. N °: 2, SEQ. ID. N °: 3, SEQ. ID. N °: 4, SEQ. ID. N °: 5, SEQ. ID. N °: 6, SEQ. ID. N °: 7 and SEQ. ID. N °: 8, can be obtained by conventional methods as previously mentioned.
  • the antihypertensive peptides provided by this invention are used as ingredients of any type of food product to turn it into a functional food product with antihypertensive activity, obtaining fermented products with good organoleptic characteristics would be of no importance since What is intended is to obtain the greatest possible amount of the antihypertensive peptide or the maximum ACEI activity in order to obtain it in sufficient quantity to be used as an ingredient.
  • fermentation would be aimed at obtaining the highest possible concentration of the peptide and then proceed to its isolation and purification by conventional methods, for example, by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • the following examples illustrate the invention but should not be considered as limiting the scope thereof.
  • EXAMPLE 1 Selection of strains of microorganisms that produce fermented milk with ACEI activity: Isolation of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT
  • the ACEI activity of the supernatants was determined by the test described in Example 1.2. Bacteria whose supernatants showed no ACEI activities or ACEI activities below 70% were discarded, when the supernatant diluted in half was tested. A total of 47 bacteria were selected that were identified by their fermentative and biochemical profile through the use of API strips (BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France), and incorporated into the Cultures Collection of Grupo Leche Pascual, S.A. (Table 1).
  • the ECA activity was measured according to the method described by Cushman and Cheung (Cushman DW, Cheung HS. 1971. Biochem Pharmacol 20: 1637-1648) and subsequently modified by Nakamura (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K et al. nineteen ninety five.
  • the sample used to measure ACEI activity was the supernatant of the fermented milk, subjected to centrifugation at 20,000 x g for 10 minutes, and subsequently diluted in half with distilled water.
  • the test is performed by pipetting the reagents indicated in Table 2 into Eppendorf tubes.
  • the substrate solution was formed by 0.1 M sodium borate, 300 mM sodium chloride, 5 mM Hip-His-Leu (Sigma, St. Louis, MO), pH 8.3 at 37 ° C.
  • the ECA enzyme solution (Sigma, St. Louis, MO) was adjusted to an activity of 0.1 U / mL.
  • the different reaction mixtures were incubated for 30 minutes at 37 ° C and then 150 ⁇ L of 1M hydrochloric acid was added to each test tube in order to stop the reaction and subsequently 1,000 ⁇ L of ethyl acetate to extract the hippuric acid.
  • the resulting mixtures were vigorously stirred for 20 seconds and centrifuged at 1,500 xg for 10 minutes, to separate and collect from each tube the upper phase (ethyl acetate).
  • 750 ⁇ L of each upper phase was pipetted into individual tubes, which were introduced into a bath with boiling water until the solvent evaporated, under an extractor hood. After removing the ethyl acetate, 800 ⁇ L of distilled water was added to each of the tubes to gently dissolve the dry residue without stirring. Finally, the content of each tube was transferred to quartz cuvettes to read its absorbance at 228 nm. The percentage of inhibition (% inhibition) was calculated by applying the following formula:
  • E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 or E. faecalis CECT 5827 can be used interchangeably.
  • the substrate is skimmed bovine milk powder reconstituted in 10% water and autoclaved (100 ° C for 20 minutes).
  • a liquid starter was manufactured, inoculating the substrate with a culture handle so that the initial population was 10 5 -10 7 CFU / mL and incubating for 24 hours. 3% by weight of this culture was used as inoculum of the second fermentation that was maintained for 48 hours. Both fermentations were performed at 30 ° C.
  • the final reaction volume is always 160 ⁇ L [100 ⁇ L of the substrate solution, 20 ⁇ L of the ECA solution and 40 ⁇ L of the sample to be tested (supernatant at the corresponding dilution with distilled water)] .
  • the results obtained show that the fermented milks produced by both microorganisms have a potent ACEI activity, since with small sample volumes 100% inhibitions of the activity are obtained.
  • the ACEI activity was determined following the previously described protocol and is represented as a serum dilution activity that produces a 50% inhibition of the enzyme activity expressed in volume inhibition units (IU / mL), understood as one unit of inhibition to that capable of inhibiting 50% of the activity of the enzyme ACE.
  • fermented milk products were obtained by strains of E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 and / or E. faecalis CECT 5827 (separately).
  • bovine milk powder reconstituted in 10% water and autoclaved underwent a first 24-hour fermentation with an approximate amount of bacteria of 10 7-10 9 per 100 mL of milk reconstituted, and a second fermentation of 48 hours with an inoculum of the first fermentation of 3% by weight, performing both fermentations at 30 ° C and stopping the fermentation process by pasteurization of fermented milk at 75 ° C for 1 minute.
  • the resulting products were centrifuged at 20,000 xg for 10 minutes.
  • the supernatants obtained were ultrafiltered through a 3,000 Da pore size hydrophilic membrane (Centripep, Amicon Inc, Beverly, MA, USA).
  • the permeate obtained were frozen, lyophilized and kept at -20 ° C until subsequent fractionation.
  • Figure 3 shows the chromatogram corresponding to the permeate of the milk fermented by E. faecalis strain CECT 5727. This fraction was subjected to a second analysis by means of HPLC in reverse phase at preparative scale using the same equipment, column and solvents but eluting the sample with a linear gradient of 20% to 35% of solvent B in A in 40 minutes ( Figure 4).
  • the equipment uses nitrogen as a nebulizer and drying gas and operates with a helium pressure of 5 x 10 "3 bar.
  • Mass spectra are acquired in a range of 50-1500 m / z and at a speed of 13,000 Da / second.
  • Interpretation of the MS spectra in tandem for the identification of the peptide sequences was carried out with the Biotools 2.1 program (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) The peptides that are collected in Table 3 were identified.
  • the equipment (1100 series) consisted of a quaternary pump, an automatic injector, an eluent degassing system and a variable wavelength ultraviolet detector (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) coupled in line to a trap mass spectrometer Ionic Esquire 3000 (Bruker Daltonik).
  • the column was a Hi-Pore C- 8 column (250 x 4.6 mm ID, 5 ⁇ m particle size) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).
  • Solvent A was a mixture of water and trifluoroacetic acid (1000: 0.37) and solvent B a mixture of acetonitrile and trifluoroacetic acid (1000: 0.27).
  • the samples were eluted with a flow of 0.8 mL / minute with a linear gradient from 0% to 30% of solvent B in A in 25 minutes.
  • the eluent was monitored at 214 nm, by mass spectrometry, under the same conditions as indicated in 3.C, except that the injection flow of the sample through the nebulizer was 60 ⁇ L / min.
  • the first four peptides were initially selected to test their antihypertensive activity in spontaneously hypertensive rats (SHR) and in Wistar-Kyoto (WKY) rats.
  • Fermented milks were prepared according to the procedure described in Example 2. The peptides tested were chemically synthesized following the protocol described in Example 3.D.
  • the administration of the products to be tested was performed by intragastric tube within a period of time between 9 am and 10 am in the morning.
  • the SHR rats used for the study at that time had PAS and PAD values, respectively between 240 and 290 mm Hg, and between 200 and 250 mm Hg.
  • the WKY rats used for the study at that time had PAS and PAD values, respectively between 160 and 200 mm Hg, and between 100 and 140 mm Hg.
  • PAS and PAD measurements were taken in animals periodically, every 2 hours, up to 8 hours post-administration of the products to be tested; Additionally, a measurement of both variables (PAS and PAD) was taken 24 hours after the administration of these products.
  • the supernatant obtained by centrifugation at 20,000 xg for 10 minutes of fermented and pasteurized milk at 75 ° C for 1 minute was used as the administration product following the procedure described in Example 2. From the corresponding supernatant, a single administration of 5 mL / kg of body weight of the animal was carried out.
  • Figures 5 A and 5B show, respectively, the decrease in SBP and PAD obtained in SHR rats at different times, after administration of fermented milks with the selected strains of E. faecalis (CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 and CECT 5827). These figures also include the decrease in PAS and PAD observed after the administration of Captopril. As expected, Captopril produced a pronounced decrease in SBP and PAD in SHR rats. The decrease in SBP was maximum 6 hours after drug administration, while the decrease in PAD was maximum 4 hours after administration. Serums from fermented milks caused a decrease in SBP and PAD in animals that was smaller than the decrease produced by Captopril, but which was also significant.
  • Figures 6A and 6B show respectively the changes of the PAS and the PAD obtained in WKY rats at different times, after the administration of sera from fermented milks with E. faecalis (CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 and CECT 5827 ).
  • the results obtained after the administration of Captopril are also included. It can be seen that neither fermented milks, nor Captopril, modified the PAS or PAD of the treated animals; no significant differences were observed when compared for each time studied using the LSD test. These results allow us to rule out possible undesirable effects of the fermented products tested on the blood pressure of normotensive subjects.
  • Figures 7A and 7B show, respectively, the changes in the decrease in
  • PAD this variable

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Abstract

La bacteria Enterococcus faecalis tiene la capacidad de producir péptidos bioactivos, tales como péptidos con actividad inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina y/o con actividad antihipertensiva. Dicha bacteria puede utilizarse para fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos bioactivos. Dicha bacteria y dichos péptidos bioactivos pueden ser utilizados en la industria farmacéutica y alimentaria, en la elaboración de composiciones farmacéuticas o productos alimentarios funcionales.

