CZ20001082A3 - Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou s vysokou produktivitou tripeptidu, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby - Google Patents
Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou s vysokou produktivitou tripeptidu, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001082A3 CZ20001082A3 CZ20001082A CZ20001082A CZ20001082A3 CZ 20001082 A3 CZ20001082 A3 CZ 20001082A3 CZ 20001082 A CZ20001082 A CZ 20001082A CZ 20001082 A CZ20001082 A CZ 20001082A CZ 20001082 A3 CZ20001082 A3 CZ 20001082A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pro
- lactic acid
- milk
- fermented
- val
- Prior art date
Links
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 170
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 68
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 11
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 title abstract 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 56
- DOFAQXCYFQKSHT-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DOFAQXCYFQKSHT-SRVKXCTJSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 29
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 claims abstract description 22
- 108010015385 valyl-prolyl-proline Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 FQYQMFCIJNWDQZ-CYDGBPFRSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 claims description 81
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 claims description 42
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 27
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 27
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 claims description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 235000021262 sour milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 claims description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 claims description 3
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 3
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 3
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 claims description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 claims description 2
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N aldehydo-D-galactose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 claims 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011497 sour milk drink Nutrition 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 abstract description 5
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 abstract description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 4
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 20
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100026819 Inositol polyphosphate 1-phosphatase Human genes 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 10
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 10
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 2
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 2
- 235000021552 granulated sugar Nutrition 0.000 description 2
- 235000020252 horse milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011699 spontaneously hypertensive rat Methods 0.000 description 2
- ZJTVIMUHNBCZBP-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-benzamidoacetyl)amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CNC=N1 ZJTVIMUHNBCZBP-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- AAXWBCKQYLBQKY-IRXDYDNUSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[(2-benzamidoacetyl)amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CN=CN1 AAXWBCKQYLBQKY-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010070551 Meat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010016268 hippuryl-histidyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000008371 vanilla flavor Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 235000008924 yoghurt drink Nutrition 0.000 description 1
- 235000020125 yoghurt-based beverage Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
- A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
- A23C9/137—Thickening substances
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/147—Helveticus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Tento vynález se týká nových bakterií Lactobacillus helveticus produkujících kyselinu mléčnou, které kultivujíli se v mediu živočišného mléka, mohou vytvářet určitý tripeptid s vysokou účinností, a které mají vysokou extracelulární proteázovou aktivitu, fermentovaného mléčného výrobku obsahujícího bakterie produkující kyselinu mléčnou a způsobu výroby tohoto výrobku.
Dosavadní stav techniky
Lactobacillus helveticus se pro mléčné výrobky dlouho používá k výrobě fermentovaného mléka jako iniciátor bakterií produkujících kyselinu mléčnou. Lactobacillus helveticus má vysokou proteolytickou aktivitu, a zejména jeho vysoká aktivita extracelulární proteázy hraje důležitou roli při fermentaci živočišného mléka. To znamená, že extracelulární proteáza tráví proteiny živočišného mléka za vytvoření různých fragmentů peptidů. Vytvořené peptidy jsou dále podrobeny působení peptidáz, aby se vytvořily peptidy o nižší molekulové hmotnosti. Je známo, že část peptidů vytvořených v mediu je díky působení proteázových enzymů přijata buňkami bakterií produkujících kyselinu mléčnou a utilizována jako zdroj dusíku. Dále bylo publikováno, že některé z peptidů produkovaných v mediu mají inhibiční aktivitu k angiotenzin konvertujíčímu enzymu (ACE), který způsobuje hypertenzi /J. Dairy Sci., 78, 777-783 (1995)/.
Jako peptidy k inhibici aktivity ACE a potlačení zvýšení krevního tlaku byly publikovány různé účinné peptidy, jako například takové, které byly odvozeny od produktů degradace mléčných proteinů, sójových proteinů nebo proteinů rybího masa. Například Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro (zkrácené dále jako VPP a IPP, tyto peptidy jsou společně dále uvedeny jako laktotripeptidy) jsou známy jako peptidy s ACE inhibiční aktivitou přítomné v mléce fermentovaném Lactobacilius helveticus. Pokusy s použitím spontánně hypertenzních krys (SHR) potvrdily, že tyto laktotripeptidy mají silný hypotenzívní účinek /J 1257 (1995)/.
Avšak fermentované
Dairy Sci., 78, 1253mléko obsahující laktotripeptid produkovaný živočišným mlékem fermentovaným běžnými kmeny Lactobacilius helveticus se může těžko použít tak, jak je, neboť díky velkému množství kyseliny mléčné vytvořené v průběhu fermentace projevuje vysokou aciditu. Zředění fermentovaného mléka má za následek výrazné snížení obsahu laktotripeptidů.
