JP2003048849A - 血圧降下剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】安全性が高く、微量の経口投与（摂取）でも有
効な天然物由来の医薬品、特定保健用食品、健康食品等
に使用することができる血圧降下剤を提供する。 【解決手段】ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を有
効成分として含有し有効投与量０．０５〜１０ｍｇ／ｋ
ｇ体重・日の血圧降下剤。
効な天然物由来の医薬品、特定保健用食品、健康食品等
に使用することができる血圧降下剤を提供する。 【解決手段】ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を有
効成分として含有し有効投与量０．０５〜１０ｍｇ／ｋ
ｇ体重・日の血圧降下剤。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血圧降下作用を有し、
医薬品、特定用保健用食品、健康食品等に利用でき、か
つ、微量の投与量でも効果を発揮するジペプチドを有効
成分として含有する血圧降下剤に関する。 【０００２】 【従来の技術】高血圧症の発症と高い相関性を有するア
ンギオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting Enz
yme，以下ＡＣＥという）は、主に肺や血管内皮細胞に
存在し、レニンにより分解されたアンギオテンシンＩに
作用して、血管壁平滑筋収縮作用を有する活性ペプチド
であるアンギオテンシンIIを産生することにより、強い
血圧上昇作用を示すことが知られている。更に、ＡＣＥ
は降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化す
る作用を有する。このようにＡＣＥは血圧を上昇させる
作用を有するので、この酵素活性を阻害することにより
血圧上昇を抑制することが出来ると考えられている。 【０００３】このようなＡＣＥ阻害作用を有する物質は
既に種々の天然物及び合成物において見いだされ、それ
らの物質のいくつかは降圧剤として実用化されている。
例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メ
チル−３−メルカトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有
名である。しかし、このような化学合成物は、常に安全
性の問題を考慮しなければならないという問題点があ
る。 【０００４】一方天然物成分としては、乳蛋白質、大豆
蛋白質あるいは魚肉蛋白質に、様々なＡＣＥ阻害ペプチ
ドが含まれていることが報告されている。これら天然物
由来のＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤と
して実用化が検討されている。しかし、これらの天然物
由来ペプチド群に含まれる血圧降下ペプチドは微量であ
り、現実的な経口での摂食量では大きい効果が期待出来
ないものや、ＡＣＥ阻害活性は強いが血圧降下作用はあ
まり強くないものが多い。 【０００５】近年、乳酸菌発酵乳から強いＡＣＥ阻害活
性を有する２種のトリペプチド、即ちＶａｌ−Ｐｒｏ−
ＰｒｏとＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏとが報告されている
（J. Dairy Sci. ７８：７７７−７８３）。更に、これ
らのトリペプチドの強い血圧降下作用が自然発症高血圧
ラット（ＳＨＲ）にて確認された報告がある（J. Dairy
Sci. ７８：１２５３−１２５７）。しかしながら、乳
酸菌発酵乳中に産生されるトリペプチドは、乳酸発酵の
進行と共に乳酸菌が産生する蛋白質分解酵素により生じ
るために、発酵条件によりトリペプチド量は変動しやす
く、一定の含有量で得ることが困難である。 【０００６】また、乳を原料として乳酸菌発酵により製
造されたヨーグルトが血圧降下作用を有することが報告
されている（特開平７−１２３９７７号公報）。しか
し、その血圧降下作用の原因物質に関しては、明らかで
はない。 【０００７】従って、血圧降下作用の原因物質が明らか
で、工業的に安定した生産が可能であり、且つ微量の投
与量において有効な安全性の高い天然物由来の血圧降下
ペプチドが望まれている。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高く、経口投与（摂取）で有効な天然物由来の医薬
品、特定保健用食品、健康食品等に使用することができ
る血圧降下剤及びその製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記血圧降下剤を精製することに
より、微量の経口投与（摂取）でも有効な天然物由来の
血圧降下剤を提供することにある。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、ジペプ
チドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を有効成分として含有
し、その有効投与量が０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重・
日であることを特徴とする血圧降下剤が提供される。 【００１０】また、本発明によれば、アミノ酸配列Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地
を用いて、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）乳
酸菌を培養し、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液
を得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提
