DE69829983T2 - Lactobacillus helveticus mit hoher kapazität für die produktion von tripeptiden, fermentiertes milchprodukt, und verfahren für seine herstellung - Google Patents
Lactobacillus helveticus mit hoher kapazität für die produktion von tripeptiden, fermentiertes milchprodukt, und verfahren für seine herstellung Download PDFInfo
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Description
- Fachgebiet
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Milchsäurebakterien von Lactobacillus helveticus, die ein besonderes Tripeptid mit hoher Effektivität herstellen können, wenn sie in einem Medium aus Tiermilch gezüchtet werden, und die eine hohe extrazelluläre Proteinaseaktivität haben, ein fermentiertes Milchprodukt, das die Milchsäurebakterien enthält; und ein Verfahren zur Herstellung des Produktes.
- Hintergrund des Fachgebietes
- Lactobacillus helveticus wird schon seit langer Zeit als typischer Milchsäurebakterienstarter für Milchprodukte benutzt, um fermentierte Milch herzustellen. Lactobacillus helveticus hat eine hohe proteolytische Aktivität, und seine extrazelluläre Proteinase, die eine hohe Aktivität hat, spielt im Besonderen eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Tiermilch. Die extrazelluläre Proteinase verdaut nämlich tierische Milchproteine, um verschiedene Peptidfragmente herzustellen. Die hergestellten Peptide werden weiterhin der Aktion der Peptidasen unterworfen, um Peptide mit einem kleineren Molekulargewicht zu werden. Es ist bekannt, dass ein Teil der Peptide, die in einem Medium infolge der Wirkung der Proteinaseenzyme hergestellt werden, in die Zellen der Milchsäurebakterien aufgenommen und als Stickstoffquelle benutzt wird. Es wurde auch berichtet, dass einige der Peptide, die in dem Medium hergestellt werden, eine hemmende Wirkung auf das Angiotensin Converting Enzym (ACE) haben, das Hypertension bewirkt (J. Dairy Sci. 78: 777–783 (1995)).
- Als Peptide, die die ACE-Aktivität hemmen und den Anstieg des Blutdrucks unterdrücken, wurde von verschiedenen effektiven Peptiden berichtet, die z. B. aus Abbauprodukten von Milchproteinen, Sojabohnenproteinen oder Fischfleischproteinen stammen. Zum Beispiel Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro (weiter unten als VPP bzw. IPP abgekürzt. Diese Peptide werden weiter unten insgesamt als Lactotripeptide bezeichnet) sind dafür bekannt, dass sie eine ACE-hemmende Aktivität haben, die in Milch, die mit Lactobacillus helveticus fermentiert wurde, gegenwärtig ist. Es wurde bestätigt, dass diese Lactotripeptide einen starken hypotensiven Effekt in Experimenten mit einer spontan hypertensiven Ratte (SHR) zeigen (J. Dairy Sci. 78: 1253–1257 (1995)).
- Jedoch kann die fermentierte Milch, die das Lactotripeptid enthält und die aus fermentierter Tiermilch mit konventionellen Lactobacillus helveticus-Stämmen produziert wurde, kaum so verwendet werden, wie sie ist, da sie einen hohen Säuregrad aufgrund der großen Mengen an Milchsäure, die beim Fermentationsablauf gebildet werden, besitzt. Verdünnung der fermentierten Milch führt zu einem extremen Abfall des Gehaltes an Lactotripeptiden.
- Deshalb ist es wünschenswert, fermentierte Milch mit einem höheren Gehalt an Lactotripeptiden im Vergleich zu dem Gehalt an Milchsäure, die in der fermentierten Milch gebildet wird, herzustellen. Durch Hinzufügen einer kleinen Menge dieser fermentierten Milch zu verschiedenen Nahrungsmitteln und Getränken können Produkte, die die Funktion der Lactotripeptide haben, einfach hergestellt und den Verbrauchern in einer zum Einnehmen angenehmen Art zur Verfügung gestellt werden. Aber keiner der bekannten Milchsäurebakterienstämme produziert das Lactotripeptid mit hoher Effizienz.
- Offenbarung der Erfindung
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Milchsäurebakterienstamm bereitzustellen, der große Mengen des Lactotripeptides mit hoher Effizienz bezogen auf die Menge an gebildeter Milchsäure produzieren kann.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein fermentiertes Milchprodukt, das das Lactotripeptid enthält, das Aktivitäten wie hypotensive Aktivität hat und von dem erwartet wird, dass es einen anti-Stress-Effekt hat, und einen Milchsäurebakterienstamm, der in der Lage ist, große Mengen dieses Lactotripeptids herzustellen, das auf angenehme Art und Weise als Nahrungsmittel und Getränk aufgenommen werden kann, und eine Methode bereit zu stellen, um diese herzustellen.
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Milchsäurebakterien von Lactobacillus helveticus bereitgestellt, die, wenn sie in einem Medium aus Tiermilch, das 9 Gew.-% Festbestandteile von fettfreier Milch enthält, gezüchtet werden, die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro in einer Menge von nicht weniger als 60 μg in Form von Val-Pro-Pro pro ml Medium erzeugen und eine extrazelluläre Proteinaseaktivität von nicht weniger als 400 U/OD590 zeigen, wobei sie die folgenden bakteriologischen Eigenschaften haben:
- (Morphologische Eigenschaften)
-
- 1) Form der Zelle: Stäbchen
- 2) Motilität: keine
- 3) Sporenbildung: keine
- 4) Gram-Färbung: positiv
- (Physiologische Eigenschaften)
-
- 1) Katalaseproduktion: negativ
- 2) Indolproduktion: negativ
- 3) Nitratreduktion: negativ
- 4) Aerobes Wachstum: fakultativ anaerob
- 5) Bildung von DL-Milchsäure aus Glucose durch homolaktische Fermentation ohne Bildung von Gasen
- 6) Kohlenhydratabbau Glucose; + Lactose; + Mannose; + Fructose; + Galactose; + Saccharose; – Maltose; – Xylose; – Rhamnose; – Cellobiose; – Trehalose; – Melibiose; – Raffinose; – Stachyose; – Mannit; – Sorbit; – Esculin; – Salicin; –.
