DK149597B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af calcitoninanaloge hentriaconpeptidderivater eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller komplekser deraf - Google Patents

Description

t49597

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte calcitoninanaloge hentriaconta-peptidderivater med den i kravets indledning angivne almene formel I, II eller III, eller et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt eller kompleks deraf, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Polypeptiderne med formlerne I, II og III har serum-calciumreducerende virkning.

Calcitonin er et velkendt polypeptid med reducerende aktivitet over for calcium i pattedyrserum, og det isoleres fra pattedyrs og fugles skjoldbruskkirtel eller gællerne hos fisk. Amino syre sekvensen af calcitonin afhænger af de arter, hvorfra stoffet hidrører, og man har fornylig fremstillet syntetiske calcitoniner med samme kemiske struktur som naturlige stoffer.

Calcitoninerne af naturlig oprindelse, f.eks. fra ål, laks eller mennesker, er polypeptider bestående af 32 aminosyrer, hvori 1. og 7. aminosyre er L-cystein, og mercapto-grupperne deri er bundet under dannelse af en disulfidbro.

Polypeptider fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse har hverken den 1. eller 7. aminosyre L-cystein, og L-cysteinet er erstattet med α-aminosuberinsyre (Asu) med formlen: ch2 - ch2 -ch2 - ch2

CH2 -COOH H2N - CH-COOH

Carboxylgruppen i %jj -stillingen er bundet til N-ende-aminosyren ved dannelse af en ringstruktur.

De hidtil ukendte forbindelser, som fremstilles ifølge opfindelsen, har betydelig terapeutisk virkning. De ordineres til sænkning af calciumindholdet i serum ved sådame sygdomme som hypercalcemi, sygelig endogencalcitoninmangel forårsaget af dystyroidisme eller hyperparatyroidisme.

De hidtil ukendte forbindelser kan ordineres ved oste-opati, som kræver calcium, eksempelvis osteoporose, osteo-omalaci, benbrud, fibrøs dysplasi i benvævet eller rachitis forårsaget af corticosteronterapi eller inaktivering efter 149597 2 menopause eller ydre skade, især i kombination med terapi med calcium eller phosphor. De hidtil ukendte forbindelser kan også benyttes til terapeutisk behandling af Paget’s bensygdom (ostetis deformans). Desuden kan de hidtil ukendte forbindelser anvendes til terapeutisk eller præventiv behandling af peptisk mavesår. I serum, leveren og nyrerne er de ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser mere stabile end det kendte calcitonin, og de er mere stabile ved rensningsprocesser eller oplagring som følge af fraværet af disulfidbinding. Aktiviteten af poly-peptiderne med formlerne I, II og III er lige så stor som eller større end aktiviteten af kendt calcitonin ved prøver på rotter.

Forbindelserne fremstillet ifølge kravet er hidtil ukendte typeanaloge af ålecalcitonin, laksecalcitonin og humant calcitonin, hvor de to cvsteinrester i stillingerne 1 og 7 i calcitoninerne er erstattet med entø-aminosuberinsyre. Ved denne modifikation er ustabile disulfidbindinger (-S-S-) blevet ændret til stabile ethylenbindinger (-CHg-CHg-), og derfor er de oprindelige ustabile forbindelser blevet omdannet til meget stabile .forbindelser.

Disse forbindelser har stærkere aktivitet i henseende til serumcalciumreduktion end de oprindelige calcititoniner, og desuden har de god varmestabilitet og syrestabilitet, som giver fordelagtige præparater. Tilsvarende calcitoninpræparater er ustabile og bør udleveres som lyofiliseret pulver i en beholder og indsprøjtes efter samtidig opløsning med fysiologisk saltvand tilsat.

I modsætning hertil kan præparaterne indeholdende forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, foreligge i form af en injicerbar opløsning i en ampul, som let kan administreres.

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen har ingen -S-rS-binding og har en specifik -C-C-binding, derfor kan de ikke syntetiseres ved hjælp af alene den konventionelle peptidsyntese..

Værdierne for serumcalciumreduktionsaktiviteten fremgår af eksemplerne.

Aktiviteten af humant calcitonin er 80 MRC enheder/mg, 1 7 medens aktiviteten af (Asu ’ )-humancalci'£onin i eksempel 3 er 1000 MRC-enheder/mg.

Stabiliteten af de omhandlede forbindelser skal forklares nærmere i forbindelse med tegningen, hvor fig 1-2 viser stabiliteten af de her omhandlede forbindelser sammenlignet med de tilsvarende kendte forbindelser i afhængig- 149597 3 hed af pH-værdien, og fig 3-4 stabiliteten af de her omhandlede forbindelser sammenlignet med de tilsvarende kendte forbindelser i afhængighed af tiden.

Som det fremgår af fig 1, sammenlignes (Asu * )-åle- calcetonin (-C-C-) (eksempel 1) nedenfor med naturligt åle- calcitonin (-S-S-) ved 65°C ved forskellige pH-værdier i 0,5% tartratstødpude. Førstnævnte forbindelse har bedre stabilitet end sidstnævnte. Samme sammenligning udføres mellem (Asu ’ laksecalcitonin (forbindelse II) og naturligt laksecalcitonin.

Der fåset lignende resultat, således som det fremgår af fig.2.

Pulver og opløsning til injektion af (Asu ’ )-åle- og -laksecalcitoniner,og naturligt laksecalcitonin sammenlignes med hensyn til stabilitet. Som det fremgår af figur 3 og 4, 17 17 er (Asu *')-ålecalcitonin og(Asu'*')-laksecalcitonin mere stabile end naturligt laksecalcitonin.

Figurerne viser tydeligt de omhandlede forbindelsers overlegne stabilitet i sammenligning med de kendte forbindelsers.

Varmestabiliteten af (Asu ålecalcitonin svarer til eller ér større end stabiliteten af naturligt lakse- og svinecalcitonin,. og endvidere er de kendte forbindelser ustabile i opløsning.

Derfor leveres handelsprodukterne deraf i lyofiliseret form, medens (Asu *')- ålecalcitonin leveres i injicerbare væskepræparater.

Aktiviteten af forskellige calcitoniner fremgår af nedenstående tabel 1.

Tabel 1

Calcitoniner MCR-enhe der/mg svine- 120 okse- 60 humant 70 lakse-I- 2700 - 3500 åle- 3500 - 5000 (Asu1»7)- ålecalcitonin 3000 - 7000 149597 4

Aktiviteten af Asu^'^-ålecalcitonin, 3000-7000 MRC-enheder mg varierer afhængende af ikke blot renheden af stoffet, men også i overensstemmelse med den benyttede analysemetode. Aktiviteten kan måles ved analyse af mængden af calcium i serum in vivo, og således vil en lang række betingelser (måledatoen, den målende person, det tekniske stade, de benyttede dyr osv.) øve indflydelse til frembringelse af fejl. Derfor er fejl i området 80-125% acceptable.

En MRC-enhed er den internationale enhed for calci-toniners calciumreduktionsevne.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kondenseres eventuelt beskyttede aminosyrer og/eller eventuelt beskyttende peptider i den ønskede rækkefølge.

Beskyttelsesgrupperne er gængse beskyttelsesgrupper til peptidsyntese og bør let kunne fjernes ved hydrolyse, sur nedbrydning, reduktion, aminolyse eller hydrazinolyse.

Hydroxylgruppen i serin, threonin eller tyrosin kan eventuelt beskyttes ved forestring eller forethring. Beskyttelse af hydroxylgruppen kan bevirkes ved 2,2,2-tri-fluor-l-tert.-butyloxycarbonylaminoethyl eller 2,2,2-tri-fluor-l-benzyloxycarbonylaminoethyl. Det er imidlertid ikke altid nødvendigt at beskytte disse hydroxylgrupper.

Aaiinogruppsi i guanidinogruppen i arginm kan beskyttes med en nitro-, tosyl eller benzyloxycarbonyl-gruppe, men guanidinogruppen behøver ikke nødvendigvis beskyttes. Iminogruppen i histidin kan beskyttes ved hjælp af en benzyl-, trityl-, benzyloxy-carbonyl- eller tosylgruppe.

De som udgangsmaterialer anvendte peptider syntetiseres ved kondensation af aminosyrer eller peptider med 2-4 aminosyrer i den rækkefølge, hvori aminosyrerne forekommer i formlen I. Således omsættes eksempelvis aminosyre eller peptid, hvor α-aminogruppen er beskyttet, og den endestillede carboxylgruppe aktiveret, med aminosyre eller 149597 5 peptid med fri α-amonogruppe og beskyttet endestillet car-boxylgrupper. På den anden side omsættes aminosyre eller peptid, hvori aminogruppen er aktiveret, og den endestillede carboxylgruppe beskyttet, med aminosyre eller peptid med fri endestillet carboxylgruppe og beskyttet oc-aminogruppe.

Carboxylgruppeaktivering kan f.eks. ske ved hjælp af syreazid, syreanhydrid, syreimidazolid eller aktiv ester, som bevirker omdannelse til cyanomethylester, thiophenyl-ester, p-nitrothiophenylester, p-metansulfonylphenylester,p-nitroph% nyiesterT 2 ,'4-dinitropheny léstér,'2,4,5-trichlorphehylestér, 2,4,6-trichlorphenylester, pentachlorphenylester, N-hydroxyphthali-midester-8- hydroxypiperidiinester eller N-hydroxypiperidin-ester eller carbodiimid, Ν,Ν-carbonyl-diimidazol eller iso-xazoliumsalt, såsom Woodward’s reagens.

Den foretrukne kondensationsreaktion er Wunsch-metoden, azid, aktiv ester eller Geiger-metoden. Ved kondensationsreaktionen bør racemisering omhyggeligt undgås.

En beskyttet delsekvens indeholdende aminosyresekvensen (ch2)5coor H-A-^ -Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- hvor A-j_ og R har samme betydning som i kravet,tilvejebringer muligheden for ringdannelse. Ringdannelsesreaktionen udføres ved en kondensationsreaktion mellem aktiveret cxj -carboxylgruppe i α-aminosuberinsyre og fri aminogruppe i den N-terminale aminosyre. Ved ringslutning.sreaktionen beskyttes hydroxylgruppen i serin og threonin fortrinsvis.