Description

CEPAS DE ENTEROCOCCUS FAECALIS PRODUCTORAS DE PÉPTIDOS BIOACTIVOS, PÉPTIDOS BIO ACTIVOS Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la bacteria Enterococcus faecalis que tiene la capacidad de producir péptidos bioactivos, en particular, péptidos que muestran actividad Inhibidora de la Enzima Convertidora de la Angiotensina (actividad IECA) in vitro y/o actividad antihipertensiva, y a su empleo en la industria farmacéutica y alimentaria. La invención también se refiere a dichos péptidos bioactivos y a su empleo en la industria farmacéutica y alimentaria.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La hipertensión arterial es un problema de gran importancia socio-sanitaria, cuya transcendencia está hoy día fuera de toda duda debido a razones de prevalencia, y debido también a que es uno de los principales factores de riesgo de enfermedades cardiovasculares. Hoy día entre el 15% y el 20% de los adultos de los países occidentales la padecen, y numerosos estudios han demostrado la estrecha relación entre la hipertensión arterial no tratada y la aparición de hipertrofia ventricular, insuficiencia cardíaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas, por lo que su prevención y tratamiento constituye una de las estrategias más utilizadas para reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares (MacMahon S, Peto R, Cutler J y col. 1990. Lancet 335: 765-774). Todas estas enfermedades son también frecuentes en el mundo occidental. Estudios clásicos de epidemiología evidencian que la morbilidad cardiovascular aumenta significativamente a partir de unos determinados valores de presión arterial pero, además, las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares son las principales causas de muerte en las sociedades industrializadas.
Por otra parte, aunque la detección y control de la hipertensión arterial es relativamente sencilla, la realidad es que muchos pacientes hipertensos no tienen conocimiento de su enfermedad, ya que no presentan ningún tipo de síntomas, y otros están diagnosticados pero reciben un tratamiento inadecuado. Es por todo ello obvio el interés que siguen teniendo los estudios que intentan establecer nuevas estrategias para el control de la hipertensión arterial. Se han desarrollado muchas hipótesis para explicar la elevación de los niveles de presión arterial que presentan los pacientes hipertensos. Sin embargo, la etiopatogenia de la hipertensión arterial sigue sin esclarecerse definitivamente. Son múltiples los mecanismos por los que se puede producir una elevación de la presión arterial, y a menudo estos mecanismos interactúan. En cualquier caso, el sistema renina-angiotensina-aldosterona juega un papel importante en el mantenimiento de la tensión arterial y en el daño orgánico secundario a la elevación de esta variable, y su implicación en la modulación del tono arterial de algunos pacientes hipertensos puede ser importante. Uno de los componentes principales de este sistema es la Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA) [EC 3.4.15.1] (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977. Science 196: 441-444), que cataliza la conversión de angiotensina I, un decapéptido inactivo, en angiotensina II, un octapéptido con una potente actividad vasoconstrictora (Skeggs Lt, Kahn JE, Shumway NP. 1956. J Exp Med 103: 295-299). Además, la ECA cataliza la inactivación de la bradikinina, molécula que posee actividad vasodilatadora. Por tanto, la ECA desempeña un papel muy importante en la regulación de la tensión arterial en el organismo, y su inhibición puede facilitar una vasodilatación y el control de la hipertensión arterial. De hecho, existe un grupo de fármacos inhibidores de la ECA, que se utilizan ampliamente como antihipertensivos. Entre ellos se incluyen Captopril, Enalapril y Lisinopril. La acción antihipertensiva de estos compuestos se potencia cuando se asocian con diuréticos. Aunque relativamente poco frecuentes, los efectos indeseables de los fármacos inhibidores de la ECA, pueden resultar un inconveniente para el tratamiento de algunos pacientes.
Por otro lado, las proteínas de la leche, además de su alto valor nutricional, pueden ser origen de péptidos bioactivos, es decir, péptidos capaces de modular actividades fisiológicas de importancia para la salud y bienestar de los consumidores. Estos péptidos o fragmentos proteicos son inactivos cuando se encuentran en el interior de la proteína nativa pero muestran su actividad biológica cuando son liberados por hidrólisis química o enzimática.
Existen diversos mecanismos para originar cortes en las proteínas lácteas con la consiguiente aparición de péptidos. Estos mecanismos pueden actuar de manera complementaria. Se pueden generar por hidrólisis producida por el propio procesado del producto (aumentos de temperatura, cambios de pH...), por el empleo de enzimas hidrolíticas comerciales o por el uso de microorganismos proteolíticos vivos, capaces de liberar péptidos bioactivos durante el propio proceso de fermentación de la leche, derivados lácteos o cualquier sustrato proteico.
Las investigaciones realizadas hasta este momento confirman diversas actividades biológicas encontradas en péptidos derivados de proteínas lácteas y sus aplicaciones potenciales (Kayser H, Meisel H. 1996. FEBS Letters 383: 18-20; Tome D, Debabbi H. 1998. Int Dairy J 8: 383-392; Gaucheron F, Mollé D, Briard V, Léonil J. 1999. Int Dairy J 9: 515-521; Cross ML, Gilí HS. 2000. Br J Nutr 84: 81S-89S; Shah NP. 2000. Br J Nutr 84: 3S-10S). Entre las actividades biológicas descritas para estos péptidos destacan: actividad antihipertensiva, actividad opiácea, efecto inmunomodulador, actividad antimicrobiana, actividad antitrombótica y capacidad para unir minerales. Los péptidos con actividad antihipertensiva se han obtenido a partir de hidrolizados enzimáticos de distintas proteínas alimentarias de origen animal y vegetal, pero las proteínas lácteas, tanto caseínas como proteínas de suero, constituyen la principal fuente de péptidos con actividad antihipertensiva (Yamamoto N. 1997. Biopolymers 43 : 129-134). Dentro de las investigaciones sobre péptidos funcionales con actividad Inhibidora de la ECA (actividad IECA) y/o con actividad antihipertensiva, destacan los trabajos del grupo de Yamamoto y colaboradores (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78: 777-783; Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995. J Dairy Sci 78: 1253-1257). Estos investigadores estudiaron el efecto que sobre la presión arterial ejercía una leche fermentada por distintas cepas de Lactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae. Identificaron varios péptidos procedentes de la leche fermentada que mostraban actividad IECA in vitro, y observaron que después del proceso de fermentación, la leche fermentada disminuía la presión arterial de las ratas espontáneamente hipertensas (SHR). Por el contrario, la leche fermentada no modificaba la presión de las ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las ratas SHR. Más adelante, dichos investigadores demostraron que la leche fermentada presentaba efectos antihipertensivos en humanos (Hata Y, Yamamoto N, Ohni M, Y y col. 1996. Am J Clin Nutr 64: 767-771).
Recientemente se ha descrito el efecto de una leche fermentada por Lactobacillus helveticus que disminuye la presión arterial en ratas SHR (Sipola M, Finckenberg P, Korpela R; Vapaatalo H, Nurminen MI. 2002. J Dairy Res 69: 103-111) y en humanos hipertensos (Seppo LM, Kerojoki O, Suomalainen H, Korpela R. 2002. Milchwissenschaft 57: 124-127; Seppo LM, Jauhiainen T, Poussa T, Korpela R. 2003. Am J Clin Nutr 77: 326-330). Los resultados de estas investigaciones se han traducido en la comercialización de algunas leches fermentadas y productos lácteos fermentados tipo yogur que contienen péptidos antihipertensivos (Calpis®, Calpis Food Industry Co., Ltd, Tokio, Japón; Evolus®, Valió, Finlandia).
Adicionalmente, se han aislado y caracterizado péptidos con actividad IECA en leches fermentadas con Lactobacillus delbrueckii y Lactococcus lactis (Gobbetti M, Ferranti P, Smacchi E y col. 2000. Appl Environ Microbiol 66: 3898-3904) y también en quesos manchegos (Gómez-Ruiz JA, Ramos M, Recio I. 2002. Int Dairy J 12: 697-706).
El péptido LHLPLP ha sido descrito como un péptido que presenta actividad IECA cuando dicha actividad se valora in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado su actividad antihipertensiva (Kohmura M, Nio N, Kubo K y col. 1989. Agrie Biol. Chem 53:2107- 2114). En relación con esto, merece la pena destacar que muchos péptidos que in vitro se caracterizan como potentes inhibidores de la ECA, muestran, sin embargo, un efecto muy pequeño, o nulo, sobre esta enzima cuando se ensayan in vivo (Maruyama S, Mitachi H, Awaya J y col. 1987. Agrie Biol Chem 51 : 2557-2561 ; Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Puede asimismo suceder el caso contrario; es decir, que péptidos que presentan in vitro poca actividad IECA sean capaces de adquirir in vivo esta actividad gracias a la actuación sobre ellos de las enzimas digestivas (Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Todos estos resultados ponen de relieve la necesidad de probar la eficacia antihipertensiva de los péptidos que muestran actividad IECA in vitro, inicialmente se debe estudiar el efecto de estos péptidos sobre la presión arterial de animales hipertensos, y si procede, se intentará después corroborar su efecto antihipertensivo en humanos (Darragh AJ. 2002. Bull IDF 375:25-31).
Por otra parte, el potencial antihipertensivo de los péptidos administrados por vía oral depende de su capacidad para alcanzar sus lugares de actuación sin ser degradados, y consecuentemente inactivados, por las enzimas del tracto digestivo. Por tanto, la resistencia a dichas enzimas es un prerrequisito para un efecto antihipertensivo in vivo tras la ingestión oral de dichos péptidos.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Aunque se conocen péptidos bioactivos procedentes de diferentes sustratos, y también procedimientos para producir tales péptidos bioactivos basados en la fermentación de un sustrato por determinados microorganismos, debido al creciente interés y demanda de productos alimentarios funcionales que incorporan péptidos bioactivos, resulta oportuna, conveniente, y casi necesaria, la búsqueda de nuevos péptidos bioactivos, así como el desarrollo de procedimientos alternativos para producir dichos péptidos. Ventajosamente, dichos péptidos bioactivos deben ser resistentes a la acción de las enzimas del tracto digestivo o bien ser precursores de formas activas (que posteriormente puedan ser liberados por acción de las enzimas gastrointestinales) con el fin de que puedan ser administrados por vía oral.
