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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
blutdrucksenkenden Mittels, das als wirksamen Bestandteil ein Dipeptid
enthält,
das eine blutdrucksenkende Wirkung besitzt, wobei das Mittel als
Medikament, als Lebensmittel für
eine bestimmte gesundheitliche Verwendung und als gesundes Lebensmittel
verwendet werden kann, und wobei das Mittel die Wirkung selbst in
einer geringen Dosis zeigt.
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Das
Angiotensin konvertierendes Enzym (ACE), das mit der Manifestation
von Bluthochdruck eng in Verbindung steht, kommt hauptsächlich in
Lungen oder Angioendothelialzellen vor. Man weiss, dass ACE eine starke
hypertensive Wirkung durch Spalten von Angiotensin I aufweist, das
durch Renin hergestellt wird, um Angiotensin II zu bilden, das ein
bioaktives Peptid ist, das die Kontraktion eines glatten Muskels
eines Blutgefäßes zur
Folge hat. Weiterhin baut ACE Bradykinin, das eine blutdrucksenkende
Wirkung hat, ab und inaktiviert es. Dementsprechend besitzt ACE
eine hypertensive Wirkung, und es wird daher angenommen, dass der Blutdruck
durch Hemmen der Aktivität
dieses Enzyms unterdrückt
werden kann.
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Es
wurden unter verschiedenen natürlichen
Produkten oder synthetischen Produkten Substanzen gefunden, die
ACE hemmen können.
Einige dieser Substanzen werden bereits als blutdrucksenkende Mittel
in der Praxis verwendet. Zum Beispiel ist Captopril (D-2-Methyl-3-mercaptopropanoyl-L-prolin)
ein gut bekanntes synthetisches chemisches Produkt, das eine ACE
hemmende Fähigkeit
besitzt. Jedoch muss immer besonders auf die Sicherheitsaspekte
dieser synthetischen chemischen Produkte geachtet werden.
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Es
wurde berichtet, dass verschiedene anti-ACE-Peptide als natürliche Produkte
in Milchprotein, Sojaprotein oder Fischprotein enthalten sind. Diese
natürlichen
ACE hemmenden Substanzen werden für die praktische Verwendung
als blutdrucksenkende Mittel mit geringer Toxizität und hoher
Sicherheit vorgeschlagen. Jedoch sind die meisten dieser blutdrucksenkenden
Peptide nur in geringer Menge in solchen natürlichen Produkten enthalten,
und man kann somit keine ausreichende Wirkung bei der oralen Einnahme
in der Praxis erwarten. Weiterhin besitzen die meisten der Peptide
keine starke blutdrucksenkende Wirkung, selbst wenn die Peptide
eine starke ACE hemmende Wirkung besitzen.
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Kürzlich wurde über zwei
Tripeptide berichtet, die eine starke ACE hemmende Aktivität besitzen, Val-Pro-Pro
und Ile-Pro-Pro, die von mit Milchsäurebakterien fermentierter
Milch stammen (J. Dairy Sci. 78: 777–783). Weiterhin wurde die
blutdrucksenkende Wirkung dieser Tripeptide in spontan hypertensiven
Ratten (SHR) bestätigt
(J. Dairy Sci. 78: 1253–1257).
Jedoch variiert die resultierende Menge an Tripeptiden meist abhängig von
den Bedingungen der Fermentation, da die Tripeptide durch Proteinase
hergestellt werden, die durch Milchsäurebakterien produziert wird,
während
die Milchsäurefermentation
in Milch fortschreitet. Es ist somit schwierig, die Tripeptide in
einer stabilen Menge zu erhalten.
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Es
wurde ebenfalls berichtet, dass Joghurt, der durch die Fermentation
von Milch als Rohmaterial mit Milchsäurebakterien hergestellt wird,
eine blutdrucksenkende Wirkung besitzt (
Japanische veröffentlichte Patentanmeldung
Nr. 95-123977 ). Jedoch ist der Wirkstoff für die blutdrucksenkende
Wirkung noch immer nicht bekannt.