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden auch Milchsäurebakterien von Lactobacillus helveticus bereitgestellt, wobei die Milchsäurebakterien der Lactobacillus helveticus-Stamm CM4 (hinterlegt beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology am 15. August, 1997, Zugangsnummer FERM BP-6060) sind.
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden weiterhin die Milchsäurebakterien von Lactobacillus helveticus bereitgestellt, die eine chromosomale DNA besitzen, welche ein Fragment von 15 bis 17 kb ergibt, wenn die chromosomale DNA mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut wird.
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein fermentiertes Milchprodukt bereitgestellt, das fermentierte Milch, die die vorher erwähnten Milchsäurebakterien umfasst, und ein Tripeptid beinhaltet, das aus der Gruppe, die aus Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro und Gemischen davon besteht, ausgewählt wird.
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines fermentierten Milchproduktes bereitgestellt, das die Fermentation eines Mediums mit den Milchsäurebakterien umfasst, das Nährmaterial aus der Gruppe, die aus einem Peptid, einem Protein und Gemischen davon, einschließlich der Sequenz Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro besteht, enthält.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 ist ein Foto, das das Elektrophoresemuster des Agarosegels der chromosomalen DNA-Fragmente der verschiedenen Lactobacillus helveticus-Stämme aus Beispiel 2 zeigt. - Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
- Die Milchsäurebakterien der vorliegenden Erfindung gehören zu Lactobacillus helveticus und sind dadurch charakterisiert, das die Milchsäurebakterien die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro mit einem Gehalt von nicht weniger als 60 μg und vorzugsweise nicht weniger als 70 μg in Form von Val-Pro-Pro pro ml Medium herstellen, wenn sie in einem Medium aus Tiermilch, das 9 Gew.-% Festbestandteile fettfreier Milch enthält, gezüchtet werden, und eine extrazelluläre Proteinaseaktivität von nicht weniger als 400 U/OD590 und vorzugsweise nicht weniger als 430 U/OD590 zeigen. Die definierte Lactotripeptid-Produktivität ist ein Index, um die vorliegenden Milchsäurebakterien von den herkömmlichen Milchsäurebakterien von Lactobacillus helveticus zu unterscheiden. Mit diesem Index wird, zum Beispiel, eine Eigenschaft der vorliegenden Milchsäurebakterien festgelegt, die, wenn sie in Tiermilch, die 9 Gew.-% Festanteile von fettfreier Milch enthält, gezüchtet werden, die Lactotripeptide mit einem Gehalt von nicht weniger als 60 μg in Form von VPP pro ml Medium herstellen, was nicht mit den herkömmlichen Milchsäurebakterien erreicht werden konnte. Je geringer der Gehalt an Festbestandteilen von fettfreier Milch in dem Kulturmedium ist, desto kleiner ist normalerweise der Gehalt an Lactotripeptiden, die hergestellt werden sollen. Je höher der Gehalt an Festbestandteilen von fettfreier Milch ist, desto größer ist der Gehalt des Lactotripeptids.
- Die Produktivität der Lactotripeptide als ein Index wird durch die Schritte der Inokulation von Tiermilch wie Kuhmilch, Ziegenmilch, Pferdemilch und deren Magermilch, die 9 Gew.-% Festbestanteile von fettfreier Milch beinhalten, mit Milchsäurebakterien der Züchtung der Bakterien bei 37°C für 24 h, um fermentierte Milch herzustellen, der Zentrifugation von 1 ml fermentierter Milch bei 15000 UpM für 10 Minuten, der Messung des Überstandes auf die Mengen an VPP und IPP und der Umrechnung der Mengen in VPP-Mengen gemessen. Der umgerechnete Gehalt des Lactotripeptids in Form von VPP wird mit der folgenden Gleichung berechnet, da die ACE-hemmende Aktivität von IPP pro Einheitsgewicht der 1,7-fachen Aktivität von VPP entspricht.
- Das Maximum der Lactotripeptid-Produktivität ist nicht im besonderen begrenzt; es kann aber erreicht werden, wenn das gesamte Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro, die als Sequenzen in dem Protein des Mediums enthalten sind, durch Verdau als Tripeptide heraus genommen werden.