Esta invención proporciona unos péptidos bioactivos, en particular, unos péptidos que muestran actividad IECA in vitro y/o con actividad antihipertensiva cuando se administran mediante sonda intragástrica. Por ello, pueden ser administrados por vía oral y utilizarse en la elaboración de productos alimentarios funcionales y/o en la elaboración de composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o profilaxis de la hipertensión arterial. También se ha encontrado que la bacteria Enterococcus faecalis es capaz de producir dichos péptidos bioactivos por proteolisis de proteínas cuyas secuencias de aminoácidos contienen las secuencias de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos. Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con la bacteria Enterococcus faecalis que tiene la capacidad de producir péptidos bioactivos, en particular, unos péptidos que muestran actividad IECA in vitro y/o con actividad antihipertensiva. En una realización particular, dicha bacteria es una cepa de E. faecalis depositada en la CECT (Colección Española de Cultivos Tipo) seleccionada entre la cepa identificada como E. faecalis CECT 5727, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5728, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5826 y la cepa identificada como E. faecalis CECT 5827. Dichas bacterias pueden ser utilizadas en la producción de péptidos bioactivos útiles en la industria alimentaria y farmacéutica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una preparación bacteriana que contiene E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 y, opcionalmente, uno o más microorganismos diferentes. En una realización particular, dicha preparación bacteriana puede encontrarse en forma de polvo liofilizado o en una cápsula.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido bioactivo por fermentación de un sustrato que contiene una proteína, péptido o fragmento de los mismos que contiene dicho péptido bioactivo por E. faecalis. En una realización particular, dicho péptido bioactivo es un péptido que muestra actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados y sus mezclas, y dicha bacteria se selecciona entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de E. faecalis CECT 5727,
E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 en la industria alimentaria. En una realización particular, la invención se relaciona con el empleo de dichas cepas en la preparación de un producto alimentario, por ejemplo, un producto lácteo, opcionalmente fermentado y/o sometido a un tratamiento térmico, o una bebida. Los productos alimentarios que comprenden dicha bacteria o preparación bacteriana, o que han sido preparados utilizando dicha bacteria o preparación bacteriana, también constituyen un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 como sustancia terapéutica, en particular, con el empleo de dichas bacterias en el tratamiento y/o la prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, así como con su empleo en el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 en la obtención de péptidos bioactivos, en particular, en la obtención de péptidos que muestran actividad IECA in vitro y/o actividad antihipertensiva. En una realización particular, dicho péptido bioactivo se selecciona del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de E. faecalis CECT 5727,
E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 en la preparación de un producto antihipertensivo. En una realización particular, dicho producto antihipertensivo comprende el péptido antihipertensivo identificado por la SEQ. ID. N°: 1, sus derivados y/o sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas. En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas. En una realización particular, dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica antihipertensiva.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, así como con su empleo en el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.
En otro aspecto, la invención se relaciona con la obtención de alimentos funcionales con actividad antihipertensiva, por ejemplo, leches fermentadas, que contienen un péptido antihipertensivo, tal como el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1, sus derivados y/o sus sales farmacéuticamente aceptables. En otro aspecto, la invención se relaciona con un producto alimentario funcional que comprende un producto alimentario y un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°:
4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas. En otro aspecto, la invención se relaciona con un aditivo alimentario o con un suplemento alimentario que comprende un péptido seleccionado entre los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
Finalmente, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para tratar y/o prevenir la hipertensión arterial en todas sus formas, o los desórdenes asociados con la hipertensión arterial, en un sujeto, tal como un ser humano o un animal, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica antihipertensiva proporcionada por esta invención.
Otras características de la invención serán desarrolladas posteriormente en la descripción de la invención que se detallará más adelante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una gráfica que representa el porcentaje de inhibición de la ECA que se obtiene según el volumen añadido de sobrenadante o suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (•), con E. faecalis CECT 5728 (A), con E. faecalis CECT 5826 (m) o con E. faecalis CECT 5827 (•*).
La Figura 2A es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (o), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (•), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5727.
La Figura 2B es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (Δ), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (A), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5728.
La Figura 2C es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (D), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), (m), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5826.
La Figura 2D es una gráfica que muestra la evolución de la hidrólisis, medida por el método OPA y expresada como mg peptona/mL (0), y la actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI mL), (4), según el tiempo de fermentación para la leche fermentada por E. faecalis CECT 5827.
La Figura 3 es un cromatograma de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa del sobrenadante activo que se obtiene tras la centrifugación y ultrafiltración, a través de una membrana de 3.000 Da de tamaño de poro, de la leche fermentada por E. faecalis CECT
5727. Los péptidos con actividad IECA eluyen con tiempos de retención superiores a 47 minutos.
La Figura 4 es un cromatograma de HPLC en fase reversa a escala semipreparativa de la fracción activa que se obtiene de la primera separación mediante HPLC. Los péptidos con actividad IECA se recogieron en 7 fracciones que eluyen entre el minuto 12 y el minuto
42.
La Figura 5A es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (•), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5827 ( ) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 7 animales. Salvo indicación en contrario, todas las dosis indicadas en esta descripción se refieren al peso corporal del animal.
La Figura 5B es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (•), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con
E. faecalis CECT 5827 (f) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 7 animales.
La Figura 6A es una gráfica que muestra la variación de la presión arterial sistólica
(PAS) obtenida en ratas Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (•), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5827 (*•>) ó 50 mg/kg de Captopril (-), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 7 animales.
La Figura 6B es una gráfica que muestra la variación de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas Wistar-Kyoto a las que se administra 1 mL de agua (X), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5727 (•), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5728 (A), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5826 (m), 5 mL/kg de suero de leche fermentada con E. faecalis CECT 5827 (••>) ó 50 mg/kg de Captopril (-),en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 7 animales. La Figura 7A es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial sistólica (PAS) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X) ó 2 mg/kg del péptido LHLPLP (•»), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales.
La Figura 7B es una gráfica que muestra la disminución de la presión arterial diastólica (PAD) obtenida en ratas espontáneamente hipertensas a las que se administra 1 mL de agua (X) ó 2 mg/kg del péptido LHLPLP (•»), en función del tiempo pasado tras la administración. Los datos representan la media ± ESM para un mínimo de 9 animales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la invención se relaciona con cepas de Enterococcus faecalis con actividad proteolítica y capacidad para producir péptidos bioactivos, en particular, péptidos que muestran actividad IECA in vitro y/o con actividad antihipertensiva. En una realización particular, la invención proporciona una cepa de E. faecalis depositada en la CECT seleccionada entre la cepa identificada como E. faecalis CECT 5727, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5728, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5826 y la cepa identificada como E. faecalis CECT 5827. Las dos primeras cepas de E. faecalis han sido depositadas el 10 de octubre de 2002 en la CECT, correspondiéndoles el número de acceso indicado y las dos segundas han sido depositadas el 17 de julio de 2003 en la CECT, correspondiéndoles el número de acceso indicado. Las cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y
E. faecalis CECT 5827 han sido seleccionadas a partir de microorganismos aislados de leche bovina cruda de diferentes procedencias, tras haber sido sometidas a un proceso de selección en base a la presencia de actividad IECA superior al 70% en los sobrenanadantes tras la centrifugación (suero) de las leches fermentadas con dichos microorganismos. Las cepas fueron aisladas y caracterizadas posteriormente por su perfil fermentativo y bioquímico. En el Ejemplo 1 se describe de forma detallada el aislamiento y caracterización de dichas cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827.
La cepa E. faecalis CECT 5727 presenta, entre otras, las siguientes características: • Características de la colonia:
1) Crecimiento en MI 7, facultativamente en MRS
2) Forma: circular 3) Tamaño: 1 mm (en 24 horas)
4) Color: blanca
5) Aspecto: brillante
6) Elevación: lisa
7) Borde: irregular • Características morfológicas:
1) Forma: coco
2) Motilidad: ninguna
3) Formación de esporas: no
4) Tinción GRAM: positiva • Propiedades fisiológicas:
1) Producción de catalasa: negativo
2) Crecimiento aeróbico, anaerobiosis facultativa
3) Perfil bioquímico: Arginina Dihidrolasa: + β-Glucosidasa: + β-Glucuronidasa: - α-Galactosidasa: - β-galactosidasa: -
Fosfatasa Alcalina: - Ribosa (Acidificación): +
Manitol (Acidificación): +
D-sorbitol (Acidificación):+
Lactosa (Acidificación): + Trehalosa (Acidificación): +
Rafinosa (Acidificación): -
Sacarosa (Acidificación): +
L-arabinosa (Acidificación): - D- arabitol (Acidificación): -
Ciclodextrina (Acidificación): +
Producción de Acetoina: +
Alanil-Fenilalanil -Prolina Arilamidasa: -
Acido Piroglutámico Arilamidasa: + N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: +
Glicil- Triptófano Arilamidasa: +
Hidrólisis Hipurato: -
Glicógeno (Acidificación): -
Pululano (Acidificación): - D-maltosa (Acidificación): +
Melibiosa (Acidificación): -
Melezitosa (Acidificación): +
Metil β-D-glucopiranosido (Acidificación): +
Tagatosa (Acidificación): + β-manosidasa: +
Ureasa: - La cepa E. faecalis CECT 5728 presenta unas características morfológicas, propiedades fisiológicas y perfil fermentativo y bioquímico similar al de la cepa E. faecalis CECT 5727 con las excepciones siguientes: Aspecto de la colonia: cremoso
Elevación de la colonia: elevada
Borde de la colonia: liso. β-Glucosidasa: -
N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: - Metil β-D-glucopiranosido (Acidificación): - β-manosidasa: - La cepa E. faecalis CECT 5826 presenta unas características morfológicas, propiedades fisiológicas y perfil fermentativo y bioquímico similar al de la cepa E. faecalis CECT 5727 con las excepciones siguientes:
Tamaño de la colonia: 2-3 mm (en 24 horas) Borde de la colonia: liso.
N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: - Glicil- Triptófano Arilamidasa: - Metil β-D-glucopiranosido (Acidificación): - β-manosidasa: - La cepa E. faecalis CECT 5827 presenta unas características morfológicas, propiedades fisiológicas y perfil fermentativo y bioquímico similar al de la cepa E. faecalis CECT 5727 con las excepciones siguientes:
Tamaño de la colonia: 4 mm (en 24 horas) Aspecto de la colonia: cremoso. Elevación de la colonia: elevada.