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Yamamoto
(1997) Biopolymers 43(2), 129–34
berichtet über
verschiedene Peptide, die Angiotensin I konvertierendes Enzym hemmen
und die von Lebensmitteln und der enzymatischen Hydrolyse von Proteinen stammen.
Insbesondere werden Peptide, die von Milchcasein durch die Wirkung
des proteolytischen Systems von Milchsäurebakterien stammen, in Betracht
gezogen. Diese Peptide sollen eine blutdrucksenkende Wirkung in
spontan hypertensiven Ratten aufweisen.
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Yamamoto
et al. (1994) J. Dairy Sci. 77(4), 917–22 offenbart Milch, die mit
Lactobacillus helveticus fermentiert wurde und die eine blutdrucksenkende
Wirkung in spontan hypertensiven Ratten zeigen soll. Im Gegensatz
dazu soll Milch, die mit einer Variante von L. helveticus fermentiert
wurde, der die Proteinaseaktivität fehlt,
diese Aktivität
nicht besitzen. Die Autoren schließen daraus, dass Peptide, die
von Casein durch Proteinase im Kulturmedium befreit wurden, die
blutdrucksenkende Wirkung in spontan hypertensiven Ratten besitzen.
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EP0737690A offenbart
ein blutdrucksenkendes Mittel, das eine wirksame Menge eines Peptids
mit einer Aminosäuresequenz
Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln und/oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu
enthält.
Es wird ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung dieses blutdrucksenkenden
Mittels durch Fermentierung einer tierischen Milch als Startmaterial
mit einem Mikroorganismus, zum Beispiel einem Milchsäurebakterium
der Gattung Lactobacillus offenbart.
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Yamamoto
et al. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58(4), 776–78 offenbart
eine Milch, die mit einer Lactobacillus-Art fermentiert wurde, die
eine blutdrucksenkende Aktivität
in spontan hypertensiven Ratten zeigen soll. Im Gegensatz soll Milch,
die mit anderen Lactobacillus-Arten fermentiert wurde, diese Aktivität nicht
besitzen.
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DE3047596 offenbart pharmakologische
Eigenschaften des Dipeptids Tyr-Pro, insbesondere im zentralen Nervensystem
von Ratten.
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Daher
ist es wünschenswert,
ein natürliches
blutdrucksenkendes Peptid bereitzustellen, das als aktive Substanz
spezifiziert ist, in einer gewerblich stabilen Art und Weise hergestellt
werden kann, in einer niedrigen Dosis wirksam ist und eine große Sicherheit
besitzt.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung
eines blutdrucksenkenden Mittels bereitzustellen, das für Medikamente,
Lebensmittel für
bestimmte gesundheitliche Verwendung und gesunde Lebensmittel verwendet
werden soll und das äußerst sicher
und in oraler Dosierung wirksam ist.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die
Herstellung eines blutdrucksenkenden Mittels, das selbst in einer
niedrigen oralen Dosierung wirksam ist, durch Reinigen des vorstehend genannten
blutdrucksenkenden Mittels bereitzustellen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines antihypertensiven
Mittels bereitgestellt, wobei das antihypertensive Mittel eine wirksame
Menge von Peptiden umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus einem Dipeptid Tyr-Pro, einem pharmazeutisch verträglichen
Salz des Dipeptids Tyr-Pro, und Gemischen davon, wobei das Verfahren
die Schritte umfasst:
Züchten
von Milchsäurebakterien
der Gattung Lactobacillus in einem Medium, welches ein Peptid und/oder
ein Protein enthält,
das/die Aminosäuresequenz
Tyr-Pro einschließt/einschließen, um
eine Kulturflüssigkeit
zu erhalten, welche das Dipeptid Tyr-Pro enthält;
Zentrifugieren der
Kulturflüssigkeit,
welche das Dipeptid Tyr-Pro enthält,
um einen Überstand
zu erhalten; und
Reinigen des Überstands mit einem Umkehrphasenharz
durch Absorption und Elution des Dipeptids Tyr-Pro, wodurch die
Konzentration des Dipeptids erhöht
wird.