- Die extrazelluläre Proteinaseaktivität wird in Übereinstimmung mit der Methode von Yamamoto et al. gemessen (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740), basierend auf der Methode von Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984)), und wird ausgedrückt, indem der Gehalt an Enzym, der 1% Fluoreszenz-Intensität zeigt, als 1 U/OD590 definiert wird. Die obere Grenze der extrazellulären Proteinaseaktivität ist auch nicht begrenzt, beträgt aber normalerweise 800 U/OD590. Die vorliegenden Milchsäurebakterien können eine große Menge des Lactotripeptides bezogen auf die Milchsäuremenge, die während der Fermentation gebildet wird, herstellen. Deshalb hat eine Fermentation, die die vorliegenden Milchsäurebakterien benutzt, eine fermentierte Milch zur Folge, die eine größere Menge des Lactotripeptides enthält als eine fermentierte Milch, die die gleiche Milchsäuremenge enthält, die mit herkömmlichen Milchsäurebakterien hergestellt wird. Die Milchsäure infolge einer solchen Fermentation ist DL-Milchsäure. Die Menge des Lactotripeptids, das bei einer Fermentation mit den vorliegenden Milchsäurebakterien hergestellt wird, beträgt vorzugsweise nicht weniger als 30 μg in Form von VPP pro 1 ml der erhaltenen fermentierten Milch, die 0,01 g/ml der DL-Milchsäure, die während der Fermentation gebildet wird, enthält. Die obere Grenze der Lactotripeptid-Menge ist nicht besonders eingeschränkt, aber es ist für die Bakterien möglich, bis zu etwa 50 μg in Form von VPP pro 1 ml der fermentierten Milch zu produzieren, die 0,01 g DL-Milchsäure enthält. Die Menge an DL-Milchsäure ist in etwa zu der Menge des Lactotripeptids proportional. Deshalb ist, wenn zum Beispiel 0,02 g DL-Milchsäure in 1 ml fermentierter Milch produziert werden, die Menge der Lactotripeptid-Bildung vorzugsweise nicht weniger als 60 μg in Form von VPP. Im Gegensatz dazu beträgt der Gehalt des Lactotripeptids bei der Fermentation mit herkömmlichen Milchsäurebakterien allenfalls weniger als 30 μg in Form von VPP pro 0,01 g DL-Milchsäure in 1 ml fermentierter Milch.
- Ein Beispiel der vorliegenden Milchsäurebakterien ist der Lactobacillus helveticus-Stamm CM4, der als FERM BP-6060 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt ist (hinterlegt am 15. August, 1997). Der Lactobacillus helveticus CM4-Stamm hat folgende bakteriologische Eigenschaften:
- 1. Morphologische Eigenschaften
-
- 1) Form der Zelle: Stäbchen
- 2) Motilität: keine
- 3) Sporenbildung: keine
- 4) Gram-Färbung: positiv
- 2. Physiologische Eigenschaften
-
- 1) Katalaseproduktion: negativ
- 2) Indolproduktion: negativ
- 3) Nitratreduktion: negativ
- 4) Aerobes Wachstum: fakultativ anaerob
- 5) Bildung von DL-Milchsäure aus Glucose durch homolaktische Fermentation ohne Bildung von Gasen
- 6) Kohlenhydratabbau Glucose; + Lactose; + Mannose; + Fructose; + Galactose; + Saccharose; – Maltose; – Xylose; – Rhamnose; – Cellobiose; – Trehalose; – Melibiose; – Raffinose; – Stachyose; – Mannit; – Sorbit; – Esculin; – Salicin; –
- Die zuvor erwähnten bakteriologischen Eigenschaften des CM4-Stammes sind identisch mit dem öffentlich bekannten Lactobacillus helveticus NCDO-099-Stamm, wenn sie mit der Methode von Mitsuoka et al. (Rinshoukensa 18, 1163 (1974)) überprüft werden. Jedoch unterscheidet sich CM4 klar von NCDO-O99., aufgrund der folgenden Eigenschaften, die nicht von Mitsuoka et al., beschrieben werden.
- 7) Extrazelluläre Proteinaseaktivität; nicht weniger als 400 U/OD590
- 8) Lactotripeptid-Produktivität; Produktion von zwei Sorten von Tripeptiden (VPP und IPP) in Mengen von 60 μg oder mehr in Form von VPP pro ml fermentierter Flüssigkeit, wenn sie in einem Medium, das 9 Gew.-% Magermilch enthält, bei 37°C für 24 Stunden gezüchtet werden.
- Die Lactotripeptid-Produktivität in 8) wird gemessen, wobei Magermilch als Festbestanteil fettfreier Milch benutzt wird.
- Der Milchsäuebakterien-Stamm der vorliegenden Erfindung kann durch das folgende Durchmustern und die folgende Messung der extrazellulären Proteinaseaktivität erhalten werden.
- (1) Erstes Durchmustern
- (Selektion des Stammes durch Messung der hohen ACE-hemmenden Aktivität in der fermentierten Milch)
- Die Stämme, die durchgemustert werden sollen, werden bei 37°C für 24 Stunden in einem 9 Gew.-% Magermilch-Medium gezüchtet. Nachdem die Anzucht beendet wurde, werden die Zahl der Milchsäurebakterien, der Säuregrad der Milchsäure und die ACE-hemmende Aktivität gemessen. Stämme, die 1 × 108 Zellen/ml oder mehr Milchsäurebakterien produzieren und einen Säuregrad der Milchsäure von 1,6 Gew.-% oder mehr zeigen und eine ACE-hemmende Aktivität von 40 Unit/ml oder mehr zeigen, werden selektiert. Die ACE-hemmende Aktivität wird mit der Methode von Cushman und Cheung (Cushman, D. W., und Cheung, H. S. Pharmacol., 20 1637 (1971)) gemessen.
- (2) Zweites Durchmustern
- (Selektion von Stämmen, die eine hohe Lactotripeptid-Produktivität aufweisen)
- Die angezogenen Flüssigkeiten der Stämme, die im ersten Durchmustern selektiert wurden, werden bei 15000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, und deren Überstände werden in eine HPLC zur Quantifizierung des Lactotripeptids gegeben. Stämme, die nicht weniger als 50 μg in Form von VPP pro ml herstellen, werden selektiert.