Tudíž je žádoucí vyrobit fermentované mléko s vyšším obsahem laktotripeptidů v porovnání s obsahem kyseliny mléčné vytvořené ve fermentovaném mléce. Výrobky s funkcí laktotripeptidů by mohly být snadno připraveny a poskytnuty spotřebitelům v přijatelné formě k podávání přidáním malého množství takového framentovaného mléka k různým potravinám a nápojům. Avšak žádné ze známých kmenů bakterií produkujících kyselinu mléčnou nevytvářejí laktotripeptid s vysokou účinností.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je poskytnout nový kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou, který může vytvářet velké množství laktotripeptidu s vysokou účinností vzhledem k množství vytvořené kyseliny mléčné.
Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnout fermentovaný mléčný výrobek, kerý obsahuje laktotripeptid s takovými účinky, jako například hypotenzívním účinkem a očekávaným protistresovým účinkem, a kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou schopný vytvářet velké množství laktotripeptidu, a který se může přijatelně užívat v podobě potravin nebo nápojů, a způsob jeho přípravy.
Podle tohoto vynálezu se poskytují bakterie produkující kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus s těmito bakteriologickými vlastnostmi, přičemž kultivují-li se řečené bakterie v mediu živočišného mléka obsahujícího 9 % hmot. sušiny netučného mléka, vytvářejí tripeptidy Val-ProPro a Ile-Pro-Pro v množství ne menším než 60 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml media, a řečené bakterie projevují aktivitu etracelulární proteázy ne menší než 400 U/OD590:
morfologické vlastnosti
1. tvar buňky: tyčinka
2. pohyblivost: žádná
3. tvorba spor: žádná
4. gramovo barvení: pozitivní fyziologické vlastnosti
1. produkce katalázy: negativní
2. produkce indolu: negativní • 4 44
3. redukce nitrátu: negativní
4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentací bez tvorby plynů
6. degradace uhlovodíků
-glukóza: +
-laktóza: +
-mannóza: +
-fruktóza: +
-galaktóza: +
-sacharóza: -maltóza: -xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafinóza: -stachyóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin:
Podle tohoto vynálezu se také poskytují bakterie produkující kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus, kde řečenými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou je kmen Lactobacillus helveticus CM4 (uložen v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie 15.srpna 1997 pod číslem uložení FERM BP 6060) .
Podle tohoto vynálezu se dále poskytují bakterie produkující kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus
• · · · • 0· ♦ e · 0 0 0 • 00 0 • 0 0 0 chromozomální DNA při a EcoRI poskytuje DNA s chromozomální DNA, kdy řečená trávení restrikčními enzymy Pstl fragment o velikostí 15 až 17 kb.
Podle tohoto vynálezu se také poskytuje fermentovaný mléčný výrobek, který obsahuje fermentované mléko obsahující výše zmíněné bakterie produkující kyselinu mléčnou a tripeptid zvolený ze skupiny zahrnující Val-Pro-Pro, IlePro-Pro a jejich směsi.
Podle tohoto vynálezu se také poskytuje způsob výroby fermentovaného mléčného výrobku, který zahrnuje fermentaci media obsahujícího výživnou látku zvolenou ze skupiny zahrnující peptid, protein a jejich směsi, zahrnující sekvence Val-Pro-pro a Ile-Pro-Pro, bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou.
Stručný popis k obrázkům
Obrázek 1 je fotografie ukazující způsobem elektroforézy na agarózovém gelu fragmenty chromozomální DNA různých kmenů Lactobacillus helveticus z příkladu 2.
Upřednostňovaná ztělesnění vynálezu
Bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu patří k Lactobacillus helveticus, a vyznačují se tím, že bakterie produkující kyselinu mléčnou při kultivaci v mediu živočišného mléka obsahujícího 9 % hmot. sušiny netučného mléka vytvářejí trípeptidy Val-Pro-Pro a Ile-ProPro v množství ne menším než 60 pg, a výhodně ne menším než 70 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml media, a projevují aktivitu extracelulární proteázy ne nižší než 400 U/OD590, a
• · · výhodně ne nižší než 430 U/OD590 . Produktivita definovaného laktotripeptidu je ukazatelem k rozlišení těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou od běžných bakterií produkujících kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus. Tímto ukazatelem se například definuje vlastnost těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou vytvářet při kultivaci v mediu živočišného mléka obsahujícím 9 % hmot. sušiny netučného mléka laktotripeptidy v množství ne menším než 60 pg ve smyslu obsahu VPP na ml media, která se nemohla uskutečnit běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou. Obvykle se snížením obsahu sušiny netučného mléka v mediu pro kutivaci vytvoří menší množství laktotripeptidu. Zvýšením obsahu sušiny netučného mléka se vytvoří větší množství laktotripeptidu.