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Das
antihypertensive Mittel der vorliegenden Erfindung enthält eine
wirksame Menge des Dipeptids Tyr-Pro und/oder eines Salzes davon.
Das Salz kann durch ein pharmazeutisch verträgliches Salz, einschließlich eines
Salzes einer anorganischen Säure
wie Hydrochlorat, Sulfat oder Phosphat, und eines Salzes einer organischen
Säure wie
Citrat, Maleat, Fumarat, Tartrat oder Laktat aufgezählt werden.
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Das
antihypertensive Mittel der vorliegenden Erfindung, das das Dipeptid
Tyr-Pro und/oder
das Salz davon als wirksamen Bestandteil enthält, wird durch Züchten von
Milchsäurebakterien
der Gattung Lactobacillus in einem Medium hergestellt, welches ein
Peptid und/oder ein Protein enthält,
das die Aminosäuresequenz Tyr-Pro
einschließt/einschließen, um
eine Kulturflüssigkeit
zu erhalten, die das Dipeptid Tyr-Pro enthält. Dies bedeutet, dass das
Dipeptid Tyr-Pro durch Kultivierungsbehandlung des Mediums mit Milchsäurebakterien
der Gattung Lactobacillus erhalten wird.
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Das
Milchsäurebakterium
der Gattung Lactobacillus kann zum Beispiel Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus delbruekii subsp. Bulgaricus und Lactobacillus acidophilus
einschließen.
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Von
diesen ist Lactobacillus helveticus besonders bevorzugt.
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Das
Medium ist nicht besonders eingeschränkt unter der Voraussetzung,
dass das Medium ein Peptid und/oder ein Protein enthält, das
die Aminosäuresequenz
Tyr-Pro einschließt, und
kann Medien einschließen, die
von verschiedenen Lebensmittelmaterialien stammen, enthaltend tierische
Milchproteine wie tierische Vollmilch, tierische Magermilch, und
Casein einer tierischen Milch, und Lebensmittelmaterialien, enthaltend
pflanzliche Proteine wie Getreide, Getreideprotein, Weizen, Weizenprotein,
Sojabohne, entfettete Sojabohne und Sojabohnenprotein; und im Handel
erhältliche
Medien für
Milchsäurebakterien
wie Briggs-Leberbrühe
und MRS-Brühe
enthalten. Weiterhin kann das Medium ebenfalls eine wässrige Lösung sein,
enthaltend natürliche Lebensmittelmaterialien,
enthaltend tierische Milchproteine und/oder pflanzliche Proteine
einschließlich
der Aminosäuresequenz
Tyr-Pro, dem andere Medien für
Milchsäurebakterien,
ein Hefeextrakt, Vitamine oder Mineralien gegebenenfalls zugegeben
wurden.
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Die
Züchtung
der Milchsäurebakterien
kann durch Zugabe von vorgezüchtetem
Milchsäurebakterienstartmaterial
zu dem Medium durchgeführt
werden, das vorher mit Hitze sterilisiert und auf die vorbestimmte Temperatur
zur Inkubation abgekühlt
wurde. Die Inokulationsmenge des Milchsäurebakterienstartmaterials kann
bevorzugt 105 bis 107 Zellen
von Milchsäurebakterien/ml
Medium sein. Die Temperatur für
die Inkubation liegt für
gewöhnlich
bei 20 bis 50°C
und bevorzugt bei 30 bis 45°C.
Die Inkubationszeit liegt für
gewöhnlich
bei 3 bis 48 Stunden und bevorzugt bei 6 bis 24 Stunden. Insbesondere
ist es bevorzugt, dass die Züchtung
in dem Medium bei einem pH-Wert in einem Bereich von 3,5 bis 7,
stärker
bevorzugt 4 bis 5 erfolgt, um die Züchtung der Milchsäurebakterien
wirksam durchzuführen.
Weiterhin ist es bevorzugt, eine pH-Stat-Züchtung unter Beibehaltung des
pH-Werts in einem Bereich zwischen 4 und 7 durchzuführen. Die
Inkubation kann ohne Einschränkung
beendet werden, wenn die Zahl der Milchsäurebakterien 108 Zellen/ml übersteigt.
