ES2291417T3 - Metodo para preparar un agente antihipertensor que contiene un dipeptido como ingrediente activo. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un agente antihipertensor, comprendiendo el agente antihipertensor una cantidad eficaz de péptidos seleccionados del grupo que consta de un dipéptido Tyr-Pro, una sal farmacéuticamente aceptable del dipéptido Tyr-Pro, y mezclas de los mismos, comprendiendo dicho método las etapas de: cultivar bacterias de ácido láctico del género Lactobacilo en un medio que contiene un péptido y/o proteína que incluye una secuencia de aminoácido Tyr-Pro, para obtener un líquido cultivado que contiene dipéptido Tyr-Pro; centrifugar dicho líquido cultivado que contiene dipéptido Tyr-Pro para obtener un líquido sobrenadante; y purificar dicho líquido sobrenadante con una resina de inversión de fase por absorción y elución del dipéptido Tyr-Pro, aumentando con ello la concentración del dipéptido.
Description
Método para preparar un agente antihipertensor
que contiene un dipéptido como ingrediente activo.
La presente invención se refiere a un método
para preparar un agente antihipertensor que contiene como
ingrediente activo un dipéptido que tiene efecto antihipertensor,
agente que se puede utilizar para medicinas, alimentos para usos
específicos de la salud y alimentos sanos, y agente que exhibe el
efecto incluso en pequeñas dosis.
La enzima que convierte la angiotensina (ECA),
que tiene estrecha relación con la manifestación de la hipertensión,
existe principalmente en los pulmones y en las células
angioendoteliales. Se sabe que la ECA exhibe un fuerte efecto
hipertensor, escindiendo la angiotensina I producida por renina,
para producir angiotensina II, un péptido bioactivo que provoca
contracción del músculo liso de los vasos sanguíneos. Además, la ECA
degrada e inactiva la bradiquinina que tiene efecto
antihipertensor. Por consiguiente, la ECA tiene efecto hipertensor
y se cree, así, que se puede reducir la presión sanguínea inhibiendo
la actividad de esta enzima.
Se han encontrado sustancias que tienen
capacidad inhibidora de ECA entre una diversidad de productos
naturales y productos sintéticos. Algunas sustancias de este tipo
ya se han puesto en uso práctico como agentes antihipertensores.
Por ejemplo, captopril
(D-2-metil-3-mercaptopropanoil-L-prolina)
es un producto químico sintético bien conocido que tiene capacidad
inhibidora de ECA. Sin embargo, se tiene que prestar especial
atención, en todo momento, a los aspectos de seguridad de estos
productos químicos sintéticos.
Como productos naturales, se ha reseñado que
diversos péptidos anti ECA están contenidos en las proteínas de
leche, las proteínas de las semillas de soja o las proteínas de
pescado. Estas sustancias naturales inhibidoras de ECA se proponen
para uso práctico como agentes antihipertensores que tienen baja
toxicidad y gran seguridad. Sin embargo, la mayoría de estos
péptidos antihipertensores están contenidos apenas en una pequeña
cantidad en los productos naturales de este tipo y, por lo tanto,
no se puede esperar un efecto suficiente en una ingesta oral
práctica. Además, la mayoría de los péptidos no tiene efecto
antihipertensor fuerte, incluso si los péptidos tienen una fuerte
actividad inhibidora de ECA.
Recientemente, se ha elaborado un informe sobre
dos tripéptidos que tienen una fuerte actividad inhibidora de ECA,
Val-Pro-Pro e
Ile-Pro-Pro, derivados de leche
fermentada por la bacteria del ácido láctico (J. Dairy Sci.
78:777-783). Además, se ha confirmado el fuerte
efecto antihipertensor de estos tripéptidos en ratas que padecían
hipertensión espontáneamente (RHE) (J. Dairy Sci.
