DE3047596A1

DE3047596A1 - Pharmakologisch aktive dipeptide

Info

Publication number: DE3047596A1
Application number: DE19803047596
Authority: DE
Inventors: Victor Dipl.- Chem. 8000 München Brantl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-12-17
Filing date: 1980-12-17
Publication date: 1982-07-22

Description

PHARMAKOLOGISCH AKTIVE DIPEPTIDE
Beschreibung Die Erfindung berifft neue pharmakologisch aktive Dipeptide,Verfahren zu deren Herstellung,sowie nach diesen verfahren hergestellte Dipeptide.
Aufgabe der Erfindung ist es,neuartige Peptide zu schaffen, welche in der Laye sind pharmako logische Wi.rkul cn,insbesondere eine neuroleptische,auszulösen.
Die Aufgabe der Erfindung ist dadurch gelöst,daß die Peptide die Aminosäuresequenz Tyr-Pro aufweisen.(Tyr steht für die N-terminale Aminosäure Tyrosin,Pro steht für die C-terminale Aminosäure Prolin).
Diese erfindungsgemäßen Peptide weisen insbesondere den Vorteil auf,daß diese besonders kostengünstig herzustellen sind.
Weiterhin ist von Vorteil,daß diese Dipeptide aufgrund ihres kleinen Molekulargewichts vermehrt die Blut/Hirn schranke überwinden können,was bei zentral wirksamen Stoffen von großer Bedeutung ist.Größere Peptide sind wesentlich teuerer herzustellen und dringen nur in einem geringerem Ausmaß in das Zentralnervensystem ein.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt das N-terminale Tyrosin in der folgenden Formel vor: wobei im einzelnen bedeuten: R1 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, R2 für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe, R3 für Wasserstoff,eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, oder eine R4CO-Gruppe,wobei R4 für einen gesättigten oder ungesättigten,geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 17 C-Atomen,einen Phenylrest oder einen Phenylalkylrest mit 7 bis 12 C-Atomen,wobei die Phenylreste durch 1 oder 2 Substituenten aus der Reihe Halogen,Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen substituiert sein können,wobei die R30-Gruppe sich im meta- oder para-Stellung zum Rest befindet, W für Wasserstoff,Alkyl mit 1 bis 5 0-Atomen, Alkenyl mit 3 bis 5 C-Atomen,Cyclopropyimcthyl, Cyclobutylmethyl,R4CO-Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt das C-terminale Prolin in der folgenden Form vor: wobei R7 für Wasserstoff,eine Hydroxygruppe,eine Alkyl-oder Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht, - eine oder mehrere Ketogruppen in den Ring eingeführt sind, - der Ring als Dehydroprolin vorliegt.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegen beide Aminosäuren der Dipeptide in der stereochemischen L-Form vor.
Eine der Aminosäuren kann nach einer anderen Weiterbildung in der stereochemischen D-Form vorliegen.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Dipeptide an ihrem C-terminalen Ende als Amid,Ester oder Hydrazid vorliegen.
Hierbei können diese funktionellen Gruppen an der SäureslU}l)i.erllncJ des C-ter.m.inus durch Alkylgruppen verschiedencr Kettenlänge substituiert sein Nach einer Weiterbildung der Bri.indung werden die erfindungsgemäßen Dipeptide nach einem in der Peptidchemie und/oder in der Natur üblichen Verfahren synthetisiert.
Unter üblichen Verfahren wird das Einführen sowie das Abspalten von Schutzgruppen (z.B. der Schutz der Aminogruppe durch Carbobenzoxychlorid und das Abspalten derselben durch Hydrierung;der Schutz von Säuregruppen als Ester und deren späterer Hydrolyse) während der Synthese verstanden.Ublich sind ebenfalls Synthesen an Trägermaterial, wie z.B. Polystyrol.
Nach einer anderen Weiterbildung erfolgt das Knüpfen der Peptidbindungen zwischen den cinzelnell Amillol;iurerlllli.t dcll üblichen Methoden.
Nach einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung werden die Dipeptide nach der im Beispiel aufgeführten Methode synthetisiert.
Arzneimittel und Tierarzneimittel enthalten nach einer Weiterbildung der Erfindung die in den Ansprüchen 1-9 beschriebenen Dipeptide und/oder deren Derivate und/oder deren Säureadditionssalze.
Die Arzneimittel können insbesondere als Antipsychotika, Tranquilizer und/oder als Neuroleptika Verwendun(3 finden.
Die Arzneimittel kÖnnen übliche Trägermateriallen sowie Antioxidantien enthalten.Die Säureadditionssalze können vorzugsweise Hydrohalogenide,Lactate,Citratc,SulZate und/ oder Phosphate sein.Die Dosen sind je nach Applikationsart unterschiedlich.Als ungefähre Richtlinie sei hier eine Dosis für eine intravenöse Verabfolgung gegeben:O.05 bis 60 mg pro Kg Körpergewicht.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Peptide als Funktionsdiagnostika verwendet.