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Weiterhin
kann die gezüchtete
Flüssigkeit,
die das Dipeptid Tyr-Pro enthält,
das durch das vorstehende Verfahren erhalten wurde, zentrifugiert
werden, und der resultierende Überstand
kann einer Reinigungsbehandlung mit einem Umkehrphasenharz unterzogen
werden, um ein blutdrucksenkendes Mittel zu erhalten, bei dem der
Gehalt an dem aktiven Bestandteil, dem Dipeptid Tyr-Pro, erhöht wird.
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Die
Zentrifugierung kann bevorzugt zum Beispiel bei 5.000 bis 20.000
UpM für
1 bis 10 min durchgeführt
werden. Die Zentrifugation kann ebenfalls in einem Zentrifugiergerät erfolgen.
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Die
Reinigungsbehandlung mit einem Umkehrphasenharz kann durch Absorption
und Elution des Dipeptids mit einem Umkehrphasenharz und/oder Umkehrphasen-Chromatographie
erfolgen, wodurch die Reinheit des Dipeptids Tyr-Pro erhöht wird. Die Absorption und
Elution mit dem Umkehrphasenharz kann zum Beispiel durch Behandlung
der gezüchteten
Flüssigkeit
durch ein Säulenverfahren
oder ein Batchverfahren mit einem Harz wie „Preparative C18" (hergestellt von
WATERS INC.) als Umkehrphasenharz und anschließend durch Eluieren der absorbierten
Fraktion mit einem polaren Lösungsmittel
wie Wasser, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol oder Acetonitril,
bevorzugt einer wässrigen
Lösung,
die 20 Volumenprozent Acetonitril enthält, gefolgt von der Verdampfung
des Lösungsmittels
zum Anreichern des Dipeptids Tyr-Pro, durchgeführt werden.
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Die
Behandlung durch Umkehrphasenchromatographie kann ohne Einschränkung durch öffentlich
bekannte Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) erfolgen. Die HPLC kann durch ein Verfahren mit einem linearen
Gradienten unter Verwendung ähnlicher
Lösungsmittel
wie diejenigen, die in der Absorption und Elution mit dem Umkehrphasenharz
aufgezählt
sind, durchgeführt
werden, um das Dipeptid Tyr-Pro mit hoher Reinheit zu erhalten.
Die Behandlung durch Umkehrphasenchromatographie kann mehrere Male
zur weiteren Erhöhung
der Reinheit des Dipeptids Tyr-Pro wiederholt werden.
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Das
blutdrucksenkende Mittel, das durch das Verfahren der vorliegenden
Erfindung erhalten wird, ist für
gewöhnlich
ein Gemisch aus Peptiden und kann andere Peptide außer dem
Dipeptid Tyr-Pro enthalten. Für die
Verwendung als Lebensmittel und Getränke können die gereinigten Produkte
der gezüchteten
Flüssigkeit, die
das Dipeptid Tyr-Pro enthalten, direkt verwendet werden.
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Alternativ
kann das Mittel durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung oder Trocknung mit
einem Trommeltrockner vor der Verwendung als Pulver formuliert werden.
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Die
wirksame Menge des blutdrucksenkenden Mittels der vorliegenden Erfindung
variiert abhängig von
dem Alter und dem Zustand eines Patienten und liegt im Bereich von
0,05 bis 10 mg/kg Körpergewicht/Tag. Es
ist bevorzugt, dass 0,3 bis 3,0 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht
werden. Ist die Dosis nicht niedriger als 0,05 mg/kg Körpergewicht/Tag,
kann man eine ausreichende Wirkung erwarten. Wenn die Dosis nicht
mehr als 10 mg/kg Körpergewicht/Tag
beträgt,
kann die Wirkung wirksam gezeigt werden.