78:1253-1257). Sin embargo, como los tripéptidos
son producidos por proteinasa que es producida por la bacteria del
ácido láctico a medida que se desarrolla en la leche la
fermentación del ácido láctico, la cantidad resultante de
tripéptidos tiende a variar dependiendo de las condiciones la
fermentación. Es difícil obtener, así, los tripéptidos en una
cantidad estable.
También se ha reseñado que el yogurt producido
por fermentación de leche como materia prima con la bacteria del
ácido láctico tiene un efecto antihipertensor (solicitud de patente
japonesa abierta a consulta por el público nº
95-123977). Sin embargo, la sustancia activa del
efecto antihipertensor todavía es desconocida.
Yamamoto (1997) Biopolimers 43(2),
129-34 revisa diversos péptidos inhibidores de la
enzima que convierte angiotensina I que se han derivado de
materiales alimenticios y de la hidrólisis enzimática de proteínas.
En particular, se consideran péptidos derivados de caseína de leche
por la acción del sistema proteolítico de bacterias de ácido
láctico. Se dice que estos péptidos exhiben efectos
antihipertensores en ratas que padecen hipertensión
espontáneamente.
Yamamoto y col. (1994) J Diary Sci.
77(4), 917-22 describe leche fermentada con
Lactobacilo helvetico que se dice que demuestra actividad
antihipertensora en ratas que padecen hipertensión espontáneamente.
En contraposición, no se dice que tenga esta actividad la leche
fermentada con una variante de L. helvetico defectuosa en
actividad de proteinasa. Los autores concluyen que los péptidos
liberados desde caseína por proteinasa en el medio de cultivo
poseen los efectos antihipertensores en ratas que padecen
hipertensión espontáneamente.
El documento EP0737690A describe un agente
antihipertensor que contiene una cantidad eficaz de un péptido que
tiene una secuencia de aminoácidos
Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln
y/o un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
Tyr-Lis-Val-Pro-Gln-Leu.
También se describe un procedimiento para preparar este agente
antihipertensor fermentando un material de partida de leche animal
con un microorganismo, por ejemplo una bacteria de ácido láctico
del género Lactobacilo.
Yamamoto y col. (1994) Biosci. Biotech.
58(4), 776-78 describe leche fermentada con
especies de Lactobacilo que se dice que demuestra actividad
antihipertensora en ratas que padecen hipertensión espontáneamente.
En contraposición, no se dice que tenga esta actividad la leche
fermentada con otras especies Lactobacilos.
El documento DE3047596 describe propiedades
farmacológicas del dipéptido Tyr-Pro,
específicamente en el sistema nervioso central de ratas.
\newpage
Por lo tanto, se desea proporcionar un péptido
natural antihipertensor, que se especifica como una sustancia
activa, que se pueda producir de manera industrialmente estable, que
sea eficaz en pequeñas dosis y que tenga mayor seguridad.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para producir un agente antihipertensor para
ser usado en medicinas, alimentos para usos específicos de la salud
y alimentos sanos, que es muy seguro y que es eficaz en
dosificación oral.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para producir un agente antihipertensor que
es eficaz incluso en dosificación oral baja, purificando el agente
antihipertensor anteriormente mencionado.
Según la presente invención, se proporciona un
método para preparar un agente antihipertensor, comprendiendo el
agente antihipertensor una cantidad eficaz de péptidos seleccionados
del grupo que consta de un dipéptido Tyr-Pro, una
sal farmacéuticamente aceptable del dipéptido
Tyr-Pro, y mezclas de los mismos, comprendiendo
dicho método las etapas de: cultivar bacterias de ácido láctico del
género Lactobacilo en un medio que contiene un péptido y/o
proteína que incluye una secuencia de aminoácido
Tyr-Pro, para obtener un líquido cultivado que
contiene Tyr-Pro; centrifugar dicho líquido
cultivado que contiene dipéptido Tyr-Pro para
obtener un líquido sobrenadante; y purificar dicho líquido
sobrenadante con una resina de inversión de fase por absorción y
elución del dipéptido Tyr-Pro, aumentando con ello
la concentración del dipéptido.
