DE2616399A1

DE2616399A1 - Polypeptid und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2616399A1
Application number: DE19762616399
Authority: DE
Inventors: Terutoshi Kimura; Tadanori Morikawa; Eisuke Munekata; Toshiharu Noda; Shumpei Sakakibara; Nishinomiya Yasuo
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1975-05-01
Filing date: 1976-04-14
Publication date: 1976-11-11
Also published as: CA1065856A; DE2616399C2; CH624660A5; NL7604605A; AU1356576A; SE437836B; FR2309235B1; NZ180675A; HU176623B; DK149597C; NL164551B; JPS5341677B2; GB1516947A; FR2309235A1; US4086221A; AT360670B; DK193876A; SE7604761L; ATA311476A; DK149597B

Description

Patentanwälte Dipl-ing. Η.Ψειοκμανν, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

25 15309

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH SCO 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

Toyo Jozo Kabushiki Kaisha

632-I, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun,

Shizuoka-ken, Japan

Polypeptid und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Polypeptid der allgemeinen Formel I -(CHj₁- 1

Kto-Aj-Asn

worin A₁ Ser oder GIy, A~ VaI oder Met, A₁₀ Lys oder Thr, A₁₁ Leu oder Tyr, A₁₂ Ser oder Thr, A₁^ GIu oder Asp, A₁₅ Leu oder Phe, A₁^ His oder Asn, A₁Q Leu oder Phe, A₁₉ Gin oder His, A₃₁ Tyr oder Phe, A₃-, Arg oder Gin, A₃₁- Asp, Asn oder Ala, A₂^ VaI, Thr oder lie, A₃₈ AIa, Ser oder VaI und A-^ Thr, VaI oder AIa bedeuten,sowie dessen Säureadditionssalze und Komplexe und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

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Das Polypeptid der allgemeinen Formel I hat den Calciumspiegel des Serums senkende Eigenschaften.

Calcitonin ist ein bekanntes Polypeptid mit den Calciumspiegel des Serums bei Säugetieren senkenden Eigenschaften und wird aus Säugetier- oder Vögelschilddrüsen oder aus dem letzten Kiemenkörper von Fischen isoliert. Die Aminosäuresequenz des Calcitonins hängt von seiner natürlichen Herkunft ab, und kürzlich wurden synthetische Calcitonine bekannt, die dieselbe chemische.Struktur wie diejenigen natürlichen Ursprungs aufweisen.

Die Calcitonine natürlichen Ursprungs wie z.B. Aal-, Lachsoder Humancalcitonin sind Polypeptide, die aus 32 Aminosäuren bestehen, wobei die erste und die siebte Aminosäure jeweils L-Cystein ist und deren Mercaptogruppen unter Bildung einer Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.

Das Polypeptid gemäß der Erfindung enthält demgegenüber weder als erste noch als siebte Aminosäure L-Cystein, das L-Cystein ist vielmehr durch o(-Aminokorksäure der Formel

CH₀-CH₀-CH₀-CH₀
,2 2 2 ι 2

CH₂COOH H₂N-CH-COOH
ersetzt.

Die ο-Carboxylgruppe ist an die N-terminale Aminosäure unter Bildung einer Ringstruktur gebunden.

Das neue Polypeptid weist ein bedeutendes Ausmaß an therapeutischer Wirkung auf. Die neue Verbindung kann verordnet werden, um den Serum-Calcium-Spiegel bei Krankheiten wie beispielsweise Hypercalcämie, endogener CaIeitonin-Mangelkrankheit, welche durch Dysthyroidismus oder Hyperparathyroidismus verursacht wird, herabzusetzen.

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Die neue Verbindung kann für eine Calcium benötigende Chiropraktik wie beispielsweise Osteoporose, Osteomalazie, Fraktur, Faser-Dysplasie des Knochens oder Rachitis, welche durch Corticosteron-Therapie oder eine Inaktivierung nach dem Klimakterium oder durch äußere Verletzung verursacht wird, verordnet werden, insbesondere kombiniert mit Calcium oder Phosphor. Die neue Verbindung kann auch zur Therapie der Pagetschen Krankheit verwendet werden. Ferner kann die neue Verbindung zur Therapie oder zur Verhinderung von Magengeschwüren verwendet werden. Die erfindungsgemäße Verbindung ist im Serum, in der Leber oder in der Niere stabiler als das bekannte Calcitonin und außerdem stabiler bei Verfahren zu ihrer Reinigung und bei der Lagerung, und zwar infolge des Fehlens einer Disulfid-Brückenbindung. Die Aktivität der Art von Polypeptiden der Formel I ist im Vergleich mit dem bekannten Calcitonin gleich oder höher, wie Vergleichsversuche bei Ratten ergeben haben.

Die Verbindung der allgemeinen Formel I kann mittels herkömmlicher peptidsynthetischer Methoden hergestellt werden, d.h. eine Aminosäure und/oder ein Peptid aus 2 bis 4 Aminosäuren wird in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz gemäß der allgemeinen Formel I kondensiert und das Aminosäurekondensat, das die Sequenz der Formel

H-Aj-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-

enthält, wird bei irgendeiner Reaktionsstufe beim Aufbau des Peptids einer* Ringschlußreaktion unterworfen und die zum Schutz der reaktiven Gruppe eingeführte Schutzgruppe wird in irgendeiner Reaktionsstufe wieder abgespalten. Gewünschtenfalls kann die Verbindung in ein Säureadditionssalz oder einen Komplex übergeführt werden.

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Die bei der Synthese der Ausgangsmaterialien oder der Zwischenprodukte verwendeten Schutzgruppen stellen für Peptidsynthesen übliche Schutzgruppen dar und sollen durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse leicht entfernt werden können.

Beispielweise wird die Aminogruppe in herkömmlicher Weise durch eine Acylgruppe wie beispielsweise eine Forrr.yl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,^-Dinitrophenylsulfenylcruppe, eine Aralkylgruppe wie beispielsweise eine Benzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylrr.ethy !gruppe geschützt (diese Gruppen können gegebenenfalls durch eine Niederalkcxygruppe wie beispielsweise eine o-Kethoxy- oder p-Methoxygruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe wie beispielsweise eine Benzyloxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl- oder p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe wie beispielsv/eise eine Cyclopentyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, tert.-Butoxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe wie beispielsweise eine 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tosyl-isopropoxycarbonyl- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe.substituiert sein. Diese Aminogruppe kann durch Bildung eines Enamin durch Umsetzung mit einem 1,3-Oiketon- wie beispielsweise Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon.geschützt werden.

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Die Carboxylgruppe kann durch Bildung ihres Amids ihres Hydrazide oder durch Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe ist durch eine 3,^-Dimethoxybenzyl- oder Bis(p-methoxyphenyl)-methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist durch eine Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracctyl-, tert.-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergruppe ist durch ein Alkanol wie beispielsweise Methanol, Äthanol, tert.-Eutanol oder Cyanomethylalkohol, ein Aralkanol wie beispielsweise Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,ⁱJ,6-Trimethylbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brorr,-benzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, ein Phenol wie beispielsweise 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol, oder ein Thiophenol wie beispielsweise Thiophenol, Thiokresol oder p-Nitrothiophenol substituiert, Die Hydroxygruppe in Serin, Threonin oder Tyrosin kann gegegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Eine für den Schutz durch Veresterung verwendete Schutzgruppe ist beispielsweise eine Niederalkanoylgruppe wie beispielsweise die Acetylgruppe, eine Aroylgruppe wie beispielsweise die Benzoylgruppe oder eine Gruppe, die sich von Carbonyl ableitet, wie beispielsweise die Benzyloxycarbonyl- oder Äthoxycarbonylgruppe, Eine für den Schutz durch Verätherung verwendete Schutzgruppe

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ist beispielsweise die Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert.-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann durch die 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe erfolgen. Es ist jedoch nicht immer notwendig, diese Hydroxygruppen zu schützen. Die Aminogruppe oder Guanidinogruppe in Arginin kann durch die Nitro-, Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt werden, jedoch muß die Guanidinogruppe nicht unbedingt geschützt werden. Die Iminogruppe in Histidin kann durch die Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe geschützt werden, jedoch muß diese Iminogruppe nicht unbedingt immer geschützt werden.

Das Peptid der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte wird synthetisiert durch Kondensation von Aminosäuren oder von Peptiden aus zwei bis vier Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäure-Sequenz der Formel I«

Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine geschützte #-Aminogruppe oder eine aktivierte endständige Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid,

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welches eine freie itf-Aminogruppe und eine geschützte endstilndige Carboxylgruppe enthält, umgesetzt. Andererseits wird eine Aminosäure oder ein Peptid, welches eine aktive Λ-Aminogruppe und eine geschützte endständige Carboxylgruppe enthält, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, welches eine freie endständige Carboxylgruppe und eine geschützte tf-Air.inogruppe enthält, umgesetzt.

Die oben angegebene Carboxylgruppe kann aktiviert werden, wie beispielsweise als Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie beispielsweise durch überführung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Tr'ichlorphenylester, 2,^,6-Trichlorphenylester, Pentachlor- phenylester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxypiperidin- ester oder N-Hydroxypiperidinester, oder ein Carbodiimid, Ν,Ν¹-Carbonyl-diimidazol oder Isoxazoliumsalz wie beispielsweise Woodward-Reagenz.

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Die Kondensationsreaktionen werden bevorzugt nach der Wunsch-Methode, Azid-Methode, aktive-Ester-Methode oder Geiger-Methode durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion soll eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden.

Die Baueinheit, die das auf diese Weise erhaltene Peptid der Formel

(CH₂)₅C00R

Η-Α,-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-

enthält, worin A, und R die oben genannten Bedeutungen besitzen, wird der Ringschlußreaktion unterworfen. Die Ringschlußreaktion wird durch Kondensation der aktivierten to-Carboxylgruppe der

o(-Aminokorksäure mit der freien Aminogruppe der N-terminalen Aminosäure der Baueinheit durchgeführt. Bei der Kondensationsreaktion wird die Hydroxylgruppe des Serins und Threonins vorzugsweise geschützt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Peptidring (mit wahlweise geschützten aktiven Gruppen), der die tX-Aminokorksäure enthält, mit dem übrig bleibenden anderen großen Peptidbaustein, der wahlweise geschützte aktive Gruppen besitzt, kondensiert. Das heißt, das N-terminale Bruchstück, das aus der ersten bis sechsten oder neunten Aminosäure besteht, wird mit dem restlichen Teil des Peptids mit der Gesamtsequenz der siebten bis zehnten oder 31· Aminosäure kondensiert;. Wegen der Reaktivität beider Fragmente bei der Kondensation und um eine Racemisierung zu verhindern, wird Glycin vorzugsweise als C-terminale Aminosäure verwendet.