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Das
Dipeptid Tyr-Pro wurde WKY-Ratten mit normalen Blutdruck (18 Wochen
alt, Körpergewicht
320 g, n = 5) in einer Menge von 10 mg/kg Körpergewicht/Tag oral einem
Monat lang kontinuierlich verabreicht, und es wurde keine Abnormalität hinsichtlich
des Verhaltens, des Aussehens, des Blutdrucks und der Autopsie der Ratten
festgestellt. Lebensmittel, die mit Lactobacillus-Bakterien fermentiert
wurden, wurden von Menschen über
einen langen Zeitraum gegessen, und es wird daher angenommen, dass
das Tyr-Pro, das in dem blutdrucksenkenden Mittel der vorliegenden
Erfindung enthalten ist, kein Sicherheitsproblem darstellt.
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Da
das blutdrucksenkende Mittel der vorliegenden Erfindung das Dipeptid
Tyr-Pro als aktiven
Bestandteil enthält,
kann es den Blutdruck in einer deutlich geringen Dosis senken, verglichen
mit blutdrucksenkenden Peptiden, die von Lebensmittelmaterialien
stammen, über
die bisher berichtet wurde. Weiterhin besitzt das blutdrucksenkende
Mittel der vorliegenden Erfindung eine hohe Sicherheit und kann
somit als Medizin, Lebensmittel für bestimmte gesundheitliche
Verwendung und gesunde Lebensmittel verwendet werden.
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Da
das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Züchtung von Milchsäurebakterien
in einem Medium einschließt,
das ein Peptid und/oder ein Protein enthält, kann das blutdrucksenkende
Mittel, das das Dipeptid Tyr-Pro als aktiven Bestandteil enthält und eine
hohe Sicherheit besitzt, einfach mit geringen Kosten aus einem Material
wie natürliche
Peptide oder Proteine hergestellt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele näher erklärt, die
nur zur Veranschaulichung dienen, die Erfindung jedoch nicht einschränken sollen.
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Herstellungsbeispiel 1
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10
kg einer wässrigen
Lösung
mit 9 Gewichtsprozent aus Magermilchpulver wurden mit 300 g fermentierter
Milch, die mit Lactobacillus helveticus CPN4 (FERM BP-4835) als
Milchsäurebakteriumstartmaterial
fermentiert wurden, beimpft. Die beimpfte Lösung wurde bei 37°C 8 Stunden
lang inkubiert. Als sich geronnene Milch bildete und der pH-Wert
4,2 erreichte, wurde die Inkubation beendet und die Lösung abgekühlt. In
der erhaltenen Lösung
aus fermentierter Milch waren 1,0 mg/100 g des Dipeptids Tyr-Pro
enthalten.
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10
kg der erhaltenen Lösung
aus fermentierter Milch wurden bei 10.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert,
um 8,4 kg Molke zu erhalten. In der Molke waren 1,1 mg/100 g des
Dipeptids Tyr-Pro enthalten.
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Der
L. helveticus-Stamm CNP4 gehört
zu L. helveticus und wurde beim National Institute of Bioscience und
der Human Technology Agency of Industrial Science and Technology
am 17. Oktober 1994 hinterlegt. Ihm wurde die Zugangsnummer FERM
BP-4835 zugeteilt. FERM BP-4835 wurde zur Hinterlegung unter dem
Budapester Vertag für
die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
zum Zwecke des Patentverfahrens aufgenommen. Jegliche Beschränkungen
hinsichtlich des Zugangs von FERM BP-4835 für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich
mit der Erteilung eines Patents aufgehoben.
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Beispiel 1
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120
mg der Molke, die im Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, wurden
einer Absorptionsbehandlung durch 10 sep-pak-Kartuschen (WATERS
INC.) unterzogen und anschließend
einer Elutionsbehandlung unter verschiedenen in Tabelle 1 gezeigten
Bedingungen mit Acetonitril unterzogen, das 0,1 Gewichtsprozent
TFA (Trifluoressigsäure)
(Lösung
B) enthält,
die mit einer wässrigen
Lösung
verdünnt
wurde, die 0,1 Gewichtsprozent TFA (Lösung A) enthielt. Eine Probe,
die ohne Absorption eluiert wurde und Proben, die unter der jeweiligen
Bedingung eluiert wurden, wurden jeweils als Fraktionen 1 bis 6
bezeichnet. Jede Fraktion wurde gefriergetrocknet und in 40 ml einer
physiologischen Kochsalzlösung
gelöst,
um die Proben 1 bis 6 zu erhalten.