Beskyttelsesgrupperne fraspaltes afhængigt af, hvilke grupper der er tale om, f.eks. ved katalytisk hydrering i nærværelse af palladium på kul, ved hjælp af vandholdig eddikesyre, ved hjælp af trifluoreddikesyre, med hydrogenchlo-rid, hydrogencyanid eller svovlsyrling i organisk opløsningsmiddel eller med en blanding af eddikesyre, myresyre og vand (7:1:2).

149597 6

Man kan fjerne alle beskyttelsesgrupper i et eneste trin ved hydrolysebehandling under anvendelse af trifluor-eddikesyre, når man til beskyttelse af aminogrupper anvender tert.-butoxycarbonyl, til carboxylgrupper i sidekæder tert.-butylester, til hydroxygrupper i serin, threonin og tyrosin tert.-butylether henholdsvis 2,2,2-trifluor-l-tert.butoxy-carbonylaminoethyl til beskyttelse af aminogruppen i histidin.

Polypeptiderne, som fås via fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan fås i form af fri base eller salte deraf.

Den frie base kan hensigtsmæssigt fås fra et salt deraf.

Den frie base kan omdannes til farmakologisk acceptable salte ved omsætning med uorganisk syre, f.eks. saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre eller phosphorsyre eller med en organisk syre, f.eks. myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, ravsyre, æblesyre, citronsyre, vinsyre, benzoesyre, benzensulfonsyre eller toluen-sulfonsyre.

Ovennævnte hidtil ukendte polypeptider kan omdannes til kompleksform ved tilsætning af uorganiske eller organiske stoffer. Eksempler på uorganiske kompleksdannende stoffer er calcium-,magnesium- eller zinkphosphat, -pyrophosphat eller -polyphosphater. Eksempler på de kompleksdannende organiske stoffer er ikke-antigen gelatine, carboxymethylcellulose og polyglutarsyre.

I den foreliggende sammenhæng anvendes følgende forkortelser: BOC = tert.-butoxy carbonyl AOC = 5-amyloxycarbonyl DIP = diisopropylmethoxycarbonyl

Cbz = benzyloxycarbonyl 7 149597 CICbz = o-chlorbenzyloxycarbonyl Bzl = benzyl HOSU = N-hydroxysuccinylimid

Tos = Tosyl

Oet = ethylester

Obzl = benzylester ONP = p-nitrophenylester OSU = N-hydroxysuccinylimidester

Phe = L-phenylalanin

Ser = L-serin

Asn = L-asparagin

Leu = L-leucin

Thr = L-threonin

Val = L-valin

Pro = L-prolin

Arg = L-argin

Asp = L-asparaginsyre

Ala = L-alanin TFA = trifluoreddikesyre

TosOH = p-toluensulfonsyre CHA = cyclohexylamin DCHA = dicyclohexylamin THF = tetrahydrofuran DMF = dimethylformamid

AcOEt = ethylacetat DCC = dicyclohexylcarbodiimid WSC = N-ethyl-N-dimethylaminopropylcarbodiimid HOBT = 1-hydroxybenzotriazol

MeOH = methanol

EtOH = ethanol

AcOH = eddikesyre

Gly = glycin

Lys = L-lycin

Gin = L-glutamin

Glu = L-glutaminsyre

His = L-histidin

Tyr = L-tyrosin OBu : tert.- butylester

Met : L-methionin lie : L-isoleucin U9597 8

Efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen.

Til bestemmelse af aktiviteten med hensyn til formindskelse af serumcalciumindholdet anvendes følgende forsøgsmetode.

En prøve fortyndes tilstrækkeligt med en opløsning, som er 0,1 N-natriumacetat og 0,1% med hensyn til albumin. På hver enkelt af et antal hanrotter injiceres intramuskulært 0,2 ml af de respektive opløsninger. Efter 1 times forløb aflives samtlige rotter, og blodet fra hver enkelt rotte samles separat. Serumcalciumværdien for hver blodprøve bestemmes ved atom - absorptionsspektrofotometri. På den anden side fortyndes Research Standard B, som er en ekstrakt fra svine-skjoldbruskkirtler, til 2,5, 5, 10 og 20 MRC mU/0,2 ml. På hver af et antal hanrotter injiceres intramuskulært 0,2 ml af fortyndingerne.

På samme måde som angivet ovenfor bestemmes serumcalciumværdien på rotterne 1 time efter injektionen.

Tyndtlagschromatografi:

Bærer: silicagel G

Opløsningsmiddelsystem for fremkalder: 1. CHC15 - MeOH - AcOH 95 : 5 : 3 2. CHCl^ - MeOH - AcOH 85 i15 : 5 3. CHC13 - MeOH - AcOH 85 :10 : 5 4. CHC1, - MeOH - AcOH 80 :25 : 2 3 5. CHC13 - EtOH - AcOEt 5:2:5 6. CHC13 - MeOH - AcOH - H20 10 slO : 1 : 1 (nederste lager) 7. Benzen - AcOEt 2:1 8. n-BuOH - pyridin - AcOH - H20 15 :10 : 3 : 12 9. methanol

Aminosyreanalyse.

En prøve hydrolyseres ved hjælp af 6 N HC1 (ved tilsætning af nogle dråber anisol) ved 110°C i 40 - 45 timer og tørres under formindsket tryk, hvorpå man foretager en aminosyreanalyse.

149597 9

Eksempel 1 TFA (5ml) sættes til BOC - Ly s £Cbz(o-Cl ) ) - Le u-S« r ( Bz 1 ) — Gin —G I u (OBzl)-Leu*^Hi s— Ly s (Cb r ( o - Cl ))-Le u-Gl n-Th r (Bzl)-Tyr(Bzl) -P r o -A rg(Tos)-Thr(Bz 1 )-Asp (OBzl) -Va1-G 1 y-Ala-Gly-Th r(Bz1 )-P ro-NHs 230 mg (62,7 jimol) ved -5°C og opløses i vakuum. Der tilsættes 4 N HCL /dioxan (0,5 ml) under omrøring, og man omrører yderligere ved stuetemperatur i 40 minutter. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum til fjernelse af TFA. Der sættes diethylether til resten, og man samler udfældningen ved dekantering. Disse operationer gentages to gange, og man tørrer over NaOH.

Tørret udfældning opløst i DMF(2ml) indstilles til en pH-værdi på ca. 7 ved tilsætning af triethylamin og N-methylmorpholin.

--(OH*) -

-C 0 —S e r — A s n —Le u—Ser — Thr — HNCHCO — V a 1 —L e u — GI y— OH

51,3 mg (54,4 pmol) og HOSU 12,5 mg tilsættes, hvorpå man tilsætter DCC (22,4 mg) under omrøring. Reaktionsblandingen omrøres natten over. Der tilsættes yderligere DCC (11 mg) til fortsat omrøring natten over.

(Kontrol ved tyndtlagschromatografi, opløsningsmiddelsystem 4).

1 M eddikesyre (50 ml) tilsættes, og udfældningen samles ved centrifugering og vaskes to gange med 1 M eddikesyre og tre gange med vand og tørres til opnåelse af et kondensat (305 mg).

Det fremkomne pulver (290 mg) omsættes i hydrogenfluorid (20 ml) og en anisol-phenol-blanding (1:1, 3 ml) ved 0°C i 90 minutter. Hydrogenfluoridet fjernes, og re- ίο 143597 * sten vaskes med ethylacetat og benzen til størkning og tørres derpå til opnåelse af et pulver (183 mg).

Det således opnåede pulver opløst i 1 M eddikesyre ledes gennem en søjle bestående af"Dowex"(registreret varemærke) 1x2 (acetatform), og eluatet frysetørres til opnåelse af et pulver (168 mg). Dette pulver (168 mg) opløst i 0,1 M eddikesyre hældes på en søjle (2,2 x 110 cm) af "Sephadex" (registreret varemærke)G-50 og elueres med 0,1 M eddikesyre (10 ml) pr. time). Eluatet samles for hver fraktion (5g), og de aktive fraktioner (nr. 38-40) frysetørres til opnåelse af et aktivt pulver (36,0 mg, 1300 MRC-enheder/mg).

Det aktive pulver (36,0 mg) opløst i 0,01M vandigt ammoniumacetat hældes på en søjle af carboxymethylcellu-lose (2,0 x 20 cm) og elueres ved hjælp af en lineær gradient af 0,01 M vandigt ammoniumacetat (pH 4,4, 200 ml)-0,1 M vandigt ammoniumacetat (pH 4,4, 200 ml)(25 ml pr. time). Eluatet samles for hver fraktion (4 ml). De aktive fraktioner (glas nr. 41-70) samles og frysetørres til opnåelse af et aktivt pulver (18 mg).

Det aktive pulver (18 mg) hældes på en søjle (2 x 75 cm) af "Sephadex" LH-20 og elueres med 0,1 M acetat, og eluatet samles for hver fraktion (5 ml), hvorpå man frysetørrer de aktive fraktioner (glas nr. 13-17) til opnåelse af et pulver (3390 MRC-enheder/mg) med formlen -( CH z ) s---1 -CO-S er-As n—Le u-Ser-Thr-HNCHCO-Va1-Le u- G l y—L y s —L eu —Se i—GI n—G 1 u — Leu— His — Ly s —Le u —

Gln-Tlir-Ty r-Pro-Ar 8Γ-Τ hr-Asp-Va 1-G1 y-A 1 a-G 1 y — Th r-P r o-NH 2^ 149597 11

Rf = 0,70 {"Merck"(registreret varemærke)-cellulose, n-BuOH: pyridin: AcOH: E^O (15:10:3:12))

Aminosyreanalyse:

Lys His ArgAspThr Ser Glu 0,96x2 0,89 0,95 0,95x2 0,97x4 1,00x3 1,11x3

Pro Gly Ala Val Leu Tyr AAS* 1,08x2 1,00x3 0,92 1,05x2 0,95x5 0,92 0,99 * -amino suberinsyre

Udgangsmaterialet til ovenstående reaktion kan fås som angivet i eksempel 2.