El agente antihipertensor de la presente
invención contiene una cantidad eficaz de dipéptido
Tyr-Pro y/o una sal del mismo. La sal puede estar
representada por una sal farmacéuticamente aceptable, incluyendo una
sal ácida inorgánica, tal como hidroclorato, sulfato o fosfato, y
una sal ácida orgánica, tal como citrato, maleato, fumarato,
tartrato o lactato.
El agente antihipertensor de la presente
invención que contiene el dipéptido Tyr-Pro y/o la
sal del mismo como ingrediente activo se produce cultivando
bacterias de ácido láctico del género Lactobacilo, en un
medio que contiene un péptido y/o una proteína que incluye la
secuencia de aminoácido Tyr-Pro, obteniendo con
ello un líquido cultivado que contiene el dipéptido
Tyr-Pro. Esto es, el dipéptido
Tyr-Pro se obtiene por tratamiento de cultivo del
medio con bacterias de ácido láctico del género
Lactobacilo.
Las bacterias de ácido láctico del género
Lactobacilo pueden incluir, por ejemplo, Lactobacilo
helvético, Lactobacilo delbruekii subesp. Bulgárico y
Lactobacilo acidófilo. De éstos, el Lactobacilo
helvético es especialmente preferido.
El medio no es particularmente limitado a
condición de que dicho medio contenga un péptido y/o una proteína
que incluya la secuencia de aminoácido Tyr-Pro y
pueda incluir medios derivados de diversos materiales alimenticios
que contengan proteínas de leche animal tales como leche entera
animal, leche desnatada y caseína de leche animal, y materiales
alimenticios que contengan proteínas vegetales tales como maíz,
proteína de maíz, trigo, proteína de trigo, semilla de soja,
semilla de soja deslipidizada y proteína de semilla de soja; y
medios comercialmente disponibles para bacterias de ácido láctico
tales como caldo de cultivo de hígado de Briggs y caldo de cultivo
MRS. Además, el medio también puede ser una solución acuosa que
contenga materiales alimenticios naturales que contengan proteínas
de leche animal y/o proteínas vegetales que incluyan la secuencia de
aminoácido Tyr-Pro, a los que se han añadido
opcionalmente otros medios para las bacterias de ácido láctico,
extracto de levadura, vitaminas o minerales.
Los cultivos de bacterias de ácido láctico se
pueden realizar añadiendo un iniciador pre-cultivado
de bacterias de ácido láctico al medio que ha sido previamente
esterilizado por calentamiento y ha sido enfriado a una temperatura
predeterminada para incubación. La cantidad de inoculación del
iniciador de bacterias de ácido láctico puede ser preferiblemente
de 10^{5} a 10^{7} células de bacterias de ácido láctico/ml de
medio. La temperatura para la incubación es habitualmente 20ºC a
50ºC y preferiblemente 30ºC a 45ºC. El tiempo de la incubación es
habitualmente 3 a 48 horas y preferiblemente 6 a 24 horas.
Particularmente, se prefiere realizar el cultivo en un medio que
tenga un pH en el intervalo de 3,5 a 7, más preferiblemente de 4 a
5, para realizar eficazmente el cultivo de las bacterias de ácido
láctico. Además, se prefiere realizar el cultivo a pH estable
manteniendo el pH en el intervalo de 4 a 7. El cultivo se puede
terminar, sin restricción, cuando el número de bacterias de ácido
láctico excede de 10^{8} células/ml.
Además, el líquido de cultivo que contiene
dipéptido Tyr-Pro obtenido por el método
anteriormente mencionado se puede centrifugar y el líquido
sobrenadante resultante se puede someter a un tratamiento de
purificación con una resina de inversión de fase, para obtener un
agente antihipertensor en el que se aumenta el contenido en
ingrediente activo, dipéptido Tyr-Pro.