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Die
erhaltene Molke vor der Fraktionierung und die Proben 1 bis 6 wurden
spontan hypertensiven Ratten (SHR: von CHARLES RIVER JAPAN INC.,
fünf Ratten
pro Gruppe, 20 bis 22 Wochen alt, männlich) mit einer Magensonde
in einer Menge von 1 ml/Tier verabreicht. Die Veränderung
beim maximalen Blutdruck nach sechs Stunden wurde mit dem einer
Kontrollgruppe verglichen, der eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht
worden war. Die Messung des Blutdrucks erfolgte mit dem Schwanzmanschettenverfahren
unter Verwendung eines nicht-invasiven Blutdruckmessgeräts (Handelsname „PE 300", NARKO BIO-SYTEMS,
CO., LTD.). Als Ergebnis wurde eine deutliche blutdrucksenkende
Wirkung in Beispiel 2 wie in Tabelle 1 gezeigt. Somit fand man heraus,
dass Fraktion 2 aktiv war. Tabelle 1
| Probe | Verhältnis von
Lösung
B (%) | Verringerung
des Blutdrucks nach 6 Stunden (ΔSBP ± SE) |
| Vor
der Fraktionierung | - | –29,6 ± 9,5 *** |
| Fraktion
1 | Nicht
absobiert | –9,6 ± 5,7 * |
| Fraktion
2 | 0–10 | –22,3 ± 3,2 ***
(Aktive Fraktion) |
| Fraktion
3 | 10–15 | –8,1 ± 2,6 |
| Fraktion
4 | 15–20 | 1,0 ± 6,3 |
| Fraktion
5 | 20–30 | –8,8 ± 8,5 * |
| Fraktion
6 | 30–50 | –7,6 ± 5,3 |
| Kontrolle | | 1,9 ± 8,1 |
| (physiolgische
Kochsalzlösung) | | |
- ***; P < 0,001,
*; P < 0,05
-
Anschließend wurde
Probe 2 einer Elutionsbehandlung durch Umkehrphasen-Hochdruckfüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter den folgenden Bedingungen gemäß der in Tabelle 2 gezeigten
Elutionszeit unterzogen, um Probe 2 weiter in vier Fraktionen 2-1
bis 2-4 zu fraktionieren. Die Anwendungsmenge von Probe 2 in einer
Elution betrug 1 ml, und die Elution wurde 15 Mal wiederholt. Das
bedeutet, dass eine Gesamtmenge von 15 ml von Probe 2 fraktioniert
wurde.
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Pumpe,
L6200 INTELLIGENT-Pumpe, hergestellt von HITACHI LTD.;
Detektor,
L4000 UV-Detektor, hergestellt von HITACHI LTD.;
Säule, WATERS
MICROBONDASHERE 5 μ C18,
hergestellt von NIHON MILLIPORE LTD., Tokyo, Japan;
Elutionsmittel,
Lösung
A (0,1 Gewichtsprozent wässrige
Lösung
Trifluoressigsäure
(TFA); und Lösung
B (Acetonitril, enthaltend 0,1 Gewichtsprozent TFA);
Gradient,
linearer Gradient von Lösung
B 0% (Lösung
A 100%) bis Lösung
B 40% (Lösung
A 60%) (0 bis 60 Minuten)
Fließgeschwindigkeit, 1 ml/min.
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Fraktionen
2-1 bis 2-4 wurden gefriergetrocknet und in 15 ml physiologischer
Kochsalzlösung
aufgelöst,
um Proben 2-1 bis 2-4 herzustellen. Diese Proben wurden SHR-Ratten
oral mit einer Magensonde in einer Menge von 1 ml/Tier verabreicht,
und die Veränderung
des maximalen Blutdrucks nach sechs Stunden wurde mit dem einer
Kontrollgruppe wie vorstehend verglichen, der eine physiologische
Kochsalzlösung
verabreicht worden war, um die blutdrucksenkende Wirkung zu untersuchen.