Eksempel 2

Fremstilling af;

I-(0H2 -J

l—CO - Ser - Asn - Leu - Ser - Thr - HNCHCO - Val - Leu-Gly -Lys - Leu - Ser - Gin - Glu - Leu - His - Lys - Leu - Gin -Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr - Asp - Val - Gly - Åla - Gly -Thr - Pro - 1 g (0,27 mmol) af BOC - Lys (Cl Cbz) - Leu - Ser (Bzl) - Gin - Glu (OBzl) - Leu - His - Lys (Cl Chz) - Leu - Gin -Thr (Bzl) - Tyr (Bzl) - Pro - Arg (Tos) - Thr (Bzl) - Asp (OBzl) - Val - Gly - Ala - Gly - Thr (Bzl) - Pro - NH2 opløses i 10 ml TFA ved -r5°C under formindsket tryk, og der tilsættes 1 ml 4N HCl/dioxan. Efter omrøring i 40 minutter ved stuetemperatur inddampes opløsningen i vakuum, og der tilsættes ethylether til dannelse af en udfældning. Udfældningen tørres over natriumhydroxid. Den tørrede udfældning opløses i 5 ml DMF og indstilles til en pH-værdi på 7 ved tilsætning af triethylamin under afkøling. Til denne opløsning sættes 100 ml vand til dannelse af en udfældning.Udfældningen tørres over P20^ til dannelse af forbindelse n uden BOC som fri base. 400 mg -(oh2)5-.

—CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HMCHCO-Val-Leu-Gly-OH

149597 12 opløses i 2 ml DMF. Der tilsættes HOSU ( 90 mg), og der tilsættes yderligere DCC (120 mg) under afkøling, hvorpå man omrører natten over. Efter reaktionen fjernes udfældet urinstof, og til den således opnåede opløsning sættes den ovenfor opnåede forbindelse uden BOC som fri base,og der tilsættes yderligere DM? (5 mg) til opløsning af forbindelsen. Efter tre dages forløb tilsættes der 150 ml vand. Den således dannede udfældning samles ved filtrering, vaskes grundigt med ethylacetat og ethylether og tørres, hvorved der fås 1,4 g.

,-<CH2>5 -1 i i _CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO - Val-Leu-Gly-

Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH^ som råprodukt. De ovennævnte 1,4 g råprodukt behandles med hydrogenfluorid og 15 ml blanding af phenol og anisol (i forholdet 1 : 1) ved 0°C i 90 minutter. Efter destillation af hydrogenfluorid vaskes resten med ethylacetat og benzen til størkning af produktet, og man°P-løser i sil M opløsning af eddikesyre. Opløsningen ledes gennem en søjle af "Dowex" lxl (registreret varemærke) (acetatform) og eluatet frysetørres til opnåelse af 870 mg pulver.

870 mg af dette pulver renses ved samme procedure som i eksempel 1 ved gelfiltrering på "Sephadex" G-50 (registreret varemærke), ionchromatografi på carboxymethylcellulose og gelfiltrering på "Sephadex" LH-20 til opnåelse af 200 mg (3450 MRC U/mg) produkt. Rf = 0,71 (bærestof "Merck" (registreret varemærke)-cellulose, fremkalder: n-BuOH-pyri-din-AcOH-vand (15:10:3:12).

Aminosyreanalyse: Lys 0,91 x 2, His 0,92, Arg 0,93, Asp 1,02 x 2, Thr 0,73 x 4, Ser 1,00 x 3, Glu 1,00 x 3, Pro 0,99 x 2, Gly 0,92 x 3, Ala 1,11, Val 0,90 x 2, Leu 0,78 x 5, Tyr 0,96, oc-aminosuberinsyre 0,97.

1*95*7 13

Det opnåede produkt (200 mg) renses ved samme procedure som i eks.l, dvs. ved "Sephadex"-G-50-gelfiltrering, carboxy-methylcelluloseionchromatografi og "Sephadex"-LH-20-gel-filtrering til opnåelse af 136 mg renset produkt (5280MRC-enheder/mg).

Udgangsmaterialet fremstilles som følger:

Fremstilling af delaminosyresekvens 10-31: BOC-Lys (ClCbz)-Leu-Ser (Bzl)-Gln-Glu (OBzl)-Leu-His-Lys (ClCbz)-Leu-Gln-Thr (Bzl)-Tyr (Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NHg.

(1) Fremstilling af BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH2: B0C-Thr(Bzl)-0H (67,7 g),H-Pro-NH2,HCl (33,0 g) og HOBT (29,6 g) tilsættes i THF (220 ml). Derefter tilsættes WSC (40,0 ml) under afkøling til -r 5°C, og man omrører i 1 time ved -f5°C og derpå natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og der tilsættes ethylacetat (800 ml) til resten, som derpå vaskes to gange med IN· HC1 (400 ml) og to gange med en 5%’s natrium! i c arb ona topi ø sning (300 ml) og vand. Efter tørring med vandfrit magnesiumsulfat inddampes det organiske lag i vakuum. Det olieagtige materiale cromatograferes på en silicagelsøjle (430 g). Fremkaldelse ved hjælp af en blanding af benzen og ethylacetat i forholdet 1:1, ethylacetat og methanol i den her angivne rækkefølge. De eluerede fraktioner· kontrolleres ved tyndtlagschromatografi på silicagel. Aktive fraktioner opsamles og opløses i ethylacetat (500 ml) og vaskes derpå to gange med en 5%'s vandig natriumbicarbonatopløsning (300 ml) og vand. Efter tørring med vandfrit magnesiumsulfat inddampes opløsningen i vakuum, og resten behandles med n-hexan, og der opnås BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH^ som et hvidt pulver (54,5 g, udbytte 61,4%), RF2 = 0,48 α p8 = - 14,0° (c = 1,DMF).

149597 14

Elementær analyse (H31N03):

$C $H $N

Fundet: 62,04 8,01 9,90

Beregnet: 62,20 7,71 10,30 (2) Fremstillingen af BOC-Ala-Gly-OBZl: BOC-Ala-OH (94,6 g),H-Gly-OBzl-TosOH (168,8 g) og HOBT (67,6 g) opløses i THF (450 ml), og der tilsættes WSC (91,5 ml), og man omrører en time ved 0°C natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og resten opløses i acylacetat (800 ml). Der tilsættes IN HC1 (500 ml), og udfældningen fjernes ved filtrering, og ethylacetatlaget vaskes med IN HC1 (400 ml), to gange med 5$’s bicarbonatopløsning og vand i den angivne rækkefølge.

Efter tørring med vandfrit magnesiumsulfat inddampes der i vakuum. Resten behandles med n-hexan, og man får et råmateriale (152,5 g). Der udføres omkrystallisation to gange med ethylacetat og n-hexan til opnåelse af BOC-Ala-Gly OBzl (144 g) Udbytte 85,7$, Smp. 87-88,5°C. Tyndtlagschromatografi: én plet, (RF^= 0,59).

(3) Fremstilling af BOC-Ala-Gly-OH: BOC-Ala-Gly-OBzl (101 g) opløses i THF (500 ml) og hydrogeneres ved hjælp af 5$ palladium på kul (7 g). Efter seks timers forløb fjernes katalysatoren, hvorefter man inddamper og opløser i THF (800 ml), hvorpå der atter hydrogeneres ved hjælp af 5$ palladium på kul. Efter fire timers forløb fjernes katalysatoren, og man inddamper i vakuum, og resten størknes ved behandling med n-hexan. Den første rest omkrystalliseres ved hjælp af ethylacetat-THF-n-hexan til opnåelse af BOC-Ala-Gly-OH (72 g, udbytte 97,4$, smp. 129-130°C.

Ved tyndtlagschromatografering fås én plet (opløsningssystem 2, αρ8 = - 8,87°(c = 1, DMF).

15 148597

Elementæranalyse (^χο^18^2®5^5

% C % Η % N

fundet: 48,80 7>41 11,29 beregnet: 48,77 7,37 11,38 (4) Fremstilling af BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2: BOC-Thr (Bzl)-Pro-NH2 (10,0 g) sættes til TFA (30 ml) ved -5°C, og man omrører i 30 minutter og inddamper i vakuum. Resten behandles med ether, filtreres og tørres over natrium til opnåelse af H-Thr(Bzl)-Pro-NH2.TFA.

B0C-Ala-Gly-0H fremstillet vinder' (3Ϊ '(6,08 ‘g) og HOBT (3,34 g) sættes til THF (100 ml), og WSC (4,5 ml) og tilsættes ved -5°C (pH-værdi 4,0). Efter omrøring ved -5°C i 1 time og ved stuetemperatur i 7 timer afkøles blandingen til - 5°C, og der tilsættes WSC (0,8 ml) og pH-værdien indstilles til 4,0, og man omrører ved - 5°C i en time og ved stuetemperatur natten over, hvorefter man inddamper i vakuum. Resten opløses i ethylacetat (400 ml), vaskes med mættet natriumchloridopløsning to gange med 5%'s vandig natriumbicarbonat-opløsning (100 ml), IN HC1 mættet med NaCl (100 ml) og vand (50 ml) i den nævnte rækkefølge.

Ethylacetatlaget tørres med vandfrit natriumsulfat, og det vandige lag ekstraheres med chloroform, som vaskes to gange med vand og slås sammen med ethylacetatlaget. Det organiske lag inddampes i vakuum, og resten chromatograferes under anvendelse af silicagel (150 g). Søjlen skylles med ethylacetat og med ethanol, og methan-oleluat inddampes i vakuum, n-hexan tilsættes resten til krystallisation af BOC-Ala-Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2, smp. 106-116°C. 11,5 g (udbytte: 87,3%). Tyndtlagschromatografi: én plet, Rf^ = 0,29,

Rf6 = 0,52.

(5) Fremstilling af BOC-Val-Gly-OEt: BOC-Val-OH, DCHA (219,2 g) sættes til ethylacetat (l liter). Opløsningen vaskes to gange med 1 N HC1 (600 ml) og vand (500 ml) i den nævnte rækkefølge. Efter tørring ved hjælp af vandfrit natriumsulfat inddampes opløsningen i vakuum. THF (100 ml) og dichlormetan (400 ml) sættes til resten, og H-Gly-OEt, HC1 (69,8 g) og triethylamin (70 ml) tilsættes. DCC (103,2g) tilsættes ved - 5°C, og man omrører ved denne temperatur i 1 time og ved stuetemperatur natten over. Eddikesyre (10 ml) sættes til reaktionsblandingen, og man omrører i 1 time og filtrerer. Filtratet vaskes to gange med 1 N HC1 (500 ml), to gange med en 5%’s natrium-bicarbonatopløsning (500 ml) og med vand i den nævnte rækkefølge.