供される。 【００１１】更に、本発明によれば、前記ジペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液
を逆相系樹脂により精製処理することを特徴とする前記
血圧降下剤の製造方法が提供される。 【００１２】更に、本発明よれば、前記ラクトバチルス
属（Lactobacillus sp.）乳酸菌が、ラクトバチルス・
ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）であるこ
とを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提供され
る。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の血圧降下剤は、有効成分
として、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を含有す
る。前記塩としては、薬理学上許容されるジペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏと酸等との塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、
燐酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フ
マル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げること
ができる。 【００１４】前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩
を有効成分として含む本発明の血圧降下剤は、アミノ酸
配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を
含む食品素材を蛋白質分解酵素により処理する方法、公
知の有機化学的合成法等の方法によっても製造すること
ができるが、好ましくはアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを
含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いて、乳
酸菌好ましくはラクトバチルス属（Lactobacillus s
p.）乳酸菌を培養し、前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを
含む培養液を得ることにより得ることができる。即ち、
前記培地を乳酸菌好ましくはラクトバチルス属乳酸菌で
発酵処理することにより前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ
を得ることができる。 【００１５】前記ラクトバチルス属乳酸菌としては、例
えばラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus he
lveticus)、ラクトバチルス・デルブルキィ・サブスピ
ーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii s
ubsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス
（Lactobacillus acidophilus）等を挙げることができ
るが、特にラクトバチルス・ヘルベチカスが好ましい。 【００１６】前記培地としては、アミノ酸配列Ｔｙｒ−
Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む限り特に
限定されないが、例えば、獣乳の全乳、脱脂乳、カゼイ
ン等の獣乳蛋白質、とうもろこし、コーン蛋白質、小
麦、小麦蛋白質、大豆、脱脂大豆、大豆蛋白質等の植物
蛋白質等の各種食品素材等に由来する培地、又はブリッ
グス・リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）、ＭＲＳ
ブロス等の市販の乳酸菌用培地等を挙げることができ
る。更に、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含む獣乳蛋白
質及び／又は植物蛋白質等を含有する天然物由来の食品
原料を水溶液状として、更に、必要に応じてその他の乳
酸菌用培地、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類等を
添加した培地等を用いることもできる。 【００１７】前記乳酸菌の培養は、前記培地を加熱殺菌
し所定の培養温度まで冷却後に、予め前培養しておいた
乳酸菌スターターを添加することにより行なうことがで
きる。前記乳酸菌スターターの接種量は、培地に対して
乳酸菌数で１０5個／ｍｌ〜１０7個／ｍｌとするのが好
ましい。また培養温度は通常２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４５℃、培養時間は通常３〜４８時間、好ましく
は６〜２４時間の範囲で行なうことができる。特に乳酸
菌の培養を効果的に行なうためには、培地のｐＨを好ま
しくは３．５〜７、さらに好ましくは４〜５の範囲で行
うのが望ましい。さらに、ｐＨ４〜７に維持するように
ｐＨスタット培養を行なうのが望ましい。培養の終了点
は、特に限定されないが、例えば乳酸菌数が１０8個／
ｍｌ以上になった時点で反応を終了することができる。 【００１８】前記方法等により得られたジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液を
逆相系樹脂により精製処理することにより、有効成分で
あるジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの含有量を高めた血圧降
下剤を得ることもできる。 【００１９】前記遠心分離は、例えば、好ましくは回転
数５，０００から２０，００回転／分において、１〜１
０分間行なうことができる。また連続遠心分離機を用い