Gemäß der Erfindung wird vorzugsweise ein Peptid mit der aus der 1. bis 9· Aminosäure bestehenden Sequenz mit einem Peptid

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mit der aus der 10. bis 31· Aminosäure bestehenden Sequenz umgesetzt.

Die genannte Kondensationsreaktion kann ausgehend von dem Peptid mit der freien terminalen Carboxylgruppe, nach der sog. Wunsch-Methode, oder nach entsprechenden Methoden durchgeführt werden. Vorzugsweise kann sie mittels der Azid-Methode durchgeführt werden, ausgehend von einem Peptid mit einer terminalen Azid- oder Hydrazid-Gruppe, mittels der aktive-Ester-Methode oder mittels der gemischten Anhydrid-Methode.

Die Synthese des N-terminalen Fragments, nämlich des Nonapeptids mit der aus der 1. bis 9· Aminosäure bestehenden Sequenz, wird nachstehend im einzelnen erläutert werden; das Hexapeptid 1-6, das Heptapeptid 1-7 bzw. das Oktapeptid 1-8 kann jedoch ebenso mit Hilfe desselben Verfahrens hergestellt werden.

Die Nonapeptid-Sequenz kann durch Verknüpfen jeder Aminosäure mit einem niedrigen Peptid, das aus 2-4 Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz, ausgehend von der C-terminalen Aminosäure, besteht, hergestellt werden. Aminosäuren wie Glycin, Leucin, Valin, Οί-Aminokorksäure, Threonin, Methionin, Serin oder Asparagin werden vorzugsweise mittels der aktive-Ester-Methode kondensiert. Die niederen Peptide, wie z.B. das Tripeptid aus den Aminosäuren 2-4, werden vorzugsweise mittels der Geiger- oder der Wunsch-Methode kondensiert.

Bei der Kondensationsreaktion nach dem Azid-, Aktivesteroder Säureanhydridverfahren muß die endständige Carboxylgruppe im Decapeptid nicht unbedingt geschützt werden. Die Carboxylgruppe kann auch durch Veresterung z.B. mit Methanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden. Die Estergruppe, beispielsweise der Methylester, kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung oder durch überführung in ein

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Hydrazid entfernt werden, die Benzylestergruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Die Aminogruppe des Zwischenproduktes wird durch übliche Schutzgruppen wie beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-, Trityl-, tert.-Butoxycarbonyl- oder die 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe geschützt. Die Carboxylgruppe kann gewünschtensfalls durch herkömmliche Veresterung geschützt werden. Die Hydroxylgruppe in Serin und Threonin kann gewünsentenfalls durch Verätherung unter Verwendung von tert.-Butanol, Benzylalkohol oder eines anderen Alkohols geschützt werden.

Die oben genannten Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladium/Kohle abgespalten. Die N-Tritylgruppe wird durch wäßrige Essigsäure abgespalten und die tert.-Butoxycarbonylgruppe kann durch Trifluoressigsäure zersetzt werden. Die o-Nitrophenylsulfenylgruppe wird durch Chlorwasserstoff, Cyanwasserstoff oder schwefelige Säure in einem organischen Lösungsmittel abgespalten. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe wird durch ein Essigsäure/Ameisensäure-Wassergemisch (7:Ii2) abgespalten. Der Methylester, Äthylester oder p-Nitrobenzylester wird unter Verwendung von Hydrazinhydrat in das Hydrazid übergeführt. Die Methylestergruppe kann durch verdünnte Natriumhydroxidlösung, der tert.-Butylester durch Trifluoressigsäure abgespalten werden.

Ein C-terminales Peptid mit der aus der 7.-10. bzw. bis 31· Aminosäure bestehenden Sequenz, welches mit dem oben genannten N-terminalen Peptid kondensiert wird, wird vorzugsweise durch Verknüpfen der C-terminalen Aminosäure (Aminosäure Nr. 31) oder eines C-terminalen Bruchstückes, z.B. des Peptide mit der Sequenz der Aminosäuren 30 bis 31* 28 bis 31* 25 bis 31* 24 bis 31 oder 23 bis 31* mit jeder Aminosäure oder jedem

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niederen Peptid synthetisiert, das aus 2-4 Aminosäuren in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz besteht.

Beispielsweise kann ein C-terminales Teilstück mit der aus der 10.-31· Aminosäure bestehenden Sequenz hergestellt werden durch Kondensation von Aminosäuren und niederen Peptiden wie beispielweise dem Dipeptid aus den Aminosäuren 28 bis 29, dem Dipeptid 26 bis 27, dem Tripeptid 20 bis 22, dem Tetrapeptld 15 bis 18 und dem Tripeptid 10 bis 12 in der Reihenfolge der genannten Aminosäuresequenz und zwar ausgehend von der Seite mit der endständigen Carboxylgruppe nach der Aktivestermethode oder der Geiger-Methode. Als Schutzgruppen werden bevorzugt verwendet: Für die <*-Aminogruppe die tert.-Butoxycarbonylgruppe; für die Seitenketten-Carboxylgruppe von Asparaginsäure und Glutaminsäure die Benzylestergruppe; für die £-Aminogruppe von Lysin die o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe; für die Hydroxylgruppe von Serin, Threonin und Tyrosin die Benzylgruppe; und für die Aminogruppe in der Guanidingruppe des Arginins und für die Iminogruppe des Histidins die Tosylgruppe.

Die Schutzgruppe des C-terminalen, aus den Aminosäuren 7 bis 10 bzw. bis 31 bestehenden Teilstücks, welche die £X-Aminogruppe schützt, beispielsweise das aus der Sequenz der 10. bis 31· Aminosäure bestehende Dodecapeptidamid, wird nach irgendeinem geeigneten Verfahren entfernt. Die Tritylgruppe z.B. wird durch wäßrige Essigsäure abgespalten. Die Diphenylisopropoxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe und tert.-Butoxycarbonylgruppe

werden durch ein Eisessig Ameisensäure-Wasser-Gemisch,

Hydrierung bzw. Trifluoressigsäure entfernt.

Auf diese Weise erhält man das Hentriacontapeptidamid mit.

einer geschützten 0{-Aminogruppe, einer geschützten £-Aminogruppe

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rjid wahlweise geschützter Carboxyl- und/oder Hydroxylgruppe in ier Seitenkette. Bisse Schutzgruppen -werden mit Hilfe eines der eben beschriebenen "/erfahren abgespalten, vorzugweise einer Säure wie z.B. Fluorwasserstoff und schließlich erhält man das Produkt der Ferkel I.

Im Falle der Synthese des neuer, erfindungsgemäßen Polypeptids nach der Meryfield-pestphasen -Peptidsynthese kann die Hydroxygruppe in Serin, Threonin und Tyrosin durch beispielsweise eine 3enzy!gruppe geschützt werden; die Inincgruppe in Histidin kann beispielsweise durch die

l-Benzyloxyoarbonyl£nino-2_;2,2-trifluoräthylgruppe geschützt werden; die 'Suanidincgruppe in Arginin kann beispielsweise dursh die Nitrcgrupce geschützt werden:, und die Seitenkette in iar Glutaminsäure kann durch die B-snz^lestergruppe geschützt werden, 2ine Schutzgruppe für die ös'-Aminogruppe ist

sarbinyl- oder o-BrcrnbsnsylCÄycarbony !gruppe, Das geschützte Γ-sptid wird von dem vrägsrhars entfernt, und dis Schutsgruppe wird durch wasserfreien Fluorwasserstoff entfsrnt,

Sine einstufige Entfernung ääintlieher Schutsgruppen durch Hydrolyse unter Terwendung "cn Trifiuoressigsäur» liann erreicht "erden_s wenn die tert.-Outoxycarbcny !gruppe

aen Schutz äer Seitenketten-Carboxylsr^ppei -ierti-Bu^'läther ftlr den Schutz ier Hydroxylgruppe in Ssrin, "Threonin -ηά Tyrosin und ΰί-2 2a2/l-T-riflucr-i-tsrt;₃=-buto:-iy'2arbcn7l2.niincithylgruppt rar den Schuts ier lirdnosrupps in Histidin ver-

4 6 /

BAD ORIGINAL

Das neue Polypeptid der Formel I kann in Form der freien Base oder eines Salzes erhalten werden. Die freie Base kann in üblicher Weise aus ihrem Salz hergestellt werden. Die freie Base kann in ein pharmakologisch verträgliches Salz übergeführt werden durch Umsetzen mit einer anorganischen Säure, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Benzoesäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure.

Das neue Polypeptid kann durch Zugabe einer anorganischen oder organischen Substanz in einen Komplex übergeführt werden. Der Komplex wird hergestellt, indem eine anorganische oder organische Substanz einem langkettigen Polypeptid zugesetzt wird; der genaue Aufbau dieses Komplexes ist nicht bekannt, er hat Jedoch bei der Verabreichung eine lang anhaltende Wirksamkeit. Beispiele für diese komplexbildenden Substanzen sind anorganische Verbindungen, die von einem Metall, wie beispielsweise Calcium, Magnesium oder Zink, abgeleitet sind, insbesondere Phosphate, Pyrophosphate oder Polyphosphate dieser Metalle. Weitere Beispiele für komplexbildende Substanzen sind organische Verbindungen, wie beispielsweise nicht-antigene Gelatine, CMC, Polyglutaminsäure oder dergleichen.