149597 16

Efter tørring med vandfrit natriumsulfat inddamper man i vakuum.

Resten omkrystalliseres under anvendelse af ethylacetat-n-hexan, hvorved man får BOC-Val-Gly-OET (105,4 g) Smp. 95-96°Cf udbytte 69,7$.

(6) Fremstilling af BOC-Val-Gly-OH: BOC-Val-Gly-OEt (96,8g) opløses i methanol (150 ml) og der tilsættes 1 N NaOH-opløsning (368 ml) ved -t 5°C. Efter en times omrøring indstilles pH-værdien på 8,0 ved tilsætning afIN HC1. Methanolet fjernes ved inddampning i vakuum, og det vandige lag vaskes med ethylether (100 ml). Det vandige lag indstilles til en pH-værdi på 2,0 ved tilsætning af 1N-HC1. Det vandige lag ekstraheres med ethylacetat (200 ml) fire gange og ekstrakten tørres ved hjælp af vandfrit natriwsulfatf hvorpå man inddamper i vakuum. Resten behandles med n-hexan og omkrystalliseres af ethylacetat og n-hexan til opnåelse af BOC-Val-Gly-OH (85,5 g, udbytte 97,4$) Smp. 112-117°C (sønderdeling).l'yndtlagscrromatografi i én plet, RF^ = 0,35.

(7) Fremstilling af BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2: B0C-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (10,5 g) sættes til TFA (35 ml) ved -i-50C. Efter omrøring i 30 minutter inddampes der i vakuum. Resten behandles med ethylether, og det udfældede materiale frafiltreres og tørres i vakuum over natriumhydroxid, hvorved man opnår H-Ala--Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2, TFA. THF (100 ml) tilsættes, og der tilsættes triethylamin ved -s-5°C til indstilling af pH-værdien på 5) BOC-Val-Gly-OH (5,49) og HOBT ( 2,66 g) tilsættes, og til denne blanding sættes der dråbevis WSC (3,61 ml) ved -t-5°C, og blandingen omrøres ved -j-5°C i en time og ved stuetemperatur natten over. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og resten opløses i chloroform (300 ml). Opløsningen vaskes to gange med NaCl-mættet 1N-HC1 (200 ml), to gange med NaCl-mættet 5$ natriumbicarbonatopløsning (200 ml) og mættet NaCl-opløsning (75 ml) i den nævnte rækkefølge. Efter at opløsningen er tørret med vandfrit natriumsulfat inddampes det organiske lag i vakuum. Omkrystallisation af methanol og ethylether giver BOC-Vål-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH^ (12,0 g), udbytte 88,3$.

Smp. 121-123°C (sønderdeling). Tyndlagschromatografi giver én plet (opløsningsmiddel 5). = 10,30° (c=l, DMF).

Elementæranalyse (C^H^Ny0^.1/2 H20) C$ H$ N$ fundet: 56,67 7,43 13,90 beregnet:56.72 7.50 14,03 (8) Fremstilling af B0C-Asp(0Bzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2: TFA (100 ml) sættes til BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (33,lg) ved -7-5°C. Det hele omrøres i 30 minutter og inddampes derefter i 149597 17 vakuum. Der sættes ethylether til resten, og det udfældede materiale tørres i vakuum over NaOH og tilsættes . DMF (80 ml). Desuden tilsætte triethylamin til justering af pH-værdien på 7,5. Efter tilsætning af HOBT (950 mg) og BOC-Asp(OBzl)-GSU (30,2 g) indstilles pH-værdien på 7,5 ved tilsætning af N-methylmorpholin og omrøring i to dage. pH-værdien holdes på 7,5 under omrøringen ved tilsætning af IN-methylmorpholin. Derefter tilsættes atter BOC-Asp (OBzl)-OSU (2,0 g), og pH-værdien indstilles på 7 ved tilsætning af IN-methyl-morpholin, og omrøringen fortsættes natten over. En stor mængde vand sættes til reaktionsblandingen, og den udfældede klæbrige substans fraskilles ved dekantering og krystalliseres ved behandling med ethylether. Den vandholdige fase ekstraheres med chloroform, og ekstrakten inddampes i vakuum. Resten tilsættes vand, hvorved der udfældes et klæbrigt stof. Dette behandles med ethylether med henblik på krystallisation. De faste bestanddele slås sammen og omkrystalliseres i methanol og ethylether fire gange og vaskes med en varm blanding af ethylacetat og ethylether og tørres. Man får på denne måde BOC-Asp-(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH« (34,2 g, udbytte 79,6%) Λ ^ OQ °

Smp. 195-199 C. Tyndtlagschroma tograf i: én plet, RF = 0,46, α =-rl8,27 (c » 1, DMF). D

Elementæranalyse (C/ /^52^^12* .¾^) C% H% N%

Fundet : 58,08 6,90 12,47

Beregnet 57,88 7,07 12,27 (9) BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(BzlJ-Pro-NHg: TFA (30 ml) sættes til BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro--NH2 (7,-2 g) ved -f50C, og det hele omrøres i 30 minutter, hvorpå der inddampes i vakuum. Resten behandles ved tilsætning af ethylether, og det udfældede materiale tørres i vakuum over NaOH. Der tilsættes DMF (15 ml) og pH-værdien indstilles på 7,5 ved tilsætning af triethylamin. Efter tilsætning af HOBT (100 mg) og BOC-Thr(Bzl)-OSU (4,0 g) indstilles pH-værdien med N-methylmorpholin, og det hele omrøres i to dage ved stuetemperatur. pH-værdien indstilles derefter atter på 7,5 ved tilsætning af DMF (3 ml) og N-methylmorpholin, hvorpå reaktionsblandingen omrøres natten over.

Efter afsluttet reaktion tilsættes en stor mængde vand, og det udfældede materiale frafiltreres og omkrystalliseres i en blanding 18 169597 af metanol og ethylether tre gange. Der fås på denne måde BOC-Thr (Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (6*7 g, udbytte 77,1%) Smp. 172-188°C. Tyndtlagschromatografi: én plet (opløsningsmiddelsystem 2 o g 5, a -13,65° (c = 1, DMF).

Elementæranalyse (C^H,^ NgO^^, 1/2 H20) C% E%

Fundet i 60,31 6,92 11,58

Beregnet: 60,31 7,00 11,51 (10) Fremstilling af AOC-Arg (TOS)-Thr(Bzl)-ASp (OBzl)-Val-Gly-Ala--Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2: TFA (20 ml) sættes ved +5°C til BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala--Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2 (6,52 g) og det hele omrøres i 30 minutter, hvorefter man inddamper i vakuum. Resten behandles ved tilsætning af ethylether, og det udfældede stof tørres i vakuum over NaOH. Der tilsættes DMF (25 ml), og pH-værdien indstilles på 5,0 ved tilsætning af triethylamin ved -i- 5°C. HOBT (972 mg), AOC-Arg (To s)-OH (3,2 g)

A

og WSC (1,3 ml) tilsættes dråbevis under afkøling ved 4-5 C, hvorpå reaktionsblandingen omrøres i en time ved +5°C og derefter natten over ved stuetemperatur.

Der sættes ethylacetat til reaktionsblandingen, og udfældningen behandles med en varm blanding af methanol (400 ml) og ethylether (50 ml), hvorpå behandlingen gennemføres med varm blanding af methanol (300 ml) og ethylether (100 ml), hvorved man får AQC-Arg(Tos)- -Thr(Bzl)-As.p-(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (7,0 g, udbytte . 82,7?0 med smp. 187-193°C (sønderdeling). Tyndlagschromatografi: én plet (opløsningsmiddel 2 og 5) Rf^ = 0,42.

Elementæranalyse (CggHg^N^^0^yS,H20): C% H% N0/ S%

Fundet: 57,97 6,88 12,76 2,26

Beregnet: 58,01 6,84 12,75 2,24

Aminosyresammensætning: NH^ 1,28, Arg 0,95 (1), Aap 1,04 (1), Thr 1,50 (2), Pro 0,98 (1), Gly 1,84 (2), Ala 1,00 (1), Val 1,01 (1).

(11) Fremstilling af BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl: BOC-Tyr(Bzl)-OH,CHA (37,6 g) blandes med ethylacetat (300 ml) og IN HC1 (120 ml), hvorpåethylacetatfasen fraskilles og vaskes tre gange med vand. Efter tørring med natriumsulfat inddampes den organiske fase i vakuum, og man får en olieagtig rest, som opløses i dichlorme-than (80 ml). Opløsningen tilsættes H-Pro-Bzl,HCl (19,3 g). Til 149597 19 blandingen sættes WSC(14,6 ml) ved en temperatur på -4-5°C, hvorpå det hele omrøres i en time ved -r5°C og derefter natten over ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og resten rystes med ethylacetat (800 ml) og 1 N HC1 (400 ml) med henblik på fraskillelse af ethylacetatfasen. Den organiske fase vaskes to gange med IN HC1 (300 ml), to gange med vand (300 ml), tre gange med en 5%'s vandig opløsning af natriumbicarbonat (300 ml) og to gange med vand (300 ml) i den nævnte rækkefølge. Den organiske fase tørres med natriumcarbonat og inddampes i vakuum. Råproduktet underkastes søjlechromatografi ved anvendelse af silicagel (400 g). En blanding af chloroform og ethylacetat i mængdeforholdet 4:1 ledes gennem søjlen, og eluatet undersøges ved hjælp af tyndtlagschromatografi under anvendelse af opløsningsmiddelsystem 1, og man får et olieagtigt BOC-Tyr(Bzi)-Pro--OBzl (43 g). Rf1 = 0,88.

(12) Fremstilling af Boc-Thr(Bz1)-Tyr(Bzi)-Pro-OBz1: TFA (50 ml) sættes under afkøling til -r5°C til BOC-Tyr(Bzl)-Fro-OBzl (20g), og man omrører i 10 minutter ved *5°C og derefter i 50 minutter ved stuetemperatur, hvorpå det hele inddampes i vakuum.

