DE3786852T2 - Antibakterielle Verbindung. - Google Patents

Antibakterielle Verbindung.

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DE3786852T2 DE87112579T DE3786852T DE3786852T2 DE 3786852 T2 DE3786852 T2 DE 3786852T2 DE 87112579 T DE87112579 T DE 87112579T DE 3786852 T DE3786852 T DE 3786852T DE 3786852 T2 DE3786852 T2 DE 3786852T2
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Description

    Erfindungsgebiet
  • Die Erfindung betrifft einen neuen antibakteriell wirkenden Stoff und insbesondere einen solchen vom Lepidopterantyp mit hoher antibakterieller Aktivität.
    • Stand der Technik
  • Es ist bekannt, daß man durch Impfen von Seidenspinnerraupen mit abgetöteten, mit Formalin behandelten E. coli-Bakterien den eine Immunreaktion aus lösenden Stoff Lepidopteran herstellen kann. Dieser umfaßt die drei Homologen (Lepidopteran A, B und C), deren Struktur aufgeklärt ist, wobei Lepidopteran A synthetisch zugänglich ist. Synthetisches Lepidopteran A weist im wesentlichen dieselben antibakteriellen Aktivitäten auf wie natürliches Lepidopteran A, ist jedoch in seiner antibakteriellen Aktivität als praktisch verwendbares antibakterielles Mittel, wie z. B. in Agrochemikalien, pharmazeutischen Präparaten usw., nicht zufriedenstellend, weshalb es einer Verbesserung bedarf.
  • T. Nakai et al. beschreiben in "Peptide Chemistry", B. 23, 1985, 55. 207-212, Leipidopteran A und Peptidfragmente davon, die vom Aminosäurerest 1 bis 18, 1 bis 23 und 1 bis 30 von Lepidopteran A reichen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen antibakteriell wirkenden Peptids vom Lepidopterantyp mit hohen antibakteriell wirkenden Aktivitäten sowie einer breiten und stark ausgeprägten Verwendbarkeit in Agrochemikalien, pharmazeutischen Präparaten usw.
  • Es wurde gefunden, daß ein neues antibakteriell wirkendes Peptid vom Lepidopterantyp, das hohe antibakterielle Aktivitäten aufweist, erhalten werden kann, wenn eine Alkylamidgruppe in das C-Ende eines Peptids eingebaut wird, welches ein Lepidopteran bildendes Fragment darstellt.
  • Die Erfindung stellt ein antibakterielles Peptid mit 18 bis 35 Aminosäureresten bereit, und zwar mit derselben Aminosäuresequenz wie Lepidopteran A, beginnend mit dem N-endständigen Arginin und endend mit der Aminosäure 18 bis 23 der Lepidopteran A-Sequenz, wobei die Carboxylgruppe am C- Ende des Peptids in die Octylamidgruppe der Formel
  • -CONH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3;
  • umgewandelt ist.
  • Das neue antibakterielle Peptid weist hohe antibakterielle Aktivitäten auf. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform können sie verglichen mit Lepidopteran A eine mehrere zehnmal höhere antibakterielle Aktivität aufweisen und für die Entwicklung verschiedener neuer Agrochemikalien, pharmazeutischer Präparate usw. in Frage kommen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 zeigt das Elutionsmuster bei der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex LH-60, durchgeführt an einem im nachfolgend beschriebenen Versuch 33 erhaltenen Produkt.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Lepidopteran A weist die Struktur der Formel II auf:
  • Wie aus Formel II hervorgeht, ist Lepidopteran A ein Polypeptid mit 35 Aminosäureresten, wobei sich die Carboxylgruppe am C-Ende, d. h. am rechten Ende in Formel II befindet und ein Amid (-CONH&sub2;) bildet.
  • In der nachfolgenden Beschreibung sind die einzelnen Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz der Formel II so durchnumeriert, daß Arg am N-Ende (linkes Ende) die Nummer 1 trägt, die nachfolgenden Aminosäurereste in Richtung des rechten Endes die Nummern 2, 3 usw. tragen und die Sequenz dann mit Nr. 35 bei Ile des C-Endes (rechtes Ende) endet. Lepidopteran A kann daher abgekürzt wie folgt dargestellt werden:
  • H-(1-35)-NH&sub2;.
  • Das Peptid, der erfindungsgemäße antibakteriell wirkende Stoff, stellt ein Fragment dar, welches Lepidopteran A bildet und das Stickstoffende enthält, wobei die Zahl der Aminosäurereste im Fragment vorzugsweise 18 oder darüber beträgt, besonders bevorzugt jedoch 23 oder mehr, und zwar im Hinblick auf die Stärke der erzielten antibakteriellen Aktivität.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des antibakteriellen Stoffes liegt die Zahl der das oben erwähnte Fragment bildenden Aminosäurereste bei 23 bis 35.
    • Beispiele
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert. Die dabei verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:
  • DMF: N,N-Dimethylformamid
  • DMSO: Dimethylsulfoxid
  • NMP: N-Methyl-2-pyrrolidon
  • HMPA: vexamethylphosphorsäuretriamid
  • THF: Tetrahydrofuran
  • TFA: Trifluoressigsäure
  • TFE: 2,2,2-Trifluorethanol
  • AcOH: Essigsäure
  • AcOEt: Ethylacetat
  • Me&sub2;S: Dimethylsulfid
  • EDT: 1,2-Ethandiol
  • HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
  • WSCl: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid
  • DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
  • Boc-: t-Butoxycarbonyl
  • Tos-: p-Toluolsulfonyl
  • ClZ-: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
  • CHO-: Formyl
  • -Bzl: Benzyl
  • -Pac: Phenacyl
  • -cHex: Cyclohexyl
  • -Su: Succinimid
  • -Np: p-Nitrophenyl
  • -Pcp: Pentachlorphenyl.
  • Nachfolgend werden die Verfahren A bis F beschrieben:
    • Nachbehandlung nach der Kondensation (Verfahren A):
  • Bei diesem Verfahren ist ein blockiertes Peptid in Ethylacetat (AcOEt) löslich.
  • Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt und in AcOEt gelöst. Die AcOEt-Schicht wird nacheinander mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung, gesättigter wässeriger Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Sole gewaschen, wonach über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet wird. Das Trocknungsmittel wird dann abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Erzielung eines Rohproduktes eingeengt. Dieses wird dann auf den nachfolgenden Stufen verwendet.
    • (Verfahren B):
  • Bei diesem Verfahren ist das blockierte Peptid in Ethylacetat oder ähnlichen Lösungsmitteln leicht löslich.