La centrifugación se puede realizar
preferiblemente, por ejemplo, de 5.000 a 20.000 rpm durante 1 a 10
minutos. La centrifugación también se puede realizar en una
centrifugadora.
El tratamiento de purificación con una resina de
inversión de fase se puede realizar por absorción y elución del
dipéptido con una resina de inversión de fase y/o por cromatografía
de inversión de fase, aumentando con ello la pureza del dipéptido
Tyr-Pro. La absorción y la elución con la resina de
inversión de fase se puede realizar, por ejemplo, tratando el
líquido de cultivo por un método de columna o por un método por
cargas con una resina tal como "Preparado 18" (fabricado por
WATERS INC.) como resina de inversión de fase, y eluyendo luego la
fracción absorbida con un disolvente polar, tal como agua, metanol,
etanol, propanol-1, propanol-2 o
acetonitrilo, preferiblemente una solución acuosa que contiene 20%
v/v de acetonitrilo, seguidas de evaporación del disolvente, para
concentrar el dipéptido Tyr-Pro.
El tratamiento por cromatografía de inversión de
fase se puede realizar, sin limitación, por cromatografía líquida
de elevado rendimiento (HPLC) de inversión de fase públicamente
conocida. La HPLC se puede realizar por un método de gradiente
lineal usando disolventes similares a los detallados para la
absorción y elución con la resina de inversión de fase, para
obtener un dipéptido Tyr-Pro con elevada pureza. El
tratamiento por cromatografía de inversión de fase se puede repetir
varias veces para aumentar más la pureza del dipéptido
Tyr-Pro.
El agente antihipertensor obtenido por el método
de la presente invención es habitualmente una mezcla de péptidos y
puede contener péptidos distintos del dipéptido
Tyr-Pro. Para el uso como alimentos y bebidas, se
pueden usar directamente los productos purificados del líquido de
cultivo que contienen el dipéptido Tyr-Pro.
Alternativamente, el agente se puede pulverizar por secado por
liofilización, secado por atomización, o secado por una secadora de
tambor antes de uso.
La cantidad eficaz de agente antihipertensor
varía dependiendo de la edad y estado del paciente y está en el
intervalo de 0,05 a 10 mg/kg de peso corporal/día. Es preferible
administrar de 0,3 a 3,0 mg/kg de peso corporal/día. Se puede
esperar un efecto suficiente si la dosis no es menor de 0,05 mg/kg
de peso corporal/día. Si la dosis no es más de 10 mg/kg de peso
corporal/día el efecto se puede exhibir de modo eficaz.
Se administró el dipéptido
Tyr-Pro, por vía oral, a ratas WKY que presentaban
una presión sanguínea normal (de 18 semanas de edad, peso corporal
de 320 g, n = 5) en una cantidad de 10 mg/kg de peso corporal/día,
continuamente durante un mes, y no se encontró anormalidad alguna
en el comportamiento, aspecto, presión sanguínea ni en la autopsia
de las ratas. Durante mucho tiempo, los seres humanos han comido
alimentos fermentados con bacterias de Lactobacilo y se
supone por lo tanto que el Tyr-Pro contenido en el
agente antihipertensor de la presente invención no tiene problemas
de seguridad.
Dado que el agente antihipertensor de la
presente invención contiene dipéptido Tyr-Pro como
ingrediente activo, éste puede reducir la presión sanguínea en una
dosis significativamente baja en comparación con los péptidos
antihipertensores derivados de los materiales alimenticios reseñados
hasta la fecha. Además, el agente antihipertensor de la presente
invención es muy seguro, y se puede usar por ello como medicina,
alimentos para usos específicos de la salud y alimentos sanos.
Dado que el método de la presente invención
incluye el cultivo de bacterias de ácido láctico en un medio que
contiene un péptido y/o una proteína, se puede producir fácilmente a
bajo coste el agente antihipertensor que contiene como ingrediente
activo un dipéptido Tyr-Pro que tiene una gran
seguridad a partir de un material tal como los péptidos y las
proteínas naturales.