Den olieagtige rest tørres over NaOH natten over, hvorpå man tilsætter DMF (30 ml), hvorpå man indstiller pH-værdi en på 7,5 ved tilsætning af triethylamin ved -f-5°C. Der tilsættes HOBT (470 mg) og BOC-Thr (Bzl)-OSU (14,2 g), og man omrører ved -5-5°C i tre timer og derefter natten over ved stuetemperatur. Under omrøringen holdes reaktions-. blandingen ved en pH-værdi på 7 ved tilsætning af N-methylmorpholin. Efter to dage tilsættes dimethylaminopropylamin (iml), og man omrører i yderligere to timer, hvorpå reaktionsblandingen inddampes i vakuum. Resten rystes med vand (500 ml) og ethylacetat (500 ml), hvorpå ethylacetatfasen skilles fra. Vandfasen ekstraheres atter med ethylacetat (200 ml). Ethylacetatfaserne slås sammen og vaskes tre gange med IN HC1, vand, 5%’s natriumbicarbonatopløsning og vand i den nævnte rækkefølge. Efter tørring med vandfrit magnesiumsulphat inddampes den organiske fase i vakuum. Resten omkrystalliseres i en blanding af ethylether og n-hexan, og man får 19,6 g råmateriale. Dette omkrystalliseres i samme opløsningsmiddel, og man får BOC-Thr(Bzl)--Tyr(Bzl)-Pro-OBzl (14,4 g), udbytte 54,9% , Rf£= 0,67.

(13) Fremstilling af BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-0H: B0C-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl (14,2 g) opløses i THF (30 ml),og til opløsningen sættes dråbevis IN NaOH (23 ml) i løbet af 15 minut- 20 T49597 ter ved - 5°C. Efter omrøring i fire timer ved stuetemperaur, indstilles pH-værdien på 7 med i N HC1, hvorefter man inddamper i vakuum med henblik på fjernelse af THF. Der sættes vand til den vandholdige fase, og efter vaskning med ethylether indstilles pH-værdien i den vandholdige fase på 2 ved tilsætning af I.R HC1, hvorpå der ekstra-heres med ethylacetat to gange. Ethylacetatfasen vaskes med vand og tørres med vandfrit magnesiumsulfat og inddampes i vakuum. Resten omkrystalliseres af en blanding af ethylether og n-hexan, og man får et råmateriale (12 g). Dette opløses i ethylacetat, og opløsningen tilsættes ethylether og henstilles til krystallisation. Ved gradvis tilsætning af n-hexan får man BOC-Thr (Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro~GH (10,5 g) 1 et udbytte på 84% og med smp. 136 - 138°C. Tyndtlagschromatografi: én plet, Rf·^ = 0,68, Rf^ = 0,53.

Elementæranalyse (C^yH^N^Og) C% H% N%

Fundet: 67,33 6,85 6,40

Beregnet: 67,35 6,88 6,37 (14) Fremstilling af BOC-Thr(Bzl)-Tyr (Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)--Asp(OBz)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2: AOC-Arg (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (6,0 g) sættes til TFA (20 ml) ved -5°C, og man omrører i 30 minutter, hvorpå man inddamper under formindsket’ tryk. Resten behandles med ethylether og tørres i vakuum over NaOH. Der tilsættes DMF (20 ml), og efter indstilling af pH-værdien på 4,5 ved tilsætning af triethylamin ved -5°C tilsættes HOBT (851 mg), og der tilsættes dråbevis BOC-Thr (Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-0H(4,2 g) og WSC (1,2 ml) ved -5°C. Der omrøres i en time ved -5°C og derefter natten over ved stuetemperatur. Methanol (300 ml) og ethylether (100 ml) sættes til reaktionsblandingen, og udfældningen frafiltreres og omkrystalliseres tre gange, først af en. blanding methanol og ethylether, derefter med en blanding af DMF-ethylether og til sidst med methanol, og ethylether, og man får B0C-.' -Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly--Thr(Bzl)-Pro-NH2 (5,8 g, udbytte 71,3%), smp. 186,5 - 190°C(søn-derdeling). Tyndtlagschromatografi: én plet (opløsningsmiddelsystem 2 og 5), <Xp8 = 15,86 (c-1, DMF).

Elementæranalyse (C100H12gN1g022S,l/2 H20): C% H% N% S%

Fundet: 61,44 6,63 11,55 1,73

Beregnet: 61,68 6,68 11,51 1,65 149597 21

Aminosyreanalyse: NH^ 1,60, Arg 0,92 (1), Asp 1,04 (l), Thr 2,1 (3),

Pro 1,08 (2), Gly 1,86 (2), Val 1,00 (l), Tyr 0,91(1) (15) Fremstilling af BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NHg: BOC -Thr (Bzl) -Tyr (Bzl) -Pro-Arg( To s)-Thr (Bzl) -Asp (OBzl) -V al-Gly-Ala-- Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (5,4 g) sættes til TFA (20 ml) ved -r5°C, og man omrører i 30 minutter og inddamper i vakuum. Resten behandles med ethylether og tørres over NaOH i vakuum. DMF (18 ml) tilsættes, og pH-værdien indstilles på 7,5 med triethylamin, hvorpå HOBT (100 mg) og BOC -Gln-ONP (1,54 g) tilsættes, og der omrøres i to dage ved stuetemperatur. Under omrøringen holdes pH-værdien på 7,5 ved tilsætning af N-methylmorpholin. Derefter tilsættes BOC-Gln-ONP (0,2 g), og pH-værdien indstilles på 7,0 under omrøring natten over. Efter reaktionen tilsættes en stor mængde vand til udfældning af produktet, som omkrystalliseres tre gange i methanolethylether, hvorved man får BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val--Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (4,8 g, udbytte: 82,9%) Smp. 178-182°C, Rf2= 0,67, α p8 = 15,19° (c = 1, DMF).

Elementær analyse (^ο^Η-^Ν-^Ο,,^Β, 2H20) C% H% N% S%

Fundet: 59,92 6,56 12,05 1,47

Beregnet: 59,98 6,71 11,99 1,53 (16) Fremstilling-af-BOC-Lys(ClCbz)-LeU-OEt: B0C-Lys(ClCbz)-0H, tert.-butylaminsalt (7,32g) suspenderet i ethylace-tat vaskes tre gange med 1 N HdilOO ml) og vand (100 ml) Efter tørring med vandfrit magnesiumsulphat, afdestilleres ethylacetatet.

Resten tilsættes dichlormethan (60 ml), H-Leu-OEt,HCl (2,93 g) og.

HOBT (2,0 g) og desuden tilsættes WSC (2,75 ml) ved 4-5°C, og man omrører i en time. Omrøringen fortsættes natten over ved stuetemperatur. Efter reaktionen fjernes dichlormethanen i vakuum, og resten opløses i ethylacetat (150 ml). Opløsningen vaskes medlNHCl, 5%'s natriumbi-carbonatopløsning og vandv Efter tørring med vandfrit magnesiumsulphat inddampes i vakuum, og resten omkrystalliseres i en blanding af ethylacetat og n-hexan, hvorved man får 6,4 g BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt i et udbytte på 76,6% og med smp. 76-79°C.

(17) Fremstilling af BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OH:

Til® Opløsning af BOC-Lys(ClCbz)-Leu-OEt (6,13 g) i ethylacetat (20 ml) sættes IN NaOH (12,1 ml) ved 0°C, og man omrører i to timer ved stuetemperatur. En yderligere mængde IN NaOH (1,1 ml) tilsættes 149597 22 og efter en times omrøring indstilles pH-værdien til 7, og man inddamper i vakuum. Resten vaskes med ether, og den vandholdige fase indstilles til en pH-værdi på 3 og ekstraheres tre gange med ethyl-acetat (100 ml). Efter vaskning af ethylacetatfasen (lOOél) og tørring med vandfrit natriumsulphat inddampes den i vakuum. Resten opløses i ethylether (50 ml), koncentreres under formindsket tryk og tørres, således at man får BGC-Lys(ClCbz)-Leu-OH i form af et pulver (5,85 mg) aed smp. 46-60°C. = -10,68° (c = 1, DMF).

Elementæranalyse (^25^38^3 O7CI, 1/3 H2O): C%

Fundet: 56,25 7,35 8,00

Beregnet: 56,21 7,31 7,87 (18) Fremstilling af BOC-Leu-His-OH: H-His-0H,HC1 (3,8 g) opløses under opvarmning i vand (25 ml). Efter afkøling af opløsningen til stuetemperatur tilsættes natriumbicarbo-nat (1,84 g) og yderligere HOBT (270 mg), BOC-Leu-OSU (8,5 g) og THF (25 ml)tilsættes. Der tilsættes 10 ml vand, og man omrører natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingens pH-værdi indstilles til 7 ved tilsætning af en vandopløsning af natriumbicarbonat, og der tilsættes atter BOC-Leu-OSU (1,3 g), hvorpå man omrører. Efter seks timer tilsættes yderligere 1,3 g, og omrøringen fortsættes natten over.

Efter afsluttet reaktion, hvilket fastslås ved tyndtlags-cromatografi, inddampes reaktionsblandingen i vakuum til fjernelse af organisk opløsningsmiddel, og den resterende vandholdige fase vaskes med ethylacetat. Den vandige fase indstilles til en pH-værdi på 5 og hældes på en søjle af "Diaion" HP-20(2,3 x 18 cm) ("Diaion" er registreret varemærke for Mitsubishi Chemical Industries), hvorpå man vasker med vand, til vaskeeluatet giver negativ ninhydrin-reaktion. Derefter eluerer man med methanol. Eluatet inddampes i vakuum, og resten tilsættes ethylether. Den dannede udfældning frafiltreres og genudfældes to gange med en blanding af methanol og ethylether, hvorved man får et tørt pulver (3,94 g) i et udbytte på 53,5% og smp. 178-180°C.

149597

23 1 Q

α-£ = 0,19 (c-1, BMP).