Die hier verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

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BOC:	tert.-Butoxycarbonyl,	OBu:	t-Butylester,
AOC:	tert.-Amyloxycarbonyl.	Met:	L-Methionin,
DIP:		lie:	L-Isoleucin,
Cbz:	*	DMF:	Dimethylformamid,
ClCbz:	Diisopropylmethoxycarbonyl,	AcOÄt:	Äthylacetat,
BzI:	Benzyloxycarbonyl,	DCC:	Dicyclohexylcarbodiimid,
HOSU:		WSC:	N-Äthyl-N¹-diraethylaraino
Tos:	o-Chlorbenzyloxycarbonyl,		propyl-carbodiimid,
OÄt:	Benzyl,	HOBT:	1-Hydroxybenzotriazol,
OBzI:	N-Hydroxysuccinimid,	MeOH:	Methanol,
ONP:	Tosyl,	XtOH:	Äthanol,
OSU:	Äthylester,	AcOH:	Essigsäure.
Phe:	Benzylester,
Ser:	p-Nitrophenylester,
Asn:
Leu:
Thr:
VaI:
Pro:
Arg:
Asp:	N-Hydroxysuccinimidester,
Ala:	L-Phenylalanin,
TFA:	L-Serin,
TosOH:	L-Asparagin,
CHA:	L-Leucin,
DCHA:	L-Threonin,
THP:	L-VaIin,
GIy:	L-Prolin,
Lys:	L-Arginin,
Gin:	L-Asparaginsäure,
GIu:	L-Alanin .
His:	Trifluoressigsäure,
Tyr:	p-Toluolsulfonsäure,
Cyclohexylamin,
Dicyclohexylamin,
Te trahydrofur an,
Glycin,
L-Lysin,
L-Glutamin,
L-Glutaminsäure,
L-Histidin,
L-Tyrosin,

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, auf welche sie jedoch nicht beschränkt ist, näher erläutert.

Zunächst wird die Versuchsmethode zur Bestimmung der den Calciumspiegel im Serum senkenden Wirksamkeit, der Träger und das Entwicklersystem für die Dünnschichtchromatographie sowie die Bedingungen für die Analyse beschrieben.

Versuchsmethode

Die Probe wird mit einer 0,1 N-Natriumacetat-O,l#-Albuminlösung in geeigneter Weise verdünnt. Jeweils 0,2 ml der Lösung werden durch intra Injektion einzelnen männlichen Ratten verabreicht. Nach einer Stunde werden alle Ratten getötet, ihr Blut wird entnommen, und der Serum-Calcium-Wert jeder Blutprobe wird durch Atomabsorptionsspektrophotometrie bestimmt. Andererseits wird eine Standard-Yersuchsprobe B, welche einen aus Schweineschilddrüsen gewonnenen Extrakt dar-\(o9J^; stellt, so verdünnt, daß Lösungen von 2,5* 5» 10 und 20 MRC mU/0,2 ml erhalten werden. Jeweils 0,2 ml dieser Lösungen wer-^^! den durch intra Injektion an männliche Ratten verabreicht. Der Serum-Calcium-Wert der Ratten wird nach demselben verfahren wie oben beschrieben eine cStunde nach der Injektion bestimmt. Aus der Wirksamkeit der entsprechenden Standard-Yersuchsprobe wird die Wirksamkeit des Calcitonins in der Probe bestimmt.

Dünnschichtchromatographie (DSC)

Träger: Silikagel G Zellulose

50984S/10A7

95	: 5 :	3	1
85	: 15	: 5	: 10 :
85	: 10 ;	: 5
80	: 25 :	CVl	: 3 : 12
5 :	2 : [
10	: 10 ι	: 1 : 1
(untere Schicht)
2 :
15

Lösungsmittelsystem für den Entwickler:

1. CHCl, - MeOH - AcOH

2. CHCl, - MeOH - AcOH

3. CHCl, - MeOH - AcOH

4. CHCl, - MeOH - AcOH

5. CHCl₃ - Ä'tOH - AcOXt

6. CHCl, - MeOH - AcOH -

7. Benzol-AcOÄt

8. n-BuOH - Pyridin - AcOH

9. Methanol

Aminosäureanalyse

Die Probe wird mit 6 N-HCl (unter Zugabe einiger Tropfen Anisol) bei 110⁰C 40 - 45 Stunden lang hydrolysiert, unter vermindertem Druck getrocknet und dann der Aminosäureanalyse unterworfen.

Beispiel 1

Herstellung von:

CO-Ser-Asη-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-VaI-Leu-Gly-Lys-Leu-Scr-Gl n-(ilu-Leu-Hi s-Lys-Leu-Q!n-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Va1-Gly-Ai a-Gl v-Thr-Pro-NII*

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1 g (0,27 mMol)

BOC-Lys (CI Cbz)- Lcu-Ser ( Bz I ) -

Gl η-Gl u ( OBzI ) - Leu-Hi s-Lys (Ci Cbz )-Leu-Gln-Thr ( Bz 1 ) - Tyr ( Bz 1 ) - Pro-Arg (Tos ) -Thr ( BzI ) -Asp ( OBzI ) -VaI-GIy-Ala-Gly-Thr ( BzI ) - Pro-NH,

wurden in 10 ml TPA bei -5°C unter vermindertem Druck gelöst und 1 ml 4N-HCl/Dioxan zugesetzt. Nach 40-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung im Vakuum eingeengt und mit Äther versetzt, bis sich ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde über Natriumhydroxid getrocknet. Der getrocknete Niederschlag wurde in 5 ml DMP gelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von Triäthylamin unter Kühlung auf pH 7 eingestellt. Zu dieser Lösung wurde Wasser zur Bildung eines Niederschlags zugegeben. Der Niederschlag wurde über PpOj- getrocknet, wonach die de-BOC-Verbindung· als freie Base erhalten wurde.

1- CO-Ser (BzI) -Asn-Leu-Ser (BzI) -Thr (BzI) -HNCHCO-VaI-Leu-Gly-OH

wurden in 2 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde mit 90 mg HOSU und danach unter Kühlung mit 120 mg DCC versetzt und anschließend über Nacht gerührt. Nach der Reaktion wurde ausgefallener Harnstoff abgetrennt, und die so erhaltene Lösung wurde mit der oben erhaltenen freien Base de-BOC und mit 5 mg DMP als Lösungsmittel versetzt. Nach drei Tagen wurde der Lösung

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Wasser zugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, gründlich mit Essigester und Äther gewaschen und getrocknet, worauf 1,4 g

'5

LcO-Ser (BzI )-Asn-Leu-Ser (BzI)-Thr (BzI )-HNCHCO-Val-Leu-Gly-Lys (Cl Cbz )-Leu-Ser (BzI) -Gln-Glu (OBzI) -Leu-His-Lys (ClCbz) -Leu-Gln-Thr (BzI) -Tyr (BzI) -Pro-Arg (Tos) -Thr (BzI) -Asp (OBzI) -Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂

als Rohprodukt erhalten wurden. Diese 1,4 g des Rohprodukts wurden mit Fluorwasserstoff und 15 ml eines Phenol-Anisol (1 : 1)-Gemischs bei O⁰C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasserstoffs wurde der Rückstand mit Essigester und Benzol gewaschen, um das Produkt zu verfestigen, und anschließend wurde in 1 M-Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1X1 (Acetatform)-Säule gegeben und chromatographiert. Das Eluat wurde gefriergetrocknet, und es wurden 87O mg pulverförmiges Produkt erhalten.

870 mg dieses Pulvers wurden durch Sephadex G-50 Gelfiltration, CM-Zellulose-Ionenchromatographie und Sephadex LH-20 Gelfiltration gereinigt, wonach 200 mg (3450 MRC U/mg) des Produkts erhalten wurden«

Rf = 0,71 (Träger: Merck-Zellulosej Entwickler: n-Bu0H Pyridin - AcOH - Wasser (15 : 10 : 3 : 12)).

Aminosäureanalyse: Lys 0,91 X 2, His 0,92, Arg 0*93, Asp 1,02 X 2, Thr 0,73 X 4, Ser 1,00 X 3, GIu 1*00 X 3, Pro 0,99 X 2, GIy 0,92 X 3, AIa 1,11, VaI 0,90 X 2, Leu 0,78 X 5, Tyr 0,96, uf-Arainokorksäure 0,97·

Das Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt:

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Darstellung der Teilsequenz der Aminosäuren IO -

BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(BzI)-GIn-GIu(OBzI)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr (BzI)-Tyr (BzI)-Pro-Arg (Tos)-Thr (BzI)-Asp (OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂

(1) Herstellung von BOC-Thr(BzI)-PrO-NH₃:

67,7 g BOC-Thr(BzI)-OH, 33 g H-Pro-NHg-HCl und 29,6 g HOBT werden zu 220 ml THF hinzugefügt. Dazu gibt man 40 ml WSC unter Kühlen bei -5°C, rührt eine Stunde bei -5°C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand mit 800 ml Essigester versetzt, und anschließend wird zweimal mit 400 ml 1 N-HCl, zweimal mit 300 ml 5#-iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Wasser gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem

, 609846/104?

Magnesiumsulfat wird dia organische Schicht im Vakuum eingeengt. Das dlise Material wird auf eine· aus 150 g Silikagel b^s^öhsnde Säule zwecks Chromatographie aufgebracht. Es v/ird mii ainer Mischung aus Senscl-Äthylacetat {1:1}, Äthylacetat und Msthanol ir. dieser Raihenfclse entwickelt _} und die Fraktionen werden eluiert und durch Silikagal-Dünnschicht-2hr:^atographi-a untersucht, Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und in 500 cm"* üthylacetat gelöst ₃ sodann zweimal mit 3'3O cm" Seiger wässeriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser- g£was£lv2n. Nach dam Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt, Der Rückstand wird mit . r.-Hej-:ar. behandelt, wobei BOC-Thr(EsI)-PrD-NHp in Form eines weisen Pulvers erhalten wird'. '
(54,5 5 , Ausbeute ι 61,ii Ä). Hf₁ = 0,^8 ^^³= 1Ü,O° {c=i₃ DMP)

0% HJi NJi GeT.: 62,04 8,01 9,90

62_S2Q 7,71 10,30

-Ci * ·

ν2) Herstellung von BGC-Ala-Gly-OSzl:

94,6 g 2C-AIa-OH, 168,8 g H-Giy-CBsl.TosOH und'67,6 g HG3T werden in ^SG cm-' THF gelöst, und dazu werden 91,5 cm-' WSC hinzugefügt: nun wird eine 3tur.de bei O⁰C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt» Das Rsaktionsgemisch wird in 7«kuuin eingeengt, und der Rückstand wird in 800 ca·' Xthylacssat gelöst, Ss werden 500 531"In-HCl hinaugefügt, der Nieder