La presente invención se explicará con más
detalle con referencia a los Ejemplos que se dan solamente para
ilustración y no tienen la intención de limitar la invención.
Preparación del Ejemplo
1
Se inocularon 10 kg de solución acuosa de leche
desnatada en polvo al 9% con 300 g de leche fermentada que se había
hecho fermentar con Lactobacilo helvético CPN4 (FERM
BP-4835) como iniciador de bacterias de ácido
láctico. La solución inoculada se incubó a 37ºC durante 8 horas.
Cuando se formó el coágulo y el pH llegó a 4,2 se terminó la
incubación y se enfrió la solución. La solución obtenida de leche
fermentada contenía 1,0 mg/100 g de dipéptido
Tyr-Pro.
Se centrifugaron 10 kg de la solución obtenida
de leche fermentada a 10.000 rpm, durante 10 minutos, para
recuperar 8,4 kg de suero. El suero contenía 1,1 mg/100 g de
dipéptido Tyr-Pro.
La cepa de L. helvético CPN4 pertenece a
L. helvético y se depositó en el National Institute of
Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and
Technology el 17 de Octubre de 1994 y tiene concedido el número de
registro FERM BP-4835. Se ha aceptado el registro
FERM BP-4835 como depósito acogido al Tratado de
Budapest respecto al Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para Fines de los Procedimientos de Patentes. Todas
las restricciones sobre la disponibilidad para el público de FERM
BP-4835 se eliminarán irrevocablemente con la
concesión de la patente.
Se sometieron 120 mg del suero obtenido en la
Preparación del Ejemplo 1 a un tratamiento de absorción a través de
10 cartuchos sep-pak (WATERS INC.) y
subsiguientemente a un tratamiento de elución bajo las diversas
condiciones que se muestran en la Tabla 1 con un acetonitrilo que
contenía 0,1% en peso de ATF (ácido trifluoracético) (solución B)
diluido con una solución acuosa que contenía 0,1% en peso de ATF
(solución A). Una muestra eluida sin absorción y las muestras
eluidas bajo cada una de las condiciones se definieron como
Fracciones 1 a 6, respectivamente. Se secaron por liofilización
cada una de las fracciones y se disolvieron en 40 ml de suero
fisiológico salino para preparar las Muestras 1 a 6.
El suero obtenido antes del fraccionamiento y
las Muestras 1 a 6 se administraron con una sonda estomacal a ratas
que padecían hipertensión espontáneamente (RHE: de CHARLES RIVES
JAPAN INC., cinco ratas por grupo, de 20 a 22 semanas de edad,
machos) en una cantidad de 1 ml/animal. Se comparó el cambio en la
presión sanguínea máxima después de seis horas con la presión del
grupo de control al que se había administrado suero fisiológico
salino. La medición de la presión sanguínea se realizó por el método
de la abrazadera en la cola usando un aparato de medición de
presión sanguínea no invasor (nombre comercial "PE 300", NARKO
BIO-SYSTEMS, CO., LTD.). Como resultado, se observó
un significativo efecto antihipertensor en la Muestra 2 como se
expone en la Tabla 1. Por lo tanto, se encontró que la Fracción 2
era activa.
\vskip1.000000\baselineskip
Subsiguientemente, la Muestra 2 se sometió a un
tratamiento de elución por cromatografía líquida de elevado
rendimiento (HPLC) de inversión de fase bajo las siguientes
condiciones según el tiempo de elución que se expone en la Tabla 2,
para fraccionar adicionalmente la Muestra 2 en cuatro Fracciones
2-1 a 2-4. La cantidad de
aplicación de la Muestra 2 en una elución fue de 1 ml, y se repitió
15 veces la elución. Esto es, se fraccionó un total de 15 ml de la
Muestra 2.