- (3) Messung der extrazellulären Proteinase-Aktivität
- Jeder der im zweiten Durchmusterungsprozeß ausgewählten Stämme wird in einem 9 Gew.-% Magermilchmedium angezogen, wobei dessen pH-Wert bei 6 gehalten wird. Es wird eine Probe in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase genommen und mit 1 Gew.-% Natrimcitrat gemischt und bei 5000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Die geernteten Zellen werden mit 50 mM β-Glycerophosphorsäure gewaschen und in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,8) suspendiert, um die Trübung (OD590) auf 1 einzustellen. Die Proteinase-Aktivität an der Zelloberfläche wird dann gemessen. Es wird bestätigt, dass das Ergebnis mit der Lactotripeptid-Produktivität der Stämme, die im zweiten Screening gemessen wurde, korreliert.
- Der Milchsäurebakterien-Stamm von Lactobacillus helveticus, der mit der oben genannten Methode selektiert wurde, kann identifiziert und von anderen Milchsäurebakterien-Stämmen mittels z. B. der oben genannten Lactotripeptid-Produktivität und der extrazellulären Proteinase-Aktivität unterschieden werden.
- Die Milchsäurebakterien der vorliegenden Erfindung haben vorzugsweise zusätzlich zu der oben erwähnten Lactotripeptid-Produktivität und der extrazellulären Proteinase-Aktivität eine chromosomale DNA, die DNA-Fragmente von 15 bis 17 kb ergibt, wenn sie mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut wird. Die Milchsäuebakterien der vorliegenden Erfindung können deshalb klar von anderen Stämmen der gleichen Art unterschieden werden, indem untersucht wird, ob der Stamm die chromosomale DNA besitzt, die solche Fragmente ergibt.
- Die Existenz des DNA-Fragmentes mit 15 bis 17 kb kann bestätigt werden, indem die chromosomale DNA der Milchsäuebakterien in Übereinstimmung mit der Methode von Leenhouts et al. extrahiert wird. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56: 2726), die chromosomale DNA mit EcoRI und PstI verdaut wird, eine 0,8% Agarosegel-Elektrophorese mit den verdauten Fragmenten durchgeführt wird und das entstandene Elektrophoresemuster analysiert wird. Bei der Elektrophorese wird die Existenz des DNA-Fragmentes klar bestätigt, indem λ-Phagen-DNA, die mit dem Restriktionsenzym Hind III verdaut wurde, parallel bei der Elektrophorese als Größenmarker eingesetzt wird.
- Das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung beinhaltet als einen notwendigen Bestandteil die fermentierte Milch, die die Milchsäurebakterien und die Tripeptide beinhaltet, die aus der Gruppe, die aus VPP, IPP und Mischungen davon besteht, ausgewählt wurden. Das heißt, das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung beinhaltet fermentierte Milch, die das Lactotripeptid und die Milchsäurebakterien enthält und mittels Fermentation eines Mediums, in dem das Nährmaterial, das aus Peptiden und/oder Proteinen einschließlich der Sequenz VPP und/oder IPP zusammengesetzt ist, enthalten ist, mit den Milchsäurebakterien der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Deshalb sollen die Milchsäurebakterien- und Tripeptid-Bestandteile abhängig von der Sorte des fermentierten Milchproduktes, das hergestellt werden soll, geeignet ausgewählt werden. Das vorliegende fermentierte Milchprodukt kann das erhaltene fermentierte Produkt selbst, ein verdünntes fermentiertes Produkt oder ein gereinigtes fermentiertes Produkt enthalten.
- Das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung beinhaltet DL-Milchsäure, die während der Fermentation gebildet wird. Das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung beinhaltet vorzugsweise das Lactotripeptid in Mengen von 30 bis 50 μg in Form von VPP bezogen auf 0,01 g DL-Milchsäure. Die Menge der DL-Milchsäure ist in etwa proportional zur Menge des Lactotripeptids. Deshalb wenn das fermentierte Milchprodukt eine konzentrierte fermentierte Milch beinhaltet und zum Beispiel 0,02 g DL-Milchsäure beinhaltet, dann ist die Menge des Lactotripeptids vorzugsweise in einem Bereich von 60 bis 100 μg in Form von VPP. Wenn das fermentierte Milchprodukt eine verdünnte fermentierte Milch enthält und zum Beispiel 0,005 g DL-Milchsäure beinhaltet, beträgt die Menge des Lactotripeptids vorzugsweise 15 bis 25 μg in Form von VPP. Obwohl das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung L-Milchsäure enthalten kann, die ein Nahrungsmittelzusatz zur Einstellung des Säuregehaltes ist, muss diese L-Milchsäure von der DL-Milchsäure, die während der Fermentation gebildet wird, unterschieden werden.
- Die Milchsäurebakterien in dem fermentierten Milchprodukt der vorliegenden Erfindung können auch nach der Fermentation sterilisiert werden oder ohne Sterilisation lebend erhalten werden.
- Das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung kann Joghurt, Milch-enthaltende angesäuerte Getränke, Käse, verarbeitete Nahrungsmittel, die fermentierte Sauermilch enthalten, und Reform sein, die fermentierte Sauermilch enthalten. Deshalb kann das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung als weitere Zugabe zur fermentierten Milch als eine notwendige Komponente verschiedene Materialien, die normalerweise zur Produktion einer solchen Variation von Produkten hinzugefügt werden, enthalten. Das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung kann in fester Form wie als Pulver, Körner und Tabletten oder flüssig als Paste, Gel oder Flüssigkeit vorliegen.