Nach einer anderen Weiterbildung werden die erfindungsgemäßen Dipeptide nach Kopplung an Thyroglobulin(oder andere makromolekulare Eiweißkörper) als Antigene zur Bildung voii Antikörpern im Säugestierorganismus CJcgen gegen die in den Ansprüchen 1-6 beschriebenen Peptide Verwendet werden und diese Antikörper wiederum zur Bestimmung der Konzentration derselben in Körpergeweben oder -flüssigkeiten dienen.
Hierzu wird das Peptid in üblicher Weise mit Carbodiimid an das Makromolekül gekoppelt und intracutan in die Rücken und Bauchhaut von Kaninchen injiziert.
Beispiel Zunächst wird auf die Synthese der erfindungsgemäßen Dipeptide eingegangen;daran anschließend wird die pharmakologische Wirkung beschrieben.
I. Synthese Die Peptidsynthese erfolgt mittels der Methode des gemischten Anhydrids,so wie diese von Tilak,M.A.,1970 in Tetrahedron Lettersw11,849-894, beschrieben wurde.
a) Bildung des gemischten Anhydrids.
629 mg (1.4 mmol) N,O,-di-Z-Tyrosin werden in 15 ml Dimethylformamid (DMF) unter Zusatz von 165il (1.4 mmol) N-Methylmorpholin gelöst und mit 175 yl (1.3 mmol) Chlorameisensäureisobutylester bei -150C 15 Minuten umgesetzt.
b) Vorbereitung der Aminokomponente.
129 mg L-Prolinmethylester (1 mmol) werden in 20 ml DMF unter Zusatz von 110 po (1 mmol) N-Methylmorpholin bei -15°C aufgelöst.
Die Kopplung der beiden Komponenten a erfolgt durch Vermischen derselben bei -150C und bei Belassen bei der gleichen Temperatur über Nacht.
c) Aufarbeitung Der 50 %ige Überschuß an gemischtem Anhydrid wird zerstört.Hierzu wird bei OOC der pH des Reaktionsproduktes mit wässriger,gesättigter KHC03-Lösung auf pH 8 eingestellt und 20 Minuten bei 0°C gerührt. Das Dipeptid wird mit gesättigter NaCl-Lösung gefällt und 5 Stunden bei 40C temperiert.Danach wird das Peptid durch mehrmaliges Ausschütteln mit 50-100 ml Ethylacetat extrahiert.Nach weiterem mehrmaligen Waschen mit kaltem Wasser wird die organische Phase am Rotationsverdampfer zum Trockenen gebracht.
d) Abspalten der Schutzgruppe.
Zur Abspaltung der Schutzgruppe durch Hydrierung wird der Rückstand aus c) in 30 ml Methanol gelöst und 100 mg Palladium auf Aktivkohle (Merck) zugegeben.Nach dem Verdrängen der Luft durch Stickstoff wird Wasserstoff in das Reaktionsgefäß eingeleitet,in welchem sich die Methanollösung befindet.Die Hydrierung wird bei 350C bis 50°C für ca. 3 bis 4 Stunden durchgeführt.Die Lösuny wird dann filtriert und zum Trockenen gebracht. Im Kolben zurück bleibt ein weißgelblicher Film e) Abspalten der Estergruppe am C-Terminus.
Das Produkt der Stufe d) kann ganz oder teilweise einer sauren Esterhydrolyse ullterwor.Et werden. (5. 7 N HCl,bei 37°C, für 7 Stunden, 2 mal durchgeführt).Die erfolgreiche Deblockierung wurde mittels Papierelektrophorese überprüft.
f) Vor der weiteren Reinigung wird der Rückstand in Wasser dest. aufgenommen,zentrifugiert und der wässrige Teil lyophilisiert.Die so gewonnenen Peptide können nun einer weiteren Reinigung zugeführt werden.
g) Nachreinigung inc nachfolgende Auftrennung des Reaktionsproduktes Illittels Gelfiltration auf einer Biogel P 2 (Biorad) <400 mesh,Durchmesser 20 mm'Länge 1170 mm,Flußgeschwindigkeit 12 ml pro Stunde,UV Absorptionsmessung bei 220/280 nm und einem Fraktionskollektor(je 20 min/Frak.) wurde durchgeführt.Die Fraktionen wurden entsprechend dem UV-Elutionsprofil gepoolt und auf ihre Aminosäurezusammensetzung hin untersucht.
h) Aminosäureanalyse Zur Spaltung wurde die Fraktionen (Teile hiervon) mit 6N HCl 24 Stunden unter Vakuum (1100C) erhitzt.Eine Aminosäureanalyse erbrachte bei der Fraktion mit der größten Menge an Material die richtige Aminosäurezusammensetzung: Tyr : 1;Pro : O.9.Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäurereste pro mol Peptid.Dies entsprach dem theoretischen Wert des gewünschten Peptids von Tyr :1;Pro : 1.Ein zusätzlich durchgeführter Abbau nach Edman zeigte die riciitige Aminosäuresequenz an. Somit ist das Peptid als hochrein zu betrachten.
II. Pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide.
Nach intracerebroventrikulärer Injektion von 50-500 µg (in 5-10 Y1 isotoner NaCl) des erfindungsgemäßen Peptids (Tyr-Pro) in das Ventrikelsystem von Ratten,(Präparation der Tiere siehe Herz und Bläsiy,in Endorphins in Mental Health Research,Usdin,I£d.,Mlcnillan Press, London,1979, Seite 269 ff.)zeigen diese Tiere eine Katalepsie,so wie vergleichbar,nach Injektion von 25-50 µg Haloperidol.Die Tiere werden für die Katalepsiemessung auf Holzklötze gesetzt,z.B. mit dem Kopf und den Vorderfüssen nach unten und die Hinterbeine auf dem 5 cm.hohen Klotz.Die Tiere verharren so in dieser "unnatürlichen" oder aufgezwungenen Position für mehr als 30 Sekunden.Ab 30 Sekunden wird der Effekt als Katalepsie betrachtet.Diese Effekte hielten für ca. 20 bis 55 Minuten an.