509843/1047 BAD ORiGINAL

schlag wird abfiltriert, und die Äthylacetatschicht v;ird r.it 400 cm ^n-HCl, zweimal mit einer 5/5ißen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit η-Hexan behandelt, wobei 152,5 g rohes Material erhalten werden. Es wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 144 g EOC-Ala-Gly-OBzI erhalten werden. Ausbeute 85,7 Jf. Fp. 87-88,5⁰C DSC: 1 Fleck, RF₁ = 0,59.
(3) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OH:

101 g BOC-Ala-Gly-OBzl werden in 500 cm³ THF gelöst und unter Zugabe von 7 g 5% Palladium/Kohle hydriert, Nach 6 Stunden wird der Katalysator entfernt, es wird eingeengt und in 800 cm³ THF gelöst. Nun ."wird wiederum unter Zugabe von 5% Palladium/Kohle hydriert. Nach 4 Stunden wird der Katalysator entfernt , und es wird".im Vakuum eingeengt; der Rückstand wird durch Behandlung mit η-Hexan verfestigt. Beim·Umkristallisieren aus Äthylacetat-THF-n-Hexan erhält man 72 g BOC-Ala-Gly-OH, Ausbeute: 97,4 Jf₁ Fp. 129-132⁰C. DSC : 1 Fleck (Lösungsmittel

	₁₈N₂O₅):	,80	7	,41	N*	,29
Elementaranalyse (C-qH	c%	,77	7	,37	11	,38
	48				11
Gef.:	48
Ber.:

6-03048/1047

Herstellung von BOC-Ala-Gly-ThrCBzU-Pro-NHp:

10,0 g BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden zu 30 cm³ TFA bei -5⁰C gegeben, es wird 30 Minuten gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, filtriert und über Natrium getrocknet, wobei H-Thr(Bzl)-Pro-NH-TFA erhalten wird.

6,08 g des in (3) erhaltenen BOC-Ala-Gly-OH und 3,3*4 g HOBT werden zu 100 cm⁵ THF hinzugefügt, wozu ή ,5 cm⁵ WSC bei -5⁰C (pH k_s0) hinzugefügt werden. Nach einstündigem Rühren bei -5⁰C und siebenstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird die Mischung auf r5°C gekühlt, 0,8 cm³ WSC v/erden hinzugefügt und der pH-Wert wird auf ^1,0 eingestellt;nun wird eine Stunde bei -5°C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Ί00 cm-⁵ Äthylacetat gelöst, mit gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal ■ζ

mit 100 ciTi 5iiger wässeriger Natriumbicarbonat lösung, mit 100 Cm³^n-HCl, welches mit NaCl gesättigt ist, und 50 cm⁵ Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Xthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, welches zweimal mit Wasser gewaschen ! und sodann mit der Äthylacetatschicht

vereinigt wird. Die organische Schicht wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird unter Verwendung von 150 g Silikagel chromatographiert. Durch^xdie Säule wird Äthylacetat und Methanol geleitet. Das Methanol-Eluat wird im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird η-Hexan hinzugefügtem . das BOC-Ala-Qly-Thr(BzI)- PrO-NH₂ aus-zu-kristallisieren. Fp.: 106 - 116°C, 11j5 g. Ausbeute:' 87.,3 %.

SÖ9Ö4S/104?

- 23 DSC: 1 Fleck/Rf^ = 0,29, Rf₆ ■- 0,52

/QIO

(5) BOC-Val-Oly-OXt

219,2 g BOC-VaI-OH-DCHA werden in " * 1 Liter Äthylacetat eingetragen. Die Lösung wird zweimal mit 600 cnr^n-HCl ■und 500 cnr Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird, die Lösung im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand werden 100 cm** TH? und JJOO cnr Dichlormethan hinzugefügt _D und dazu werden 69»8 g H-Gly-OÄt.HCl und 70 cnr* Triäthylamin. gegeben. Nun werden 103,2 g DCC bei -5⁰C hinzugefügt, und "es wird eine Stunde . bei -5⁰C und über Macht bei Zimmertemperatur gerührt» Zu dem Reaktionsgemisch werden 10 cm Essigsäure hinzugefügt _s es wird eine Stunde gerührt und filtriert. Das Filtrat wird zweimal mit 500 cnr^n-HCl, zweimal mit 500 cnr Seiger Natriumbiearbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Mach dem Trocknen über x^asserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum ©ingeengt. Der Rückstand wird dseimal unter Verwendung von Äthylacetat-n-Hexan*'umkristallisiert» wobei 105s¹? g BQG-Val-Gly-ÖÄt erhaltea werden₈ Pp₀ 1 95 - 96°C. Ausbeute :

Herstellung von BOC-VaI-GIy-OH:

96,8 g BOC-Val-Gly-OÄt werden in 150 cm^ .Methanol gelöst ₃ und dazu werden 368 cm·⁵ einer1n-NaOH°Lösung bei -5⁰C hinzugefügt. Mach ©inständigem Rühren wird der pH-Wert mit1n-HCl auf 8_s0 eingestellt ο Das Methanol wird durch Einengen im Vakuum entfernt;,

di© wässerige Schicht wird mit 100 em Ä thy lather getiraschen. wässerige Schicht wird durch Zugabe von1n-HGl auf einen i5 von 2_s0 eingestellt. Di© wässerige Schicht wird alt

13848/104? BAD ORIGINAL

2816399

200 enr Äthylacetat viermal extrahiert. Der Extrakt wird über

"■jsss-srireiem Natriumsulfat getrocknet und daraufhin in Yakuum ©ingeengtο Der Rückstand wird mit n-Kexan behandelt und aus lthyIaaetat-n=Hexan umkristallisiert,, wobei 85 _a5 g SQC-YaI-GIy-OH erhalten werden. Ausbeute : 91 ^k %° Fp.:

112 - HT⁰C₃ CZerSo) DSC; 1 Fleck, Rf₁ - O₃35o CT) Herstellung von BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BsI)-PrO-HH₂:

10,5 g BOC-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₅ werden su 35 cv? ■

Sm

1^;?A bei -5°v eingetragene Nach 30 Minuten dauernden Rühren wird im Vakuum eingeengt« Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt j das ausgefällte Material wird abfiltriert und im 7akuur.i über Hatriuiroiydroxid getrocknet _s wobei H-Ala-Gly-Thr (Bsi)"Fro-MKg.,TPA erhalten wird*, Dazu werden 100 cm' THP Mng«gefügt₃ 'und Triäthylarain vrird bei =-5°C zugesetztem isn pK^'iert auf 5_a0 einsustellen.

5s^S9 S BOO-Val-Gly-OH.und 2₃ββ g HOBT werden eingetragen. %'i iisssr Mischung gibt man tropfenweise 3₅β1 czn^ WSC bei *5°0 ^rand rührfc sine Stunde bei -5⁰C und dann über Nacht' bei

Bas Reaktionsgemisch wird im Vakuum

3 j und der Rückstand wird in 300 cm Chloroform gelöst.

Sie Lesung wird zweimal mit 200 cm in-HCl, v;elches mit KaCl gesättigt ist_a zweimal mit 200 cm⁵ 5$iger Natriumbicarbonatläsung, welche mit NaCl gesättigt ist₃ und mit 75 cm^ gesättxger

NaGl-Lösung in dieser Reihenfolge gewaschen. Naeh dem Trocknen der Lösung übes* wasserfreiem Natriumsulfat.,.wird die- organische Tak^um eingeengte Beim Umkristallisieren aus hy2,äthsr· erhält man 12 ₀0 g B0C=-Val»ai2f°Ala-Qly-

s 88_D3 i?o Fp₀ 121 - 135^G (Z©2«s_s)

iM

BAD ORIGINAL

DSC : 1 Fleck (Lösungsmittelsystem.6).

= 10,30° (c= 1, DMP)

Elementaranalyse	(C₃	3^H5	1^N7°9 *	1 H₀O)	NJS	,90
		C%		H£	13	,03
Gef.:		56	,67	7,¹O	1*J
Ber.:		56	,72	7,50

(8) Herstellung von BOC-AspiOBzD-Val-Gly-Ala-Gly-ThrCBsl)-PrO-NH₂:
100 cm³ TFA werden zu 33,1 g BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-

g bei -5°C eingetragen.es wird 30 Minuten,geführt und sodann im Vakuum eingeengt. Zu dem Rückstand wird Äthyläth^r hinzugesetzt, und das ausgefällte Material wird im,Vakuum über NaOH getrocknet. 80 cnr DMF und ferner Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 werden hinzugefügt. Nach Zugabe von 950 mg HOBT und 30,2 g BOC-Asp(OBzI)-OSU wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 eingestellt, und es wird_% aweii-Tage gerührt. Der pHrWert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin während des Rührens auf 7*5 eingestellt. Nun werden neuerlich 2,0 g BOC-Asp(OBzl)-OSU hinzugefügt, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, und es wird über Nacht gerührt.' Zu dem Reaktionsgemisch wird eine große Menge Wasser hinzugefügt, und die ausgefällte klebrige Substanz wird abdekantiert und durch Behandlung mit Äthyläther auskristallisiert. Die wässerige Schicht wird mit Chloroform extrahiert, und der Extrakt wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei eine klebrig© Substanz ausfällt. Die ausgefallene klebrige Substanz wird

609846/1047

■ - 26 -

üii'ö K thy lather behandelt, um sie zu kristallisieren« Die Feststoffe werden vereinigt und viermal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert und sodann mit heißem Äthylacetat-Äthyläther gewaschen und getrocknet, wobei 3*1,2 g BOC-ASp(OBzI)-VaI-GIy-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂ erhalten werden. Ausbeute : 79,6 %. Pp.: 195 - 199°C. DSC: 1 Fleck. Rf₅ = O,46;jtf]{*⁸= 18,27° Cc = I,

DMF).	c%	):	m	Ni
Elementaranalyse (C	58,08	6,90	12,47
	57,88	7,07	12,27
Gef.:
Ber.:

(9) BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂

30 cm⁵ TFA werden zu 7,2 g BOC-ASp(OBzI)-VaI-GIy-AIa-GIy-Thr(BzI)-PrO-NH₂ bei -5⁰C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt, und das ausgefallene Material wird im Vakuum Über NaOH getrocknet. 15 cnr ΤΑΨ werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 7,5 eingestellt. Nach der Zugabe von 100 mg HOBT und 4,0 g BOC-Thr(BzI)-OSU wird der pH-Wert mittels N-Methylmorpholin eingestellt, und es wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Durch Zugabe von 3 cm DMF und N-Methylmorpholin wird der pH-Wert auf 7,5 eingestellt, worauf über Nacht gerührt wird.