- Bomba, bomba L6200 INTELIGENTE fabricada por HITACHI LTD.;
- Detector, detector L4000 UV fabricado por HITACHI LTD.;
- Columna, WATERS MICROBONDASPHERE 5\muC18 fabricada por NIHON MILLIPORE LTD., Tokio, Japón;
- Eluyente, Solución A (solución acuosa al 0,1% en peso de ácido trifluoracético (ATF)); y Solución B (acetonitrilo que contiene 0,1% en peso de ATF);
- Gradiente, gradiente lineal desde 0% de la Solución B (100% de la Solución A) a 40% de la Solución B (60% de la Solución A) (0 a 60 minutos)
- Caudal, 1 ml/min.
\newpage
Las Fracciones 2-1 a
2-4 se secaron por liofilización, y se disolvieron
en 15 ml de suero fisiológico salino para preparar las Muestras
2-1 a 2-4. Estas muestras se
administraron por vía oral a ratas (RHE) con una sonda estomacal en
una cantidad de 1 ml/animal y se comparó el cambio en la presión
sanguínea máxima después de seis horas con la presión del grupo de
control al que se había administrado suero fisiológico salino, de la
misma manera que antes, para examinar el efecto antihipertensor.
Como resultado, se observó un significativo efecto antihipertensor
en la Fracción 2-2 como se expone en la Tabla 2. Por
lo tanto, se encontró que la Fracción 2 era una fracción ac-
tiva.
tiva.
\vskip1.000000\baselineskip
1 ml de la Muestra 2-2 se
sometió a un tratamiento de elución por HPLC en las mismas
condiciones que en el caso anterior excepto en las siguientes
condiciones que se mencionan a continuación.
- Gradiente, gradiente lineal desde 5% de la Solución B (95% de la Solución A) a 20% de la Solución B (80% de la Solución A) (0 a 60 minutos).
Esta elución se repitió diez veces, esto es, se
sometieron a elución 10 ml en total de la Muestra
2-2.
Cada una de las fracciones obtenidas
2-2-1 a
2-2-5 se secaron por liofilización,
y se disolvieron en 10 ml de suero fisiológico salino para preparar
la Muestras 2-2-1 a
2-2-5. Estas muestras se
administraron por vía oral a ratas (RHE) con una sonda estomacal en
una cantidad de 1 ml/animal, y se comparó el cambio en la presión
sanguínea máxima después de seis horas con la presión del grupo de
control al que se había administrado suero fisiológico salino, de
la misma manera que antes, para examinar el efecto antihipertensor.
Como resultado, se observó un significativo efecto antihipertensor
en la Fracción 2-2-2 como se expone
en la Tabla 3.
1 ml de la Muestra
2-2-2 se sometió a un tratamiento de
elución por HPLC en las mismas condiciones que las del tratamiento
de la Muestra 2-2 para la purificación de la
muestra, y se analizó la secuencia de aminoácidos de la misma desde
el término-N con el "secuenciador automático de
proteínas PPSQ-10 SYSTEM" fabricado por SHIMADZU
CO. Como resultado, se confirmó que contenía la secuencia de
aminoácidos Tyr-Pro. Alternativamente, el péptido
purificado se hidrolizó con ácido clorhídrico 6N a la temperatura de
105ºC durante 24 horas, y se realizó el análisis de aminoácidos con
un sistema de análisis de aminoácidos de elevada velocidad (nombre
comercial "Amino Acid Analysis System" fabricado por NIHON
BUNKOU KOUGYO Co.). Como resultado, se confirmó que los aminoácidos
Tyr y Pro estaban contenidos en cantidades molares iguales. Por lo
tanto, se concluyó que el péptido obtenido era un dipéptido que
tenía la secuencia Tyr-Pro.
Preparación del Ejemplo
2
Se inocularon 100 kg de solución acuosa de leche
desnatada en polvo al 9% con 3 kg de leche fermentada que se había
hecho fermentar con L. helvético CPN4 (FERM
BP-4835), y se cultivaron a 37ºC durante 20 horas.