- Das Verfahren zur Herzustellung des fermentierten Milchprodukts der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Fermentation eines Mediums, das Nährmaterial enthält, das aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Protein und Gemischen davon einschließlich der Sequenz Val-Pro-Pro und/oder Ile-Pro-Pro als Teil seiner Sequenz ausgewählt wird, mit den Milchsäurebakterien.
- Das Nährmaterial indem Medium kann jeder Art sein, so lange es Peptide und/oder Proteine beinhaltet, einschließlich der Sequenz VPP und/oder IPP. Das Nährmaterial kann zum Beispiel Tiermilch, Milchcasein, Mais, Maisprotein, Weizen, Weizenprotein, Sojabohne, Sojamilch, entfettete Sojabohne, Sojaprotein oder Gemische davon sein. Im Besonderen wird vorzugsweise ein Nährmaterial benutzt, das Tiermilch wie Kuhmilch, Ziegenmilch, Pferdemilch oder die Magermilch davon enthält. Der Gehalt der Festbestandteile der entfetteten Milch in der Tiermilch ist nicht besonders begrenzt, aber beträgt normalerweise 5 bis 20 Gew.-%.
- Es gibt keine besondere Begrenzung der Menge der Milchsäurebakterien, mit denen das Medium inokuliert wird. Die Inokulationsmenge beträgt normalerweise etwa 105 bis 107 Zellen der Milchsäurebakterien pro 1 g des vorher erwähnten speziellen Nährmaterials in dem Medium.
- Die Fermentation wird bei 25 bis 50°C und vorzugsweise bei 30 bis 45°C für 6 bis 30 Stunden und vorzugsweise 10 bis 24 Stunden in einem pH-Bereich von vorzugsweise 3,0 bis 4,0 und mehr bevorzugt 3,0 bis 3,5 ausgeführt.
- Die Fermentation wird vorzugsweise so ausgeführt, dass die Menge an Lactotripeptid nicht weniger als 60 μg in Form von VPP pro ml gewonnener fermentierter Milch beträgt. Genau gesagt, wenn Kuhmilch, die 9 Gew.-% Festbestanteile fettfreier Milch enthält, als Medium verwendet wird, ergibt die Fermentation bei 25 bis 40°C für 12 bis 48 Stunden eine fermentierte Milch, die das Lactotripeptid in einer Menge von nicht weniger als 70 μg in Form von VPP pro ml enthält. Der Gehalt des Festbestandteils der fettfreien Milch in dem Medium ist etwa proportional zu dem Lactotripeptid, das hergestellt werden soll. Wenn zum Beispiel das Nährmaterial 5 Gew.-% Festbestandteile fettfreier Milch enthält, ergibt die Fermentation in Übereinstimmung mit den vorher genannten Bedingungen eine Produktion des Lactotripeptids in einer Menge von etwa 33,3 μg in Form von VPP pro ml.
- Die fermentierte Milch, die bei der vorher erwähnten Fermentation erhalten wird, kann mit dem Produkt, so wie es ist, gemischt werden. Wenn es nötig ist, kann die fermentierte Milch vor dem Mischen einer Verdünnung oder Reinigung unterworfen werden. Die fermentierte Milch kann gekühlt und bei 5°C aufbewahrt werden und dann mit anderen Komponenten gemischt werden, um ein Produkt wie ein Kühlprodukt herzustellen. Alternativ dazu kann die fermentierte Milch einer Hitzesterilisations-Behandlung unterworfen werden, und, wenn nötig, mittels einer Sprühtrocknung pulverisiert werden, um ein Produkt zum Vertrieb bei normalen Temperaturen herzustellen.
- Da das fermentierte Milchprodukt der vorliegenden Erfindung die fermentierte Milch enthält, die durch Fermentation mit den Milchsäurebakterien erhalten wurde, kann es dazu benutzt werden, einfach Produkte, die einen hohen Gehalt des Lactotripeptids bezogen auf den Gehalt an Milchsäure beinhalten, in einer zum Einnehmen angenehmen Form herzustellen. Es wird erwartet, dass das fermentierte Milchprodukt den hypotensiven Effekt und den anti-Stress-Effekt des Lactotripeptids ausübt, wenn es von Menschen eingenommen wird.
- Da die Milchsäurebakterien der vorliegenden Erfindung große Mengen des Lactotripeptids durch Züchtung dieser in dem spezifischen Nährmaterial produzieren, sind die Bakterien nützlich, um eine Vielzahl fermentierter Milchprodukte, funktioneller Nährmittel, Reformkost, Nahrungsmittel speziell für den Gesundheitsgebrauch, spezielle Nahrungsmittel für den Gebrauch durch ältere Menschen und das Material davon, das den hypotensiven Effekt und den Stress-senkenden Effekt der Lactotripeptide ausübt, herzustellen.
- Beispiele der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung wird durch Bezug auf die Beispiele weiter unten mehr im Detail erklärt, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
- Von den Lactobacillus helveticus-Stämmen, die in den Beispielen benutzt werden, ist der CM4-Stamm beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt und es wurde ihm die Zugangsnummer FERM BP-6060 zugeteilt. ATCC15009, NCDO-099, JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120, und JCM1004 sind öffentlich erwerbbare Stämme. Andere Stämme als die oben genannten Stämme, die in den Beispielen benutzt werden, sind aus der Stammsammlung des Anmelders ausgewählt worden.
