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Pharmakologisch aktive,N-tcrminal Phenylalanin
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enthaltende Peptide.
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Beschreibunq Die Erfindung betrifft neuartige, pharmakologisch aktive
Peptide'Verfahren zu deren Herstellung sowie nach diesen Verfahren hergestellte
Peptide.
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Aus der DT-OS 29 21 216 sind pharmakologisch akti.ve Peptide bekannt,
welche alternierende Prolinsequenzen (jede 2. Aminosäure des Peptides ist ein Prolinrest)
aufweisen und an ihrem N-terminalen Ende die Aminosäure Tyrosin aufweisen. Diese
auch 8-Casomorphine genannten Peptide bewirken in vivo und in vitro strke opiatartige
Effekte.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es neuartige pharmakologisch
aktive Peptide zu schaffen, welche vorzugsweise opiatinaktiv,teils aber auch opiataktiv
sind und neuartige Aminosäuresequenzen aufweisen.
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Diese Aufgabe ist gemäß der Erfindung dadurch gelöst,daß die pharmakologisch
aktiven Peptide die folgende Formel aufweisen: X¹-Pro²-A³-Pro4-B5-Pro6-C7-Pro8-D9-......
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wobei X¹ gleich derN-terminalen Aminosäure Phenylala nin ist. Pro
steht für die Aminosäure Prolin.A,B,C,D, kann jede beliebige Aminosäure sein.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung können die Prolinreste ganz
oder teilweise durch die Aminosäurereste Tryptophar, Alanin, Phenylalanin und/oder
Methionin ersetzt sein.
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Nach einer anderen Weiterbildung der Erfindung weisen die erfindungsgemäßen
Peptide die folgenden Formeln auf:
S-Pro-A X-pro-A-Pro X-Pro-A-Pro-B
X-Pro-A-Pro-B-Pro X-Pro-A-Pro-B-l'r-o-C X-Pro-A-Pro-B-Pro-C-Pro-...
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A,B,C,C,... kann jede beliebige Aminosäure sein. Pro steht für die
Amniosäure Prolin.
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Nach einer bevorzugten Weiterbildung der erfindungsgemäßen Peptide
steht für X Phenylalanin A Phenylalanin oder Prolin B Clycin C Prolin Die erfindungsgemäße
Peptide weisen den Vorteil auf, daß diese vorzugsweise opiatinaktiv (siehe Beispiel)
sind und so besondere pharmakologische Wirkungen selektiv ausgelöst werden.
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Die Peptide können auch oplatartige Effekte auslösen und zeichnen
sich durch eine wesentlich bessere Permeation in das Zentralnervensystem (Blut-Liquor-Gängigkeit)aus,was
ganz oder teilweise auf das Fehlen der Ilydroxygruppe am Tyrosinring zurückzuführen
ist. Diese Permeation in das ZNS ist im Vergleich zu den Peptiden des St. d. T.,der
DT-OS 29 21 216 wesentlich größer.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt die endständige,N-terminale
Aminosäure X1 in der allgem. Formel:
als Phenylalanin vor wobei
R1 für Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen steht.
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W für Wasserstoff,Alkyl mit 1-5 C-Atomen,Alkenyl mit 3-5 C-Atomen,
Cyclopropylmethyl, Cyclobutylmethyl H-Trp,H-Ser,El-Phe,H-Dopa,R2CO wobei R2 für
einen gesättigten oder ungesättigten,geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylrest
mit 1-17 C-Atomet, einen Phenylrest oder einen Phenylalkylrest mit 7-12 C-Atomen'wobei
die Phenyireste durch 1 oder 2 Substituenten aus der Reihe Halogen,Alkyl mit 1-4
C-Atomen oder Alkoxy mit 1-4 C-Atomen substituiert sein können,steht.
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R3 für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, Alkyl mit 1-4 C-Atomen
oder Alkoxy mit 1-4 C-Atomen steht.