Nachdem die Reaktion beendet ist, wird eine große Menge Wasser hinzugefügt, und das ausgefallene Material wird filtriert und dreimal aus Methanol-Äthyläther "umkristallisiert, wobei 6,7 g BOC-Thr(BzI)-Asp(OBsI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NB₂

609846/104?

2616393

erhalten werden. Ausbeute : 77,1 %. Fp.: 172 - 188⁰C. DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 3 und 6).^]^ = -13,65⁰C (c=l, DMP).

Elementaranalyse (C.-r-Η^,-Ν-.Ο. ,,.·,.· H₀O):

jj ij y 14 2 2

c% - n% Njs

Gef.: 60,31 6,92 11,58

Ber.: ' ·· 60,31 7,00 11,51

(10) Herstellung von AOC-Arg(TOS)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr (BzI)-Pi¹O-NH₂:

20 cm³ TPA werden bei -5⁰C zu 6,52 g BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr· (Bzl)-Pro-NH₂ hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äthyläther behandelt_s und die ausgefallene Substanz wird im Vakuum über NaOH getrocknet. 25 cnr DMP werden hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei -5⁰C auf 5,0 eingestellt. Es werden 972 mg HOBT und 3,2 g ÄÖG-Arg(Tos)-OH hinzugefügt, worauf l_a3 cm·³* WSC tropfenweise unter Kühlung bei -5⁰C hinzugefügt werdenj daraufhin wird eine Stunde bei -5⁰C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt .

Zu dem Reaktionsgemisch wird Äthylacetat hinzugefügt, und der Niederschlag wird mit heißem Methanol (iJOG cm³)-Äthyläther C50 cjir) behandelt und daraufhin mit heißem Methanol (30© sm³)-&thylather (100 cm³) behandelt,wobei 7,0 g ÄOC-Äs?g(Tös)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl >-Pro-NH₂

erhalten werden. Ausbeute : 82,7 %· Fp.: 187 - 192°C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsystem 2 und 5) Rf₃ = 0,42. Elementaranalyse (CgnH-cNjjO^S.HgO)^:

c%	,97	HZ	NSi	,76	SJi	26
57	,01	"6,88	12	,75	2,	24
58	6,84	12	2,

Gef.:
Ber.:

Aminosäurezusammensetzung: NH, 1,28, Arg 0,95 (1), Asp 1,04 (1), ■Thr 1,50 (2), Pro 0,98 (1), GIy 1,84 (2), AIa 1,00 (1), VaI 1,01 (1).
(11) Herstellung von BOOTyr(Bzl)-Pro-OBzl:

37,6 g BOC-Tyr(Bzl).OH.CHA werden mit 300 cm⁵ Äthylacetat und 120 cnr7n-HCl gemischt; die Schichten werden getrennt, und die Äthylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt, und der ölige Rückstand wird in 80 cm Dichloräthan gelöst. Dazu weüden 19,3 g H-Pro-OBzlvHCl hinzugefügt. In die Mischung werden 14,6 cnr WSC bei -5⁰C eingetragen, worauf eine Stunde bei -5⁰C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird.

Das Reaktions^emisch wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit 800 cnr⁵ Äthylacetat und 400 cm⁵4n-HCl ausgeschüttelt. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt. Die organische Schicht wird zweimal mit 300 cnr'fn-HCl, zweimal mit 300 cnr Wasser, dreimal mit 300 cnr 5£iger Natriumbicarbonatlösung

und zweimal mit 300 cm Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen.

Die organische Schicht wird über Natriumcarbonat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das rohe Produkt wird durch Säulen- ·

609846/104?

Chromatographie unter Verwendung von 400 g Silikagel untersucht. Durch die Säule wird eine Chloroform-Äthylacetat-(4:1)-Mischung geleitet, und die Eluate werden mittels Dünnschichtchromato-. graphie unter Verwendung des Lösungsmittelsystemf 1 untersucht, wobei öliges BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl (43 g), Rf₁ = 0,88, erhalten wird.

(12) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl: 50 cnr TFA werden unter Kühlung auf -5⁰C in 20 g BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl eingetragen, es wird 10 Minuten bei -5⁰C und 50 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über NaOH über Nacht getrocknet; daraufhin werden 30 cm DMF hinzugefügt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin bei -5°C . auf 7,5 eingestellt.470 mg HOBT und 14,2 g BOC-Thr(Bzl)-OSU werden hinzugefügt, und es wird eine Stunde bei -5⁰C und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens. wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von N-Methylmorpholin bei einem pH-Wert von 7 gehalten. Nach zwei Tagen wird 1 cnr Dimethylaminopropylamin hinzugefügt, und es wird weitere zwei Stunden gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit 500 cm^ Wasser und 500 cm^ Äthylacetat geschüttelt) worauf die Äthylacetatschicht abgetrennt wird. Die wässerige Schicht wird neuerlich mit 200 cm⁵ Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten werden vereinigt, dreimal mif/n-HCl, Wasser,. 5?iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser' in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Entwässern über wasserfreiem

Magnesiumsulfat wird die organische Schicht im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 19,6 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird aus dem gleichen Lösungsmittel umkristallisiert, wobei 14,4 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(BzI)-Pro-OBzl erhalten werden. Ausbeute : 54,9 Ϊ. Rf₂ = 0,67.'
(13) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH:

14,2 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl werden in 30 cm³ THP gelöst, und es werden 23 cm Ίη-NaOH-Lösung tropfenweise während 15 Minuten bei -5⁰C hinzugefügt. Nach vierstündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird der pH-Wert durch Zugabe von In-HCl auf 7 eingestellt, worauf im Vakuum zur Entfernung von THF eingeengt wird. Zu der wässerigen Schicht wird Wasser hinzugefügt, UTkd nach dem Waschen mit Äthyläther wird der pH-Wert der wässerigen Schicht durch Zugabe von1n-HCl auf 2 eingestellt. Nun wird zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet_/worauf im Vakuum eingeengt wird. Der Rückstand wird aus Äthyläther-n-Hexan kristallisiert, wobei 12 g rohes Material erhalten werden. Dieses rohe Material wird in Äthylacetat gelöst, Äthyläther wird hinzugefügt und die Lösung wird bei-seite gestellt, wobei durch allmähliche Zugabe von n-Hexan 10,5 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-'0'H auskristallisieren. Ausbeute : 84 %. Fp. 136-138⁰C. DSC: 1 Fleck, Rf₁ = 0,68 Rf₅-= 0,63.

£09848/1047

- 31 Elementaranalyse: (C₃₇H₁₁₅N₃O₈): 2616399

	HS	m
67,33	6,85	6,40
67,35	6,88	6,37

(14) Herstellung von BOC-Thr(BzI)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-Tos-Thr(Bzl) Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-GIy-Thr(BzI)-PrO-NH₂: 6,0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-, Thr(Bzl)-Pro-NH₂ werden zu 20 cm³ TFA bei -5⁰C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt und im Vakuum über NaOH getrocknet. 20" cnr DMF werden hinzufügt, und nach dem Einstellen des pH-Wertes mit Triäthlyamin bei -5⁰C auf 4,5 werden 851mg HOBT und 4,2 g BOC-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-OH hinzugefügt; sodann werden 1,2 cm⁵ WSC tropfenweise bei -5⁰C hinzugegeben.· Das Rühren wird eine Stunde bei -5⁰C und sodann über Nacht bei Zimmertemperatur fortgesetzt. 300 cnr Methanol und 100 cm^ Xthylather werden in das Reaktionsgemisch eingetragen, und das ausgefällte Material wird abfiltriert, welches dreimal aus Methanol-Ä thy lather, ' DMF-Äthylather und Methanol-Äthyläther in dieser Reihenfolge umkristallisiert wird, wobei 5,8 g BOC-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂ erhalten werden. Ausbeute : 71,3 %· Fp. *· 186,5 - 190⁰C (Zers.). DSC: 1 Fleck (Lösungsmittelsysteme 5 und 6).&\q = -15,86° (c=l/ DMF),

6G98U/1047

- 32 Elementaranalyse (C₁₀₀H₁₂₈N₁₆O₂₂S^H₂O): 2616399

C% H% N% s%

Gef.: 61,11» 5,63 11,55 1,73

Ber.: 61,68 6,68 · 11,51 1,65

Aminosäureanalyse: NH, 1,60, Arg 0,92 (1), Asp 1,04 (1), Thr 2,1 (3), Pro 2,08 (2), GIy 1,86 (2), VaI 1,00 (1), Tyr 0,91 (1).

(15) Herstellung von BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂:

5,1 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp (OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-(Bzl)-Pro-NH₂ werden zu 20 cm⁵ TFA bei -5⁰C hinzugefügt, es wird 30 Minuten gerührt und sodann im. Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther behandelt und über NaOH im Vakuum getrocknet. Es werden 18 cm³ DMF hinzugefügt, worauf Triäthylamin zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 sowie 100 mg HOBT und 1,51 g BOC-GIn-ON? zugesetzt werden; sodann wird zwei Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Während des Rührens wird der pH-Wert durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7,5 gehalten. Ferner werden 0,2 g BOC-GIn-ONP zugesetzt,· und der pH-Wert wird unter Rühren über Nacht auf 7,0 eingestellt. Nach der Reaktion wird eine große Menge Wasser zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, um das Produkt auszufällen, welches dreimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert wird. Man erhält so 1,8 g BOC-Gln-Thr (Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Oly-Thr ·

009846/1047
BAD ORIGINAL

(BzI)-PrO-NH₂ . Ausbeute : 82,9£. Fp. 178 -l82°. Rf= 0,67, IfCj^ =15,19° (c = l, DMF).
Elementaranalyse (C_inc-H ,-N_{1 fl}0_o,.S· . 2H₀O):

\j /ο Π/4 Vi /α Ο/β

Gef.: 59,92 6,56 12,05 1,17

Ber.: 59-98 6,71 11,99 1,53

(l6)Herstellung von BOC-Lys (ClCbz)-Leu-OÄt:

7,32 g BOC-LyS(ClCbZ)-OH.tert.Butylamin-salz, welches in Xthylacetat suspendiert ist, urerden dreimal mit' 100 cm^n-HCl und 100 cm^ Wasser gewaschen. .Nachdem Trocknen über wasserfeiem Magnesiumsulfat wird das Äthylacetat abdestilliert. Zu dem Rückstand gibt man 60 cm^ Dichlormethan, 2,93 g H-Leu-OÄt.HCl und 2,0 g HOBT, ferner 2,75 cm⁵ WSC bei -5⁰C und rührt eine Stunde. Es wird 'nun- über Nacht bei Zimmertemperatur weiter gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Dichlormethan im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 150 cm^ Xthylacetat

G09846/1047

gelöst. Die Lösung wird mif/n-HCl, 5#iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und anschließendem Einengen im Vakuum wird der Rückstand aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 6,4 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OÄt erhalten werden. Ausbeute: 76,6%. Fp.: 76 - 79°C.
(l7) Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH:

Zu einer Lösung von 6,13 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OÄt in 20 cm·⁵ Äthylacetat werden 12,1 cnr'/n-NaOH bei O⁰C hinzugefügt, und es wird zwei Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Ferner werden 1,1 cnvVn-NaOH zugesetzt, und nach-' 1 ,Stunde dauerndem Rühren wird der pH-Wert auf 7 eingestellt, und es wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äthyläther gewaschen, die wässerige Schicht wird auf den pH-Wert von 3 eingestellt, und es wird dreimal mit 100 cm-⁵ Äthylacetat extrahiert. Nach dem Waschen der Äthylacetatschicht mit 100 cm-⁵ Wasser und Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 cm^ Äthyläther gelöst, untej* vermindertem Druck eingeengt und getrocknet, wobei

BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH in Form eines Pulvers erhalten werden.