Elementæranalyse (ci7H28N4°5'2/3 H20) C% H% N%

Fundet: 53,39 7,65 14,71

Beregnet: 53,65 7,79 14,73 (19) Fremstilling af BOC-Leu-Ser (Bzl)-OH: H-Ser(Bzl)-OH (11,7 g) opløses i vand (50 ml), og til opløsningen sættes natriumbicarbonat (10,1 g) og dioxan (10 ml). Derefter tilsættes BOC-Leu-OSU (16,4 g) i dioxan (15 ml) og DMF (5 ml). Efter omrøring af reaktionsblandingen natten over indstilles pH-værdien på 7, og blandingen inddampes i vakuum til fjernelse af organisk opløsningsmiddel. Den vandige fase rystes med ethylacetat (100 ml), og den organiske fase vaskes to gange med 1 N HC1 og vand. Den organiske fase tørres med vandfrit magnesiumsulphat og inddampes i vakuum, og resten omkrystalliseres to gange i en blanding af ethylacetat og n-hexan, hvorved man får B0C-Leu-Ser(3zl)-0H (16,1 g) i et udbytte på 78,8%, smp. 82-86°C.

(20) Fremstilling af BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)=OH.

BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH (4,1 g) (10 mmol) sættes under afkøling ved -r-5°C til TFA (25 ml), og man omrører i 25 minutter, hvorpå man inddamper i vakuum. Der sættes ethylether til resten tiludfældning af materialet som tørres over INaOH i vakuum.

Krystallerne opløses i DMF (8 ml) og opløsningen tilsættes BOC-Lys (ClCbz)-ONP (8 g) og HOBT (270 mg), og pH-værdien indstilles på 8 med N-methylmorpholin og omrøres natten over ved stuetemperatur.

Der tilsættes IN HC1, og udfældningen udfæl'desi chloroform, og opløsningen vaskes tre gange med IN·Hel, tre gange med en 5%fs na-triumbicarbonatopløsning og tre gange med vand. Efter tørring med vandfrit magnesiumsulfat. inddampes chloroformfasen i vakuum. Resten udfældes tre gange af en blanding af ethylacetat og n-hexan og yderligere tre gange med en blanding af ethylether og n-hexan, hvorpå produktet ledes gennem en søjle af silicagel (180 g), som vaskes med ethylacetat og benzen i forholdet 2:1 og elueres med methanol. Metha-noleluatet inddampes i vakuum. Resten omkrystalliseres af en blanding af ethylacetat og n-hexan, og man får BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH (5,25 g) i et udbytte på 74,5%, smp. 84-100°C (sønderdeling). Tyndt-lagschromatografi: én plet.

149697 24

Aminosyresammensætning: Lys 0,98 (1), Leu 1,00 (1), Ser 0,82 (l).

(21) Fremstilling af BOC-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2: BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(03zl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NE2 (7,65 g) opløses i TFA (35 ml) ved 4-5°C, hvorefter man omrører i 30 minutter og inddamper i vakuum. Resten behandles med diethyle ther, o’g det udfældede materiale tørres over

NaOH i vakuum og opløses i DMF (25 ml). Til opløsningen sættes HOBT (600 mg) BOC-Lys(CICbz)-Leu-0H(2,35 g) og WSC (0,69 ml) ved 4-5°C, hvorpå man omrører i en time ved 4-5°C og derefter natten over ved stuetemperatur. Der sættes 1N-HC1 til reaktionsblandingen til udfældning af materialet, og dette udfældes to gange med en blanding af methanol og ethylether og tørres, hvorved man får produktet (8,0 g) i et udbytte på 87% og med smp.

. ,,.o. , , , , 15 = 18,65 (c =1, DMF).

over 164 C (sønderdelxng), D

Elementæranalyse: (ci25Hl64N21°28SC1’^: C% H% N%

Fundet: 59,63 6,67 11,78

Beregnet: 59,75 6,62 11,71 (22) Fremstilling af B0C-Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr (Bzl) -Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) Pro-NH2: BOC-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(To s-Thr(Bzl)-Asp (OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (7,68 g) fremstillet som angivet ovenfor under (6) opløses i TFA (40 ml) ved 4-5°C, hvorpå opløsningen omrøres i 30 minutter og inddampes i vakuum. Resten opløses i DMF (20 ml), opløsningens pH-værdi indstilles på 5 ved tilsætning af triethylamin, og man tilsætter H0SU (430 mg) ,B0C-Leu-His-0H (1,37 g) og ¥SC (58 ml ved 4-5°C og omrører i en time og derefter i stuetemperatur natten over. Der sættes IN HC1 til reaktionsblandingen til udfældning af materialet, som genudfældes åf en blanding .af methanol og ethylether og atter af en blanding af DMF og ethylether. Produktet (8,30 g) fås ved tørring i et udbytte på 98,2% og smp.

167 - 175°C, cc £5 = 4-17,45 (c-1. DMF).

149597 25

Elementæranalyse (ci37Hi82N25°30SC1 ’HC1 * ^¾0 ^: C% H% N%

Fundets 58,19 6,71 12,42

Beregnet: 58,04 6,79 12.35 (23) Fremstilling af BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCBz)-Leu-Gln-Thr(Bzl) -Tyr(Bzl)-Pro-Arg(T®s)-Thr(Bzl)—Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2: BOC-Leu-Hi s-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Arg(To s)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)_Pro-NH2 (7,64 g) fremstillet som angivet ovenfor vinder (7) opløses i TFA (35 ml) ved -r5°C, hvorpå opløsningen omrøres i 40 minutter og inddampes i vakuum. Resten opløses i DMF (30 ml) pH-værdien indstilles på 7 ved tilsætning af N-oethylmorpholin, og der tilsættes HOBT (70 mg og BOC-Glu (OBzl)-OSU (1,82 g). Man indstillet atter pH-værdien på 7 ved tilsætning af N-methylmorpholin, hvorefter man omrører i to dage ved stuetemperatur. Der sættes IN HC1 til reaktionsblandingen, og udfældningen omkrystalliseres to gange af en blanding af methanol og ethylether, hvorved man efter tørring får produktet (7,55 g) i et udbytte på 92,5% og Smp. på l6l-l69°C (sønderdeling)

Aminosyresammensætning: Lys: 0,94 (1), His 0,83 (1), Arg: 1,05 (1)

Asp: 1,08 (1), Thr: 2,52 (3), Glu: 2,06 (2)

Pro:2,16 (2), Gly: 2,00 (2), Ala:l,06 (1),

Val: 1,10 (1), Leu: 1,82 (2), Tyr: 0,73 (l) (24) Fremstilling af BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(ClCbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Pro-NH2: B0C-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg (Tes)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-GlyAla-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH2 (7,29g) opløses i TFA (30 ml) ved -r5°C og opløsningen omrøres i 45 minutter, og inddampes i vakuum. Resten opløses i DMF (15 ml), pH-værdien indstilles på 7 ved tilsætning af lN-methylmorpholin, og der tilsættes HOBT (100 mg) og BOC-Gln-ONP (1,4 g), hvorefter man omrører natten over ved stuetemperatur.Der sætte 1N-HC1 til reaktionsblandingen, og udfældningen samles og vaskes med vand. Der genudfældes tre gange, hvorpå man får et tørt produkt (7,00 g) i et udbytte på 91,5% og Smp. 171 - 175°C (sønderdeling).

149597 26 (25) Fremstilling af BOC-Lys(CICbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-

Hi s-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr (Bzl)-Pro-NH2: BOC-Gln-Glu(OBzl)Leu-His-Lys(CICbz)-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-!lhr(Bzl)-Pro-NH2 (670 g) opløses i TFA (30 ml ved -r-5°C, og opløsningen tilsættes 4N-HCl/dioxan (2,2 ml) og omrøres i 45 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og resten tilsættes ethylether til udfældning af materialet, som vaskes omhyggeligt med ethylether og tørres over NaOH i vakuum.

Det således opnåede stof opløses i DMF (15 ml), og opløsningen indstilles til en pH-værdi på 5,5 - 6 ved tilsætning af N-methylmor-pholin og tilsættes HOBT (360 mg), BOC-Lys(ClCbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH (1,86 g) og DCC (540 mg) opløst i DMF (5 ml), hvorpå man omrører i en time og derefter natten over ved stuetemperatur.IN- HC1 tilsættes, og den dannede opløsning frafiltreres. Den i ethanol uopløselige del af udfældningen slås sammen med det udfældede materiale, som opnås ved tilsætning af ethylether til filtratet, og man tilsætter en blanding af methanol og ethylether, hvorpå udfældningen gentagne gange omkrystalliseres i en blanding af methanol og ethylether, hvorved man får produktet (7,0 g) i et udbytte på 87,6% og med smp. 171-177°C (sønderdeling), a·1^ = 18,45 (c = 1, DMF).

Elementæranalyse (ci84%42N32°4lscl2»HC1» 1/2 H20): C% H% N% S% Cl%

Fundet: 58,53 6,65 11,83 0,94 2,64

Beregnet: 58,21 6,74 11,81 0,84 2,80

Aminosyresammensætning: Lys: 1,86 (2), His: 0,74 (l),Arg: 0,97 (1)

Asp:. 1,04.(1),‘..Thr: 2,55 (3),Ser: 0,53 (1)» Glu: 2,85 (3), Pro: 2,08 (2), Gly:2,00 (2)

Ala: 1,04 (1), Val: 1,04 (1), Leu:2,67 (3), Tyr: 0,67 (1).

27 U9597

Aminosyresekvens nr. 1-9: ,-(ch2)5-,

i I

'""Co-Ser (Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH “ fremstilles som følger:

(26) Fremstilling af (c^) 000H

j BOC-Thr(Bzl)-HN-CH-COOCH, (ch2)5 COOH 5

Cbz-HN^H-COOCH^ (olie, 56g) opløses i methanol (300 ml) og vand (150 ml)

Til opløsningen sættes aktivkul, og efter omrøring i en time tilsættes der palladium på kul, og man hydrogenerer i 10 timer. Catalysatoren fjernes, og man inddamper i vakuum indtil 100 ml. Til koncentratet sættes dioxan (200 ml), triethylamin (21 ml) under afkøling og BOC-

Thr (Bzl)“OSU (80 g). Efter omrøring i tre dage ved stuetemperatur tilsættes der N,N-dimethylamino-1,3-propandiamin, og man omrører i tre timer, hvorefter man inddamper indtil 100 ml og ekstraherer med ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med 1N-HCL og vand og destilleres i vakuum. Det således opnåede olieagtige produkt opløses i ether og - optages i 5$>'s natriumbicarbonatopløsning. Efter omhyggelig vask-ning af det vandige lag med ether ekstraherer man igen med ethylacetat og vasker med vandjlN-HCl og vand i den nævnte rækkefølge, tørrer med vandfrit natriumsulphat og afdestillerer ethylacetatet til opnåelse af et olieagtigt produkt (57 g)

(CHjc COOH

(27) Fremstilling af BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCOOCH^, CHA:

(CH2)5 COOH

BOC-Thr(Bzl)-HNCHC00CHj (50 g) opløses i TFA (150 ml) under afkøling. Efter 30 minuttetf ved stuetemperatur fjernes TFA under formindsket tryk, og den olieagtige rest tørres overNaOH i vakuum natten over.