ることにより行なうこともできる。 【００２０】前記逆相系樹脂による精製処理は、逆相系
樹脂等を用いて吸着及び溶出する方法及び／又は逆相ク
ロマトグラフィー等により行なうことができ、これによ
りジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの精製度を高めることがで
きる。前記逆相系樹脂を用いて吸着及び溶出する方法と
しては、具体的には、例えば逆相系樹脂として「Prepar
ative Ｃ１８」（商品名、ウオーターズ社製）等の樹
脂を用いて、カラム法又はバッチ法により処理し、次い
で前記吸着画分を、例えば水、メタノール、エタノー
ル、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトニト
リル等の極性溶媒、特に好ましくは２０容量％アセトニ
トリル−水混合溶液等により溶出した後、アセトニトリ
ル及び水を留去することによりジペプチドＴｙｒ−Ｐｒ
ｏを濃縮する方法が挙げられる。 【００２１】前記逆相クロマトグラフィーによる処理
は、特に限定されないが、公知の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）等により行なうことができる。
前記ＨＰＬＣは、好ましくは前記逆相系樹脂を用いて吸
着及び溶出する方法で例示したものと同様の溶媒を用い
て、直線濃度勾配法により精製度の高いジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを得ることができる。さらに前記逆相クロマ
トグラフィーによる処理を複数回繰り返し、ジペプチド
Ｔｙｒ−Ｐｒｏの精製度をさらに上げることもできる。 【００２２】本発明の製造方法により得られる血圧降下
剤は、通常ペプチド混合物を含むものとして得られ、ジ
ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ以外の他のペプチド成分を含有
してもよい。飲食品等に使用する場合には、前記ジペプ
チドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液及び／又はそれを精製
処理したものをそのまま用いることが出来る。また、凍
結乾燥、噴霧乾燥、ドラムドライヤー乾燥等により粉末
化した形で使用することも出来る。 【００２３】本発明の血圧降下剤の有効投与量は、患者
の年齢、症状により異なるが、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒ
ｏ及びその塩として０．０５〜１０ｍｇ／体重ｋｇ・日
である。好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／体重ｋｇ・日
を投与するのが望ましい。０．０５ｍｇ／体重ｋｇ・日
以下の投与量では十分な効果が期待できず、また１０ｍ
ｇ／体重ｋｇ・日以上の投与量では効果の増強が認めら
れないため不経済である。 【００２４】前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを正常血圧
値を示すＷＫＹラット（１８週齢、体重約３２０ｇ、ｎ
−５）に１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、１ヶ月間連続経口投
与したが、ラットの行動、外観、血圧値、解剖所見に異
常は認められなかった。ラクトバチルス属乳酸菌による
発酵食品は、長年にわたり人類に食用されているもので
あり、本発明の血圧降下剤に含まれるＴｙｒ−Ｐｒｏの
安全性は問題ないと思われる。 【００２５】 【発明の効果】本発明の血圧降下剤は、ジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有するので、これまでに
報告されている食品素材由来の血圧降下ペプチドに比べ
て、極めて低い投与量で血圧を降下させることができ、
安全性も高く、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に
用いることが可能である。また、本発明の製造方法は、
ペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いてラクトバ
チルス属乳酸菌を培養する製造方法であるので、天然物
由来のペプチド、蛋白質等を原料として、安全性の高い
ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有する血
圧降下剤を容易にしかも安価に製造することができる。 【００２６】 【実施例】以下本発明を製造例及び実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。 【００２７】 【製造例１】乳酸菌スターターとしてラクトバチルス・
ヘルベティカスＣＰＮ４（工業技術院寄託番号：ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４８３５）を用いた発酵乳３００ｇを９重量
％の脱脂粉乳水溶液１０ｋｇに接種し、３７℃、８時間
培養した。カード状組織形成し、ｐＨ４．２に達した時
点で発酵を終了した後に冷却した。得られた発酵乳溶液
中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．０ｍｇ／１０
０ｇ含有されていた。 【００２８】得られた発酵乳溶液１０ｋｇを撹拌均質化
後に１０，０００回転／分、１０分間遠心分離を行ない
培養上清（ホエー）８．４ｋｇを回収した。培養上清中
には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．１ｍｇ／１００
ｇ含有されていた。 【００２９】 【実施例１】製造例１で得られたホエー１２０ｍｇをｓ
ｅｐ−ｐａｋカートリッジ（ウオーターズ社製）１０個
を用いて吸着させ、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ
酢酸）含有アセトニトリル（Ｂ液）を０．１重量％ＴＦ
Ａ水溶液（Ａ液）で希釈した溶出液で表１に示す各種の
条件にて溶出し、吸着せずに流出したもの及び各条件で
溶出したものをそれぞれ画分〜とし、それぞれ凍結
乾燥した後４０ｍｌの生理食塩水にて溶解し、試料〜
とした。 【００３０】分画前の前記得られたホエー及び試料〜
を、それぞれ自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ：日本チ
ャールズリバー社、１群５匹、２０−２２週齢雄）に胃
ゾンデにて１ｍｌ／匹投与し、６時間後の最高血圧値の
変化値をコントロール（生理食塩水投与）群と比較し
た。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（商品名「ＰＥ
３００」、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail
cuff法にて求めた。その結果、表１に示す通り試料
について有意な降圧作用が確認され、画分が活性画分
であることが見いだされた。 【００３１】 【表１】 【００３２】次に試料を以下の条件に従った逆相高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により溶出し、表
２に示す溶出時間に従って更に４つの画分に分画し、画
分−１〜−４とした。尚、１回の溶出における試料
の供給量は１ｍｌとし、１５回の溶出を繰り返し、合
計１５ｍｌの試料を分画した。 【００３３】ポンプ：Ｌ６２００インテリジェントポン
プ（日立製作所） 検出器：Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所） カラム：ウオーターズ、マイクロボンダスフェアー、５
μＣ１８（日本ミリポア社製） 溶出液：Ａ液；０．１重量％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液；０．１重量％ＴＦＡ含有アセトニトリル 溶出条件：Ｂ液０％（Ａ液１００％）〜Ｂ液４０％（Ａ
液６０％）まで直線濃度勾配溶出（０〜６０分） 流速：１ｍｌ／分 画分−１〜〜４をそれぞれ凍結乾燥した後１５ｍｌ
の生理食塩水に溶解し、試料−１〜−４とし、前記
条件と同様にＳＨＲへ胃ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与
し、６時間後の最高血圧値の変化値をコントロール群
（生理食塩水投与）と比較して血圧降下作用を調べた。
その結果、表２に示す通り試料−２において強い血圧
降下作用が確認され、画分−２が活性画分であること
が見いだされた。 【００３４】 【表２】【００３５】試料−２の１０ｍｌを以下の溶出条件に
従った他は前記と同様のＨＰＬＣにより、１ｍｌずつ１
０回繰り返し溶出し、表３に示す溶出時間に溶出した５
つの主要ペプチドピークを分取し、それぞれ画分−２
−１〜−２−５とした。 【００３６】溶出条件：Ｂ液５％（Ａ液９５％）〜Ｂ液
２０％（Ａ液８０％）まで直線濃度勾配溶出（０〜６０
分） 流速：１ｍｌ／分 得られた画分−２−１〜−２−５をそれぞれ凍結乾
燥した後生理食塩水１０ｍｌに溶解し試料−２−１〜
−２−５とし、前記条件と同様にそれぞれＳＨＲへ胃
ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与し、６時間後の最高血圧
値の変化値をコントロール群（生理食塩水投与）と比較
して血圧降下作用を調べた。その結果、表３に示す通り
試料−２−２において強い血圧降下作用が確認され
た。 【００３７】 【表３】 【００３８】試料−２−２の１ｍｌを、試料−２を
溶出した際と同様のＨＰＬＣにより再び精製した後、島
津製作所社製「全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＰＳＱ
−１０システム」によりペプチドのＮ末端からのアミノ
酸配列を分析した結果、Ｔｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列
を有することが確認された。また、精製ペプチドを６Ｎ
塩酸にて１０５℃、２４時間加水分解し、高速アミノ酸
分析装置（商品名：アミノ酸分析システム、日本分光工
業株式会社製）にてアミノ酸分析を行った結果、Ｔｙｒ
及びＰｒｏが等モル含まれることが確認された。従っ
て、得られたペプチドはＴｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列
を有するジペプチドであると結論した。 【００３９】 【製造例２】ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰＮ４
（工業技術院寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−４８３５）発酵
乳３ｋｇを９重量％の脱脂粉乳水溶液１００ｋｇに接種
し、３７℃、２０時間培養した。得られた発酵乳溶液を
１０，０００回転／分にてシャープレス型遠心分離機を
用いて処理し、培養上清（ホエー）７８ｋｇを回収し
た。次いで、培養上清をPreparative Ｃ１８充填カラ
ム（容量３リットル、ウオーターズ社製）に通し、５％
アセトニトリルを含む水溶液１０ｋｇにて洗浄後、１０
％アセトニトリルを含む水溶液５ｋｇにて溶出した。溶
出された画分は、凍結乾燥物１１８６ｍｇを得た。この
凍結乾燥物中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが６５２
ｍｇ含まれていた。ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの純度は
５５％であった。 【００４０】 【実施例２】製造例１で得られた発酵乳溶液を用いて血
圧降下作用を確認した。血圧降下作用の測定はＳＨＲを
用いて実施例１の方法に準じて行った。ＳＨＲに発酵乳
溶液及び未発酵乳溶液を４ｍｌ／匹（１２ｍｌ／体重ｋ