La solución de leche fermentada así obtenida se trató en una
separadora centrífuga Sharpless a 10.000 rpm, para recuperar 78 kg
de suero. Subsiguientemente, se aplicó el suero a una columna de
relleno Preparative C18 (de 3 litros de capacidad, fabricada por
WATERS INC.). Se lavó luego la columna con 10 kg de solución acuosa
de acetonitrilo al 5%, seguida de un tratamiento de elución con 5 kg
de solución acuosa de acetonitrilo al 10%. La fracción eluida dio
1186 mg de producto secado por liofilización. Este producto secado
por liofilización contenía 652 mg de dipéptido
Tyr-Pro. La pureza del dipéptido
Tyr-Pro era de 55%.
Se examinó el efecto antihipertensor de la
solución de leche fermentada obtenida en la Preparación del Ejemplo
1. La medición del efecto antihipertensor se realizó utilizando
ratas (RHE) según el método del Ejemplo 1. Se administraron por vía
oral a ratas (RHE) 4 ml/animal (12 ml/kg de peso corporal) de la
solución de leche fermentada o de una solución de leche no
fermentada, y se midió la presión sanguínea máxima después de seis
horas. Como resultado, se confirmó el efecto antihipertensor. Los
resultados se exponen en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó en fase sólida el péptido
antihipertensor Tyr-Pro identificado en el Ejemplo 1
con un sintetizador automático de péptidos PPSM-8
fabricado por SHIMADZU CO. El tiempo de elución del péptido
Tyr-Pro obtenido por HPLC fue el mismo que el del
péptido purificado en el Ejemplo 1.
El efecto antihipertensor del péptido
sintetizado se confirmó por el siguiente método. Se administraron
por vía oral a ratas (RHE) 0,05, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 ó 10 mg/kg de
peso corporal del péptido sintetizado Tyr-Pro, se
midió la presión sanguínea máxima después de seis horas y se comparó
con la presión del grupo de control al que se había administrado
suero fisiológico salino de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los
resultados se exponen en la Tabla 5. A partir de los resultados de
la Tabla 5, se confirmó que el efecto depende de la dosis en el
intervalo de 0,05 a 3,0 mg/kg de peso corporal.
Claims (5)
1. Un método para preparar un agente
antihipertensor, comprendiendo el agente antihipertensor una
cantidad eficaz de péptidos seleccionados del grupo que consta de
un dipéptido Tyr-Pro, una sal farmacéuticamente
aceptable del dipéptido Tyr-Pro, y mezclas de los
mismos, comprendiendo dicho método las etapas de:
- cultivar bacterias de ácido láctico del género Lactobacilo en un medio que contiene un péptido y/o proteína que incluye una secuencia de aminoácido Tyr-Pro, para obtener un líquido cultivado que contiene dipéptido Tyr-Pro;
- centrifugar dicho líquido cultivado que contiene dipéptido Tyr-Pro para obtener un líquido sobrenadante; y
- purificar dicho líquido sobrenadante con una resina de inversión de fase por absorción y elución del dipéptido Tyr-Pro, aumentando con ello la concentración del dipéptido.
2. El método según se describe en la
reivindicación 1, en el que dicho medio se selecciona del grupo que
consta de leche entera animal, leche desnatada animal, caseína de
leche animal, maíz, proteína de maíz, trigo, proteína de trigo,
semilla de soja, semilla de soja deslipidizada, proteína de semilla
de soja, caldo de cultivo de hígado de Briggs, caldo de cultivo MRS
y mezclas de los mismos.
3. El método según se describe en la
reivindicación 1, en el que dichas bacterias de ácido láctico del
género Lactobacilo es L. helvético.
4. El método según se describe en la
reivindicación 1, en el que dicha etapa de cultivo se realiza de 20
a 50ºC durante 3 a 48 horas.
5. El método para preparar el agente
antihipertensor según se describe en la reivindicación 1, en el que
dicha etapa de cultivo se realiza en un medio que tiene un pH en el
intervalo de 3,5 a 7.
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