  • Dem ein blockiertes Paptid enthaltenden Reaktionsgemisch wird gesättigte Sole zugesetzt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und nacheinander mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung, Wasser, einer gesättigten wässerigen Natriumbicarbonatlösung, Wasser, Methanol (oder AcOEt) und Ether gewaschen und danach zur Erzielung des Rohproduktes getrocknet. Dieses wird dann auf den nachfolgenden Stufen verwendet.
    • Nachbehandlung nach Entfernen der Boc-Gruppe (Verfahren C)
  • Dem Reaktionsgemisch wird Ether zugesetzt. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und danach in einem Exsikkator über Natriumhydroxid ausreichend lange getrocknet.
    • (Verfahren D):
  • Das Reaktionsgemisch (eine TFA-Lösung) wird bis auf ca. 1/3 bis 1/4 des Volumens unter vermindertem Druck eingeengt. Danach werden 10 bis 20 ml 4 bis 5 N HCl in THF zugesetzt und gerührt, wonach noch außerdem Ether zugesetzt wird. Das ausgefällte Produkt wird abfiltriert und danach in einem Exsikkator über Natriumhydroxid ausreichend lange getrocknet.
    • Nachbehandlung nach Entfernung der Phenacylgruppe (Verfahren E):
  • Der Abschluß der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch nachgewiesen. Nach Abschluß der Reaktion werden die unlöslichen Anteile abfiltriert, wonach dem Filtrat Wasser zugesetzt wird. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert oder abzentrifugiert und dann mit Wasser sowie mit Ether gewaschen, um das Acetophenon zu entfernen. Das erhaltene Produkt wird dann über Phosphorpentoxid in einem Exsikkator getrocknet.
    • (Verfahren F):
  • Kann die Reaktion dünnschichtchromatographisch nicht mehr nachgewiesen werden, wird das durch Abspaltung der Phenacylgruppe gebildete Acetophenon durch HPLC (Cosmosil 5C&sub1;&sub8;, 4 mm · 125 mm, 30% CH&sub3;CN/H&sub2;O, 1 ml/min, 240 nm) ermittelt, um den Abschluß der Reaktion nachzuweisen. Nach Abschluß der Reaktion wird die Behandlung gemäß Verfahren E durchgeführt.
    • Verfahren zum analytischen Nachweis der Aminosäuren eines blockierten Peptids
  • Ein blockiertes Peptid (0,1 bis 1 mg) wird in ein Pyrex- Reagenzglas gegeben und durch Zugabe von TFA (100 ul) gelöst, wobei man noch konz. HCl (200 ul) zusetzt, um das Volumenverhältnis von TFA zu konz. HCl auf 1 : 2 einzustellen. Danach wird das Reagenzglas unter vermindertem Druck verschlossen, wonach man bei 166ºC während 25 min (Bedingung I) bzw. 166ºC während 50 min (Bedingung II) hydrolysiert. Nach Öffnen des Reagenzglases wird das Reaktionsgemisch auf 60ºC erwärmt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der erhaltene Rückstand wird in einer Pufferlösung aus 0,2 M Zitronensäure gelöst, um eine Probe für die Aminosäureanalyse herzustellen. Trp wird unter der genannten Hydrolysebedingung vollständig abgebaut und die Rückgewinnung von Ser und Met ist vermindert. (Die Rückgewinnung von Ser beträgt 0 bis 50% und die Rückgewinnung von Met 30 bis 90%, was weitgehend von der Hydrolysedauer abhängt). Da es außerdem bei Ile zur Racemisierung kommen kann, wird als Wert für Ile derjenige verwendet, der durch Addition des allo-Ile-Wertes und des Wertes für Ile erhalten wird.
    • I. Herstellung von Boc-(1-18p-OH (Versuche 1 bis 34)
  • In den nachfolgend beschriebenen Versuchen wurde der erfindungsgemäße antibakteriell wirkende Stoff wie folgt hergestellt:
  • Zuerst wird ein geradkettiges Polypeptid mit 18 Aminosäuren (dieselbe Aminosäuresequenz mit ebenfalls 18 Aminosäuren auf der Seite des N-Endes von Lepidopteran A), wobei die Aminosäure am N-Ende mit Boc (tert.-Butoxycarbonyl) blockiert ist und am C-Ende eine freie COOH-Gruppe vorhanden ist, synthetisiert (Versuche 1 bis 34). Der erhaltene Stoff wird abgekürzt mit Boc-(1-18)p-OH bezeichnet. Danach wird durch Dehydratisierungkondensation der -COOH-Gruppe am C-Ende dieses Polypeptids mit CH&sub3;(CH&sub2;)nNH&sub2;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 17 bedeutet, die -COOH-Gruppe am C-Ende in verschiedene Arten von CONH(CH&sub2;)nCH&sub3; umgewandelt. Außerdem wird die Boc-Gruppe am N-Ende mit Hilfe von TFA in das NH&sub2;-Ende umgewandelt und die von der -CHO-Gruppe unterschiedliche Blockierungsgruppe an der Seitenkette mit Hilfe von Anisol und HF abgespalten, wonach die -CHO-Gruppe mit Hilfe von HSCH&sub2;CH&sub2;SH und HF abgespalten wird (Versuche 35 bis 42).