Fp.: >1J6 - 60⁰C. [flOj⁹ = -10,68° (c=l, DMF). Elementaranalyse ^C25^H38^N3°7^C1· T ^H2° ^:

Gef.: Ber. :

c%	,25	H*	35	Νί	OO
56	,21	7,	31	8,	87
56	7,	7,

609846/1047

U8) Herstellung von DOC-Leu-His-OH: 261639 9

3,83 g H-His-OH.HCl werden unter Erhitzen in 25 cm·^ Wasser gelöst. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur werden 1,84 g Natriumbicarbonat und sodann 270 mg HOBT, 8,53 g BOC-Leu-OSU und 55 cnr THF hinzugefügt. 10 cm^ Wasser werden zugesetzt, und es wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von wässerigem Natriumbicarbonat auf 7 eingestellt, worauf 1,3 g BOC-Leu-OSU zugesetzt werden und gerührt wird. Nach 6 Stunden werden weitere 1,3 g BOC-Leu-OSU hinzugegeben, und das Rühren wird über Nacht fortgesetzt. Nachdem das Ende· der Reaktion durch Prüfung mittels Dünnschichtchromatographie festgestellt worden war, wird das Reaktionsgemisch zur Entfernung von organischem Lösungsmittel im Vakuum eingeengt, und die übrigbleibende wässerige Schicht wird mit Xthylacetat gewaschen. Die wässerige Schicht wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und auf den Kopf einer mit HP-20 (2,3 x 18 cm) gefüllten Säule gegossen; nun wird mit Wasser gewaschen, bis das Wascheluat eine negative Ninhydrin-Reaktion aufweist. Sodann wird mit Methanol eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingeengt, und zu dem ..Rückst and " wird Äthyläther hinzugesetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und zweimal mit Methanol/Äthyläther umgefällt, wobei 3,9** ß getrocknetes Pulver erhalten werden. Ausbeute: 53,5 %»'

Pp.: 178 - 18O⁰C (Ä-]£	^y = -0,19 (c=l	C%	, DMP).	N*	,71
Elementaranalyse (C₁	2	53,39	0)		,73
	53,65	η	!H
Gef.:	7,65
Ber.:	7,79

609846/1047

(19)Herstellung von BOC-Leu-Ser(BzI)-OH:

11,7 g H-Ser(Bzl)-OH werden in 50 cn? V/asser gelöst, und 10,1 g Natriumbicarbonat und 10 cirr Dioxan werden hinzugefügt. Nun setzt man 16,4 g BOC-Leu-OSU in 15 cnr⁵ Dioxan und 5 cm DMF hinzu. Nach dem Rühren über Nacht wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 7 eingestellt, und es wird zur Entfernung des organischen Lösungsmittels im Vakuum eingeengt. Die-wässerige Schicht wird mit 100 cnr Äthylacetat geschüttelt, und die organische: Schicht wird .zweimal mit^n-HCl und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet*, im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 16,1 g BOC-Leu-Ser (EzI)-OH erhalten werden. Ausbeute: 78,8 JC. Fp.: 82 - 86°C. (20)Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH:

l|,l g (10 η Mol) des BOC-Leu-Ser(BzI)-OH

werden in 25 cm auf -5⁰C gekühltes TFA eingetragen, es wird 25 Minuten gerührt und daraufhin im Vakuum eingeengt. Zu dam Rückstand wird Äthyläther zugesetzt, wobei das Material ausfällt, ■welches über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die Kristalle werden in 8 cnr DMF gelöst,und es werden 8 g BOC-Lys(ClCbz)-ONP und 270 mg HOBT zugesetzt, der pH-Wert wird mit N-Methylmorpholin auf 8 eingestellt, worauf über Nacht bei Zimmertemperatur gekühlt wird. Man gibtIn-HCl hinzu und löst den Niederschlag in "Chloroform welches dreimal mif/n-HCl, dreimal mit 5JCiger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen wird. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird -.die Chlorof.ormschicht im Vakuum eingeengt.

6Ό9846/10Α7

- yj -

Der Rückstand wird dreimal aus Äthylacetat-n-Hexan umgefällt

ferner dreimal wiederholt aus Äthyläther-n-Hexan umgefällt und sodann durch eine Säule aus l80 g Silikagel geleitet. Diese wird mit Äthylacetat-Benzol (2:1) gewaschen und mit Methanol eluiert. Das Methanoleluat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-n-Hexan umkristallisiert, wobei 5,25 ß BOG-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH erhalten werden. Ausbeute: 7^,5 %> Fp.: 84.. - 100⁰C (Zers.). DSC: 1 Fleck. Aminosäurezusammensetzung: Lys 0,98 (1), Leu : 1,00 (i), Ser: 0,82 (I)V

(21)Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NH₂:

7,65 g des BOC-Gln-Thr

(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂ werden in 35 cm³ TPA bei -5⁰C gelöst, 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Diäthylather behandelt, und das ausgefallene Material wird über NaOH im Vakuum getrocknet. Daraufhin wird es in 25 cm³ DMF gelöst, und 600 mg HOBT, 2,35 g des in (2) erhaltenen BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH sowie 0,69 cm³ WSC bei -5°C werden hinzugesetzt, worauf eine Stunde bei -5⁰C und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt wird. Zu dem Reaktionsgemisch wird'/n-HCl hinzugesetzt, wobei das Material ausfällt, welches zweimal aus Methanol-Äthyläther umgefällt und getrocknet wird, wobei 8,0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,3 2. Fp·': >l64°C (Zers.)

= -18,65 (c=l, DMF)

609846/1047

BAD ORIGINAL

Elementaranalyse

CSS	H?	NS
59,63	6,67	11,78
59,75	6,62	11,71

Gef.: Ber.:

(22) Herstellung von BOC-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH₂:

7,68 g des BOC-LyS(ClCbZ)-LeU-GIn-

Thr(BzI)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr( BzI)-PrO-NH₂ werden in 40 cm³ TPA bei -5°C gelöst, es wird 30 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 20 cm³ DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 5 eingestellt, worauf 430 mg HOSU, 1,37 g BOC-Leu-His-OH und 58 cm⁵ WSCO bei -5⁰C hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde -5⁰C geröhrt und daraufhin über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wird ^n-HCl hinzugefügt, und das ausgefallene Material wird aus Methanol-Xthylather umgefällt und ferner aus DMF-Äthyläther wiederholt umgefällt. Beim Trocknen erhält man 8,30 g des Produktes. Ausbeute : 98,2 %. Pp.: I67 - 175⁰C;

³ = -17,45 (c=l, DMF)."
Elementaranalyse (C₁₃₇H₁₈₂N₂₅O₃₀SCLHCl^H₂O):

\jje ti/t W/i

Gef.: 58,19 6,71 12,42

Ber.: 58,04 6,79 12,35

6 0 9846/1047 BAD ORIGINAL

(23) Herstellung von BOC-GIu(OBzI)-LeU-HiS-LyS(ClCbZ)-LeU-Gln-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-VaI-GIy-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NH₂:

7,64 g des BOC-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NHp werden in 35 ml TFA bei -5°C gelöst, es wird 40 Minuten gerührt und sodann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 30 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, worauf 70 mg HOBT und 1,82 g BOC-GIu(OBzI)-OSU hinzugefügt werden. Der pH-Wert wird erneut mit N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, und es wird 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 1 N-HCl, und der gebildete Niederschlag wird zweimal aus Methanol-Äthyläther umkristallisiert. Nach dem Trocknen werden 7,55 g des Produktes erhalten. Ausbeute: 92,5$· Fp.: 161 - 169°C (Zers.).

Aminosäurezusammensetzung: Lys: 0,94, His: 0,83 (1), Arg: 1,05 (1), Asp: 1,08 (1), Thr: 2,52 (3), GIu: 2,06 (2), Pro: 2,16 (2), GIy: 2,00 (2), AIa: 1,06 (1), VaI: 1,10 (1), Leu: 1,82 (2), Tyr: 0,73 (1).

(24) Herstellung von BOC-GIn-GIu(OBzI)-LeU-HiS-LyS(ClCbZ)-Leu-Gln-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-VaI-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂:

7,29 g des BOC-GIU(OBzI)-LeU-HiS-LyS(CICbZ)-LeU-GIn-TlIr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂ werden in 30 ml TFA bei -5°C gelöst, es wird 45 Minuten gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 7 eingestellt, worauf 100 mg HOBT und 1,4 g BOC-GIn-ONP hinzugefügt werden. Nun wird über Nacht bei

609846/1047

Zimmertemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 1 N-HCl, sammelt den Niederschlag und wäscht ihn mit Wasser. Es wird dreimal wiederholt umgefällt, wobei 7,0 g des getrockneten Produktes erhalten werden. Ausbeute: 91j5#« Pp.: 171 - 175°C (Zers.).