N-Acetil-beta Glucosaminidasa.: - Glicil- Triptófano Arilamidasa: - Metil β-D-glucopiranosido (Acidificación): - β-manosidasa: - Las cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y
E. faecalis CECT 5827 son cepas proteolíticas con capacidad para producir péptidos bioactivos, en particular, péptidos con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, a partir de un sustrato apropiado que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de dichas proteínas y péptidos, que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos de interés, mediante digestión proteolítica. En general, dicho sustrato es una fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, de origen animal, vegetal, o procedentes de microorganismos, que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos bioactivos de interés. La actividad proteolítica de las cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827 ha sido ensayada por el método OPA (o-phtaldialdehído) usando peptona de caseína para la recta de calibrado (Church FC, Swaisgood HE, Porter DH, Catgnani L. 1983. J Dairy Sci 66: 1219-1227) [Ejemplo 2]. La actividad IECA de los sustratos fermentados con dichas cepas puede ser determinada mediante el método descrito en el Ejemplo 1.2.
En una realización particular, dichos péptidos bioactivos producidos por las cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827 son los péptidos identificados con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8, algunos de los cuales presentan actividad IECA y/o actividad antihipertensiva (Ejemplos 3 y 4).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis, en particular, una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas en la obtención de péptidos bioactivos, en particular, péptidos con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, seleccionados del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "derivado" incluye cualquier derivado químico de dichos péptidos que contiene una modificación química que no afecta adversamente a su actividad biológica, por ejemplo, su actividad IECA y/o antihipertensiva; ventajosamente, dicha modificación química será una modificación tal que aumente su actividad biológica. En una realización particular, dicho derivado es un derivado peptídico que contiene una fosforilación o un grupo sulfhidrilo en el extremo amino terminal o cualquier otra modificación química que no disminuya la actividad biológica del péptido. Como es conocido, la presencia de un grupo sulfhidrilo o fosfórico aumenta, en general, la actividad de los péptidos inhibidores de la ECA (Ondetti MA, Rubin B, Cushman DW. 1977. Science 196: 441-444). Los derivados de los péptidos proporcionados por esta invención pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el péptido proporcionado por la invención con un reactivo que proporciona la modificación química deseada. El término "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos proporcionados por esta invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido o base apropiado con el péptido proporcionado por la invención.
De forma más concreta, la invención proporciona un procedimiento para producir un péptido bioactivo que comprende fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo con una cepa de E. faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular, dicho péptido bioactivo es un péptido con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, tal como un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.
En otra realización particular, dicha cepa de E. faecalis se selecciona del grupo formado por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas. Dicha cepa puede utilizarse como un cultivo puro o sustancialmente puro o como un cultivo mixto, en forma de una preparación bacteriana que contiene E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827, junto con, opcionalmente, uno o más microorganismos diferentes tales como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus o cualquier otra bacteria láctica. Dicha preparación bacteriana, en adelante preparación bacteriana de la invención, que contiene E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 y, opcionalmente, uno o más de dichos microorganismos diferentes, constituye un aspecto adicional de esta invención. La preparación bacteriana de la invención puede presentarse en cualquier forma apropiada; no obstante, en una realización particular, dicha preparación bacteriana se encuentra en forma deshidratada, de polvo liofilizado o en una cápsula.
En general, el sustrato a fermentar es una fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo. Dicho sustrato puede ser de origen animal, por ejemplo, leche, huevos, músculos de aves, peces o mamíferos, etc., o bien de origen vegetal, por ejemplo, extractos proteicos de soja, maíz, trigo, frutos secos, etc., o, incluso, puede proceder de un microorganismo, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos, etc. En una realización particular, dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene caseína, por ejemplo, β-caseína, tal como, leche cruda, leche entera, desnatada o semidesnatada, leche en polvo (previa reconstitución de la misma), yogur, mantequilla, queso, etc., o, alternativamente, un extracto proteico de soja. Cuando el sustrato es leche, ésta puede proceder de cualquier mamífero, por ejemplo, vaca, oveja, cabra, búfala, etc. La secuencia de los péptidos SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8, puede encontrarse en la secuencia de la β-caseína bovina (véase la Tabla 3, Ejemplo 3).
Las condiciones para la fermentación de dicho sustrato por E. faecalis se seleccionan de manera que sean las adecuadas para que dicha bacteria pueda ejercer su actividad proteolítica sobre el sustrato, de manera que se produzcan los péptidos bioactivos. El proceso de fermentación se puede terminar por cualquier método apropiado, por ejemplo, modificando el pH del medio, aplicando un tratamiento térmico, etc. La selección de las condiciones apropiadas, tales como temperatura, pH y/o aireación, así como de las condiciones para terminar la fermentación, forman parte del conocimiento general de un experto en la materia. En general, cuando el sustrato es líquido, por ejemplo, leche, se adiciona al sustrato un inoculo bacteriano, con una densidad bacteriana apropiada, y se deja fermentar, durante un periodo de tiempo adecuado a la temperatura y pH apropiados. Cuando el sustrato es sólido o sustancialmente sólido, el sustrato se mezcla con un líquido apropiado, tal como agua esterilizada, se mezcla hasta obtener una mezcla homogénea, se añade el inoculo bacteriano y se deja fermentar en las condiciones apropiadas. El pH del medio de fermentación se ajusta para favorecer la actividad proteolítica bacteriana bien antes de iniciar la fermentación o bien durante la fermentación, por adición de un ácido o una base, dependiendo de lo que sea necesario. La fermentación puede repetirse un número variable de veces añadiendo inóculos bacterianos bien frescos o bien procedentes de las fermentaciones anteriores sobre el sustrato.
Tras la fermentación del sustrato se obtiene una mezcla de péptidos bioactivos. En una realización particular, dicho péptido bioactivo es un péptido con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, tal como un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, y sus mezclas. La medida de la actividad IECA de los productos fermentados se puede realizar por métodos convencionales tal y como se describe en el Ejemplo 1.2. Si se desea, dichos péptidos bioactivos se pueden aislar y purificar por métodos convencionales y/o convertirlos en derivados y/o sales farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales. En una realización particular, la fermentación del sustrato con E. faecalis se realiza mediante un procedimiento que comprende una primera fermentación a una temperatura comprendida entre 10°C y 50°C, típicamente alrededor de 30°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas, típicamente alrededor de 24 horas, con una carga de inoculo con una densidad bacteriana comprendida entre 10 y 10 , preferentemente, entre 10 y 109, bacterias por cada 100 mL de sustrato, seguida de una segunda fermentación a una temperatura comprendida entre 10°C y 50°C, típicamente alrededor de 30°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 y 72 horas, típicamente alrededor de 48 horas, con una carga de inoculo procedente de la primera fermentación comprendida entre 0,01% y 90% en peso, típicamente, alrededor del 3% en peso. En el Ejemplo 3 se describe el aislamiento y caracterización de péptidos bioactivos con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva, seleccionados del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, y sus mezclas, por fermentación de leche bovina con E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 o con E. faecalis CECT 5827.
El sustrato fermentado, que contiene los péptidos bioactivos, en particular, el sustrato fermentado que contiene un péptido con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, puede ser utilizado como un agente antihipertensivo. Dicho producto fermentado, si se desea, puede ser pasteurizado, o bien puede ser secado y utilizado en forma de un polvo o de una preparación liofilizada, y puede ser utilizado en la elaboración de diversos productos, entre ellos, productos alimentarios, incluyendo productos alimentarios funcionales. El sustrato fermentado, opcionalmente, pasteurizado, constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas como sustancia terapéutica, en particular, como sustancia terapéutica para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal, tal como hipertrofia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una cepa de E. faecalis, en particular, con una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas, o de una preparación bacteriana de la invención, en la industria alimentaria, por ejemplo, en la preparación de un producto alimentario. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un producto alimentario que comprende una cepa de E. faecalis, en particular, una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas, o bien una preparación bacteriana de la invención, o bien un producto alimentario que ha sido preparado utilizando dicha cepa de E. faecalis de la invención o dicha preparación bacteriana de la invención.
El término "producto alimentario" se utiliza en esta descripción en su sentido más amplio, incluyendo todo tipo de producto, en cualquier forma de presentación, por ejemplo, en forma sólida, líquida o gelificada, que puede ser ingerido por un mamífero, por ejemplo, un alimento o una sustancia nutricional. El término "alimento", tal como se utiliza en esta descripción, incluye sustancias y composiciones que pueden ser utilizadas o preparadas para su empleo como alimento de seres humanos y animales, incluyendo sustancias que pueden ser utilizadas para su preparación, por ejemplo, aceites, ingredientes y aditivos alimentarios. A modo ilustrativo, el término "alimento" incluye bebidas (por ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, etc.), alimentos en infusión (por ejemplo, vegetales, etc.), salsas, condimentos, aliños para ensaladas, zumos de frutas, jarabes o siropes, postres (por ejemplo, puddings, gelatinas, rellenos, productos cocinados, postres congelados, tales como helados, sorbetes, etc.), helados, productos congelados suaves, dulces (por ejemplo, caramelos, etc.), chicles, etc. En una realización particular, dicho producto alimentario es un producto lácteo, opcionalmente fermentado y/o sometido a un tratamiento térmico, por ejemplo, pasteurizado, de manera que esté libre de microorganismos viables, por ejemplo, leche, yogures, etc. o una bebida, por ejemplo, una bebida con suero lácteo, una bebida de frutas, una cerveza, etc. En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido bioactivo seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°:
3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los términos "derivados" y "sales farmacéuticamente aceptables" han sido definidos previamente.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8, sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables, así como los derivados y sales farmacéuticamente aceptables del péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1, son productos nuevos y constituyen un aspecto adicional de esta invención. El péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 ha sido obtenido anteriormente mediante síntesis química y exhibía actividad IECA (Kohmura M, Nio N, Kubo K y col. 1989. Agrie Biol. Chem 53:2107-2114). Sin embargo, no se ha descrito previamente su obtención por digestión proteolítica de un sustrato con E. faecalis ni se ha demostrado su actividad antihipertensiva. Como es conocido, muchos péptidos, que in vitro se muestran como potentes inhibidores de la ECA, pierden toda o gran parte de su actividad IECA cuando son ensayados in vivo (Maruyama S, Mitachi H, Awaya J y col. 1987. Agrie Biol Chem 51 : 2557-2561; Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Por otra parte, y del mismo modo que péptidos con una potente actividad inhibitoria in vitro no siempre actúan como agentes antihipertensivos, también puede suceder el caso contrario, es decir que péptidos que in vitro no presentan gran actividad como inhibidores de la ECA, adquieran in vivo esa capacidad gracias a la actuación sobre ellos de las enzimas digestivas (Maeno M, Yamamoto N, Takano T. 1996. J Dairy Sci 79: 1316-1321). Todos estos resultados ponen de relieve la necesidad de probar in vivo la eficacia de péptidos con actividad IECA, inicialmente en un modelo animal para finalmente corroborar los resultados en humanos (Darragh AJ. 2002. Bull IDF 375:25-31).