Als Ergebnis wurde bei Fraktion 2-2 wie in Tabelle 2 gezeigt eine
deutliche blutdrucksenkende Wirkung beobachtet. Somit fand man heraus,
dass Fraktion 2 eine aktive Fraktion ist. Tabelle 2
| Probe | Elutionszeit
(min) | Verringerung
des Blutdrucks nach 6 Stunden (ΔSBP ± SE) |
| Fraktion
2-1 | 10,5–16 | –13,0 ± 2,8 ** |
| Fraktion
2-2 | 16–19 | –35,0 ± 9,7 ***
(Aktive Fraktion) |
| Fraktion
2-3 | 19–23 | –2,8 ± 5,3 |
| Fraktion
2-4 | 23–29 | –3,6 ± 5,6 |
| Kontrolle | | 2,6 ± 6,0 |
| (physiolgische
Kochsalzlösung) | | |
- ***; P < 0,001,
**; P < 0,01
-
1
ml von Probe 2-2 wurde einer Elutionsbehandlung durch HPLC unter
den gleichen Bedingungen wie vorstehend mit Ausnahme der unten stehenden
Bedingungen unterzogen:
Gradient, linearer Gradient von Lösung B 5%
(Lösung
A 95%) bis Lösung
B 20% (Lösung
A 80%) (0 bis 60 Minuten)
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Diese
Elution wurde zehn Mal wiederholt, das bedeutet, dass 10 ml insgesamt
von Probe 2-2 der Elution unterzogen wurden.
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Jede
der erhaltenen Fraktionen 2-2-1 bis 2-2-5 wurde gefriergetrocknet
und in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst, um Proben 2-2-1 bis 2-2-5
zu erhalten. Diese Proben wurden SHR-Ratten oral mit einer Magensonde
in einer Menge von 1 ml/Tier verabreicht, und die Veränderung
des maximalen Blutdrucks nach sechs Stunden wurde wie vorstehend
mit dem einer Kontrollgruppe verglichen, der eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht
worden war, um die blutdrucksenkende Wirkung zu untersuchen. Als
Ergebnis wurde eine deutliche blutdrucksenkende Wirkung in Fraktion
2-2-2 wie in Tabelle 3 gezeigt beobachtet. Tabelle 3
| Probe | Elutionszeit
(min) | Verringerung
des Blutdrucks nach 6 Stunden (ΔSBP ± SE) |
| Fraktion
2-2-1 | 21,8 | –6,6 ± 5,5 |
| Fraktion
2-2-2 | 22,7 | –23,0 ± 6,2 ***
(Aktive Fraktion) |
| Fraktion
2-2-3 | 24,0 | –9,0 ± 6,5 * |
| Fraktion
2-2-4 | 25,2 | –6,2 ± 6,2 |
| Fraktion
2-2-5 | 25,8 | –3,5 ± 4,8 |
| Kontrolle | | 2,6 ± 6,0 |
| (physiolgische
Kochsalzlösung) | | |
- ***; P < 0,001,
*; P < 0,05
-
1
ml von Probe 2-2-2 wurde einer Elutionsbehandlung durch HPLC unter
den gleichen Bedingungen wie vorstehend für die Behandlung von Probe
2-2 zur Reinigung der Probe unterzogen, und die Aminosäuresequenz
davon vom N-Terminus
wurde mit einem „automatischen
Proteinsequenziergerät
PPSQ-10 SYSTEM",
hergestellt von SHIMADZU CO. analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass
die Aminosäuresequenz Tyr-Pro
enthalten war. Alternativ wurde das gereinigte Peptid mit 6 N Salzsäure bei
einer Temperatur von 105°C
24 Stunden lang hydrolysiert, und die Aminosäureanalyse erfolgte mit einem
Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysesystem
(Handelsname „Amino
Acid Analysis System" hergestellt
von NIHON BUNKOU KOUGYO Co.). Als Ergebnis wurde bestätigt, dass
die Aminosäuren
Tyr und Pro zu gleichen Molteilen enthalten waren. Es wurde daher
daraus geschlossen, dass das enthaltene Peptid ein Dipeptid war,
das die Sequenz Tyr-Pro besaß.