ｇ）経口投与し、６時間後の最高血圧値を測定した。そ
の結果血圧降下作用が確認された。結果を表４に示す。 【００４１】 【表４】 【００４２】 【実施例３】実施例１で特定された血圧降下ペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏを、島津製作所製ペプチド自動合成装置
「ＰＰＳＭ ８型」を用いて固相合成した。得られたペ
プチドＴｙｒ−ＰｒｏのＨＰＬＣでの溶出位置は実施例
１において精製されたペプチドと同様であった。 【００４３】この合成ペプチドの血圧降下作用を以下の
方法で確認した。合成ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの０．０
５、０．１、０．３、１．０、３．０、又は１０ｍｇ／
体重ｋｇを、実施例１と同様にＳＨＲに経口投与し、投
与６時間後の最高血圧値を測定し、コントロール群（生
理食塩水投与群）の結果と比較した。結果を表５に示
す。表５より０．０５〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で
用量依存的効果が確認された。 【００４４】 【表５】
医薬品、特定用保健用食品、健康食品等に利用でき、か
つ、微量の投与量でも効果を発揮するジペプチドを有効
成分として含有する血圧降下剤に関する。 【０００２】 【従来の技術】高血圧症の発症と高い相関性を有するア
ンギオテンシン変換酵素（Angiotensin Converting Enz
yme，以下ＡＣＥという）は、主に肺や血管内皮細胞に
存在し、レニンにより分解されたアンギオテンシンＩに
作用して、血管壁平滑筋収縮作用を有する活性ペプチド
であるアンギオテンシンIIを産生することにより、強い
血圧上昇作用を示すことが知られている。更に、ＡＣＥ
は降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化す
る作用を有する。このようにＡＣＥは血圧を上昇させる
作用を有するので、この酵素活性を阻害することにより
血圧上昇を抑制することが出来ると考えられている。 【０００３】このようなＡＣＥ阻害作用を有する物質は
既に種々の天然物及び合成物において見いだされ、それ
らの物質のいくつかは降圧剤として実用化されている。
例えば化学合成物としては、カプトプリル（Ｄ−２−メ
チル−３−メルカトプロパノイル−Ｌ−プロリン）が有
名である。しかし、このような化学合成物は、常に安全
性の問題を考慮しなければならないという問題点があ
る。 【０００４】一方天然物成分としては、乳蛋白質、大豆
蛋白質あるいは魚肉蛋白質に、様々なＡＣＥ阻害ペプチ
ドが含まれていることが報告されている。これら天然物
由来のＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤と
して実用化が検討されている。しかし、これらの天然物
由来ペプチド群に含まれる血圧降下ペプチドは微量であ
り、現実的な経口での摂食量では大きい効果が期待出来
ないものや、ＡＣＥ阻害活性は強いが血圧降下作用はあ
まり強くないものが多い。 【０００５】近年、乳酸菌発酵乳から強いＡＣＥ阻害活
性を有する２種のトリペプチド、即ちＶａｌ−Ｐｒｏ−
ＰｒｏとＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏとが報告されている
（J. Dairy Sci. ７８：７７７−７８３）。更に、これ
らのトリペプチドの強い血圧降下作用が自然発症高血圧
ラット（ＳＨＲ）にて確認された報告がある（J. Dairy
Sci. ７８：１２５３−１２５７）。しかしながら、乳
酸菌発酵乳中に産生されるトリペプチドは、乳酸発酵の
進行と共に乳酸菌が産生する蛋白質分解酵素により生じ
るために、発酵条件によりトリペプチド量は変動しやす
く、一定の含有量で得ることが困難である。 【０００６】また、乳を原料として乳酸菌発酵により製
造されたヨーグルトが血圧降下作用を有することが報告
されている（特開平７−１２３９７７号公報）。しか
し、その血圧降下作用の原因物質に関しては、明らかで
はない。 【０００７】従って、血圧降下作用の原因物質が明らか
で、工業的に安定した生産が可能であり、且つ微量の投
与量において有効な安全性の高い天然物由来の血圧降下
ペプチドが望まれている。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安全
性が高く、経口投与（摂取）で有効な天然物由来の医薬
品、特定保健用食品、健康食品等に使用することができ
る血圧降下剤及びその製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記血圧降下剤を精製することに
より、微量の経口投与（摂取）でも有効な天然物由来の
血圧降下剤を提供することにある。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明によれば、ジペプ
チドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を有効成分として含有
し、その有効投与量が０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重・
日であることを特徴とする血圧降下剤が提供される。 【００１０】また、本発明によれば、アミノ酸配列Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地
を用いて、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）乳
酸菌を培養し、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液
を得ることを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提