- Beispiel 1
- (Selektion von Stämmen, die eine fermentierte Milch ergeben, die eine hohe ACE hemmende Aktivität besitzt)
- 36 Lactobacillus helveticus-Stämme, die aus verschiedenen Milchprodukten isoliert wurden, wurden durchgemustert. Die ACE-hemmende Aktivität der Milch, die mit jedem der Stämme fermentiert wurde, wurde mit der folgenden Methode gemessen. Jeder Lactobacillus helveticus-Stämme wurde in einem fettfreien Milch-Medium mit 9 Gew.-% Festbestandteilen bei 37°C für 24 Stunden gezüchtet. Das Kulturmedium wurde zu frischem Medium des gleichen Typs in solchen Mengen gegeben, dass das neue Medium 3 Gew.-% des Kulturmediums beinhaltete. Die Fermentation wurde weiterhin bei 37°C für 24 Stunden ausgeführt. Nachdem die Fermentation beendet war, wurden der Säuregehalt der Milchsäure (Gew.-%), die Menge der Peptide in der Molke (mg/ml), die Zellzahl und die ACE-hemmende Aktivität (U/ml) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Sieben Stämme von 36 Stämmen hatten sehr schwache Fermentationsfähigkeiten. 15 Stämme produzierten fermentierte Milch mit einem Säuregrad an gebildeter Milchsäure von nicht weniger als 1,6 Gew.-%. Von diesen 15 Stämmen hatten 8 Stämme eine ACE-hemmende Aktivität von nicht weniger als 40 U/ml Molke in ihrer fermentierten Milch und wurden ausgewählt.
- (Messung der ACE-hemmenden Aktivität von fermentierter Milch)
- Die ACE-hemmende Aktivität wurde in Übereinstimmung mit der Methode von Cushman und Cheung (Cushman, D. W. und Cheung, H. S: Pharmacol. 20: 1637 (1971)) bestimmt. Das heißt, dass jede fermentierte Milch bei 15000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert wurde, um den Überstand zu erhalten (Molke). Die Molke wurde so verdünnt, dass sie für die Messung geeignet war. 80 μl der verdünnten Molke wurden in ein Röhrchen gefüllt, mit 0,2 ml 0,1 M Borsäurepuffer (der 0,3 M NaCl, pH-Wert 7,3 enthielt) vermischt, der 5 mM Hippuryl-Histidin-Leucin (Hip-His-Leu, hergestellt von SIGMA CHEMICALS CO.) als Substrat enthielt, und weiterhin mit 20 μl Enzymlösung ((0,1 U/ml, hergestellt von SIGMA CHEMICALS CO.) vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde bei 37°C für 30 min zur Reaktion gebracht und anschließend mit 250 μl 1 N Salzsäure zum Beenden der Reaktion gemischt. Anschließend wurde das Gemisch mit 1,7 ml Ethylacetat gemischt, für 20 Sekunden gerührt und dann bei 3000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, um 1,4 ml der Ethylacetat-Phase (obere Phase) zu erhalten. Die obere Phase wurde bei 120°C für 40 Minuten erhitzt, um das Lösungsmittel zu entfernen und mit 1 ml destilliertem Wasser gemischt, und für etwa 20 Sekunden gerührt. Es wurde die Absorption der extrahierten Hippurylsäure („hippurylic acid") bei 228 nm bestimmt. Die Enzymaktivität wurde nach der folgenden Gleichung in Einheiten berechnet, wobei die Menge, die eine Hemmung von 50% der ACE-Aktivität ergibt, als eine Einheit definiert wurde.
- A:
- Absorption bei 228 nm ohne Probe
- B:
- Absorption bei 228 nm mit Probe
- C:
- Absorption bei 228 ohne Enzym und ohne Probe
- (Quantitative Analyse des Gehaltes an Peptiden in der fermentierten Milch)
- Die quantitative Analyse der Peptide wurde in Übereinstimmung mit der OPA-Methode durchgeführt (Charch, F. C: et al. J. Dairy Sci. 66 1219 (1883)). Als Standardsubstanz wurde mit Trypsin verdautes Casein verwendet, um eine Eichkurve zu erstellen.
- Tabelle 1
- (Selektion der Stämme, die eine hohe Lactotripeptid-Produktivität zeigen)
- Anschließend wurden VPP und IPP in der fermentierten Milch der 8 Stämme, die wie oben selektiert wurden und eine fermentierte Milch mit hoher ACE-hemmender Aktivität ergaben, gemessen.
- 1 ml fermentierter Milch wurde bei 15000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand davon, d. h. Molke, wurde gesammelt. 0,3 ml Molke wurden einer Sep-Pak-Kartuschen-Adsorption (hergestellt von WATERS INC.) unterzogen, mit destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 5 ml Methanol eluiert. Das Eluat wurde mittels Zentrifugation und reduziertem Druck getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 0,3 ml 0,05% wässriger Trifluoressigsäure-Lösung gelöst und einer HPLC-Analyse (Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie) unter den folgenden Bedingungen unterzogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Benutzter Apparat:
Hitachi L4000UV-Detektor (bei 215 nm)
Intelligente L6200-Pumpe
L5030-Säulenofen (35°C)
Bedingungen der Elution: Flußrate 0,5 ml/min.