    • Versuch 1 Herstellung von Boc-Phe-Lys(ClZ)-OPac (1)
  • HCl.H-Lys(ClZ)-OPac (14,1 g, 30 mMol) und Boc-Phe-OSu (10,9 mg, 30 mMol) wurden in 140 ml DMF suspendiert, wonach unter Eiskühlung Triethylamin (2,21 ml, 15,7 mMol) zugegeben wurde. Danach wurde gerührt. Nach 30 min wurde wieder Triethylamin (1 ml, 7,12 mMol) zugegeben. Nach einer weiteren Stunde wurde erneut Triethylamin (1 ml, 7,12 mMol) zugesetzt, wonach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Dann wurde N-(2-Aminoethyl)-piperazin (0,79 ml, 6 mMol) zugesetzt, wonach während 30 min unter Eiskühlung gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren A behandelt. Das erhaltene Rohprodukt wurde dann aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/AcOEt/Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 16,9 g (82,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 140 bis 142ºC; [α]D16,5 -8,7º (c 1,07, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 63,43; H 6,20; N 6,18; Cl 5,26%
  • Berechnet als C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub2;N&sub3;O&sub8;Cl:
  • C 63,57; H 6,22; N 6,18; Cl 5,21%
    • Versuch 2 Herstellung von HCl.H-Phe-Lys(ClZ)-OPac (2)
  • Boc-Phe-Lys(ClZ)-OPac (1) (14,0 g, 20,6 mMol), erhalten in Versuch 1, wurde in 400 ml IN HCl in AcOH gelöst, wonach die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann entsprechend Verfahren C behandelt, wonach die erhaltenen Rohkristalle aus einem Lösungsmittelgemisch von Methanol/Ether/Hexan umkristallisiert wurden. Die Ausbeute betrug 11,8 g (93,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 193 bis 195ºC (Zersetzung); [α]D16,5 -11,2º (c 1,00, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 60,26; H 5,68; N 6,86; Cl 11,61%
  • Berechnet als C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6;Cl&sub2;:
  • C 60,39; H 5,72; N 6,82; Cl 11,50%
    • Versuch 3 Herstellung von Boc-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (3)
  • HCl.H-Phe-Lys(ClZ)-OPac (2) (10,5 g, 17 mMol), erhalten in Versuch 2, wurde in 90 ml DMF gelöst, wonach unter Eiskühlung Triethylamin (2,39 ml, 17 mMol) zugegeben wurde. Danach wurde Boc-Ile-OSu (5,59 g, 17 mMol) zugesetzt, wonach über Nacht gerührt wurde. Dann wurde N-(2-Aminoethyl)-piperazin (0,45 ml, 3,4 mMol) zugesetzt, wonach unter Eiskühlung während 30 min gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren A behandelt. Das erhaltene Rohprodukt wurde dann aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether/Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 9,15 g (67,8%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 178 bis 179ºC; [α]D¹&sup7; -14,4º (c 0,98, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 63,50; H 6,75; N 7,02; Cl 4,44%
  • Berechnet als C&sub4;&sub2;H&sub5;&sub3;N&sub4;O&sub9;Cl:
  • C 63,59; H 6,73; N 7,06; Cl 4,47%
    • Versuch 4 Herstellung von HCl.H-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (4)
  • Boc-Phe-Lys(ClZ)-OPac (3) (7,93 g, 20 mMol), erhalten in Versuch 3, wurde in 175 ml 1,15N HCl in AcOH gelöst, wonach die Lösung während 40 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann entsprechend Verfahren c behandelt, wonach die erhaltenen Rohkristalle aus einem Lösungsmittelgemisch von Methanol/Ether umkristallisiert wurde. Die Ausbeute betrug 7,29 g (100%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 210 bis 213ºC (Zersetzung); [α]D14,5 +11,0º (c 1,01, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 60,67; H 6,35; N 7,57; Cl 9,76%
  • Berechnet als C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub7;Cl&sub2;:
  • C 60,90; H 6,35; N 7,68; Cl 9,72%
    • Versuch 5 Herstellung-von Boc-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (5)
  • HCl.H-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (4) (6,51 g, 8,92 mMol), erhalten in Versuch 4, wurde in 55 ml DMF gelöst, wonach Triethylamin (1,25 ml, 8,92 mMol) und Boc-Lys(ClZ)-OSu (4,57 g, 8,92 mMol) unter Eiskühlung zugegeben wurden. Danach wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde N-(2- Aminoethyl)-piperazin (0,23 ml, 1,78 mMol) zugesetzt und während 30 min unter Eiskühlung gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren B behandelt, wodurch man ein erwünschtes Peptid erhielt. Die Ausbeute betrug 9,59 g (98,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 188,5 bis 190ºC; [α]D¹&sup6; -15,9º (c 0,98, DMSO)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 61,31; H 6,45; N 7,68; Cl 6,57%
  • Berechnet als C&sub5;&sub6;H&sub7;&sub0;N&sub6;O&sub1;&sub2;Cl&sub2;·0,5H&sub2;O:
  • C 61,20; H 6,51; N 7,65; Cl 6,45%
    • Versuch 6 Herstellung von HCl.Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ).OPac (6)
  • Boc-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (5) (9,00 g, 8,26 mMol), erhalten in Versuch 5, wurde in 140 ml 1,2N HCl in AcOH gelöst, wonach die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wonach das erhaltene Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Ether ausgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 8,23 g (97,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 203 bis 205ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup6; W4,4 (c 1,02, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 58,60; H 6,21; N 8,04; Cl 10,49%
  • Berechnet als C&sub5;&sub1;H&sub6;&sub3;N&sub6;O&sub1;&sub0;Cl&sub3;:
  • C 58,60; H 6,27; N 8,05; Cl 10,18%
    • Versuch 7 Herstellung von Boc-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (7)
  • HCl.H-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (6) (3,09 g, 3 mMol), erhalten in Versuch 6, wurde in 30 ml DMF gelöst, wonach unter Eiskühlung Triethylamin (423 ul, 3 mMol) und Boc- Trp(CHO)-OSu (1,55 g, 3,6 mMol) zugesetzt wurden. Danach wurde während 2 Tagen bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren B behandelt. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/AcOEt/Ether umgefällt. Die Ausbeute betrug 3,21 g (81,7%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 221,5 bis 222,5ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup7; -11,4º (c 0,99, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 62,47; H 6,16; N 8,63; Cl 5,43%
  • Berechnet als C&sub6;&sub8;H&sub8;&sub0;N&sub8;O&sub1;&sub4;Cl&sub2;:
  • C 62,62; H 6,18; N 8,59; Cl 5,44%
    • Versuch 8 Herstellung von TFA.H-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)- OPac (8)
  • Boc-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (7) (1,50 g, 1,15 mMol), erhalten in Versuch 7, wurde in 35 ml eines Lösungsmittelgemisches aus TFA/Dimethylsulfid/1,2-Ethandiol (10 : 10 : 1 V/V) unter Eiskühlung gelöst, wonach 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann der Behandlung nach Verfahren C unterworfen, wonach der erhaltene Niederschlag aus einem Lösungsmittelgemisch von DMF/AcOEt umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 1,28 g (83,9%).
    • Versuch 9 Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-OPac (9)
  • TFA.H-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe-Lys(ClZ)-OPac (8) (1,28 g, 0,967 mMol), erhalten in Versuch 8, wurde in 15 ml DMF gelöst, wonach Triethylamin (136 ul, 0,967 mMol) und Boc- Arg(Tos)-OSu (1,02 g, 1,93 mMol) unter Eiskühlung zugesetzt wurden. Danach wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde der Behandlung nach Verfahren B unterworfen. Das dabei erhaltene Rohprodukt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch aus DMF und Methanol umgefällt. Die Ausbeute betrug 1,20 g (76,8%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 191 bis 194ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup7; -10,5º (c 0,99, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 59,89; H 6,15; N 10,45; S 2,04; Cl 4,23%
  • Berechnet als C&sub8;&sub1;H&sub9;&sub8;N&sub1;&sub2;O&sub1;&sub7;SCl&sub2;·0,5H&sub2;O:
  • C 59,92; H 6,15; N 10,35; S 1,97; Cl 4,37%
  • Aminosäureanalyse (Bedingung II):
  • Ile 0,89(1), Phe 0,91(1), Lys 2,00(2), Trp 0(1), Arg 0,92(1).