供される。 【００１１】更に、本発明によれば、前記ジペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液
を逆相系樹脂により精製処理することを特徴とする前記
血圧降下剤の製造方法が提供される。 【００１２】更に、本発明よれば、前記ラクトバチルス
属（Lactobacillus sp.）乳酸菌が、ラクトバチルス・
ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）であるこ
とを特徴とする前記血圧降下剤の製造方法が提供され
る。 【００１３】 【発明の実施の形態】本発明の血圧降下剤は、有効成分
として、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を含有す
る。前記塩としては、薬理学上許容されるジペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏと酸等との塩類、例えば塩酸塩、硫酸塩、
燐酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フ
マル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げること
ができる。 【００１４】前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩
を有効成分として含む本発明の血圧降下剤は、アミノ酸
配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を
含む食品素材を蛋白質分解酵素により処理する方法、公
知の有機化学的合成法等の方法によっても製造すること
ができるが、好ましくはアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを
含むペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いて、乳
酸菌好ましくはラクトバチルス属（Lactobacillus s
p.）乳酸菌を培養し、前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを
含む培養液を得ることにより得ることができる。即ち、
前記培地を乳酸菌好ましくはラクトバチルス属乳酸菌で
発酵処理することにより前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ
を得ることができる。 【００１５】前記ラクトバチルス属乳酸菌としては、例
えばラクトバチルス・ヘルベチカス（Lactobacillus he
lveticus)、ラクトバチルス・デルブルキィ・サブスピ
ーシーズ・ブルガリカス（Lactobacillus delbruekii s
ubsp. bulgaricus）、ラクトバチルス・アシドフィラス
（Lactobacillus acidophilus）等を挙げることができ
るが、特にラクトバチルス・ヘルベチカスが好ましい。 【００１６】前記培地としては、アミノ酸配列Ｔｙｒ−
Ｐｒｏを含むペプチド及び／又は蛋白質を含む限り特に
限定されないが、例えば、獣乳の全乳、脱脂乳、カゼイ
ン等の獣乳蛋白質、とうもろこし、コーン蛋白質、小
麦、小麦蛋白質、大豆、脱脂大豆、大豆蛋白質等の植物
蛋白質等の各種食品素材等に由来する培地、又はブリッ
グス・リバー・ブロス（Briggs Liver Broth）、ＭＲＳ
ブロス等の市販の乳酸菌用培地等を挙げることができ
る。更に、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏを含む獣乳蛋白
質及び／又は植物蛋白質等を含有する天然物由来の食品
原料を水溶液状として、更に、必要に応じてその他の乳
酸菌用培地、酵母エキス、ビタミン類、ミネラル類等を
添加した培地等を用いることもできる。 【００１７】前記乳酸菌の培養は、前記培地を加熱殺菌
し所定の培養温度まで冷却後に、予め前培養しておいた
乳酸菌スターターを添加することにより行なうことがで
きる。前記乳酸菌スターターの接種量は、培地に対して
乳酸菌数で１０5個／ｍｌ〜１０7個／ｍｌとするのが好
ましい。また培養温度は通常２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４５℃、培養時間は通常３〜４８時間、好ましく
は６〜２４時間の範囲で行なうことができる。特に乳酸
菌の培養を効果的に行なうためには、培地のｐＨを好ま
しくは３．５〜７、さらに好ましくは４〜５の範囲で行
うのが望ましい。さらに、ｐＨ４〜７に維持するように
ｐＨスタット培養を行なうのが望ましい。培養の終了点
は、特に限定されないが、例えば乳酸菌数が１０8個／
ｍｌ以上になった時点で反応を終了することができる。 【００１８】前記方法等により得られたジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを含む培養液をさらに遠心分離し、上清液を
逆相系樹脂により精製処理することにより、有効成分で
あるジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの含有量を高めた血圧降
下剤を得ることもできる。 【００１９】前記遠心分離は、例えば、好ましくは回転
数５，０００から２０，００回転／分において、１〜１
０分間行なうことができる。また連続遠心分離機を用い
ることにより行なうこともできる。 【００２０】前記逆相系樹脂による精製処理は、逆相系
樹脂等を用いて吸着及び溶出する方法及び／又は逆相ク
ロマトグラフィー等により行なうことができ、これによ
りジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの精製度を高めることがで
きる。前記逆相系樹脂を用いて吸着及び溶出する方法と
しては、具体的には、例えば逆相系樹脂として「Prepar
ative Ｃ１８」（商品名、ウオーターズ社製）等の樹
脂を用いて、カラム法又はバッチ法により処理し、次い