Eluent: Wässrige Lösung, die 0,3 M NaCl und 0,05% Trifluoressigsäure enthält
Säule: Asahipak GS320 (⌀ 3,9 × 600 mm) - Da die ACE-hemmende Aktivität von IPP pro Einheitsgewicht 1,7-mal größer ist als die von VPP, wurde der Gehalt der Lactotripeptide in Form von VPP aus den gemessenen Mengen von IPP und VPP in Übereinstimmung mit der folgenden Gleichung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
- Tabelle 2
- Die fermentierte Mich von CM4 hatte den größten Gehalt des Lactotripeptids in Form von VPP, das heißt 78,5 μg/ml Molke. Die anderen sieben Stämme ergaben einen durchschnittlichen Gehalt von 34,2 μg/ml Molke.
- (Bestimmung der extrazellulären Proteinase)
- Die extrazelluläre Proteinase-Aktivität wurde in 16 Stämmen gemessen, die relativ gute Ergebnisse der Fermentationsfähigkeit ergaben, die in Tabelle 1 dargestellt sind. Die Messung wurde in Übereinstimmung mit der Methode von Yamamoto et al. (Yamamoto, N. et al. J. Biochem. (1993) 114, 740) durchgeführt, basierend auf der Methode von Twining et al., (Twining, S. Anal. Biochem 143 3410 (1984)). Das heißt, jeder Stamm wurde in 9 Gew.-% Magermilchmedium gezüchtet, während der pH-Wert bei 6,0 gehalten wurde. In der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase wurde eine Probe genommen und mit Natriumcitrat gemischt, so dass die Endkonzentration 1 Gew.-% betrug, um das Milch-Medium zu klären. Das Gemisch wurde bei 5000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit 50 mM β-Glycerophophorsäure gewaschen und in 50 mM Tris-HCl Puffer (pH-Wert 7,8) suspendiert, um die Durchlässigkeit auf 1 (OD590, d. h. gemessene Absorption bei 590 nm) einzustellen. 30 μl der Suspension wurden mit 20 μl 0,4% Fluorescein-Casein (hergestellt von SIGMA CHEMICALS CO.) gemischt und bei 42°C für 1 Stunde inkubiert. Das Gemisch wurde weiterhin mit 120 μl 5% Trichloressigsäure gemischt, für 20 Minuten stehen gelassen und bei 15000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert. 60 ml des Überstandes wurden zu 3 ml eines 500 mM Tris- HCl-Puffers (pH-Wert 8,3) gegeben und dessen Fluoreszens-Intensität gemessen, indem die gebildete Fluoreszenz bei 525 nm mit einer Anregungswellenlänge von 490 nm bestimmt wurde. Die extrazelluläre Proteinase-Aktivtät in Einheiten wurde ermittelt, wobei der Gehalt des Enzyms, der 1% Fluoreszenz-Intensität unter den oben beschriebenen Bedingungen zeigt, als eine Einheit definiert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
- Tabelle 3
- Die Aktivität von Lactobacillus helveticus CM4 war die höchste, das heißt 450 U/OD590. Die durchschnittliche Aktivität der anderen 16 Stämme betrug 141 U/OD590, was ungefähr einem Drittel von der des CM4-Stammes entspricht.
- Beispiel 2
- Von 11 Stämmen der 36 Lactobacillus helveticus-Stämme, die in Beispiel 1 selektiert wurden, wurde die chromosomale DNA in Übereinstimmung mit der Methode von Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56: 2726) extrahiert, mit einigen Restriktionsenzymen verdaut und einer 0,8% Agarosegel Elektrophorese unterworfen, um das Elektrophoresemuster zu analysieren.
- Als ein Ergebnis wurde ein charakteristisches DNA-Fragment unter den DNA-Fragmenten des Chromosoms des CM4-Stammes beobachtet, das mit EcoRI und PstI (angezeigt durch einen Pfeil in
1 ) verdaut wurde. Solch ein Fragment wurde nicht bei den anderen Fragmenten der Chromosomen der anderen Stämme als CM4 beobachtet und es wurden kleinere Fragmente als das charakteristische Fragment von CM4 in den meisten anderen Stämmen beobachtet (angezeigt mit einem Pfeil in1 ). Das Molelulargewicht des charakteristischen Fragments wurde mittels vergleichender Elektrophorese mit den Produkten eines Verdaus von λ-Phagen-DNA mit HindIII als Größenmarker (23,1 kb, 9,4 kb, 6,6 kb 4,4 kb, 2,3 kb und 2,0 kb in der Reihenfolge ansteigender Beweglichkeit) bestimmt und es wurde gefunden, dass es etwa 16 kb groß ist. So wurde bestätigt, dass der CM4-Stamm eine chromosomale DNA besitzt, die ein DNA-Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 16 kb ergibt, wenn sie mit EcoRI und PstI verdaut wird. Es wurde auch bestätigt, dass andere Stämme als CM4 chromsomale DNA besitzen, die ein gemeinsames DNA-Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 13 kb ergeben. - Beispiel 3
- Es wurde eine fermentierte Milch mit dem Lactobacillus helveticus CM4-Stamm, der in Beispiel 1 selektiert wurde, hergestellt. Der CM4-Stamm wurde in 100 g 9 Gew.-%. Magermilch bei 37°C für 12 Stunden gezüchtet. Anschließend wurden 3 kg frisches Medium mit der gezüchteten Magermilch angeimpft und bei 37°C für 12 Stunden gezüchtet. Nachdem die Fermentation beendet war, wurde die ganze fermentierte Milch (Zellzahl des CM4-Stammes, 6,3 × 108 Zellen/ml) als Starter für eine Fermentation von 100 kg 9 Gew.-% Magermilch bei 32°C für 20 Stunden benutzt. Nachdem die Fermentation beendet war, enthielt die fermentierte Milch 74,8 μg/ml des Lactotripeptids. Der Gehalt an Milchsäure betrug 1,9 Gew.-%.