(25) Herstellung von BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(BzI)-Gln-Glu-(OBzI)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gin-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg (Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-VaI-GIy-Ala-Gly-Thr(BzI)-Pro-NH₂:

6,70 g des BOC-GIn-GIu(OBzI)-LeU-HiS-LyS(ClCbZ)-LeU-GIn-Thr(BzI)-Tyr(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Thr(BzI)-Asp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzI)-PrO-NH₂ werden in 30 ml TPA bei -5°C gelöst, 2,2 ml 4 N-HCl/Dioxan werden hinzugefügt, und es wird 45 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingeengt, und Äthyläther wird hinzugefügt, wobei das Material ausfällt, welches gründlich mit Äthyläther gewaschen und Über NaOH im Vakuum getrocknet wird.

Die so erhaltene Substanz wird in 15 ml DMF gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 5*5 bis 6 eingestellt, worauf J56O mg HOBT, 1,86 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(BzI)-OH und 540 mg DCC, gelöst in 5 ml DMP, hinzugefügt werden. Sodann wird eine Stunde gerührt und anschließend über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. 1 N-HCl wird hinzugefügt, und der gebildete Niederschlag wird abfiltriert. Der in Äthanol unlösliche Teil des Niederschlages und das ausgefallene Material, welches durch Zugabe von Äthyläther zum Piltrat erhalten wurde, werden vereinigt. Man fügt Methanol-Diäthyläther hinzu und kristallisiert den Niederschlag wiederholt aus Methanol-Äthyläther um, wobei 7*0 g des Produktes erhalten werden. Ausbeute: 87,6#. Fp.: 171 - 177⁰C (Zers.).

= -18,45 (c=l, DMP).

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Elementaranalyse (Cjg^Hg^^gOj^SClgO)

C# H% N# ClJi

Gef.: 58,43 6,65 11,83 2,64 0,94

Ber.: 58,21 6,74. 11,81 2,80 0,84

Aminosäurezusammensetzung: Lys: 1,86 (2), His: 0,74 (1), Arg: 0,97 (l), Asp: l,04 (1), Thr: 2,55 (3), Ser: 0,53 (3), GIu: 2,85 (3), Pro: 2,08 (2), GIy: 2,00 (2), Ala: 1,04 (1), VaI: 1,04 (l), Leu: 2,67 (3), Tyr: 0,67 (1).

Die Sequenz der Aminosäuren Nr. 1 - 9s

LcO-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCO-VaI-Leu-Gly-OH wird wie folgt hergestellt:

(26) Herstellung von

BOC-Thr(BzI)-HN-CH-COOCH₃

(CH₂)₅C00H

56 g Cbz-HNCH-COOCH, (öl) wurden in 300 ml Methanol und I50 ml Wasser gelöst. Zu der Lösung wurde Aktivkohle gegeben, und nach einstündigem Rühren wurde Palladium-Kohle zugefügt und 10 Stunden lang hydriert. Nachdem vom Katalysator abgetrennt war, wurde im Vakuum auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Hierzu wurden 200 ml Dioxan, 21 ml Triäthylamin unter Kühlen und 80 g BOC-Thr(BzI)-OSU zugegeben» Nach 3-tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin zugesetzt, 3 Stunden lang gerührt, anschließend auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und mit Essigester extrahiert.

609846/10*7

Die Essigesterschicht wurde mit 1 N-HCl und Wasser gewaschen und im Vakuum abgezogen. Das so erhaltene ölige Produkt wurde in Äther gelöst und in eine 5^-ige Natriumbicarbonatlosung eingetragen. Nach sorgfältigem Waschen der wäßrigen Schicht mit Äther wurde erneut mit Essigester extrahiert, anschließend mit Wasser, 1 N-HCl und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und der Essigester wurde abgezogen, wonach 57 g eines öligen. Produktes erhalten wurden.

(27) Herstellung von BOC-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCOOCH^-CHA:

(CH₂)₅C0OH

50 g BOC-Thr(BzI)-HNCHCOOCH, wurden in 150 ml TPA zunächst unter Kühlen, nach 30 Minuten bei Raumtemperatur, gelöst. TFA wurde unter vermindertem Druck abgezogen, der ölige Rückstand über NaOH im Vakuum eine Nacht lang getrocknet. Das ölige Material wurde in 100 ml DMF gelöst und der pH-Wert auf 6 durch Zugabe von 40 ml Triäthylamin unter Kühlen eingestellt. 5 g HOBT und 50 g BOC-Ser(BzI)-OSU wurden zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf pH 6 durch Zugabe von N-Methylmorpholin eingestellt und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde N,N-Dimethylaraino-l,3-piOpandiamin zugegeben und eine Stunde lang gerührt, dann wurde Wasser zugegeben und schließlich mit Essigester extrahiert. Der Extrakt wurde mit 1 N-HCl, Wasser, 5$-iger Natriumbicarbonatlosung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde abgezogen und der Rückstand in 300 ml Äther gelöst und dann erneut mit 5^-iger Natriumbicarbonatlosung extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit HCl angesäuert, mit Essigester extrahiert, die Essigesterschicht mit 5^-iger Natriumbicarbonatlosung und Wasser gewaschen und anschließend mit wasserfreiem

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Natriumsulfat getrocknet. Nachdem der Essigesterschicht eine gleiche Menge Cyclohexylamin zugegeben worden war, wurde das Gemisch unter vermindertem Druck destilliert, wobei ein öliges Produkt erhalten wurde, das durch Zugabe von Äther und η-Hexan verfestigt wurde. Ausbeute: 4-1 g. Pp.: 70 - 73°C.

I⁰ = ₊4,9° (c-2,7,

(28) Herstellung von BOC-Ser(BzI)-ASn-LeU-NHNH₂:

15 g (27,2 mMol) BOC-Ser(BzI)-Asn-Leu-OÄt wurden in 100 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 50 ml 80^-H₂N-NH₂·Hg zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Um den ausfallenden Niederschlag zu vervollständigen, wurde Äther hinzugefügt, der Niederschlag anschlie ßend mit Äther gewaschen und aus Methanol-Essigester-Äther um kristallisiert, wonach 13*5 g des Produktes erhalten wurden. Ausbeute: 92,5#. Fp.: 207 - 209°C (Zers.).

° = -17,4° (c=0,77, DMF).

(29) Herstellung von

BOC-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCOOH

(CH₂)₅C00H

10,0 g BOC-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCH-COOCH₃'CHA wurden mit 1 N-HCl in Essigester zur Herstellung der freien Säure behandelt, anschließend wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. 30 ml TFA wurden dem öligen Rückstand unter Kühlen zugesetzt. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde TFA unter vermindertem Druck abgezogen. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet.

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_ 44 -

8,5 g B0C-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNH₂ wurden in 30 ml DMF gelöst und zu 14 ml Dioxan, das 1 N-HCl und 3*1 ml Isoamylnitrit enthielt, zugefügt, worauf man das Gemisch 20 Minuten lang zur Bildung des Azids reagieren ließ.

Das vorstehend beschriebene getrocknete TFA-SaIz wurde in 10 ml DMF gelöst, mit Triethylamin neutralisiert und anschließend langsam einer Lösung unterhalb von -40°C zugefügt, die die Azid-Verbindung enthielt. Der pH-Wert wurde auf 7 durch Zusatz von Triäthylamin eingestellt, und das Gemisch wurde 3 Tage lang bei 5°C umgesetzt.

Das Reaktionsgemisch wurde bei -5⁰C langsam in 300 ml 0,5^N-HCl eingetragen. Der abfiltrierte Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und mit 500 ml Chloroform extrahiert. Nach dem Waschen der Chloroformschicht mit 1 N-HCl und wäßriger NaCl-Lösung wurde das Chloroform unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand durch Zusatz von Chloroform - n-Hexan ausgefällt. Ausbeute: 11,8 g (84,3$). Fp.: I83 - 185⁰C (Zers.). ^ = -5,5° (c=0,72, DMF).

Aminosäurenanalyse: Asp 1,00 (1), Thr 0,82 (1), Ser 1,62 (2),

Leu 0,91 (1), «κ-Aminokorksäure 1,05 (l).

(30) Herstellung von

CO-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCONHNHg

(CH₂)₅C00H

3,2 g (3 mMol) BOC-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzIJ-HNCHCOCH, wurden in 30 ml trockenem Pyridin gelöst, zu 5 g TFA-ONP zugefügt und 3 Stunden bei 45°C gerührt. Das Reaktionsgemisch

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wurde im Vakuum eingeengt und anschließend mit Äther versetzt. Der Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und getrocknet, wonach 2,9 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden. 20 ml TFA wurden diesem Pulver unter Kühlen zugesetzt, anschließend wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt und schließlich die TFA entfernt. Der Rückstand wurde in 20 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde bei 45°C in 2,5 1 trockenes Pyridin unter Rühren innerhalb von 30 Minuten eingetropft. Bei 50°C wurde noch 7 Stunden und bei Raumtemperatur über Nacht weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, in 2 1 Chloroform gelöst und mit gesättigter wäßriger Kochsalzlösung, 1 N-HCl und fünfmal mit wäßriger Kochsalzlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, und schließlich wurde die Chloroformschicht bis auf ein Volumen von 10 ml im Vakuum eingeengt. Anschließend wurden 500 ml η-Hexan zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 2,0 g (72#). Fp.: 165⁰C (Zers.).

3,9 g dieser Verbindung wurden in 10 ml DMF und 50 ml Methanol gelöst, und die Lösung wurde 30 ml 80^-H₃N-NH₃'H₃O zugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde Wasser zugesetzt und der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen, mit 100 ml Methanol versetzt und unter Rückfluß zum Sieden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, der Niederschlag abfiltriert, worauf 1,4 g des Produkts erhalten wurden.

£rj20 = -8,6° (c=0,8, DMF).

Aminosäurenanalyse: Asp 1,10 (1), Thr 1,00 (l), Ser 1,64 (2),

Leu 1,00 (1), ec-Aminokorksäure 1,08 (1).

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(31) Herstellung von BOC-Leu-Gly-OBzl:

Eine Lösung aus 34 g WSC in 50 ml Methylenchlorid wurde unter Rühren bei -5°C während einer Stunde in eine Suspension aus 46,2 g BOC-Leu-OH, 1 g HOBT und 7k g H-Gly-OBzl*TosOH in 100 ml DMP und 200 ml Methylenchlorid eingetropft. Nach einer Stunde wurde die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt, um das Methylenchlorid zu entfernen. Die DMP-Schicht wurde mit Wasser versetzt und mit 1 1 Essigester und anschließend nochmals mit 500 ml desselben Lösungsmittels extrahiert. Die Essigesterschicht wurde mit 1 N-HCl, Wasser, 5^-iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, worauf 82 g öliges BOC-Leu-Gly-OBzl erhalten wurden. Rf = 0,68.