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Herstellungsbeispiel 2
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100
kg einer wässrigen
Lösung
mit 9 Gewichtsprozent aus Magermilchpulver wurden mit 3 kg fermentierter
Milch, die mit Lactobacillus helveticus CPN4 (FERM BP-4835) fermentiert
wurden, beimpft und bei 37°C 20
Stunden lang gezüchtet.
Die so erhaltene Lösung
aus fermentierter Milch wurde in einem Sharpless-Zentrifugalseparator bei 10.000 UpM
behandelt, um 78 g Molke zu erhalten. Anschließend wurde die Molke auf eine
C18-beladene preparative Säule
(3 Liter Kapazität,
hergestellt von WATERS INC.) aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 10 kg einer
fünfprozentigen
wässrigen
Acetonitril-Lösung
gewaschen, gefolgt von einer Elutionsbehandlung mit 5 kg einer zehnprozentigen
Acetonitril-Lösung.
Die eluierte Fraktion ergab 1186 mg gefriergetrocknetes Produkt.
Dieses gefriergetrocknete Produkt enthielt 652 mg des Dipeptids
Tyr-Pro. Die Reinheit des Dipeptids Tyr-Pro betrug 55%.
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Beispiel 2
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Die
blutdrucksenkende Wirkung der Lösung
aus fermentierter Milch, die im Herstellungsbeispiel 1 erhalten
wurde, wurde untersucht. Die Messung der blutdrucksenkenden Wirkung
erfolgte unter Verwendung von SHR-Ratten gemäß dem Verfahren von Beispiel
1. 4 ml/Tier (12 ml/kg Körpergewicht)
der Lösung
aus fermentierter Milch oder einer Lösung einer unfermentierter
Milch wurden den SHR-Ratten
oral verabreicht, und der maximale Blutdruck wurde nach sechs Stunden
gemessen. Als Ergebnis wurde die blutdrucksenkende Wirkung bestätigt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
| Probe | Verringerung
des Blutdrucks nach 6 Stunden (ΔSBP ± )SE) |
| Lösung aus
unfermentierter Milch | –3,5 ± 4,2 |
| Lösung aus
mit CPN4 fermentierter Milch | –20,3 ± 5,2 *** |
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Beispiel 3
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Das
blutdrucksenkende Peptid Tyr-Pro, das in Beispiel 1 identifiziert
wurde, wurde zu einer festen Phase mit einem automatischen Peptidsynthesegerät PPSM-8,
hergestellt von SHIMADZU CO. synthetisiert. Die Elutionszeit des
erhaltenen Peptids Tyr-Pro bei der HPLC war die gleiche Zeit wie
die des gereinigten Peptids in Beispiel 1.
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Die
blutdrucksenkende Wirkung des synthetisierten Peptids wurde durch
das folgende Verfahren bestätigt.
0,05, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 oder 10 mg/kg Körpergewicht des synthetischen
Peptids Tyr-Pro wurde SHR-Ratten oral verabreicht, und der maximale
Blutdruck nach sechs Stunden wurde gemessen und mit dem einer Kontrollgruppe
wie in Beispiel 1 verglichen, der eine physiologische Kochsalzlösung verabreicht
worden war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Aus den Ergebnissen
in Tabelle 5 wurde die dosisabhängige Wirkung
in einem Bereich von 0,05 bis 3,0 mg/kg Körpergewicht bestätigt. Tabelle 5
| Menge
an Tyr-Pro (mg/kg) | Verringerung
des Blutdrucks nach 6 Stunden (ΔSBP ± SE) |
| 10 | –32,1 ± 7,4 *** |
| 3 | –30,5 ± 6,7 *** |
| 1 | –27,4 ± 7,1 *** |
| 0,3 | –20,8 ± 4,1 *** |
| 0,1 | –10,2 ± 4,0 * |
| 0,05 | –8,1 ± 3,3 |
| Kontrolle | –3,6 ± 2,1 |
| (physiologische
Kochsalzlösung) | |
- ***; P < 0,001,
*; P < 0,05