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Z für die. Zahlen 1 oder 2 steht.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegt das Phenylalanin in der
Peptidkette in der allgemeinen Formel: vor,wobei
R6 für Wasserstoff oder Alkyl. t 1-4 -A4omen steht.
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R3 für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Nitro, Alkyl oder Alkoxy mit
1-4 C-Atomen st Z für die Zahlen 1 oder 2 stea
Nach einer anderen
Weiterbildung liegt das Prolin in der allgemeinen Formel:
vor,wobei R7 für Wasserstoff, eine Hydroxygruppe,eine Alkyl-oder Alkoxygruppe mit
1-4 C-Atomen steht.
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- eine oder mehrere Ketogruppen in den Ring eingeführt sind.
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- der Prolinring in seiner Dehydroform vorliegt.
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Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung liegen alle optisch
aktiven Aminosäuren der Peptide in der stereochemischen L-Form vor.
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Nach einer a:ideren Weiterbildung liegen eine oder mehrere der opLisch
aktiven Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide in der letzten Position (am C-Terminus)
und/oder die Aminosäure der Position 2 und/oder 3,vom N-Terminus gerechnet,in der
D-Konfiguration vor.
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Die D-Aminosäuren dienen dazu,den Abbau der Peptide durch spezifische
Enzyme zu verlangsamen, insbesondere bei den erfindungsgemäßen Peptiden mit ungeradzahliger
Aminosäurezahl.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung liegen die erfindungsgemäßen
Peptide an ihrem C-Terminus als Säure, Amid, Ester oder Hydrazid vor.
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Hierbei können die funktionellen Gruppen des C-terminalen Endes durch
Alkylgruppen unterschiedlicher Kettenlänge substituiert sein, vorzugsweise Alkyl
mit 1 bis 4 C-Atomen.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung werden die erfindungsgemäßen
Peptide mit Hilfe eines in der Peptidchemie und/oder in der Natur üblichen Verfahren
herstellt.
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Unter üblichen Verfahren ist die Synthese mittels Trägermaterialen
(z.B. Polystyrol) oder mmit Hilfe der GEN-Technologie zu verstehen; das Einfähren
von Schutzgruppen für die C- uiid N- N-trIli.nl n Aminosäuren und/oder Peptidfragmente
sowie das Abspalten derselben nach erfolgter Peptidbindungsknüpfung.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung erfolgt das Knüpfen der Peptidbindung
zwischen den einzelnen Aminosäure und/oder Peptidfragmenten nach den üblichen Methoden.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung erfolgt die Synthese der erfindungsgemäßen
Peptide nach dem im Beispiel aufgeführten Verfahren.
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Dieses Verfahren beinhaltet die Aktivierung der Säurefunktion von
Aminosäure oder Peptidfragmenten, welche mit Z-Gruppen geschützt sind'durch Bildung
eines gemischten Anhydrids und nachfolgender Kupplung mit der Aminofunktion von
Aminosäure- oder Peptidfragmentmethylestern.
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Arzneimittel und Tierarzneimittel enthaltend die erfindungsgemäßen
Peptide und/oder deren Derivate und/oder deren Säureadditionssalze und/oder deren
Metallkomplexe.
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Diese Arzneimittel können insbesondere als Antipsychotika, Neuroleptika
oder Traguilizer Verwendung finden.
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Die Arzneimittel können übliche trägermaterialien sowie Antioxidantien
enthalten.Die Peptide können sowohl in liposomenhaltigen Präparationen enthalten
sein,wie auch an inaktive Transportmoleküle (z.B. am C-Terminus gekoppelt) gebunden
sein.