(32) Herstellung von BOC-Val-Leu-Gly-OBzl:

70 ml TFA wurden bei -5°C 76 g BOC-Leu-Gly-OBzl zugesetzt, anschließend wurde 30 Minuten lang gerührt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde über NaOH im Vakuum getrocknet. Hierzu wurden 200 ml DMP gegeben und der pH-Wert auf 6,5 durch Zugabe von etwa 50 ml Triäthylamin bei -5 C eingestellt. Hierzu wurden 19 g BOC-VaI-OSU und 2 g HOBT zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zusatz von N-Methylmorpholin auf pH 6 eingestellt und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Während des Rührens wurde der pH-Wert des Gemischs durch Zugabe von N-Methylmorpholin auf 6 gehalten. Schließlich wurde eine große Menge Wasser zugegeben und mit Essigester extrahiert, der Extrakt mit 1 ml N,N-Dimethylamino-l,3-propandiamin versetzt und das Gemisch 30 Minuten lang gerührt. Der Extrakt wurde mit Wasser, 1 N-HCl, 5^-iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Der Essigester wurde

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abgezogen und das Produkt aus η-Hexan umkristallisiert. Es wurden 90 g BOC-Val-Leu-Gly-OBzl erhalten. Ausbeute: Fp.: 119 - 121°C.

Elementaranalyse (^cp5^H3Q^3

C%

Gef.: Ber.:

(33) Herstellung von

62,	73	8,	34	8	,85
62,	86	8,	25	8	,80

-CO-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCH-CO-VaI-Leu-Gly-OH:

-(CH₀),

1,36 g (1,42 mMol) LC0-Ser(BzI)-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCO-NHNHp wurden in 5 ml DMF suspendiert. Diese Suspension wurde mit 2 ml Dioxan, das 4 N-HCl enthielt, bei -5°C versetzt und bei 10⁰C vollständig gelöst. Bei -5 - -10⁰C wurden 0,3 ml Isoamylnitrit zugegeben, und es wurde 20 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wurden bei -50⁰C 1,2 g H-VaI-Leu-Gly-OH zugegeben, der pH-Wert durch Zugabe von Triäthylamin auf 7 eingestellt und anschließend 2 Tage lang im Eisbad gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Kühlen langsam in 200 ml 0,5 N-HCl eingetragen. Der Niederschlag wurde mit 0,5 N-HCl und Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 1,5 g des Produktes erhalten. Fp.: 240°C (Zers.). Ausbeute: 84, f - -¹⁸^° (c=0,7, DMF).

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Beispiel 2

you

H₂

^LCC~Ser»Asn-LcH -Ser-Thr-HNCHCQ-Val -

Leu—GI

L-ys — Leu — Ser — G!n -GIu —Ley -

Hä

s-Leia-Gln—Thr-Tyr - Pr ο -Ar

Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Giy-Thr-Pro-NH,

5GG 3ig (O₅130 mi-tol) BOC=LjS (DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(QBzI)-LsH=HiS=LyS (DIP ) =Leu-= 31n~2hr (Bsi) =Tyr (BzI) -Pro-Ärg (Tos) - ThZ" V3sl)-Asn-Thi·» (Bsi;=Glf=Ssr (BzI )=-Gl2T-Thr (BzI)-Pro-MHg wurden

i;i 5 ail TJk UIlU G,5 al 4 M-HCl/Dioxan bei -5°C gelöst«, Naea 40=i:ii:2i!tigSäd Rlihrss isi RamatSKiperatsir' wuirde die Lösung im "jiizu^jn singsengt und durch Zusatz von Ifcher wurde sin Mieder- -BilLlag ansg'siiilltc Ssr niederschlag würde üb©r MaOH gsfcrosk- :"9>o Dsr g'2ti"DQlsiete Hiedsrsehlag '^urd@ in 3 ml DI¹IP gelöst, ,aii 2_ΰ3 üil (öatspreühenei lOOyuMoi) diessr Lösung inuräen auf jLiz TgIlzm®:: ^?;·ίί2 1 öl sijigsengts and der pH-¥ert wurde durch. '-v.Qiz'cs ~r~n Triafeäjrlsi^ia unter ISlhlsn auf 7 eingestellte Zu disssr LosyTi wurden 23 mg HOSU₃

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2 al

BAD ORIGINAL

bei O⁰C 90 Minuten lang behandelt. Nach dem Abziehen des Fluorwasserstoffs wurde der Rückstand in 1 M-AcOH gelöst. Die Lösung wurde auf eine Dowex 1X2 (Acetatform)-Säule gegeben, das Eluat wurde gefriergetrocknet, wobei 341 mg eines Pulvers erhalten wurden. 341 mg dieses Pulvers wurden in 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst, und die Lösung wurde auf eine CM-Zellulose (2,3 X 50 cm)-Säule gegeben, mit 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 700 ml) gewaschen und mit 0,01 bis 0,1 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) bei linearem Elutionsgradienten eluiert. Es wurden jeweils Fraktionen von 10 g gesammelt; die aktiven Fraktionen (Fraktionen Nr. 80 - 111) wurden gesammelt und zu einem aktiven Pulver gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in 0,1 M AcOH gelöst und über eine Sephadex G-50 (2,2 X 105 cm)-Säule chromatographiert, wobei mit 0,1 M AcOH mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/h eluiert wurde. Das Eluat (5g) wurde fraktioniert, die aktiven Fraktionen (Nr. 55 - 63) wurden gesammelt und zu 22 mg eines aktiven Pulvers lyophilisiert.

22 mg des aktiven Pulvers wurden in 0,01 M wäßriger Ammoniumacetatlösung gelöst und über eine CM-Zellulose (2,3 X 25 cm)-Säule Chromatograph!ert und mit 6OO ml 0,01 M bis 6OO ml 0,1 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) mit einem Gradienten eluiert. Es wurden Fraktionen von jeweils 8 g gesammelt und die aktiven Fraktionen Nr. 109 - 119 wurden gefriergetrocknet. Das so erhaltene Pulver wurde in einer geringen Menge 0,1 M-Essigsäure gelöst und die Lösung über eine Sephadex LH-20 (2,3 X 135 cm)-Säule chromatographiert, wobei mit 0,1 M-Essigsäure eluiert wurde; Fraktionen von jeweils 6 g des Eluats wurden gesammelt, die aktiven Fraktionen Nr. 3I - 34 wurden zu einem aktiven Pulver gefriergetrocknet. Rf = 0,61 (Merck Zellulose; n-Bu0H : Pyridin : AcOH : Wasser (15 : 10 : 3 : 12)).

Aktivität: 3025 MRC Einheiten/mg.

609846/104?

Aminosäurenanalyse; Lys 1,82 (2), His 0,97 (1), Arg 0,98 (1),

Asp 1,96 (2), Thr 4,35 (5), Ser 2,88 (4),

GIu 3,00 O), Pro 2,16 (2), GIy 2,85 (3),

VaI 1,12 (1), Leu 4,20 (5), Tyr 1,01 (1), ei -Aminokorksäure 0,99 (1).

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Claims

26Ί6399

Patentansprüche

1J Polypeptid der allgemeinen Formel I

-(CH₀)

■2'5 I ■CW-Aj-Asn-Leu-Ser-Thr-MHCHCO-Ay-Leu

GIy-A₃₀-PrO-NH₂

worin A₁ Ser oder GIy, A~ VaI oder Met_fl A,_Q Lys oder Thr, A₁₁ Leu oder Tyr, A,p Ser oder Τα?_ΰ Ä,|, GIu oder Asp, A₁C Leu oder Phe_a A₁^ His oder Asn^, A₁O Leu oder P3ae_a A₁Q GIn oder His, Ag₁ Tyr oder Phe, A₂₅ Arg oder GIn₅ A₀₁₅ Asp, Asn oder Ala_a A_gg VaI, Thr oder lie, A₂g AIa, 3er oder VaI und A₃₀ Thr,, VaI oder AIa bedeuten^ sowie dessen - pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalas bs?j_o Komplexe.

2ο Polypeptid der Formel — -(CH₀),

2'5 I

CO-Ser-Asn-=Leu-Ser-Thr»I»JCHCO~Val-Le!i=

Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-

Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-

Ala-Gly-Thr-Pro-NH₂

3« Polypeptid der Formel — -(CH₀),

2'5

•GO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HHCHCO-Val·

His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg«

- 52 - 261639

Polypeptid der Formel
(CH₀),--

-CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-rhe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Iie=-aiy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂

5· Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäuren oder Peptide oder Kondensate davon ir, der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel I Kondensationsreaktionen unterworfen werden, daß die Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück

H-A^Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-

enthält, worin R einen reaktiven Esterrest bedeutet und A₁ die oben angegebene Bedeutung besitzt, bei irgendeiner Reaktionsstufe Ringschlußreaktionen unterworfen wird und daß das so erhaltene Polypeptid ggf. in ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz oder einen Komplex übergeführt wird.

Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß eine Aminosäure und ein Peptid aus 2 bis 4 oder mehr Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I einer Kondensationsreaktion unterworfen wird und die Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück

(CH₂)₅C00R

H-A₁-ASn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-

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enthält j, worin A₁ und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, während der Bildung der Peptideinheit, die die (A -Aminokorksäureeinheiten enthält, einer Ringschlußreaktion unterworfen wird»

7. Verfahren nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, daß eine Aminosäure und ein Peptid aus 2 bis 4 oder mehr Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I Kondensationsreaktionen unterworfen werden, die Peptideinheit, die jeweils das Bruchstück

(CH₂)₅C00R

H-Ä^Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-

enthält, worin A₁ und R die oben genannten Bedeutungen besitzen, während der Bildung der Peptideinheit, die die tX-Aminokorksäureeinheiten enthält, einer Ringschlußreaktion unterworfen wird und daß mindestens eine Amino- oder Carboxylgruppe der Verbindung der allgemeinen Formel I durch eine Schutzgruppe geschützt wird, und die Schutzgruppe anschließend wieder entfernt wird.

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