で前記吸着画分を、例えば水、メタノール、エタノー
ル、１−プロパノール、２−プロパノール、アセトニト
リル等の極性溶媒、特に好ましくは２０容量％アセトニ
トリル−水混合溶液等により溶出した後、アセトニトリ
ル及び水を留去することによりジペプチドＴｙｒ−Ｐｒ
ｏを濃縮する方法が挙げられる。 【００２１】前記逆相クロマトグラフィーによる処理
は、特に限定されないが、公知の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）等により行なうことができる。
前記ＨＰＬＣは、好ましくは前記逆相系樹脂を用いて吸
着及び溶出する方法で例示したものと同様の溶媒を用い
て、直線濃度勾配法により精製度の高いジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを得ることができる。さらに前記逆相クロマ
トグラフィーによる処理を複数回繰り返し、ジペプチド
Ｔｙｒ−Ｐｒｏの精製度をさらに上げることもできる。 【００２２】本発明の製造方法により得られる血圧降下
剤は、通常ペプチド混合物を含むものとして得られ、ジ
ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ以外の他のペプチド成分を含有
してもよい。飲食品等に使用する場合には、前記ジペプ
チドＴｙｒ−Ｐｒｏを含む培養液及び／又はそれを精製
処理したものをそのまま用いることが出来る。また、凍
結乾燥、噴霧乾燥、ドラムドライヤー乾燥等により粉末
化した形で使用することも出来る。 【００２３】本発明の血圧降下剤の有効投与量は、患者
の年齢、症状により異なるが、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒ
ｏ及びその塩として０．０５〜１０ｍｇ／体重ｋｇ・日
である。好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／体重ｋｇ・日
を投与するのが望ましい。０．０５ｍｇ／体重ｋｇ・日
以下の投与量では十分な効果が期待できず、また１０ｍ
ｇ／体重ｋｇ・日以上の投与量では効果の増強が認めら
れないため不経済である。 【００２４】前記ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを正常血圧
値を示すＷＫＹラット（１８週齢、体重約３２０ｇ、ｎ
−５）に１０ｍｇ／体重ｋｇ・日、１ヶ月間連続経口投
与したが、ラットの行動、外観、血圧値、解剖所見に異
常は認められなかった。ラクトバチルス属乳酸菌による
発酵食品は、長年にわたり人類に食用されているもので
あり、本発明の血圧降下剤に含まれるＴｙｒ−Ｐｒｏの
安全性は問題ないと思われる。 【００２５】 【発明の効果】本発明の血圧降下剤は、ジペプチドＴｙ
ｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有するので、これまでに
報告されている食品素材由来の血圧降下ペプチドに比べ
て、極めて低い投与量で血圧を降下させることができ、
安全性も高く、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に
用いることが可能である。また、本発明の製造方法は、
ペプチド及び／又は蛋白質を含む培地を用いてラクトバ
チルス属乳酸菌を培養する製造方法であるので、天然物
由来のペプチド、蛋白質等を原料として、安全性の高い
ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏを有効成分として含有する血
圧降下剤を容易にしかも安価に製造することができる。 【００２６】 【実施例】以下本発明を製造例及び実施例により更に詳
細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。 【００２７】 【製造例１】乳酸菌スターターとしてラクトバチルス・
ヘルベティカスＣＰＮ４（工業技術院寄託番号：ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４８３５）を用いた発酵乳３００ｇを９重量
％の脱脂粉乳水溶液１０ｋｇに接種し、３７℃、８時間
培養した。カード状組織形成し、ｐＨ４．２に達した時
点で発酵を終了した後に冷却した。得られた発酵乳溶液
中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．０ｍｇ／１０
０ｇ含有されていた。 【００２８】得られた発酵乳溶液１０ｋｇを撹拌均質化
後に１０，０００回転／分、１０分間遠心分離を行ない
培養上清（ホエー）８．４ｋｇを回収した。培養上清中
には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが１．１ｍｇ／１００
ｇ含有されていた。 【００２９】 【実施例１】製造例１で得られたホエー１２０ｍｇをｓ
ｅｐ−ｐａｋカートリッジ（ウオーターズ社製）１０個
を用いて吸着させ、０．１重量％ＴＦＡ（トリフルオロ
酢酸）含有アセトニトリル（Ｂ液）を０．１重量％ＴＦ
Ａ水溶液（Ａ液）で希釈した溶出液で表１に示す各種の
条件にて溶出し、吸着せずに流出したもの及び各条件で
溶出したものをそれぞれ画分〜とし、それぞれ凍結
乾燥した後４０ｍｌの生理食塩水にて溶解し、試料〜
とした。 【００３０】分画前の前記得られたホエー及び試料〜
を、それぞれ自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ：日本チ
ャールズリバー社、１群５匹、２０−２２週齢雄）に胃
ゾンデにて１ｍｌ／匹投与し、６時間後の最高血圧値の
変化値をコントロール（生理食塩水投与）群と比較し
た。血圧測定は、非観血式血圧測定装置（商品名「ＰＥ
３００」、ナルコバイオシステムズ社製）を用い、tail
cuff法にて求めた。その結果、表１に示す通り試料
について有意な降圧作用が確認され、画分が活性画分