  • Der in Versuch 9 erhaltene Stoff wird nachfolgend abgekürzt als Boc-(1-6)p-OPac bezeichnet.
    • Versuch 10 Herstellung von Boc-Met-Gly-OPac (10)
  • HCl.H-Gly-OPac (6,89 g, 30 mMol) und Boc-Met-OSu (10,39 g, 30 mMol) wurden in 140 ml DMF gelöst, wonach in drei Portionen während einer Stunde unter Eiskühlung Triethylamin (4,21 ml, 30 mMol) zugegeben wurde. Danach wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde N-(2-Aminoethyl)-piperazin (0,79 ml, 6 mMol) zugesetzt und während 30 min unter Eiskühlung gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren A behandelt, wonach die erhaltenen Rohkristalle aus einem Lösungsmittelgemisch von AcOEt/Hexan umkristallisiert wurde. Die Ausbeute betrug 10,3 g (81,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 84 bis 86ºC; [α]D15,5 -17,8º (c 1,02, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 56,65; H 6,61; N 6,63; s 7,64%
  • Berechnet als C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub6;S:
  • C 56,59; H 6,65; N 6,60; S 7,55%.
    • Versuch 11 Herstellung von HCl.H-Met-Gly-OPac (11)
  • Boc-Met-Gly-OPac (10) (2,00 g, 4,71 mMol), erhalten in Versuch 10, wurde in 25 ml 4,2N HCl in THF gelöst, wonach die Lösung während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann entsprechend Verfahren C behandelt und das erhaltene Rohprodukt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch von Methanol/Ether umkristallisiert. Die Ausbeute betrug 1,60 g (94,1%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 168 bis 170ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup6; +9,8º (c 1,01, DMF).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 49,84; H 5,88; N 7,75; S 9,07; Cl 9,91%
  • Berechnet als C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub1;N&sub2;O&sub4;SCl:
  • C 49,93; H 5,87; N 7,76; S 8,88; Cl 9,82%
    • Versuch 12 Herstellung von Boc-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (12)
  • HCl.H-Met-Gly-OPac (11) (6,00 g, 16,6 mMol), erhalten in Versuch 11, und Boc-Lys(ClZ)-OSu (10,0 g, 19,5 mMol) wurden in 90 ml DMF gelöst, wonach unter Eiskühlung Triethylamin (2,33 ml, 16,6 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde während 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde der Behandlung nach Verfahren A unterworfen. Das dabei erhaltene Rohprodukt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch von Methanol/Ether/Hexan umgefällt. Die Ausbeute betrug 11,07 g (92,3%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 138,5 bis 140ºC; [α]D¹&sup6; -16,3º (c 1,00, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 56,57; H 6,26; N 7,76; S 4,56; Cl 5,08%
  • Berechnet als C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub5;N&sub4;O&sub9;SCl:
  • C 56,62; H 6,29; N 7,77; S 4,44; Cl 4,92%.
    • Versuch 13 Herstellung von HCl.H-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (13)
  • Boc-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (12) (1,25 g, 1,73 mMol), erhalten in Versuch 12, wurde in 35 ml 1N HCl in AcOH gelöst, wonach die erhaltene Lösung während 30 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde gemäß Verfahren C behandelt, wonach der erhaltene Niederschlag aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 1,01 g (88,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 186 bis 188ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup6; -4,9º (c 1,03, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 52,56; H 5,78; N 8,45; S 4,83; Cl 10,86%
  • Berechnet als C&sub2;&sub9;H&sub3;&sub8;N&sub4;O&sub7;SCl&sub2;·0,5H&sub2;O:
  • C 52,25; H 5,90; N 8,40; S 4,81; Cl 10,63%
    • Versuch 14 Herstellung von Boc-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (14)
  • HCl.H-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (13) (800 mg, 1,22 mMol), erhalten in Versuch 13, wurde in 7 ml DMF gelöst, wonach Triethylamin (171 ul, 1,22 mMol) und Boc-Glu(OBzl)-OSu (528 mg, 1,22 mMol) unter Eiskühlung zugegeben wurden. Danach wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde N-(2- Aminoethyl)-piperazin (32 ul, 0,25 mMol) zugesetzt und unter Eiskühlung 30 min gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren A behandelt, wonach der erhaltene Niederschlag aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/ Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 0,98 g (85,9%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 164-166ºC; [α]D¹&sup6; -12,9º (c 1,01, DMF).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 58,53; H 6,21; N 7,53; S 3,37; Cl 3,81%
  • Berechnet als C&sub4;&sub6;H&sub5;&sub8;N&sub5;O&sub1;&sub2;SCl:
  • C 58,75; H 6,22; N 7,45; S 3,41; Cl 3,77%.
    • Versuch 15 Herstellung von HCl.H-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (15)
  • Boc-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (14) (9,50 g, 10,1 mMol), erhalten in Versuch 14, wurde in 180 ml 1,2N HCl in AcOH gelöst, wonach die erhaltene Lösung während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde gemäß Verfahren C behandelt. Die dabei erhaltenen Rohkristalle wurden aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether umgefällt. Die Ausbeute betrug 7,35 g (82,9%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 173 bis 175ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup6; +1,2º (c 1,01, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 55,07; H 5,84; N 8,03; S 3,81; Cl 8,17%
  • Berechnet als C&sub4;&sub1;H&sub5;&sub1;N&sub5;O&sub1;&sub0;SCl&sub2;·H&sub2;O:
  • C 55,03; H 5,97; N 7,83; S 3,58; Cl 7,92%.
    • Versuch 16 Herstellung von Boc-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (16)
  • HCl.H-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (15) (6,50 g, 7,41 mMol), erhalten in Versuch 15, und Boc-Ile-OSu (2,92 g, 8,90 mMol) wurden in 55 ml DMF gelöst, wonach unter Eiskühlung Triethylamin (1,04 ml, 7,41 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde einer Behandlung nach Verfahren B unterworfen, wonach das erhaltene Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether/Hexan umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 6,37 g (81,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 178ºC (halbgeschmolzen), 180 bis 182ºC; [α]D16,5 -10,8º (c 0,99, DMSO)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 59,11; H 6,60; N 7,93; S 3,25; Cl 3,29%
  • Berechnet als C&sub5;&sub2;H&sub6;&sub9;N&sub6;O&sub1;&sub3;SCl:
  • C 59,28; H 6,60; N 7,98; S 3,04; Cl 3,36%.