Ahora se ha encontrado que los péptidos bioactivos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8, tienen actividad IECA y/o actividad antihipertensiva, por lo que pueden ser utilizados, en particular, los péptidos antihipertensivos, en la elaboración de composiciones alimentarias o farmacéuticas con actividad IECA y/o actividad antihipertensiva. En particular, el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 es un péptido antihipertensivo que muestra una fuerte actividad IECA in vitro, así como actividad antihipertensiva ensayada en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y no tiene actividad antihipertensiva ensayada en ratas normotensas Wistar-Kyoto (WKY) cuando se administra por vía oral (Ejemplo 4). El hecho de que dicho péptido pueda alcanzar su lugar de actuación sin ser degradado y, consecuentemente, inactivado, por las enzimas del tracto digestivo, amplía su potencial aplicación ya que la resistencia a tales enzimas es un prerrequisito para que un péptido ejerza su efecto in vivo tras su ingestión oral. Tanto la actividad IECA como el efecto antihipertensivo de dicho péptido (SEQ. ID. N°: 1) han sido demostrados con el producto pasteurizado, lo que indica que no es necesaria la presencia de las bacterias vivas para la obtención de la actividad IECA y/o del efecto antihipertensivo ensayado en ratas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica antihipertensiva que comprende, al menos, un péptido antihipertensivo seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, dicho péptido antihipertensivo es el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 y/o un derivado del mismo y/o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo, típicamente, entre 0,05% y 100% en peso, preferentemente, entre 0,16% y 99% en peso. Dicha composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal, preferiblemente en el ser humano. La cantidad de péptido que debe administrarse así como su dosificación para tratar un estado patológico dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, la ruta y frecuencia de administración y del péptido concreto a utilizar.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por esta invención pueden presentarse en cualquier forma de administración apropiada, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, sublingual, respiratoria, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. En una realización particular, dicha forma farmacéutica de administración de dichos péptidos es una forma sólida o líquida diseñada para su administración por vía oral. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
En otro aspecto, la invención se refiere al empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal, por ejemplo, la hipertrofia ventricular, la insuficiencia cardiaca congestiva, los accidentes cerebrovasculares, la retinopatía, la insuficiencia renal progresiva, los aneurismas disecantes, la enfermedad coronaria y las enfermedades vasculares periféricas.
La invención también proporciona un producto alimentario funcional que comprende un producto alimentario y un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas. Dicho producto alimentario funcional constituye un aspecto adicional de esta invención. En una realización particular, dicho producto alimentario funcional es un producto con actividad antihipertensiva y resulta útil como coadyuvante en el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en un mamífero, tal como el ser humano, o de estados derivados de la misma. Aunque prácticamente cualquier producto alimentario puede ser utilizado en la elaboración del producto alimentario funcional de la invención, en una realización particular dicho producto alimentario comprende bebidas (por ejemplo, refrescos, bebidas carbonatadas, etc.), alimentos en infusión (por ejemplo, vegetales, etc.), salsas, condimentos, aliños para ensaladas, zumos de frutas, jarabes o siropes, postres (por ejemplo, puddings, gelatinas, rellenos, productos cocinados, postres congelados, tales como helados, sorbetes, etc.), helados, productos congelados suaves, dulces (por ejemplo, caramelos, etc.), chicles, etc. La cantidad de péptido o péptidos presente en el producto alimentario funcional puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular, la cantidad de péptido o péptidos presente en el producto alimentario funcional está comprendida entre 0,001% y 1% en peso respecto al total, preferentemente, entre 0,01% y 0,5% en peso.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, también pueden ser ingeridos por los seres humanos y animales como un aditivo o suplemento alimentario contenido en alimentos y bebidas. Dichos péptidos pueden ser formulados junto con una o más sustancias nutricionales, por ejemplo, vitaminas y/o minerales, e incorporados en composiciones sustancialmente líquidas tales como bebidas nutritivas, leche, leche de soja, sopas, etc., o en composiciones sustancialmente sólidas; o en gelatinas. Alternativamente, dichos péptidos pueden ser preparados en forma de polvo e incorporados como tal en un alimento. La cantidad de péptido proporcionado por esta invención que puede estar presente en dichos alimentos o bebidas puede ser similar a la dosis contenida en una composición farmacéutica típica proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis de la hipertensión arterial de un sujeto, tal como un ser humano o un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal tal como la hipertrofia ventricular, la insuficiencia cardiaca congestiva, los accidentes cerebrovasculares, la retinopatía, la insuficiencia renal progresiva, los aneurismas disecantes, la enfermedad coronaria y las enfermedades vasculares periféricas, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica antihipertensiva proporcionada por esta invención, en una cantidad apropiada para producir un efecto antihipertensivo.
Los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8 pueden ser obtenidos por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, por fermentación de un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dichos péptidos con E. faecalis, por ejemplo, con E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 tal como se ha mencionado previamente, o bien por digestión enzimática de dicho sustrato utilizando una enzima con actividad proteolítica. Alternativamente, dichos péptidos pueden obtenerse por métodos recombinantes o, ventajosamente, por síntesis química de péptidos. Información sobre métodos de síntesis química de péptidos puede encontrarse, por ejemplo, en WO 01/68113. Los derivados y las sales farmacéuticamente aceptables de dichos péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7 y SEQ. ID. N°: 8, pueden obtenerse por métodos convencionales tal como se ha mencionado previamente.
En general, cuando se desee obtener un producto alimentario funcional antihipertensivo, se realizarán todas las modificaciones necesarias en el proceso de fermentación previamente descrito para obtener una buena actividad IECA en el producto fermentado, pero controlando la producción de amargor, producido típicamente por la aparición de péptidos hidrófobos de bajo peso molecular, cuya incidencia es alta tras la hidrólisis de las caseínas, debido a que sus secuencias contienen una gran cantidad de aminoácidos hidrófobos. Por otra parte, en caso de que los péptidos antihipertensivos proporcionados por esta invención se utilicen como ingredientes de cualquier tipo de producto alimentario para convertirlo en un producto alimentario funcional con actividad antihipertensiva, la obtención de productos fermentados con buenas características organolépticas carecería de importancia ya que lo que se pretende es la obtención de la mayor cantidad posible del péptido antihipertensivo o de la máxima actividad IECA con el fin de obtenerlo en cantidad suficiente como para utilizarlo como ingrediente. Finalmente, en caso de utilizar uno de dichos péptidos, por ejemplo, el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 como fármaco antihipertensivo, la fermentación iría dirigida a la obtención de la mayor concentración posible del péptido para posteriormente proceder a su aislamiento y purificación por métodos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Aunque, en general, los péptidos antihipertensivos proporcionados por esta invención no presentan una actividad IECA tan potente como la del fármaco Captopril (IC50 = 0,006 μM, siendo IC50 la concentración del inhibidor que disminuye en un 50% la actividad enzimática), son péptidos naturales con los que cabe esperar pocos efectos secundarios y buena tolerancia. Serían por ello útiles como coadyuvantes en el tratamiento y/o la prevención de la hipertensión arterial y, en consecuencia, en la lucha contra la enfermedad cardiovascular. Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Selección de cepas de microorganismos que producen leche fermentada con actividad IECA: Aislamiento de E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT
5826 y E. faecalis CECT 5827 1.1 Selección de cepas productoras de leche fermentada con elevada actividad IECA Se ensayaron 231 microorganismos, aislados a partir de leche bovina cruda recogida de diferentes procedencias, comprobándose su capacidad para producir leches fermentadas con actividad IECA mediante el procedimiento que se describe a continuación.
Alícuotas de leche bovina cruda, de diferentes procedencias, se sembraron en placas conteniendo medio MRS (Oxoid Ltd, Basingstoke, UK) (selectivo para el género Lactobacillus) o medio MI 7 (Biokar Diagnostics, Beauvais, France) (selectivo para el género Streptococcus) y se incubaron durante 48 horas a 42°C en atmósfera anaeróbica (AnaeroGen™, Oxoid Ltd, Basingstoke, UK), con una cantidad de oxígeno menor del 1% y un nivel de dióxido de carbono comprendido entre el 9% y el 13% (medio MRS) o bien a 30°C y en condiciones de aerobiosis (medio MI 7). Cuando en una misma placa se observó crecimiento de más de una colonia diferente de microorganismos se procedió al aislamiento de las distintas colonias mediante resiembras consecutivas en los mismos medios. Utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 2, se seleccionaron, entre los organismos aislados, aquéllos con capacidad de producir leches fermentadas con actividad IECA. Al finalizar la fermentación, las leches fermentadas se centrifugaron a 20.000 x g durante 10 minutos para obtener el suero en donde se ensayó la actividad IECA. El ensayo de la actividad enzimática se realizó inmediatamente o, en caso contrario, los sobrenadantes se mantuvieron congelados a -20°C.
La actividad IECA de los sobrenadantes se determinó mediante el ensayo descrito en el Ejemplo 1.2. Se desecharon las bacterias cuyos sobrenadantes no mostraban actividades IECA o actividades IECA inferiores al 70%, cuando se ensayaba el sobrenadante diluido a la mitad. Se seleccionaron un total de 47 bacterias que fueron identificadas por su perfil fermentativo y bioquímico mediante el empleo de tiras API (BioMérieux SA, Marcy l'Etoile, Francia), e incorporadas a la Colección de Cultivos del Grupo Leche Pascual, S.A. (Tabla 1). Las cepas más prometedoras han sido depositadas el 10 de octubre de 2002 y el 17 de julio de 2003 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, y entre ellas las cepas de Enterococcus faecalis identificadas con los números de acceso CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 y CECT 5827. Estas cepas pueden crecer en medio MI 7 en aerobiosis a 30°C.