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Die o.g. Säureadditionssalze könne vorzugsweise Hydrohalogenide, Lactate,
Citratem Sulfate, und oder Phosphate sein.Als Metallkomplexe können Zink und/oder
Eisenverbindungen Verwendung finden.Als Derivate sind sämtliche Verbindungen zu
verstchentdie als C;rundgerüst die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz der Peptide
beinhalten und durch Substitution verändert sind.Ebenfalls als Derivate zu verstehen
sind Peptide anderer Sequenz,wel.che an ihrem Anfang (N-Terminus) oder Ende (C-Terminus)
Sequenzen der erfindungsgemäßen Peptide beinhalten.Weitere Derivate können die PTH-Verbindungen
der Peptide sein.Unter den Schutzumfang fallen auch sog. Inversopeptide der gleichen
erfindungsgemäßen Amlnosäuresequenz.
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Die pharmakoloischen Dosen liegen unterschiedlich, je nach erwünschten
Effekt und je nach Applikationsart.Als ungefähre Dosisriclitlinie seien hier Dosen
für subeutane Verabreichung angegeben: 1.5 bis 150 mg pro Kg körpergewicht (bei
RaLten).
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung werden die erfindungsgemäßen
peptide als Funktionsdiagnostika eingesetzt.
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Nach einer Weiterbildung der Erfindung werden diese Peptide nach Kopplung
an Thyroglobulin oder andere makromolekulare Eiweißkörper zur Bildung von Antikörpern
im Säugetierorganismus gegen die in den Ansprüchen 1-13 beschriebenen Peptid verwendet
werden und diese Antikörper wiederum ur Bestimmung der Konzentrationen derselben
in Körpergeweben und Flüssigkeiten dienen.
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Dabei wird das jeweilige Peptid in üblicher Weise mit Carbodiimid
an das Makromolekül gekoppelt und intrakutan in die Rücken- und Bauchhaut von Kaninchen
injiziert.
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Beispiel Zunächst wird die Synthese Cin(?. erfindungsgemäßen Peptids
beschrieben; daran anschließend wird auf die pharmakologische Wirkung desselben
eingegangen.
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Synthese Die Synthese wurde so durchgeführt wie von M.A.Tilak 1970
in Tetrahedron Letters, 11, Seiten 849-894 beschrieben.
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Die für diese,vom C-terminalen Ende aufbauende Synthese verwendeten
Substanzen, wie z-Aminosäuren, Z-Dipeptide und Aminosäuren stammen von den Firmen
FLUKA AG'Buchs und BACHEM,Bubendorfxbeide Schweiz.
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Die DSynthese eines beispielhaften erfindungsgemäßen Peptids nach
der Methode des gemischen Anhydrids wird im folgenden bescrieben: L-Phe-L-Pro-L-Phe-L-Pro#OMet
und #OH Stufe 1a: Bildung des gemischten Anhvdrids.
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Zu 1.39 g (5 mmol) Z-L-Phenylalanin, wobei Z für die Schutzgruppe
Benzyloxycarbonyl steht,werden 100 ml Dimethylformamid (DMF) zugesetzt;nach weiterem
Zusatz von 880 jil (8 mmol) N-Methylmorpholin und nachfolgend 975 µl (7.5 mmol)
Chlorameisensäureisobutylester wird das Reaktionsgemisch bei -150C,15 Minuten belassen.
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Stufe 1b: Vorbereitung der Aminokomponente zur Kupplung 0.83 g (15
mmol) L-Prolin-Methylester#Hcl werden in 100 ml DMF unter Zusatz von 550 µl (5 mmol)
N-Methylmorpholin bei -150C aufgelöst.
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Stufe 2: Umsetzung des gemischten Anhydrids der Stufe 1a mit der Aminokomponente
der Stufe 1b.
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Nach dem Vermischen von 1a und 1b wird die Kupplung bei -150C über
Nacht durchgeführt.Vor der Aufarbeitung des Reaktionsproduktes Z-Phe-Pro-OMet wird
der 50 %ige Uberschuß
an gemischtem Anhydrid zerstört.Hierzu wird
bei 0°C das pH des Reaktionsproduktes mit wässriger,gesättigter KHCO3 Lösung auf
pH 8 eingestellt und 30 Minuten bei 0°C gerührt.Das Peptid wird dann mit gesättigter
NaCl-Lösung gefällt und 5 Stunden bei 4 0C temperiert.Danach wird das Peptid durch
mehrmaliges Ausschütteln mit Ethylacetat extrahiert.Nach mehrmaligem Waschen mit
kaltem dest. Wasser wird die organische Phase mittels eines Rotationsevaporator
zum Trockenen gebracht.