    • Versuch 17 Herstellung von HCl.H-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (17)
  • Boc-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (16) (6,00 g, 5,69 mMol), erhalten in Versuch 16, wurden in 85 ml 1,4N HCl in AcOH gelöst, wonach die Lösung während 90 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde einer Behandlung nach Verfahren C unterworfen, wonach der erhaltene Niederschlag aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 5,45 g (96,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 208 bis 209,5ºC (Zersetzung); [α]D16,5 +1,1º (c 1,02, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 56,38; H 6,32; N 8,40; S 3,35; Cl 6,93%
  • Berechnet als C&sub4;&sub7;H&sub6;&sub2;N&sub6;O&sub1;&sub1;SCl&sub2;·0,5H&sub2;O:
  • C 56,50; H 6,36; N 8,41; S 3,21; Cl 7,10%.
    • Versuch 18 Herstellung von Boc-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly- OPac (18)
  • HCl.H-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (17) (4,60 g, 4,65 mMol), erhalten in Versuch 17, und Boc-Lys(CIZ)-OSu (2,62 g, 5,11 mMol) wurden in 50 ml DMF gelöst, wonach Triethylamin (652 ul, 4,65 mMol) unter Eiskühlung zugesetzt wurde. Danach wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde noch N-(2-Aminoethyl)-piperazin (122 ul, 0,93 mMol) zugesetzt, wonach unter Eiskühlung während 30 min gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde einer Behandlung nach Verfahren B unterworfen, wonach der erhaltene Niederschlag aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/ AcOEt/Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 5,49 g (87,5%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 173ºC (halbgeschmo1zen); 204 bis 206ºC (Zersetzung); [α]D16,5 -13,7º (c 0,98, DMSO).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 58,26; H 6,39; N 8,26; S 2,37; Cl 5,11%
  • Berechnet als C&sub6;&sub6;H&sub8;&sub6;N&sub8;O&sub1;&sub6;SCl&sub2;·0,5H&sub2;O:
  • C 58,31; H 6,45; N 8,24; S 2,36; Cl 5,22%.
  • Aminosäureanalyse:
  • Glu 1,01(1), Gly 1,00(1), Met 0,89(1), Ile 0,95(1), Lys 2,08(2) (6M Chlorwasserstoffsäure, 110ºC, 48 Stunden).
  • Der in Versuch 18 erhaltene Stoff wird nachfolgend mit Boc- (7-12)p-OPac abgekürzt.
    • Versuch 19 Herstellung von Boc-Asp(OcHex)-Gly-OPac (19)
  • HCl.H-Gly-OPac (2,00 g, 8,72 mMol) und Boc-Asp(OcHex)-OH (2,50 g, 7,93 mMol) wurden in 45 ml THF suspendiert, wonach N,N-Diisobutylethylamin (1,52 ml, 8,73 mMol) und DCC (1,64 g, 7,95 mMol) unter Eiskühlung zugesetzt wurden. Danach wurde während 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefällte Dicylcohexylharnstoff wurde abfiltriert, wonach das Reaktionsgemisch nach Verfahren A behandelt wurde, wodurch man ein öliges Produkt erhielt. Die Ausbeute betrug 3,25 g (83,5%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • [α]D¹&sup5; -15,9º (c 1,23, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 61,11; H 6,93; N 5,62%
  • Berechnet als C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub8;:
  • C 61,21; H 6,99; N 5,71%.
    • Versuch 20 Herstellung von HCl.H-Asp(OcHex)-Gly-OPac (20)
  • Boc-Asp(OcHex)-Gly-OPac (19) (2,99 g, 6,10 mMol), erhalten in Versuch 19, wurde in 30 ml 4,23N HCl in THF gelöst, wonach die Lösung während 60 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde dann nach Verfahren C behandelt, wonach das erhaltene Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol/Ether umkristallisiert wurde. Die Ausbeute betrug 2,48 g (95,4%).
    • Versuch 21 Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (21)
  • HCl.H-Asp(OcHex)-Gly-OPac (20) (10,7 g, 25,1 mMol), erhalten in Versuch 20, wurde in 150 ml THF gelöst, wonach HOBt (3,39 g, 25,1 mMol), Boc-Arg(Tos)-OH.1/3AcOEt (11,5 g, 25,1 mMol) und N,N-Diisobutylethylamin (4,37 ml, 25,1 mMol) unter Eiskühlung zugesetzt wurden. Danach wurde DCC (5,18 g, 25,1 mMol) zugesetzt und über Nacht gerührt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert, wonach das erhaltene Reaktionsgemisch nach Verfahren A behandelt wurde, wodurch man ein Rohprodukt erhielt. Dieses wurde dann durch Silicagelchromatographie (7·24 cm; Benzol/AcOEt = 1 : 3) gereinigt. Die Ausbeute betrug 15,3 g (76,1%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 75 bis 77ºC; [α]D15,5 -11,8º (c 0,95, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 56,88; H 6,76; N 10,25; S 3,93%
  • Berechnet als C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub2;N&sub6;O&sub1;&sub1;S:
  • C 56,99; H 6,54; N 10,49; S 4,00%.
    • Versuch 22 Herstellung von HCl.H-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (22)
  • Boc-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (21) (1,43 g, 17,9 mMol), erhalten in Versuch 21, wurde in 70 ml 5,26N HCl in THF gelöst, wonach die erhaltene Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wodurch man hygroskopische Kristalle erhielt. Die Ausbeute betrug 1,18 g (100%).
    • Versuch 23 Herstellung von Boc-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (23)
  • HCl.H-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (22) (13,2 g, 17,9 mMol), HOBt (2,42 g, 17,9 mMol) und Boc-Ile-OPac (16,6 g, 34,6 mMol) wurden in 10 ml THF gelöst, wonach der erhaltenen Lösung in drei Portionen während einer Stunde unter Eiskühlung N,N-Diisobutylamin (6,24 ml, 35,8 mMol) zugesetzt wurde, wonach 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren A behandelt, wonach das erhaltene Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch aus THF/Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 15,9 g (96,8%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 93 bis 95ºC (Zersetzung); [α]D¹&sup6; -16,7º (c 1,00, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 56,98; H 6,89; N 10,68; S 3,68%
  • Berechnet als C&sub4;&sub4;H&sub6;&sub3;N&sub7;O&sub1;&sub2;S·H&sub2;O:
  • C 56,70; H 7,03; N 10,52; S 3,44%.
    • Versuch 24 Herstellung von HCl.H-IlP-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (24)
  • Boc-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (23) (1,31 g, 1,44 mMol), erhalten in Versuch 23, wurde in 8 ml 4,23N HCl in THF gelöst, wonach die erhaltene Lösung während 150 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wodurch man hygroskopische Kristalle erhielt. Die Ausbeute betrug 1,21 g (98,5%).