Los resultados obtenidos con las bacterias seleccionadas por su capacidad de producir leche fermentada con actividad IECA superior al 70% medida en el sobrenadante diluido a la mitad e incorporadas a la Colección de Cultivos del Grupo Pascual, S.A. se recogen en la Tabla 1. En la mayoría de los casos aparecen dos valores de actividad IEC A debido a que se hicieron repeticiones para confirmar los resultados. La ultima columna se refiere a la cantidad necesaria de sobrenadante para producir una disminución enzimática del 50% (IC50) expresada en microgramos/mL. Para conocer la concentración de péptidos en las leches fermentadas se usó el método Kjeldhal (Norma FIL-IDF 20B 1993).
Tabla 1
Figure imgf000027_0001
Cepa no identificable 75,3 % 92,6 %
1.2 Medida de la actividad Inhibitoria de la ECA (actividad IECA)
La medida de la actividad ECA se realizó según el método descrito por Cushman y Cheung (Cushman DW, Cheung HS. 1971. Biochem Pharmacol 20:1637-1648) y modificado posteriormente por Nakamura (Nakamura Y, Yamamoto N, Sakai K y col. 1995.
J Dairy Sci 78:777-783). Este método se basa en el empleo de Hippuril-L-Histidil-L-Leucina
(Hip-His-Leu) como sustrato ya que la actuación de la ECA sobre dicho sustrato produce la liberación del ácido hipúrico, fácilmente cuantificable mediante espectrofotometría por lectura de la absorbancia a 228 nm (A228) tras su extracción con acetato de etilo. Si en el tubo de reacción además de la ECA y del sustrato se añade la muestra a ensayar, se puede determinar la actividad IECA de la muestra ensayada. Tal como se menciona en el Ejemplo
1.1, durante la selección de las bacterias, la muestra usada para medir la actividad IECA fue el sobrenadante de la leche fermentada, sometida a centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos, y posteriormente diluido a la mitad con agua destilada.
El ensayo se realiza pipeteando en tubos tipo Eppendorf los reactivos indicados en la Tabla 2.
Tabla 2
Muestra Blanco muestra Enzima Blanco Sustrato
(μL) (μL) (μL) (μL)
(A) (B) (C) (D)
Sobrenadante 40 40 0 0
Solución de sustrato 100 0 100 100
Solución de enzima
20 0 20 0 ECA (0,1 U/mL)
H2O 0 120 40 60
La solución de sustrato estaba formada por borato sódico 0,1 M, cloruro sódico 300 mM, Hip-His-Leu (Sigma, St. Louis, MO) 5 mM, pH 8,3 a 37°C. La solución del enzima ECA (Sigma, St. Louis, MO) se ajustó a una actividad de 0,1 U/mL. Las distintas mezclas de reacción se incubaron durante 30 minutos a 37°C y, a continuación, a cada tubo de ensayo se añadieron 150 μL de ácido clorhídrico 1 M con el fin de parar la reacción y, posteriormente, 1.000 μL de acetato de etilo para extraer el ácido hipúrico. Las mezclas resultantes se agitaron vigorosamente durante 20 segundos y se centrifugaron a 1.500 x g durante 10 minutos, para separar y recoger de cada tubo la fase superior (acetato de etilo). 750 μL de cada fase superior se pipetearon en tubos individuales, los cuales se introdujeron en un baño con agua en ebullición hasta evaporar el disolvente, bajo campana extractora. Una vez eliminado el acetato de etilo, se añadieron 800 μL de agua destilada a cada uno de los tubos para disolver suavemente y sin agitación el residuo seco. Por último el contenido de cada tubo se transfirió a cubetas de cuarzo para leer su absorbancia a 228 nm. El porcentaje de inhibición (% Inhibición) se calculó aplicando la siguiente fórmula:
(A) - (B) % Inhibición =
(C) - (D)
donde (A), (B), (C) y (D) corresponden a las absorbancias a 228 nm de las soluciones indicadas en la tabla 2.
EJEMPLO 2
Producción de leche fermentada con actividad IECA mediante el uso de E. faecalis
CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827.
Para la realización de este ejemplo de fermentación se puede utilizar indistintamente E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 o E. faecalis CECT 5827. El sustrato es leche bovina desnatada en polvo reconstituida en agua al 10% y autoclavada (100°C durante 20 minutos). En primer lugar se fabricó un starter liquido, inoculando el sustrato con un asa de cultivo de manera que la población inicial fuera 105-107 UFC/mL e incubando durante 24 horas. Un 3% en peso de este cultivo se utilizó como inoculo de la segunda fermentación que se mantuvo durante 48 horas. Ambas fermentaciones se realizaron a 30°C. El proceso de fermentación se paró mediante pasteurización de la leche fermentada [75°C durante 1 minuto], y el producto final pasteurizado fue utilizado para medir la actividad IECA según el protocolo descrito en el Ejemplo 1.2 si bien en este caso las leches fermentadas habían sido sometidas al tratamiento de pasteurización mencionado antes de ser centrifugadas a 20.000 x g durante 10 minutos. La Figura 1 muestra el ensayo de la actividad IECA para diferentes volúmenes de sobrenadante, diluidos adecuadamente con agua destilada con el fin de mantener un volumen constante de reacción (en el Ejemplol la dilución era a la mitad). Por lo tanto, el volumen final de reacción es siempre de 160 μL [100 μL de la solución de sustrato, 20 μL de la solución de la ECA y 40 μL de la muestra a ensayar (sobrenadante a la dilución correspondiente con agua destilada)]. Los resultados obtenidos muestran que las leches fermentadas producidas por ambos microorganismos presentan una potente actividad IECA, ya que con volúmenes de muestra pequeños se obtienen inhibiciones del 100% de la actividad.
Adicionalmente, se estudió la aparición en el tiempo de la actividad IECA en leches fermentadas con las cepas E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 así como el grado de hidrólisis de dichas cepas. Las fermentaciones se realizaron según el protocolo explicado en este mismo Ejemplo 2 pero extrayendo alícuotas de la segunda fermentación a diversos tiempos: 8, 12, 24 y 48 horas.
La actividad IECA se determinó siguiendo el protocolo previamente descrito y se representa como actividad de la dilución de suero que produce un 50% de inhibición de la actividad de la enzima expresada en unidades de inhibición por volumen (UI/mL), entendiendo por una unidad de inhibición a aquella capaz de inhibir el 50% de la actividad de la enzima ECA.
Para el estudio del grado de hidrólisis se realizó un análisis cuantitativo de los péptidos según el método OPA (Church FC, Swaisgood HE, Porter DH., Catigna GL. 1983. J Dairy Sci 66: 1219-1227). Para la curva de calibración se usó peptona de caseína (Fluka, Steinheim, Suiza). Los resultados mostraron que la actividad IECA y la actividad proteolítica, medida mediante OPA, siguen un patrón típico de un metabolito primario, con un aumento inicial pronunciado, asociado al crecimiento exponencial del cultivo, hasta llegar a una meseta final (Figura 2).
EJEMPLO 3
Identificación, aislamiento y síntesis de péptidos con actividad IECA
Para llevar a cabo este trabajo se utilizaron equipos de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) analítica y preparativa, así como un equipo de espectrometría de masas (MS) en tándem que permitió la secuenciación de los péptidos. Se realizaron las etapas que se mencionan a continuación.
3. A Obtención de la fracción soluble de productos lácteos fermentados Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 se obtuvieron unos productos lácteos fermentados por las cepas de E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y/o E. faecalis CECT 5827 (por separado). Brevemente, leche bovina en polvo reconstituida en agua al 10% y autoclavada (100°C durante 20 minutos), se sometió a una primera fermentación de 24 horas con una cantidad de bacterias aproximada de 107-109 por cada 100 mL de leche reconstituida, y una segunda fermentación de 48 horas con un inoculo de la primera fermentación del 3% en peso, realizando ambas fermentaciones a 30°C y parando el proceso de fermentación mediante pasteurización de la leche fermentada a 75°C durante 1 minuto. Los productos resultantes se centrifugaron a 20.000 x g durante 10 minutos. Los sobrenadantes obtenidos se ultrafiltraron a través de una membrana hidrofílica de 3.000 Da de tamaño de poro (Centripep, Amicon Inc, Beverly, MA, EEUU). Los permeados obtenidos se congelaron, liofilizaron y mantuvieron a -20°C hasta su posterior fraccionamiento.
3.B Fraccionamiento mediante HPLC en fase reversa a escala semipreparativa El equipo empleado (Waters Series 600 HPLC; Waters Corp., Mildford, MA, EEUU) consta de una bomba (modelo delta 600), un controlador de gradiente (modelo 600), un inyector (modelo 717 plus), un detector de ultravioleta de longitud de onda variable (modelo
996), un colector de fracciones y un software de adquisición y procesado de datos
(Millenium 3.2). La columna es una Prep Nova Pak® HR C*8 (300 x 7,8 mm d.i., 6 μm de tamaño de partícula, 60 Á de tamaño de poro) (Waters). El disolvente A es una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:1) y el disolvente B es una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0,8). Las muestras se eluyeron con un flujo de 4 mL/minuto con un gradiente lineal del 0% al 35% del disolvente B en A en 70 minutos. La absorbancia del disolvente se monitorizó a 214 nm y 280 nm. Brevemente, cada permeado liofilizado [obtenido en 3. A] se disolvió en agua en una concentración de 100 mg/mL y, en cada separación, el volumen de muestra inyectado fue de
500 μL. Las fracciones que se iban separando eran ensayadas para determinar la existencia de actividad IECA, según el protocolo descrito en el Ejemplo 1.2, observándose que los péptidos con actividad IECA eluían al final del cromatograma con tiempos de retención superiores a 47 minutos. A modo de ejemplo, la Figura 3 muestra el cromatograma correspondiente al permeado de la leche fermentada por la cepa E. faecalis CECT 5727. Esta fracción se sometió a un segundo análisis mediante HPLC en fase reversa a escala preparativa utilizando el mismo equipo, columna y disolventes pero eluyendo la muestra con un gradiente lineal del 20% al 35% del disolvente B en A en 40 minutos (Figura 4). En esas condiciones, se observó actividad IECA en fracciones que eluían entre los minutos 12 y 42 (Figura 4, fracciones 1 a 7). Dichas fracciones, que contenían péptidos con actividad IECA, se recogieron, liofilizaron y se mantuvieron a -20°C hasta su posterior identificación.