Det olieagtige materiale opløses i DMF (100 ml), og pH-værdien indstilles på 6 ved tilsætning af triethylamin (40 ml) under afkøling. Der tilsættes HOBT (5 g) og BOC-Ser(Bzl)-0SU (50 g).

28 143597

Reaktionsblandingen indstilles til en pH-værdi på 6 ved tilsætning af N-methylmorpholin og omrøres i tre dage ved stuetemperatur.

Der tilsættes N,N-dimethylamino-l,3-propandiamin, og blandingen omrøres i en time, hvorefter der tilsættes vand og ekstraheres med ethylether. Ekstrakten vaskes med 1N-HC1, vand, 5%*s bicarbonatopløs-ning og vand i den nævnte rækkefølge og tørres med vandfrit natrium-sulphat. Ethylacetatet fjernes, og resten opløses i ethylether (300ml) hvorefter den genekstraheres med 5%'s bicarbonatopløsning. Det vandige lag syrneæmed HC1 og ekstraheres med ethylacetat, og man vasker ethyl-acetatlaget med 5%'s natriumbicarbonatopløsning og vand og tørrer med vandfrit natriumsulfat. Efter tilsætning af et lige så stort rumfang cyclohexylamin til ethylacetatlaget destilleres blandingen under formindsket tryk til opnåelse af et olieagtigt produkt, som størkner ved tilsætning af ether og n-hexan.

Udbytte 41 g, smp. 70-73°C a = +4,9° C = 2,7, DMF).

(28) Fremstilling af BOG-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNHg i BOC~Ser(Bzl)-Asn-Leu-OEt (15 g, 27,2mmol) opløses i methanol (100 ml). Denne opløsning tilsættes 80Jé’s NHgNHg,HgO·(50 ml) og man lader henstå natten over ved stuetemperatur. Derpå tilsætter man ethylether til fuldstændig udfældning, og udfældningen vaskes med ethylether og krystalliseres derpå med en blanding af Na,0H, AcOEt og ethylether til opnåelse af produktet ( 13,5 g), Udbytte 92,5%) smp. 207-209°C (sønderdeling), cc = +17,4 (c = 0,77, DMF).

(29) Fremstilling af BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl- (ch2)5cooh -HNCHCOOH (oh2)5cooh i BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCH-C OOCH^,CHA (10,0 g) behandles med IN HC1 i ethylacetat til fremstilling af ren syre, hvorefter man tørrer med vandfrit natriumsulphat og inddamper i vakuum. Der sættes TFA (30 ml) til den olieagtige rest under afkøling. Efter omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur fjernes TFA linder formindsket tryk. Resten tørres over NaOH i vakuum.

149597 29 BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-NHNH2 (8,5 g) opløses i DMF (30 ml), og der tilsættes dioxan (14 ml) indeholdende IN HC1 og isoamylnitrit (3,1 mg) , hvorefter man omsætter i tyve minutter til dannelse af azid.

Det tørrede TFA salt opløses i DMF (10 ml), neutraliseres med triethylamin og sættes derpå langsomt til opløsningen indeholdende azidproduktet ved en temperatur under-r40°C. Man indstiller pH-vær di en på 7 ved tilsætning af triethylamin og omsætter i tre dage ved 5°C.

Reaktionsblandingen sættes langsomt ved -r5°C til 0,5 N HC1 (300 ml). Den frafiltrerede udfældning vaskes med vand og ekstrahe-res med chloroform (500 ml). Efter vaskning af chloroformlaget med IN HC1 og vandig NaCl-opløsning fjernes chloroformet under formindsket tryk, og resten udfældes ved tilsætning af chloroform og n-hexan til opnåelse af produktet (11,8 g). Udbytte 84,3%, smp. 183-185°C (sønderdeling) cc = -ί-5,50 (c = 0,72 DMF).

Aminosyreanalyse: Asp 1,00 (1), Thr 0,82 (l), Ser 1,62 (2), Leu 0,91(1) α-amino suberinsyre 1,05 (1).

(30) Fremstilling af --(ch2)5—-j -C0-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl) - HNCHCONHNHg : (ch2)5cooh BOC-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCQCH,, (3,2g, 3 mmol) opløses i tørt pyridin (30 ml), og man tilsætter TFA-ONP (5 g) og omrører i tre timer ved 45°C. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, og der tilsættes ethylether. Udfældningen vaskes med ethylether og tørres til opnåelse af et gulligbrunt pulver (2,9 g). Der sættes TFA (20 ml) til dette pulver under afkøling, og man omrører i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter man fjerner TFA. Resten opløses i DMF (20 ml). Opløsningen sættes dråbevis til tørt pyridin (2,5 1) ved 45°C under omrøring i 30 minutter. Omrøringen fortsætter i syv timer ved 50°C og natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum, opløses i chloroform (2 1) og vaskes med mættet vandig NaCl-opløsning, 1 N HC1 og vandig NaCl (5 gange) i den angivne 149597 30 rækkefølge, og endelig inddampes chloroformet indtil 10 ml i vakuum.

Der tilsættes n-hexan (500 ml), og udfældningen samles ved filtrering til opnåelse af produktet (2,0 g). Udbytte 72%, smp. 165°C (sønderdeling).

Forbindelsen (3,9 g) opløses i DMF (10 ml) og methanol (50 ml), og der tilsættes 80%'s (30 ml) og der omrøres natten over ved stuetemperatur. Efter reaktion tilsættes der vand, og udfældningen frafiltreres, vaskes med vand, og der tilsættes methanol (100 ml) og tilbagesvales ved opvarmning. Reaktionsblandingen afkøles til stuetemperatur, og udfældningen frafiltreres, hvorved produktet fås (1,4 g), α =-f8,6° (c = 0,8, DMF).

Amino syreanalyse: Asp 1,10 (l), Thr 1,00 (l1)* Ser 1,64 (2), Leu 1,00(1).' oc-aminosuberinsyre 1,08 (1) (31) Fremstilling af BOC-Leu-Gly-OBzl:

En opløsning af WSC (34 g) i dichlormethan (50 ml) sættes dråbevis til en suspension af BOC-Leu-OH (46,2 g), HOBT (1 g) og H-Giy-OBzl, TosOH (74 g) i DMF (100 ml) og dichlormethan (200 ml) under omrøring ved -5-5°C i en time. Efter en times forløb omrøres opløsningen natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen inddampes i vakuum til fjernelse af dichlormethan. DMF-laget tilsættes vand og ekstraheres med ethylacetat (1 1) og atter samme opløsningsmiddel (500 ml). Ethyl-acetatlaget vaskes med IN HC1, vand, 5%fS natriumbicarbonatopløsning og vand i den nævnte rækkefølge og tørres med vandfrit natriumsul-phat og inddampes i vakuum til opnåelse af olieagtigt BOC-Leu-Gly-OBzl (82 g). Rf = 0,68.

(32) Fremstilling af BOC-Val-Leu-Gly-OBzl: TFA (70 ml) sættes til BOC-Leu-Gly-OBzl (76 g) ved -s-5°C, omrøres i 30 minutter og inddampes i vakuum. Resten tørres over NaOH i vakuum. DMF (200 ml) tilsættes, og pH-værdien indstilles på 6,5 ved tilsætning af triethylamin (ca. 50 ml) ved -r 5°C.

Der tilsættes BOC-Val-OSU (19 g) og HOBT (2 g). Reaktionsblandingen indstilles til en pH-værdi på 6 ved tilsætning af N-methyl-morpholin, og man omrører i fire dage ved stuetemperatur. Under omrøringen holdes pH-værdien på 6 ved tilsætning af N-methylmorpholin.

149597 31

Der tilsættes en stor mængde vand, og man ekstraherer med ethylacetat, og derpå tilsættes der N,N-dimethylamino-1,3propandiamin (1 ml) til ekstrakten, og blandingen omrøres i 30 minutter. Ekstrakten vaskes med vand, IN HC1, 5%’s natriumbicarbonat og vand i den nævnte rækkefølge og tørres med vandfrit magnesiumsulphat. Man fjerner ethylace-tatet, og produktet krystalliseres af n-hexan til opnåelse af BOC--Val-Leu-Gly-OBzl (90 g, udbytte 94%) smp. 119-121°C.

Elementæranalyse: (C25H39N3°6): C% H% N%

Fundet: 62,73 8,34 8,85

Beregnet: 62,86 8,25 8,80 (33) Fremstilling af j-(ch2)5 -( L CO-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HN0H-C0-Val-Leu-Gly-OH: r--( CH2 ^ 5-;-1 LC0-Ser(Bzl)-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzi)-HNCHC0-NHNH2 (1*36 g, 1,42 mmol) suspenderes i DMF (5 ml). Til denne suspension sættes dioxan (2 ml) indeholdende 4N HQ1 ved +5°C og opløses helt ved 10°C. Isoamylnitrit (0,3 ml) tilsættes ved en temperatur mellem *5 og -r 10°C, og der omrøres i tyve minutter. Efter reaktionen tilsættes der H-Val-Leu-Gly-OH (1,2 g) ved -r50°C), pH-værdien indstilles på 7 ved tilsætning af triethylamin,og man omrører i to dage i isbad. Reaktionsblandingen sættes langsomt til 0,5 N HC1 (200 ml) under afkøling. Udfældningen vaskes med 0,5 N HC1 og vand og tørres derpå til opnåelse af produktet (1,5 g)» smp. 240°C (sønderdeling).

Udbytte: 84,34 α = -KL8,4° (c * 0,7, DMF).