    • Versuch 25 Herstellung von Boc-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (25)
  • HCl.H-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (24) (8,04 g, 9,45 mMol), erhalten in Versuch 34, HOBt (1,41 g, 10,4 mMol) und Boc-Asn-ONp (3,67 g, 10,4 mMol) wurden in 70 ml DMF gelöst, wonach der erhaltenen Lösung in 3 Portionen während 20 min unter Eiskühlung N,N-Diisobutylamin (872 ul, 6,20 mMol) zugesetzt wurde. Danach wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren B behandelt, wonach das erhaltene Rohprodukt mit Methanol gewaschen wurde. Die Ausbeute betrug 7,79 g, 80,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 187 bis 190ºC; [α]D¹&sup6; -19,5º (c 1,03, DMF)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 54,89; H 6,79; N 12,01; S 3,04%
  • Berechnet als C&sub4;&sub8;H&sub6;&sub9;N&sub9;O&sub1;&sub4;S·H&sub2;O:
  • C 55,11; H 6,84; N 12,05; S 3,04%.
    • Versuch 26 Herstellung von HCl.H-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (26)
  • Boc-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (25) (6,17 g, 6,00 mMol), erhalten in Versuch 25, wurden in 100 ml 1,4N HCl in AcOH gelöst, wonach die Lösung bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wodurch man das gewünschte Produkt erhielt. Die Ausbeute betrug 5,7 g (quantitativ).
    • Versuch 27 Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)- Gly-OPac (27)
  • HCl.H-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (26) (1,35 g, 1,40 mMol), erhalten in Versuch 26, wurde in 50 ml DMF gelöst, wonach HOBt (189 mg, 1,40 mMol) und Boc-Arg(Tos)-OSu (1,47 g, 2,80 mMol) zugegeben und gelöst wurden. Anschließend wurde unter Eiskühlung N,N-Diisobutylamin (244 ul, 1,40 mMol) zugegeben, wonach während 4 Tagen bei Raumtemperatur gerührt wurde. Anschließend wurde N,N-Diisobutylamin (341 ul, 1,96 mMol) zugegeben, wonach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren B behandelt, wonach das erhaltene Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch aus THF/Ether umgefällt wurde. Die Ausbeute betrug 1,51 g (80,7%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 170ºC (halbgeschmolzen), 184 bis 186,5ºC; [α]D16,5 -16,7º (c 0,97, DMF).
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 53,27; H 6,50; N 13,26; S 4,72%
  • Berechnet als C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub7;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub7;S&sub2;·2H&sub2;O:
  • C 53,30; H 6,67; N 13,25; S 4,66%.
  • Aminosäureanalyse (Bedingung II):
  • Asp 1,86(2), Gly 1,00(1), Ile 0,88(1), Arg 1,64(2)
  • Der in Versuch 27 erhaltene Stoff wird nachfolgend mit Boc- (13-18)p-OPac abgekürzt.
    • Versuch 28 Herstellung von Boc-(1-6)p-OH (Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-OH (28))
  • Boc-(1-6)p-OPac (9) (699 mg, 0,433 mMol), erhalten in Versuch 9, wurde in 20 ml eines Lösungsmittelgemisches aus DMSO/ AcOH (1 : 1 V/V) gelöst, wonach Zinkpulver (1,45 g, 22 mMol) zugegeben wurde. Danach wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren E behandelt, wodurch man ein gewünschtes Produkt erhielt. Die Ausbeute betrug 609 mg (94,0%).
    • Versuch 29 Herstellung von H-(7-12)p-OPac (Herstellung von HCl.H-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met- Gly-OPac (29))
  • Boc-(7-12)p-OPac (18) (1,35 g, 1,00 ml), erhalten in Versuch 18, wurde in 25 ml 1,4N HCl in AcOH gelöst, wonach während 20 min bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wodurch man zu dem gewünschten Produkt gelangte. Die Ausbeute betrug 1,24 g (97,1%).
    • Versuch 30 Herstellung von Boc-(1-12)p-OPac (Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OPac (30))
  • HCl.H-(7-12)p-OPac (29) (497 mg, 0,386 mMol), erhalten in Versuch 29, HOBt (52,2 mg, 0,386 mMol) und Boc(1-6)p-OH (28) (578 mg, 0,386 mMol), erhalten in Versuch 28, wurden in 15 ml DMF gelöst, wonach man unter Kühlung bei -70ºC WSCl (60 ul, 0,386 mMol) zusetzte. Anschließend wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren B behandelt. Das dabei erhaltene Rohprodukt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch von DMF/Methanol umgefällt. Die Ausbeute betrug 812 mg (77,0%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 200ºC (Zersetzung mit Färbung); [α]D²&sup8; -8,9º (c 1,00, NMP)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 58,55; H 6,21; N 10,23; S 2,47; Cl 5,06%
  • Berechnet als C&sub1;&sub3;&sub4;H&sub1;&sub6;&sub8;N&sub2;&sub0;O&sub2;&sub9;S&sub2;Cl&sub4;·H&sub2;O:
  • C 58,59; H 6,24; N 10,20; S 2,33; Cl 5,16%.
  • Aminosäureanalyse (Bedingung II):
  • Glu 0,95(1), Gly 1,00(1), Met 0,64(1), Ile 1,81(2), Phe 0,85(1), Lys 3,92(4), Trp 0(1), Arg 0,81(1).
    • Versuch 31 Herstellung von Boc-(1-12)p-OH (Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-OH (31))
  • Boc-(1-12)p-OPac (30) (812 mg, 0,297 mMol), erhalten in Versuch 30, wurde in 25 ml eines Lösungsmittelgemisches von NMP/AcOH (5 : 1 V/V) gelöst, wonach Zinkpulver (5,29 g, 80,9 mMol) zugegeben wurde. Danach wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren F behandelt, wodurch man zu einem gewünschten Produkt gelangte. Die Ausbeute betrug 698 mg (89,8%).
    • Versuch 32 Herstellung von H-(13-18)p-OPac (Herstellung von HCl.H-Arg(Tos)-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)- Gly-OPac (32))
  • Boc-(13-18)p-OPac (27) (250 mg, 0,186 mMol), erhalten in Versuch 27, wurde in 5 ml 1,4N HCl in AcOH gelöst, wonach die erhaltene Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt wurde. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren C behandelt, wodurch man einen hygroskopischen Niederschlag erhielt. Die Ausbeute betrug 227 mg (95,4%).