3.C Identificación de péptidos con actividad IECA mediante espectrometría de masas en tándem (MS/MS) El análisis mediante espectrometría de masas se realizó en un equipo de trampa iónica Esquire3000 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Los péptidos recogidos de HPLC y liofilizados [procedentes de 3.B] se disolvieron en una concentración de 5-10 μg/ml en una mezcla de 50% de acetonitrilo en agua conteniendo 0,3% de ácido fórmico. La muestra se inyectó en el nebulizador de electrospray a un flujo de 4 μL/min utilizando una bomba de jeringa tipo 22 (Harvard Apparatus, South Natick, MA, EEUU). El equipo emplea nitrógeno como gas nebulizador y de secado y opera con una presión de helio de 5 x 10"3 bar. Los espectros de masas se adquieren en un intervalo de 50-1500 m/z y a una velocidad de 13.000 Da/segundo. La interpretación de los espectros de MS en tándem para la identificación de las secuencias peptídicas se realizó con el programa Biotools 2.1 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). Se identificaron los péptidos que se recogen en la Tabla 3.
Tabla 3 Péptidos identificados en leche bovina fermentada con CECT 5727, con CECT 5728, con CECT 5826 y/o con CECT 5827
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Valor medio
3.D Síntesis de los péptidos con actividad IECA A continuación, se sintetizaron químicamente los péptidos con actividad IECA previamente identificados. La síntesis de dichos péptidos con actividad IECA se realizó mediante el método Fmoc en fase sólida con un sintetizador (modelo 431 A; Applied Biosystems Inc., Überlingen, Alemania). La pureza de los péptidos sintéticos se verificó mediante HPLC en fase reversa a escala analítica y espectrometría de masas usando un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). El equipo (serie 1100) constaba de una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector de ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik). La columna era una columna Hi-Pore C-8 (250 x 4,6 mm d.i., 5 μm de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EEUU). El disolvente A era una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0,37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0,27). Las muestras se eluyeron con un flujo de 0,8 mL/minuto con un gradiente lineal del 0% al 30% del disolvente B en A en 25 minutos. El eluyente se monitorizó a 214 nm, mediante espectrometría de masas, bajo las mismas condiciones que las indicadas en 3.C, salvo que el flujo de inyección de la muestra a través del nebulizador era de 60 μL/min.
En las leches fermentadas con E. faecalis CECT 5727, con E. faecalis CECT 5728, con E. faecalis CECT 5826 y/o con E. faecalis CECT 5827 y en los péptidos sintetizados (que se correspondían con los péptidos aislados en la leche fermentada) se determinó la concentración necesaria para producir una disminución de la actividad enzimática de la ECA del 50% (IC50, expresado en μM en el caso de los péptidos y en μg/mL en el caso de las leches fermentadas). Los valores obtenidos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4 Valores de IC5 de péptidos aislados de la leche fermentada por E. faecalis CECT 5727, por E. faecalis CECT 5728, por E. faecalis CECT 5826 y/o por
E. faecalis CECT 5827
Figure imgf000034_0001
Los cuatro primeros péptidos fueron seleccionados inicialmente para ensayar su actividad antihipertensiva en ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y en ratas Wistar- Kyoto (WKY).
EJEMPLO 4
Estudio de la actividad antihipertensiva de leches fermentadas con E. faecalis CECT
5727, con E. faecalis CECT 5728, con E. faecalis CECT 5826 y/o con E. faecalis CECT
5827 y péptidos con actividad IECA identificados en dichas leches
Debido a la elevada actividad IECA que mostraban la leche bovina fermentada con E. faecalis CECT 5727, con E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y con E. faecalis CECT 5827 así como algunos de los péptidos identificados, en particular el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1, se procedió a estudiar el efecto de dichas leches fermentadas y de dichos péptidos sobre la presión arterial de ratas espontáneamente hipertensas (SHR) y de ratas Wistar-Kyoto (WKY), que son el control normotenso de las ratas SHR.
Las leches fermentadas se prepararon según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los péptidos ensayados se sintetizaron químicamente siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 3.D.
Se utilizaron ratas macho SHR y WKY de 17-20 semanas de vida y peso comprendido entre 250 y 300 g, procedentes de Charles River Laboratories España S.A.. Las ratas permanecían con una temperatura ambiental estable de 23°C, y con ciclos de luz- oscuridad de 12 horas, ingiriendo agua y comida a libre disposición. La medida de la presión arterial en estos animales se llevó a cabo mediante una modificación de la técnica del manguito en la cola (tail-cuff), originalmente descrita por Buñag (Buñag RD. 1973. J Appl Physiol 34:79). Habitualmente, esta técnica permite obtener únicamente medidas de la presión arterial sistólica (PAS); no obstante, el equipo utilizado en este estudio (modelo Le50001 Letica) permite diferenciar la PAS y la presión arterial diastólica (PAD) de los animales, ya que facilita automáticamente el valor digital de ambos parámetros. Por este motivo, en este estudio, se evaluaron la modificación de la PAS y de la PAD producida por la administración aguda de las leches fermentadas y los péptidos. Antes de colocar el manguito en la cola de las ratas, éstas se exponían a una temperatura próxima a los 30°C para facilitar la dilatación de la arteria caudal, y se anestesiaban suavemente con éter dietílico, según el procedimiento descrito por Dietz et al. (Dietz R, Schómig A, Haebara H y col. 1978. Circ Res 43: 198-1106), para minimizar el efecto del estrés sobre la medida. Además, para asegurar la fiabilidad de la medida, los animales se acostumbraban al procedimiento 2 semanas antes de llevar a cabo el ensayo en cuestión.
La administración de los productos a ensayar se realizó mediante sonda intragástrica en un margen de tiempo comprendido entre las 9 h y las 10 h de la mañana. Las ratas SHR utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 240 y 290 mm Hg, y entre 200 y 250 mm Hg. Las ratas WKY utilizadas para el estudio tenían en ese momento valores de PAS y de PAD comprendidos respectivamente entre 160 y 200 mm Hg, y entre 100 y 140 mm Hg. Se tomaron medidas de la PAS y de la PAD en los animales periódicamente, cada 2 horas, hasta 8 horas postadministración de los productos a ensayar; adicionalmente se tomó una medida de ambas variables (PAS y PAD) 24 horas después de la administración de dichos productos.
En el caso de las leches fermentadas, como producto de administración se usó el sobrenadante (suero) obtenido por centrifugación a 20.000 x g durante 10 minutos de la leche fermentada y pasteurizada a 75°C durante 1 minuto siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Del correspondiente sobrenadante se llevó a cabo una administración única de 5 mL/kg de peso corporal del animal.
En los ensayos con el péptido SEQ. ID. N°: 1 se llevó a cabo también una única administración, y la dosis utilizada (2 mg/kg) era equivalente en unidades de actividad IECA a la dosis de 5 mL/kg de sobrenadante de las leches fermentadas por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827. Los péptidos se disolvieron siempre en agua destilada, y la dosis correspondiente se administraba siempre a cada rata en un volumen de 1 mL, ya que dicho volumen era equiparable al volumen de leche fermentada que recibía cada animal. Los resultados más significativos se obtuvieron con el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1.
Como control negativo (para establecer la variación circadiana de la PAS y de la PAD en ratas sondadas), se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a las que se les administraba mediante sonda intragástrica 1 mL de agua. Como control positivo (para establecer el efecto sobre la PAS y sobre la PAD de un fármaco IECA prototipo, tal como Captopril) se utilizaron las medidas de la PAS y de la PAD obtenidas en ratas a las que se les administraba mediante sonda intragástrica 50 mg /kg de Captopril. Esta dosis de Captopril se administraba a cada rata en un volumen de 1 mL. Asimismo, se llevaron a cabo ensayos semejantes a los descritos anteriormente, en los que los animales se trataban por el mismo procedimiento con 1 mL de leche bovina (testigo). Dichos ensayos permitían establecer el efecto de la leche no fermentada sobre la presión arterial de los animales. Los resultados de estos ensayos no se representan en las figuras, ya que los valores de PAS y de PAD correspondientes fueron semejantes a los valores de PAS y de PAD de los animales a los que se administraba agua.
Los resultados obtenidos se agruparon y se obtuvo la media ± el error estándar de la media (ESM) para un mínimo de 7 ensayos homogéneos. Los datos de los animales tratados se compararon entre sí y con los datos considerados como control negativo. Para compararlos y obtener la significación estadística se realizó el análisis de la varianza de una vía (ANO VA), estudiándose las diferencias entre los distintos tratamientos para cada tiempo estudiado mediante el test LSD (Least Significant Difference), considerándose significativa la diferencia para valores de p<0,05 (Tablas 5A y 5B).