であることが見いだされた。 【００３１】 【表１】 【００３２】次に試料を以下の条件に従った逆相高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により溶出し、表
２に示す溶出時間に従って更に４つの画分に分画し、画
分−１〜−４とした。尚、１回の溶出における試料
の供給量は１ｍｌとし、１５回の溶出を繰り返し、合
計１５ｍｌの試料を分画した。 【００３３】ポンプ：Ｌ６２００インテリジェントポン
プ（日立製作所） 検出器：Ｌ４０００ＵＶ検出器（日立製作所） カラム：ウオーターズ、マイクロボンダスフェアー、５
μＣ１８（日本ミリポア社製） 溶出液：Ａ液；０．１重量％ＴＦＡ水溶液 Ｂ液；０．１重量％ＴＦＡ含有アセトニトリル 溶出条件：Ｂ液０％（Ａ液１００％）〜Ｂ液４０％（Ａ
液６０％）まで直線濃度勾配溶出（０〜６０分） 流速：１ｍｌ／分 画分−１〜〜４をそれぞれ凍結乾燥した後１５ｍｌ
の生理食塩水に溶解し、試料−１〜−４とし、前記
条件と同様にＳＨＲへ胃ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与
し、６時間後の最高血圧値の変化値をコントロール群
（生理食塩水投与）と比較して血圧降下作用を調べた。
その結果、表２に示す通り試料−２において強い血圧
降下作用が確認され、画分−２が活性画分であること
が見いだされた。 【００３４】 【表２】【００３５】試料−２の１０ｍｌを以下の溶出条件に
従った他は前記と同様のＨＰＬＣにより、１ｍｌずつ１
０回繰り返し溶出し、表３に示す溶出時間に溶出した５
つの主要ペプチドピークを分取し、それぞれ画分−２
−１〜−２−５とした。 【００３６】溶出条件：Ｂ液５％（Ａ液９５％）〜Ｂ液
２０％（Ａ液８０％）まで直線濃度勾配溶出（０〜６０
分） 流速：１ｍｌ／分 得られた画分−２−１〜−２−５をそれぞれ凍結乾
燥した後生理食塩水１０ｍｌに溶解し試料−２−１〜
−２−５とし、前記条件と同様にそれぞれＳＨＲへ胃
ゾンデにて１ｍｌ／匹経口投与し、６時間後の最高血圧
値の変化値をコントロール群（生理食塩水投与）と比較
して血圧降下作用を調べた。その結果、表３に示す通り
試料−２−２において強い血圧降下作用が確認され
た。 【００３７】 【表３】 【００３８】試料−２−２の１ｍｌを、試料−２を
溶出した際と同様のＨＰＬＣにより再び精製した後、島
津製作所社製「全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＰＳＱ
−１０システム」によりペプチドのＮ末端からのアミノ
酸配列を分析した結果、Ｔｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列
を有することが確認された。また、精製ペプチドを６Ｎ
塩酸にて１０５℃、２４時間加水分解し、高速アミノ酸
分析装置（商品名：アミノ酸分析システム、日本分光工
業株式会社製）にてアミノ酸分析を行った結果、Ｔｙｒ
及びＰｒｏが等モル含まれることが確認された。従っ
て、得られたペプチドはＴｙｒ−Ｐｒｏのアミノ酸配列
を有するジペプチドであると結論した。 【００３９】 【製造例２】ラクトバチルス・ヘルベティカスＣＰＮ４
（工業技術院寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−４８３５）発酵
乳３ｋｇを９重量％の脱脂粉乳水溶液１００ｋｇに接種
し、３７℃、２０時間培養した。得られた発酵乳溶液を
１０，０００回転／分にてシャープレス型遠心分離機を
用いて処理し、培養上清（ホエー）７８ｋｇを回収し
た。次いで、培養上清をPreparative Ｃ１８充填カラ
ム（容量３リットル、ウオーターズ社製）に通し、５％
アセトニトリルを含む水溶液１０ｋｇにて洗浄後、１０
％アセトニトリルを含む水溶液５ｋｇにて溶出した。溶
出された画分は、凍結乾燥物１１８６ｍｇを得た。この
凍結乾燥物中には、ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏが６５２
ｍｇ含まれていた。ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの純度は
５５％であった。 【００４０】 【実施例２】製造例１で得られた発酵乳溶液を用いて血
圧降下作用を確認した。血圧降下作用の測定はＳＨＲを
用いて実施例１の方法に準じて行った。ＳＨＲに発酵乳
溶液及び未発酵乳溶液を４ｍｌ／匹（１２ｍｌ／体重ｋ
ｇ）経口投与し、６時間後の最高血圧値を測定した。そ
の結果血圧降下作用が確認された。結果を表４に示す。 【００４１】 【表４】 【００４２】 【実施例３】実施例１で特定された血圧降下ペプチドＴ
ｙｒ−Ｐｒｏを、島津製作所製ペプチド自動合成装置
「ＰＰＳＭ ８型」を用いて固相合成した。得られたペ
プチドＴｙｒ−ＰｒｏのＨＰＬＣでの溶出位置は実施例
１において精製されたペプチドと同様であった。 【００４３】この合成ペプチドの血圧降下作用を以下の
方法で確認した。合成ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏの０．０
５、０．１、０．３、１．０、３．０、又は１０ｍｇ／
体重ｋｇを、実施例１と同様にＳＨＲに経口投与し、投
与６時間後の最高血圧値を測定し、コントロール群（生
理食塩水投与群）の結果と比較した。結果を表５に示
す。表５より０．０５〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で
用量依存的効果が確認された。 【００４４】 【表５】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ジペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ及びその塩を
有効成分として含有し、その有効投与量が０．０５〜１
０ｍｇ／ｋｇ体重・日であることを特徴とする血圧降下
剤。
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