    • Versuch 33 Herstellung von Boc-(1-18)p-OPac (Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly- Arg(Tos)-Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OPac (33))
  • HCl.H-(13-18)p-OPac (32) (130 mg, 0,102 mMol), erhalten in Versuch 32, wurde in 6 ml eines Lösungsmittelgemisches aus DMF/DMSO (1 : 1 V/V) gelöst, wonach N,N-Diisopropylamin (DIEA) (17,7 ul, 0,102 mMol), HOBt (13,7 mg, 0,102 mMol) und Boc-1- 12)pp-OH (31) (266 mg, 0,102 mMol), erhalten in Versuch 31, zugesetzt und gelöst wurden. Anschließend wurde unter Eiskühlung, um die Reaktion bei Raumtemperatur fortzusetzen, WACl.HCl (19,5 mg, 0,102 mMol) zugesetzt, wonach man 7 Tage lang bei Raumtemperatur rührte, wobei man in bestimmten Abständen DIEA (insgesamt 17,7 ul) und WACl.HCl (9,8 mg) zusetzte, bis das HCl.H-(13-18)p-OPac verschwand. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration mit Hilfe von Sephadex LH-60 (2,5·70 cm; DMFD/DMSO/AcOH = 20 : 20 : 1; 15 ml/St) als Träger unterworfen. Es wurde dann die Absorption der einzelnen Fraktionen bei einer Wellenlänge von 320 nm ermittelt, um zu dem in Fig. 1 dargestellten Elutionsmuster zu gelangen. Die Fraktionen 42 bis 67 wurden gesammelt. Danach wurde der durch Zugabe von Wasser zu diesen Fraktionen erhaltene Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt und mit Wasser, THF und Ether gewaschen. Die Ausbeute betrug 235 mg (60,3%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • Sp. 226ºC (Zersetzung); [α]D²&sup9; -8,1º (c 1,04, NMP)
  • Elementaranalyse:
  • Gefunden: C 55,96; H 6,34; N 11,51; S 4,22; Cl 3,80%
  • Berechnet als C&sub1;&sub8;&sub2;H&sub2;&sub3;&sub9;N&sub3;&sub3;O&sub4;&sub2;S&sub4;Cl&sub4;·5H&sub2;O:
  • C 55,75; H 6,40; N 11,79; S 3,27; Cl 3,62%
  • Aminosäureanalyse (Bedingung II):
  • Asp 1,75(2), Glu 1,08(1), Gly 2,00(2), Met 0,74(1), Ile 2,96(3), Phe 1,01(1), Lys 4,41(4), Trp 0(1), Arg 2,68(3).
    • Versuch 34 Herstellung von Boc-(1-18)p-OH (Herstellung von Boc-Arg(Tos)-Trp(CHO)-Lys(ClZ)-Ile-Phe- Lys(ClZ)-Lys(ClZ)-Ile-Glu(OBzl)-Lys(ClZ)-Met-Gly-Arg(Tos)- Asn-Ile-Arg(Tos)-Asp(OcHex)-Gly-OH (34))
  • Bos-(1-18)p-OPac (33) (185 mg, 48,2 uMol), erhalten in Versuch 33, wurde in 10 ml eines Lösungsmittelgemisches von DMSO/AcOH (4 : 1 V/V) gelöst, wonach Zinkpulver (1,40 g, 21,4 mMol) in entsprechenden Abständen zugegeben wurde. Danach wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde nach Verfahren F behandelt, wodurch das gewünschte Produkt erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 176 mg (98,5%).
    • II. Herstellungsbeispiele für die antibakterielle Substanz der Erfindung (Versuche 35 bis 42) Versuch 35 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub1;&sub1;CH&sub3;·8HCl
  • (1) Boc-(1-18)p-OH (34) (200 mg, 53,9 uMol), erhalten in Versuch 34, wurde in einem Lösungsmittelgemisch (4 ml) von DMSO/NMP/DMF (1 : 1 : 1) gemischt, wonach CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; (10,0 mg, 53,9 uMol) und HOBt (7,3 mg, 53,9 uMol) zugegeben wurden. Danach wurde noch unter Eiskühlung WSCl.HCl (10,3 mg, 53,9 uMol) zugesetzt. Nach Rückkehr zur Raumtemperatur wurde die Reaktion 18 Stunden lang durchgeführt. Nachdem festgestellt wurde, daß das Reaktionsgemisch eine negative Ninhydrin- Reaktion aufwies, wurden CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; (2,0 mg, 10,8 uMol) und WSCl.HCl (2,1 mg, 10,8 uMol) zugesetzt, wonach die Reaktion noch 5 Stunden lang durchgeführt wurde. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch einer Nachbehandlung nach Verfahren B unterworfen. Die Ausbeute betrug 155 mg (74,1%).
  • (2) Das auf diese Weise erhaltene Produkt (70 mg, 18,0 uMol) wurde in ein Reagenzglas für die Umsetzung mit Fluorwasserstoff gegeben und in TFA (5 ml) gelöst, wonach man 1 Stunde lang bei Raumtemperatur rührte. Nach der Abdampfung des TFA wurde der Inhalt über NaOH in einem Exsikkator getrocknet. In das Reagenzglas, das auf -70ºC abgekühlt war, wurde dann Anisol (560 ul) gegossen, wonach 5 ml HF eingeleitet wurden. Danach wurde 1 Stunde lang bei 0ºC gerührt. Nach Verdampfen des Fluorwasserstoffs unter vermindertem Druck (0ºC, 25 min) wurden 2,5 ml 1,2-Ethandiol (EDT) in das Reagenzglas gegossen und danach wieder 2,5 ml HF eingeleitet, wonach während 30 min bei 0ºC gerührt wurde. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck (0ºC, 30 Minuten) abgedampft, wonach dem Rückstand 4%ige AcOH zugesetzt wurde. Danach wurde mit Ether gewaschen.
  • Die wässerige Schicht wurde durch eine Säule eines Ionenaustauscherharzes (Handelsbezeichnung Dowex 1·8, AcO&supmin;-Typ, 12·280 mm) geschickt, um die ninhydrin-positiven Fraktionen zu sammeln, die dann gefriergetrocknet wurden, um zum Rohprodukt zu gelangen. Dieses wurde dann durch HPLC (Nucleosil 300 -7C&sub1;&sub8;, 6·250 mm, Gradientenelution von 30% CH&sub3;CN/0,1% TFA bis 60% CH&sub3;CN/0,1% TFA) gereinigt. Das erhaltene Produkt wurde gefriergetrocknet, wodurch man ein weißes Pulver erhielt. Die Ausbeute betrug 12,8 mg (26,0%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2441 (berechnet 2441)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 36 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub3;NH&sub2; (11,5 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 156 mg (74,1%).
  • Eine 80 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 16,8 mg (29,7%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2469 (berechnet 2469)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 37 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub1;&sub5;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub5;NH&sub2; (13,0 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 210 mg (98,9%).