Las Figuras 5 A y 5B muestran, respectivamente, la disminución de la PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administración de las leches fermentadas con las cepas seleccionadas de E. faecalis (CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 y CECT 5827). Dichas figuras incluyen, además, la disminución de la PAS y de la PAD observada tras la administración de Captopril. Como era previsible, el Captopril produjo una pronunciada disminución de la PAS y de la PAD en las ratas SHR. La disminución de la PAS fue máxima 6 horas después de la administración del fármaco, mientras que la disminución de la PAD fue máxima 4 horas después de su administración. Los sueros de las leches fermentadas ocasionaron una disminución de la PAS y de la PAD en los animales que fue menor que la disminución producida por Captopril, pero que también fue significativa. Los valores menores de PAS después de administrar las leches fermentadas con E. faecalis (CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 y CECT 5827) se observaron entre 4 y 6 horas después de su administración. En ese momento también se obtuvieron valores muy bajos de PAD, y los valores de esta variable permanecieron bajos y sin modificar prácticamente hasta 6 horas después de la administración. Los valores de la PAS y de la PAD observados 24 horas después de las distintas administraciones eran semejantes a los que tenían los animales antes de las mismas (Tablas 5A y 5B). Tabla 5A Valores medios ± error estándard de la variación de la presión arterial sistólica en ratas SHR a distintos tiempos tras la administración de agua, Captopril y de las leches fermentadas con E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827
Tiempo 2 h Tiempo 4 h Tiempo 6 h Tiempo 8 h Tiempo 24 h
Agua -10.69+4.70° -1 1.79±8.28c -13.73±7.25c -8.08±7.02c 3.92+3.52a
CECT 5727 -32.98±5.43ab -34.81±4.48b -28.79+4.45b -14.81+2.82bc 4.46±1.21a
CECT 5728 -24.62±4.58abc -34.81±4.84b -34.76±4.05b -18.43±4.05bc -1.86+1.413
CECT 5826 -27.67+3.79ab -32.62±4.10b -28.96±4.56b -21.42±3.58b 0.46± 1.47a
CECT 5827 -20.13±6.24bc -30.79±3.91b -26.92±4.20bc -13.71±1.89bc -1.82±4.03a
Captopril -36.08±4.52a -51.98±5.36a -54.19+5.1 Ia -35.44+4.70a 1.23± 1.49a
' ' ' La misma letra en la misma columna indica diferencias no significativas entre valores medios (P<0,05).
Tabla 5B
Valores medios ± error estándard de la variación de la presión arterial diastólica en ratas SHR a distintos tiempos tras la administración de agua, Captopril y de las leches fermentadas con E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826 y E. faecalis CECT 5827
Tiempo 2 h Tiempo 4 h Tiempo 6 h Tiempo 8 h Tiempo 24 h
Agua -3.19+2.78d -4.29±3.00b -8.62±3.30b -5.00±2.42b -0.88+1.04a
CECT 5727 -24.06±5.59ab -25.50+6.18a -27.36+7.2T -18.92±5.37a -0.04± 1.04a CECT 5728 -16.79±3.56bc -27.38+3.35a -24.04±3.24a -16.98+2.46 ab 0.27±1.33a CECT 5826 -7.87±3.86cd -24.08±4.70a -27.73±3.93a -20.02+4.29a 1.17±0.62a CECT 5827 -15.10±4.02bc -30.49±5.14a -24.73+4.22a -16.10±1.39 ,ab 1.66+ 1.32a Captopril -28.29+2.40a -34.90±5.34a -28.63±5.77a -26.67±7.94a 1.37±1.02a a, b, c La misma letra en la misma columna indica diferencias no significativas entre valores medios ( <0,05). Las Figuras 6A y 6B muestran respectivamente los cambios de la PAS y de la PAD obtenidos en ratas WKY a distintos tiempos, tras la administración de los sueros de las leches fermentadas con E. faecalis (CECT 5727, CECT 5728, CECT 5826 y CECT 5827). También se incluyen los resultados obtenidos tras la administración de Captopril. Puede apreciarse que ni las leches fermentadas, ni el Captopril, modificaron la PAS o la PAD de los animales tratados; no observándose diferencias significativas cuando se compararon para cada tiempo estudiado mediante el test LSD. Estos resultados permiten descartar posibles efectos indeseables de los productos fermentados ensayados sobre la presión arterial de sujetos normotensos. Las Figuras 7A y 7B muestran, respectivamente, los cambios de la disminución de la
PAS y de la PAD obtenida en ratas SHR a distintos tiempos, tras la administración del péptido SEQ. ID. N°: 1, a una dosis de 2 mg/kg de peso corporal. Se puede observar que la administración de dicha dosis de ese péptido ocasiona una disminución significativa de la PAS en estos animales. La disminución de la PAS fue ya muy acusada 2 horas después de la administración, obteniéndose los valores menores de PAS 4 horas después de la administración del péptido. El péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 fue capaz de disminuir aún más la PAD de las ratas SHR que la PAS de estos animales. Además, su efecto sobre la PAD de las ratas SHR fue muy rápido y, 2 horas después de su administración, se observaron los valores menores de esta variable (PAD). Cabe resaltar que las disminuciones máximas de la PAS y de la PAD producidas por el péptido, fueron incluso mayores que las disminuciones máximas de estas variables producidas por las leches fermentadas ensayadas (representadas en las Figuras 5A y 5B). Sin embargo, 8 horas después de la administración del péptido, las ratas SHR habían recuperado valores de PAS y de PAD semejantes a los que tenían estos animales antes de su administración. Estos resultados demuestran que el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1 tiene un claro y pronunciado efecto antihipertensivo que, tras su administración aguda, aparece y desaparece antes que el efecto antihipertensivo de las leches fermentadas que lo contienen.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Enterococcus faecalis depositada en la CECT seleccionada entre la cepa identificada como E. faecalis CECT 5727, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5728, la cepa identificada como E. faecalis CECT 5826 y la cepa identificada como E. faecalis CECT 5827.
2. Una preparación bacteriana que contiene una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas.
3. Preparación bacteriana según la reivindicación 2, que contiene, además, uno o más microorganismos diferentes.
4. Preparación bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en forma de polvo liofilizado o en una cápsula.
5. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas en la industria alimentaria.
6. Un producto alimentario que comprende una cepa de Enterococcus faecalis según la reivindicación 1 , o una preparación bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o preparado utilizando dicha cepa o preparación bacteriana.
7. Producto alimentario según la reivindicación 6, seleccionado entre un producto lácteo, opcionalmente fermentado y/o sometido a un tratamiento térmico, y una bebida.
8. Producto alimentario según la reivindicación 7, seleccionado entre un producto lácteo fermentado y pasteurizado, una bebida con suero lácteo, una bebida de frutas y una cerveza.
9. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas como sustancia terapéutica.
10. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas como sustancia terapéutica para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.
11. Empleo según la reivindicación 10, en el que dicho desorden asociado con la hipertensión arterial se selecciona entre hipertrofia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas.
12. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas en la obtención de péptidos bioactivos.
13. Empleo de una cepa de E. faecalis seleccionada entre E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas en la obtención de péptidos con actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina y/o con actividad antihipertensiva.
14. Empleo según la reivindicación 12 ó 13, en el que dichos péptidos se seleccionan del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2,
SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus mezclas.
15. Un procedimiento para producir un péptido bioactivo que comprende fermentar un sustrato que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo con una cepa de E. faecalis y, si se desea, aislar el péptido bioactivo y/o convertirlo en un derivado y/o en una sal farmacéuticamente aceptable.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho péptido bioactivo es un péptido con actividad IECA y/o con actividad antihipertensiva.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho péptido bioactivo se selecciona del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1 , SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha cepa de E. faecalis se selecciona del grupo formado por E. faecalis CECT 5727, E. faecalis CECT 5728, E. faecalis CECT 5826, E. faecalis CECT 5827 y sus mezclas.
19. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho sustrato a fermentar es una fuente de proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos, que comprende una o más proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos que contienen la secuencia de aminoácidos de dicho péptido bioactivo.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho sustrato es de origen animal, vegetal o procedente de un microorganismo.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene una o más proteínas lácteas, o un extracto proteico de soja.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicho sustrato comprende leche o un producto lácteo, opcionalmente fermentado, que contiene caseína.
23. Un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID.
N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados y sus sales farmacéuticamente aceptables y por los derivados y sales farmacéuticamente aceptables del péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1.
24. Una composición que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
25. Una composición farmacéutica que comprende un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
26. Una composición farmacéutica antihipertensiva que comprende, al menos, un péptido antihipertensivo seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en la que dicho péptido es el péptido identificado por la SEQ. ID. N°: 1.
28. Empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la hipertensión arterial en todas sus formas en un ser humano o en un animal, y para el tratamiento y/o la prevención de cualquier desorden asociado con la hipertensión arterial en un ser humano o en un animal.
29. Empleo de un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención en un ser humano o en un animal de un desorden asociado con la hipertensión arterial seleccionado entre hipertrofia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas.
30. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29, en donde dicho medicamento se administra por vía oral.
31. Un producto alimentario funcional que comprende un producto alimentario y un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1,
SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
32. Producto alimentario funcional según la reivindicación 31, en el que dicho producto alimentario comprende bebidas, alimentos en infusión, salsas, condimentos, aliños para ensaladas, zumos de frutas, jarabes o siropes, postres, helados, productos congelados suaves, dulces o chicles.
33. Producto alimentario funcional según la reivindicación 31 ó 32, que comprende, además, una o más sustancias nutricionales.
34. Producto alimentario funcional según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que dicho producto alimentario funcional es sustancialmente líquido.
35. Producto alimentario funcional según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que dicho producto alimentario funcional es sustancialmente sólido.
36. Producto alimentario funcional según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que dicho producto alimentario funcional es una gelatina.
37. Producto alimentario funcional según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que dicho producto alimentario funcional es un producto lácteo.
38. Un aditivo alimentario que comprende un péptido seleccionado entre los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
39. Un suplemento alimentario que comprende un péptido seleccionado entre los péptidos identificados por la SEQ. ID. N°: 1, SEQ. ID. N°: 2, SEQ. ID. N°: 3, SEQ. ID. N°: 4, SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 6, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, sus derivados, sus sales farmacéuticamente aceptables, y sus mezclas.
40. Un método para el tratamiento y/o profilaxis de la hipertensión arterial de un sujeto seleccionado entre un ser humano y un animal, o para el tratamiento y/o la prevención de un desorden asociado con la hipertensión arterial, seleccionado entre hipertrofia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, accidentes cerebrovasculares, retinopatía, insuficiencia renal progresiva, aneurismas disecantes, enfermedad coronaria y enfermedades vasculares periféricas, que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica antihipertensiva según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27.
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