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Zur Abspaltung der Z-Gruppe wird das Peptid in 30 bis 100 ml Methanol
gelöst und 100-200 mg Palladium auf Aktivkohle (Merck) zugegeben.Nach dem Verdrängen
der Luft durch Stickstoff wird Wasserstoff in das Reaktionsgefäß eingeleitet. Die
Hydrierung wird bei 350C bis 500C für ca. 3-5 Stunden durchgeführt. Die Lösung wird
dann filtriert,der Kückstand im Filter mit Methanol nachgewaschen und das Filtrat
zum Trockenen gebracht. Im Kolben bleibt ein gelblich/weißer Film zurück.Dieses
Produkt: Phe-Pro-OMet wird dann in der Stufe 3 als Aminokomponeunte eingesetzt.Je
die Hälfte dieses Produktes wird im weiteren Vcrlauf zu Phe-Pro-Phe-Pro#OMet/OH
verarbeitet.
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Die weitere Synthese des Phe-Pro-Phe-Pro erfolgt nun durch Bildung
des gemischten Anhydrids aus dem käuflichen Dipeptid Z-L-Phe-Pro-OH und nachfolgender
Kupplung mit dem Dipeptid der Stufe 2 ,Phe-Pro#Omet.
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Stufe 3/Ia 1.4 g (3.75 mmol) Z-L-Phe-Pro werden in 50 ml DMF gelöst.
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Nach Zusatz von 410 µl (3.75 mmol) N-Methylmorpholin und 455 µl Chlorameisensäureisobutylester
wird das Gemisch bei -15°C belassen.
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Stufe 3/Ib Die halbe Menge des Dipeptids der Stufe 2 (ca. 2.5 mmol)
wird in 50 ml DMF gelöst und mit der Stufe 3/Ia vermischt.Die Kopplung erfolgt bei
-150C über Nacht.
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Die Aufarbeitung des Reaktionsproduktes Z-Phe-Pro-Phe-Pro-OMet erfolgt
wie vorher bei Stufe 2 beschrieben.Der nach dem Abdampfen der organischen Phase
zurückbleibende Rückstand enthält das gewünschte Peptid Phe-Pro-Phe-Pro-OMet.Auf
die Abspaltung der Estergruppe wird später eingegangen.
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Die Methylester der erfindungsgemäßen Peptide werden ganz oder teilweise
einer saurcn Esterhydrolyse unterworfen,um am C-Terminus die freie Säurefunktion
zu erhalten.Die Bedingungen: 5.7 N HCl,bei 370C über Nacht, 1 mal wiederholt .Die
Kontrolle der erfolgreichen Deblockierung des C-Terminus erfolgt mittels Papierelectrophorese
(Siehe Reinheitskriterien).
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Vor der weiteren Reinigung der Peptide wird der Rückstand der letzten
Synthesestufe nach dessen Hydrierung in dest. Wasser aufgenommen,zentrifugiert und
der wässrige Teil'der das Peptid enthält, lyophilisiert.Die so crhaltenen Peptide
können nun einer weiteren Reinigung zugeführt werden.