  • Eine 100 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 20,3 mg (28,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H:2497 (berechnet 2497)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 38 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub9;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub9;NH&sub2; (8, 5 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 204 mg (98,6%).
  • Eine 100 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 18,4 mg (29,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2413 (berechnet 2413)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 39 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub7;NH&sub2; (6,9 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 203 mg (98,4%).
  • Eine 80 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 16,2 mg (28,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2385 (berechnet 2385)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 40 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub5;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub5;NH&sub2; (5,4 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 201 mg (98,0%).
  • Eine 100 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 21,2 mg (27,9%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2357 (berechnet 2357)
  • UV-Absorption: λ(Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 41 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub3;CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wir unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2; (3,9 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 200 mg (98%).
  • Eine 100 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) in Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 21,3 mg (28,6%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2329 (berechnet 2329)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • Versuch 42 Herstellung von H-(1-18)-NH(CH&sub2;)CH&sub3;·8HCl
  • Die Kondensation wurde auf dieselbe Weise wie unter (1) in Versuch 35 durchgeführt, nur wurde CH&sub3;(CH&sub2;)NH&sub2; (2,4 mg, 53,9 uMol) anstelle von CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub1;NH&sub2; verwendet. Die Ausbeute betrug 199 mg (98,5%).
  • Eine 80 mg-Portion des oben erhaltenen Produktes wurde deblockiert und auf dieselbe Weise wie unter (2) In Versuch 35 gereinigt, wodurch man das Titelprodukt erhielt. Die Ausbeute betrug 17,1 mg (29,2%).
  • Kennzeichnung des Produktes:
  • FAB-MS M+H: 2301 (berechnet 2301)
  • UV-Absorption: λ (Schulter), 287 nm; λmax 280 nm
    • III. Antibakterielle Aktivität der erfindungsgemäßen antibakteriell wirkenden Stoffe (Beispiele 1 bis 3) Beispiel 1
  • Geprüft wurde die minimale wachstumshemmende Konzentration (MIK) gegenüber einer Reihe von Bakterien nach der Methode der Serienverdünnung des jeweiligen Präparats in der Nährbouillon unter Verwendung der in den Versuchen 35 bis 42 erhaltenen Stoffe, die keine blockierende Gruppe aufwiesen (Bewertung der antibakteriellen Aktivität). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 MIK (ug/ml)² Prüfsubstanz (1) Bakterie (3) Synthetisches Lepidopteran A
    • Bemerkungen:
  • (1) Prüfsubstanz: H-(1-18)-NH(CH&sub2;)nCH&sub3; wird als H-(1-18)-NHC+n+1 angeführt.
  • (2) Das Symbol "-" bedeutet MIK > 250 ug/ml
  • (3) Abkürzung der Bakteriennamen:
  • P.mira 129: Proteus mirabilis 129
  • P.mira 1287: Proteus mirabilis 1287
  • E.coli NIHJ: Escherichia coli NIHJ
  • S.ent 3313: Salmonella enteritidis IFO 3313
  • P.aeru: Pseudomonas aeruginosa
  • P.aeru 99: Pseudomonas aeruginosa 99
  • E.aero 13534: Enterobacter aerogenes IFO 13534
  • S.aure 209P: Staphylococcus aureus FDA 209P
  • B.sub 219: Bacillus subtilis PCI 219
  • S.hemo: Streptococcus hemolyticus
  • P.aeru OT 97: Pseudomonas aeruguinosa OT 97
  • E.coli D 21: Escherichia coli D 21
  • M.lute ML II: Micrococcus luteus ML II
  • Aus Tabelle 1 geht hervor, daß bei n ≥ 17 eine geringe antibakterielle Aktivität festzustellen ist. Eine hohe antibakterielle Aktivität zeigt sich bei bestimmten Bakterien, wie z. B. bei S.aure 209-P oder B.sub 219 im Falle von n = 13. Bei n = 11 läßt sich eine gute antibakterielle Aktivität gegen S.aure 209-P und B.sub 219 feststellen. Bei n = 3 bis 9 zeigt sich eine verglichen mit Lepidopteran A gleichwertige oder bessere antibakterielle Aktivität. Eine sehr gute antibakterielle Aktivität läßt sich insbesondere bei n = 7 erzielen.
    • Beispiel 2
  • H-(1-23)-NH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3; wurde entsprechend den Verfahren in den Versuchen 1 bis 35 synthetisiert. Die antibakterielle Aktivität dieses Stoffes wurde gegenüber verschiedenen Bakterien auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 geprüft.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Zu Vergleichszwecken wurden H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3; einerseits und synthetisches Lepidopteran A andererseits bewertet. Tabelle 2 MIK (ug/ml)¹ Prüfsubstanz Bakterie Synthetisches Lepidopteran A Bemerkungen: (1) Das Symbol "-" bedeutet MIK > 250 ug/ml
  • Tabelle 2 zeigt, daß H-(1-23)-NH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3; höhere antibakterielle Aktivität aufweist als H-(1-18)-NH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3; und das synthetische Lepidopteran A, und zwar in Bezug auf sämtliche Bakterien.
    • Beispiel 3
  • Die Zahl der Aminosäurereste des erhaltenen H-(1-18)-NH-R (R =(-(CH&sub2;)nCH&sub3;) wurde mit Hilfe eines Aminosäuren-Sequenzers der Firma Hitachi, Ltd. analysiert. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt, wobei R die Zahl der enthaltenen C-Atome bedeutet. Tabelle 3 R: C&sub1;&sub8; C&sub1;&sub6; C&sub1;&sub4; C&sub1;&sub2; Asp Glu Gly Met Ile Phe Lys Trp Arg Bemerkungen: 6M-HCl, 110ºC, 90 St. *: 24 St. **: Die theoretische Zahl der Reste ist in ( ) angegeben.
  • Aus Tabelle 3 geht hervor, daß die Aminosäurereste, in denen R 12 bis 18 C-Atome enthält, im wesentlichen mit der theoretischen Restzahl zusammenfällt. Jeder dieser Reste kann somit als im wesentlichen vollständig synthetisiert betrachtet werden.

Claims (2)

1. Antibakterielles Peptid mit 18 bis 35 Aminosäureresten, und zwar mit derselben Aminosäuresequenz wie Lepidopteren A, beginnend mit dem N-endständigen Arginin und endend mit dar Aminosäure 18 bis 23 der Lepidopteran A-Sequenz, wobei die Carboxylgruppe am C-Ende des Peptids in die Alkylamidgruppe der Formel (I)
-CONH(CH&sub2;)&sub7;CH&sub3;
umgewandelt ist.
2. Antibakterielles Peptid nach Anspruch 1, worin die Zahl der Aminosäurereste des Peptids 23 bis 35 beträgt.
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