- 43 kg der erhaltenen fermentierten Milch wurden mit 4 kg körnigem Zucker, 3 kg Wasser und 0,15 kg Pectin mit hohem Methoxygehalt gemischt und homogenisiert, um 50 kg Joghurt-Getränk zu erhalten. Das Joghurt-Getränk hatte einen vorzugsweise milden Geschmack, einen pH-Wert von 3,6 und 4,6 × 108 Zellen/g lebender CM4-Zellen.
- Beispiel 4
- 26,5 kg der in Beispiel 3 erhaltenen fermentierten Milch wurden mit 45,0 kg körnigem Zucker, 4,7 kg Sirup mit hohem Maltosegehalt und 13,8 kg Wasser gemischt. 10 kg einer 3 Gew.-%. Pectinlösung mit hohem Maltosegehalt wurden zu dem Gemisch unter Rühren hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde homogenisiert, wobei ein Labor-Homogenisator (hergestellt von ATV GAULIN INC., Modell 15M-8BA) unter Druck-Behandlung von 150 kg/cm2 und bei einer Behandlungs-Flußrate von 2500 ml/min benutzt wurden. Die homogenisierte Flüssigkeit wurde mit einem Vanillearoma gemischt und durch Erhitzen auf bis zu 85°C sterilisiert. Die so sterilisierte fermentierte Milch wurde in 200 ml Glasflaschen abgefüllt, solange sie heiß war. Der Gehalt des Lactotripeptides in dem sterilisierten fermentierten Milchprodukt wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass der Gehalt des Lactotripeptides mit dem in der fermentierten Milch vor der Sterilisation übereinstimmte. Es wurde auch gefunden, dass der Gehalt an Milchsäure 0,5 Gew.-% betrug.
Claims (11)
- Lactobacillus helveticus-Michsäurebakterien, die, wenn sie in einem Medium aus Tiermilch, welches 9 Gew.-% Festbestandteile von fettfreier Milch enthält, gezüchtet werden, die Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro in einer Menge von nicht weniger als 60 μg in Form von Val-Pro-Pro pro ml Medium erzeugen und extrazelluläre Proteinaseaktivität von nicht weniger als 400 U/OD590 zeigen, wobei sie die folgenden bakteriologischen Eigenschaften haben: (Morphologische Eigenschaften) 1) Form der Zelle; Stäbchen 2) Motilität; keine 3) Sporenbildung; keine 4) Gram-Färbung; positiv (Physiologische Eigenschaften) 1) Katalaseproduktion; negativ 2) Indolproduktion; negativ 3) Nitratreduktion; negativ 4) Aerobes Wachstum; fakultativ anaerob 5) Bildung von DL-Milchsäure aus Glucose durch homolaktische Fermentation ohne Bildung von Gasen 6) Kohlenhydratabbau Glucose; + Lactose; + Mannose; + Fructose; + Galactose; + Saccharose; – Maltose; – Xylose; – Rhamnose; – Cellobiose; – Trehalose; – Melibiose; – Raffinose; – Stachyose; – Mannit; – Sorbit; – Esculin; – Salicin; –.
- Lactobacillus helveticus-Milchsäurebakterien nach Anspruch 1, wobei die Milchsäurebakterien der Lactobacillus helveticus-Stamm CM4 sind (Hinterlegungsnummer beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology; FERM BP-6060).
- Lactobacillus helveticus-Milchsäurebakterien nach Anspruch 1, wobei die Bakterien chromosomale DNA besitzen, welche ein DNA-Fragment von 15 bis 17 kb ergibt, wenn die chromosomale DNA mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI verdaut wird.
- Fermentiertes Milchprodukt, umfassend die Milchsäurebakterien nach Anspruch 1 und ein Tripeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro und Gemischen davon.
- Fermentiertes Milchprodukt nach Anspruch 4, weiterhin umfassend DL-Milchsäure, wobei das Produkt 30 bis 50 μg des Tripeptids in Form von Val-Pro-Pro pro 0.01 g der DL-Milchsäure enthält.
- Fermentiertes Milchprodukt nach Anspruch 4, wobei die Milchsäurebakterien nach Anspruch 1 lebend sind.
- Fermentiertes Milchprodukt nach Anspruch 4, wobei das fermentierte Milchprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Joghurt, sauren Milchgetränken, Käse, verarbeiteten Nahrungsmitteln, welche fermentierte Sauermilch enthalten, und gesunden Nahrungsmitteln, welche fermentierte Sauermilch enthalten.
- Verfahren zur Erzeugung des fermentierten Milchprodukts nach Anspruch 4, umfassend die Fermentation eines Mediums, welches ein Nährmaterial enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Peptid, einem Protein und Gemischen davon, einschließlich der Sequenz Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro, mit den Milchsäurebakterien nach Anspruch 1.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Nährmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tiermilch, Milch-Casein, Mais, Maisprotein, Weizen, Weizenprotein, Sojabohnen, Sojabohnenmilch, entfetteten Sojabohnen, Sojabohnenprotein und Gemischen davon.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Fermentation bei 25°C bis 50°C für 6 bis 60 Stunden durchgeführt wird.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Fermentation unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Menge der produzierten Tripeptide Val-Pro-Pro und Ile-Pro-Pro in der resultierenden fermentierten Milch 60 μg in Form von Val-Pro-Pro pro ml beträgt.
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