Eksempel 3

Fremstilling af I-<·™2>5-[

Lco-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HHCHCO-Val

Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-

His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-

Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NI^

BOC-Lys (DIP)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-Hi s-Lys(DIP)-Leu-Gln-Thr (Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)Asn-Thr(Bzl)-Gly-Ser(Bzl)-Gly--Thr(Bzl)-Pro-NH2 (500 mg, 0,130 mmol) opløses i TFA (5 ml) og 4 N

149597 32 HCl/dioxan (0,5 ml) ved -f5°C. Efter omrøring i 40 minutter ved stuetemperatur inddampes opløsningen i vakuum, og der tilsættes ethyl-ether til dannelse af en udfældning. Udfældningen tørres over NaOH. Den tørrede udfældning opløses i DMF (3 ml) og 2,3 ml(svarende til 100 μ mol) deraf inddampes til 1 ml, og pH-værdien indstilles på 7 ved tilsætning af triethylamin under afkøling. Til denne opløsning sættes HOSU (23 mg), I-<CH2>5-

IcO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO-Val-Leu-Gly-OH (90 mg, 90 mmol) og DCC (41 mg), og blandingen omrøres i to dage ved stuetemperatur.

Efter reaktionen tilsættes der 1 M AcOH (150 ml) til udfældning af produktet, og den således dannede udfældning samles ved filtrering, vaskes grundigt med vand og tørres i vakuum til opnåelse af 520 mg produkt. Pulveret (520 mg) behandles med hydrogenfluorid (50 ml) og en blanding af phenol og anisol i forholdt 1:1 (2 ml) ved 0°C i 90 minutter. Efter afdestillation af hydrogenfluoridet opløses resten i 1 M AcOH. Opløsningen ledes gennem en søjle af Dowex (indregistreret varemærke) 1x2 (acetatform), og eluatet frysetørres til opnåelse af et pulver (341 mg). 341 mg af dette pulver opløst i 0,01 M vandig ammoniumacetatopløsning hældes på en søjle pakket med CM-cellULose (2,3 x 50 cm) og vaskes med 0,01 M vandig ammonium (pH-værdi 4,5, 700 ml) og elueres ved lineær gradient eluering med 0,01 - 01 mol ammoniumacetat (pH-værdi 4,5). Hver fraktion på lOg samles, og aktive fraktioner ( fraktion nr. 80 - 111) samles og frysetørres til opnåelse af det aktive pulver. Lyophilisatet opløses i 0,1 M AcOH og chromatograferes gennem en søjle af Sephadex (indregistreret varemærke) G-50 (2,2 x 105 cm) ved eluering med 0,1 M AcOH (10 ml/time). Eluatet (5 g) fraktioneres, og derpå samles de aktive fraktioner (.nr. 55-63) og lyophiliseres til opnåelse af det aktive pulver (22 mg).

Det aktive pulver (22 mg) opløst i 0,01 vandig ammoniumacetat opløsning hældes på en søjle pakket med CM-cellulose (2,3 x 25 cm), og man gradienteluerer med ammoni umacetat (pH 4,5). Hver 8g elueret fraktion samles, og de aktive fraktioner nr·. 109-119 frysetørres. Dette pulver opløst i en lille mængde 0,1 M eddikesyre hældes på en søjle af Sephadex (indregistreret varemærke) LH-20 (2,3 X 135 cm), og man eluerer med 0,1 M eddikesyre og opsamler hver 6 g eluat, og de aktive fraktioner nr. 31 - 34 samles og frysetørres til opnåelse af det aktive pulver.

149597 33

Rf = 0,61 (Merck) (indregistreret varemærke) cellulose, n-BuOH i pyri-din s AcOH i vand (15 : 10 : 3 :12).

Styrke: 3025 MRC enheder/mg.

Aminosyre analyse: Lys 1,82 (2), His 0,97 (l)» Arg 0,98 (1), Asp 1,96 (2), Thr 4,39 (5), Ser 2,88 (4), Glu 3,00 (3),

Pro 2,16 (2), Gly 2,85 (3), Val 1,12 (1), Leu 4,20 (5), Tyr 1,01 (1), a-aminosuberinsyre 0,99 (1).

Det opnåede aktive pulver renses yderligere ved carboxyme-thylcelluloseionchromatografi, "Sephadex"-G-50-gelfiltrering, carboxymethylcellulosechromatografi og "Sephadex"-LH-20-gelfil-trering til opnåelse af det rensede produkt (5150 MRC-enheder/mG).

Eksempel 4

Fremstilling af * (0¾) ^ j S-CO-Gly-Asn-leu-Ser-Thr-NHCHCO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe- -Asn-Lys -Phe -His -Thr-Phe -Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly -Val-Gly-Ala-Pro -HH2 2,0 g (0,6 mmol) af B0C-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl(Cl2))-Thr(Bzl)-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Asn-Lys(ClOBz)- -Phe-Hi s-Thr(Bz1)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bz1)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro - -m2 opløses i 10 ml TFA ved -5°C. Efter omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur inddampes opløsningen i vakuum, og der tilsættes ethyl-ether til dannelse af en udfældning. Udfældningen tørres over natriumhydroxid. Len tørrede udfældning opløses i 10 ml LMF og indstilles til en pH-værdi på 9 ved tilsætning af triethylamin under afkøling. Til denne opløsning sættes vand til dannelse af en udfældning. Udfældningen tørres over P20^ til opnåelse af forbiridélseh uden BOC som fri base.

34 149597 0,8 g (0,71 mmol) af

LcO-Gly-Asn-Leu^3e£(Bzl) -Thr( Bzl) -HB&HCO-Me t-Beu-Gly-OH opløses i 5 ml blanding af BMP og K-methylpyrrolidon i forholdet 1:1. Der tilsættes HOSU (122 mg), og der tilsættes yderligere DCC (146 mg) opløst i BMP (3 ml) under afkøling, hvorpå man omrører natten over. Efter afsluttet reaktion fjernes udfældningen, og til den således opnåede opløsning sættes den ovenfor opnåede forbindelse uden BOC som fri base, og der tilsættes HOBT (100 mg), og man omrører i 5 dage ved 30°C. Efter reaktionen tilsættes vand. Den således dannede udfældning samles ved filtrering, vaskes med vand og tørres, hvorved man får 2,6 g råprodukt af -(ch2)5-1 -CO-ffly-Asn-Iieu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Met-Ieu-Gly-Thr(Bzl)-· . -Tyr(Bzl(Cl2))-Thr(Bzl)-Gin-As p(OBz1)-Phe-Asn-Bys(CICbz)-Ehe-His--Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-Yal-Gly-Ala-Pro-BH2

Ovenstående 1,0 g råmateriale behandles med hydrogenfluorid (25 ml), methionin (0,1 g) og anisol (2 ml) ved -5°C i 60 minutter under afkøling ved hjælp af tøris og methanol under formindsket tryk i nærværelse af dimethylthioether. Efter afdestillation af hydrogenfluorid vaskes resten med diethylether, og udfældningen samles ved dekantering, hvilket gentages 3 gange, og man opløser i en blanding af eddikesyre (30 ml) og vand (10 ml). Opløsningen ledes gennem en kolonne af "Dowex" (indregistreret varemærke) 1x2 (acetatform) (2,5 x 8 cm), vaskes med vand (200 ml), og eluatet ledes igen gennem en søjle af Sephader HP-20 (2,5 x 7 cm). 80?6 ethanolopløs-ning ledes gennem søjlen, og efter destillation af eluatet til fjernelse af ethanol lyofiliseres opløsningen, hvorved man får 440 mg pulver. 440 mg af dette pulver opløst i 0,01 M vandigt ammoniumacetat hældes på toppen af en søjle pakket med carboxymethylcellulose (2,2 x 25 cm) og elueres med lineærgradienteluering med 0,01-0,2 mol ammoniumacetat (hver 250 ml) (pH-værdi 4,5). Hver 10 g fraktion samles, og de aktive fraktioner (fraktionsglas nr. 67-70) slås aammen og frysetørres til opnåelse af det aktive pulver. Lyofilisatet opløses i 1 M eddikesyre og chromatograferes gennem en søjle af "Sephadex" LH-20 (indregistreret varemærke) (2,2 x 137 cm) ved eluering med 1 M AcOH. Eluatet (6 g) fraktioneres, hvorpå de aktive fraktioner (nr. 28-37) samles og lyofiliseres.

«. Lyofilisatet opløses i det øverste lag af en blanding af 149597 35 butanol, eddikesyre og vand i forholdet 4:1:5, og opløsningen hældes på en søjle af "Sephadex" ff-25 (2,7 x 52 cm), som er pakket aed det nederste lag af ovennævnte opløsningsmiddelblanding og derefter erstattet med det øverste lag af det nævnte blandede opløsningsmiddel, Eluering foretages med samme øvrelagsopløsningsmiddel til fraktionering af hver 6 g fraktion, og de aktive fraktioner (glas nr.

5-14) samles og lyofiliseres. Det således opnåede pulver reehro-matograferes under de samme betingelser på "Sephadex" G-25 og lyofiliseres. Det lyofiliserede aktive pulver opløses i 1 M eddikesyre, hældes på en søjle af ’’Sephadex" DH-20 (2,2 x 137 cm) og eluerés med 1 M eddikesyre til opnåelse af fraktioner på hver 5g.De aktive fraktioner slås sammen og lyofiliseres til opnåelse af 29,7 mg af produktet (1000 MRC enheder/mg). Bf = 0,82 (bærer: Merck-cellulose, fremkalder: n-butanol, eddikesyre, vand og pyridin (15:3:12:10)), Ef = 0,43 (bærer: Merck-cellulose, fremkalder: n-butanol, eddikesyre og vand (øverste lag) (4:1:5)), = -69,6 (c = 0,72, 1 M eddikesyre).

Aminosyreanalyse: lys 1,15(1), His l,0l(l), Asp 2,94(3), Thr 4,80(5),

Ser 1,06(1), Glu 2,14(2), Pro 1,96(2), Gly 4,00(4),

Ala 2,00(2), Val 0,95(1), Met 0,87(1), Ile 0,96(1),

Deu 0,84(2), Tyr 0,96(1), Phe 3,18(3), a-aminosuberinsyre 1,02(1).