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Reinheitskriterien der synthetisierten Peptide Eine nachfolgende Auftrennung
des lyophilisierten Rückstandes mittels Gelfiltration auf einer Biogel P 2-Säule
(Fa. BIORAD) (400 mesh,Durchmesser 20 mm,Länge 1170 mm, Flußgeschwindigkeit 12 ml
pro Stunde'mit Ultraviolettabsorptionsmessung bei 220 und 280 nm und einem Fraktionskollektor
(je 20 min/Frak.) wurde durchgeführt.Die Nachreinigung kann auch mittels Hochdruckfjüssigkeitschromato
graphie durchgeführt werden. (Gerät: Waters,µ Bondapak C18,100 % 1120 isokratisch,dann
30 Minuten Gradient nach 100 % MetOII)
Die Fraktionen werden nach
dem entsprechenden UV-Eluionsprofil zusammengefasst und die Pools auf ihre Aminosäurezusammansetzung
hin untersucht. zur Spaltung werden in die Peptide mit 6N HCl versetzt und 24 Stunden
unter Vakuum bei 110°C erhitzt. Die Aminosäureanalyse mit Hilfe eines handelsüblichen
Gerätes, Aminosäureanalysator BIOTRONIK,des hydrolisierten Materials ergab : Phe
1.9'Pro 1.8.Diese Zahlen beziehen sich auf die Aminosäurereste pro Mol Peptid.
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Dieses Eryebnis entspricht dem theoretischen Wert des Peptids Phe-Pro-Phe-Pro
von Phe 2 und Pro 2.
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Ein N-terminaler Abbau mit Phenylsenföl nach Edman ergab die entsprechende
richtige Aminosäuresequenz.
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Die Papierektrophorese /Pyridin/Essigsäure/Wasser, 10:100:2390, vol/vol/vol
bei 3,75 V/cm ,15 Stunden) zeigte nur eine ninhydrinpositive Bande.Die elektrophoretische
Beweglichkeit war bei C-terminal deblockierten Peptiden geringer als bei den entsprechenden
Methylestern.
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Pharmakologische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide.
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Das erfindungsgemäße Phe-Pro-Phe-Pro#OH weist keine Opiatalitivität
auf.Die Messung der opiatartigen Wirkung erfolgte mit Hilfe des isolierten Meerschweinchenileums.
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Präparation und elektrische Stimulation des Ileums (Frequenz 0. 1
Hz,Pulse 60 V,O. 5 ms) wurden so durch geführt'wie von Kosterlitz et al. (Brit.J.Pharmacol.
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39,398-413 (1970) und Schulz und Goldstein (A.J.Pharmacol.exp.Ther.
183,404-410,1970) beschrieben.
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Eine 50 %ige Hemmung der elektrisch induzierten Kontraktionsamplitude
dieses Organpräparates konnte nicht einmal mit einer 250 µM Lösung dieser Peptide
im Organbad erreicht werden. im Vergleich hierzu zeigt das Tetrapeptid Tyr-Pro-Phe-Pro.0H
der DT-OS 29 21 216 eine IC50-Konzentration von 22 µM.
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Nach Injektion von 40 bis 600 µg in das Zentralnervensystem (intracerebroventrikuläre
Injektion) mittels von in den lateralen Seitenventrikel implantierten Kanülen,zeigte
das erfindungsgemäße Peptid Phe-Pro-Phe-pro-OH eine Katalepsie (Immobilität) ähnlich
derjenigen sowie sie durch intracercbroventrikuläre Injektion von 30-50 µg HaloperidolR
erzeugt wird. Die Versuchstiere waren Ratten mit einem Gewicht von 270 g.
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Für die Bestimmung der Katalepsie werden den Ratten auf 5 cm hohen
Klötzen unnatürliche Körperlagen (z.B.
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Hinterbeine auf dem Klotz,Vorderbeine auf der Unterlage) aufgezwungen,die
die Versuchstiere dann für mindestens 20 sec. beibehalten müssen;die Einhaltung
der verschiedenen Positionen wird dann nach einem punktesystem bewertet.Die Katalepsie
dauert 15-45 Minuten an.
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Die kataleptische Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids ist im Vergleich
zu dem Tyr-Pro-Phe-Pro.0fl selektiv, da das erfindungsgemäße Peptid keine opiatartige
Nebenwirkung mehr zeigt.