Claims

Ansprüche 1)'Pharmakologisch aktive Dipeptide der Formel: NH2-Tyr-Pro-OH, wobei NH2-Tyr die N-terminale Aminosäure Tyrosin und Pro-OH die C-terminale Aminosäure Prolin darstellen.
2) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-term.inalc c Tyrosin der allgemeinen Formel: vorliegt,wobei im einzelnen bedeuten: R1 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, R2 für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe, R3 für Wasserstoff,eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen oder eine R4CO-Gruppe,wobei R für einen 4 gesättigten oder ungesättigten,geradkettigexl oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 17 C-Atomen,eincn Phenylrest oder einen Phenylalkylrest mit 7 bis 12 C-Atomen,wobei die Phenylreste durch 1 oder 2 Substituenten aus der Reihe Halogen,Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 4 C-Atomen substituiert sein können,wobei die R30-Gruppe sich im meta- oder para-Stellung zum Rest befindet, W für Wasserstoff,Alkyl mit 1 bis 5 C-Atomen, Alkenyl mit 3 bis 5 C-Atomen,Cyclopropylmethyl, Cyclobutylmethyl, R4CO-.
3) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-2,dadurch gekennzeichnet,daß das C-tCrlninale Prolin der allgemeinen Formel: vorliegt,wobei R7 für Wasserstoff,eine Hydroxygruppe,eine Alkyl-oder Alkoxygruppe mit 1 bis 4 C-Atomen steht, - eine oder mchrere Ketogruppen in den Ring eingeführt sind, - der Ring als Dehydroprolin vorliegt.
4) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-3,dadurch gekennzeichnet,daß beide Aininoauren in der stereochemischen L-Form vorliegen.
5) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 4,dadurch gekennzeichnet,daß eine der Aminosäuren in der stereochemischen D-Form vorliegt.
6) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-5,dadurch gekennzeichnet,daß die C-terminale Aminosäure als Amid,Ester oder Hydrazid vorliegt.
i ) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-6,dadurch gekennzeichnet,daß diese mit einem in der Pcptidchemie und/oder in der Natur üblichen Verfahren synthetisiert werden.
8) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß das Knüpfen der Peptidbindung zwischen den Aminosäuren mit den üblichen Methoden erfolgt.
9) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-8,dadurch gekennzeichnet,daß diese nach dem im Beispiel aufgeführten Verfahren hergestellt wurden.
10) Arzneimittel und Tierarzneimittel,dadurch gekennzeichnet,daß diese die,in den Ansprüchen 1-9 beschriebenen,pharmakologisch aktiven Dipeptide und/ oder deren Derivate und/oder deren Säureadditionssalze enthalten.
11) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-10,dadurch gekennzeichnet,daß diese als Funktionsdiagnostica verwendet werden.
12) Pharmakologisch aktive Dipeptide nach einem der Ansprüche 1-10,dadurch gekennzeichnet,daß die Peptide nach Kopplung an Thyroglobulin (oder andere makromolekulare Eiweißkörper) als Antigene zur Bildung von Antikörpern im Säugetierorganismus gegen die in den Ansprüchen 1-6 beschriebenen Peptide verwendet werden und diese Antikörper wiederum zur Bestimmung der Konzentration derselben in Körperyewcben oder -flüssigkeiten dienen.