Produktivita laktotripeptidu jako ukazatel se měří kroky inokulace živočišného mléka, jako například kravského mléka, kozího mléka, koňského mléka a z nich odstředěného mléka obsahujícího 9 % hmot. sušiny netučného mléka, bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou, kultivace těchto bakterií k přípravě fermentovaného mléka 24 h při teplotě 37 °C, odstřeďován! 1 ml fermentovaného mléka při frekvenci otáček 15 000 za min po dobu 10 min, podrobení supernatantu měření množství VPP a IPP a převedení těchto množství na množství VPP. Protože ACE inhibiční aktivita IPP na jednotku hmotnosti je l,7násobná než VPP, vypočítá se převedené množství laktotripeptidu ve smyslu obsahu VPP tímto vztahem:
převedené množství laktotripeptidu (pg ve smyslu obsahu VPP na ml) - množství IPP (pg/ml) x 1,7 + množství VPP (pg/ml)
Maximální produktivita laktotripeptidu není zvláště omezena, ale může být dosažena, jestliže všechny ze sekvencí Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro začleněné v proteinu media se • · · · · · • · · · · · · ·· ··· · · · · ··· ···· ··· ·· ·· ·· trávením odštěpí jako tripeptidy.
Aktivita extracelulární proteázy se měří způsobem podle Yamamoto a kol. /Yamamoto N. a kol., J. Biochem., 114,
740 (1993)/ založeném na způsobu podle Twininga a kol. /Twining S., Anal. Biochem., 143, 3410 (1984)/ a vyjádří se definováním, že množství enzymu projevující 1% intenzitu fluorescence má aktivitu 1 U/OD590 . Výše uvedený limit aktivity extracelulární proteázy také není omezen, ale obvykle je 800 U/OD590 .
Tyto bakterie produkující kyselinu mléčnou mohou vytvářet velké množství laktotripeptidu vzhledem k množství kyseliny mléčné vytvořené během fermentace. Tudíž fermentace s použitím těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou má za následek fermentované mléko obsahující větší množství laktotripeptidu v porovnání s fermentovaným mlékem obsahujícím podobné množství kyseliny mléčné vytvořeným běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou.
V důsledku takové fermentace je tato kyselina mléčná kyselina DL-mléčná. Výhodně množství laktotripeptidu produkovaného fermentací těmito bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou není nižší než 30 pg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml výsledného fermentovaného mléka obsahujícího 0,01 g/ml kyseliny DL-mléčné vytvořené během fermentace. Horní limitní množství laktotripeptidu není zvláště omezeno, ale tyto bakterie jsou schopny vytvářet až přibližně 50 pg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml fermentovaného mléka obsahujícího 0,01 g kyseliny DL-mléčné. Množství kyseliny DL-mléčné je přibližně úměrné množství laktotripeptidu. Tudíž jestliže se v fermentovaném mléce vytvoří například 0,02 g kyseliny DL-mléčné, množství vytvořeného laktotripeptidu výhodně není menší než 60 pg, ve smyslu obsahu VPP. Naproti tomu fermentací běžnými bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou je množství laktotripeptidu • ·· · · ·· · · · · · ϊ • · · · · · i • · ··· ·· · • · · · · · * ··· ·· ·· ·· (maximálně) nižší než 30 pg ve smyslu obsahu VPP na 0,01 g kyseliny DL-mléčné v 1 ml fermentovaného mléka.
Příkladem těchto bakterií produkujících kyselinu mléčnou je kmen Lactobacillus helveticus CM4, který je uložen jako FERM BP-6060 v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie (uložen 15.srpna 1997). Kmen Lactobacillus helveticus CM4 má tyto biologické vlastnosti:
morfologické vlastnosti:
1. tvar buňky: tyčinka
2. pohyblivost: žádná
3. tvorba spor: žádná
4. gramovo barvení: positivní fyziologické vlastnosti
1. produkce katalázy: negativní
2. produkce indolu: negativní
3. redukce nitrátu: negativní
4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentací bez tvorby plynů
6. degradace uhlovodíků
-glukóza: +
-laktóza: +
-mannóza: +
-fruktóza: +
-galaktóza: +
-sacharóza: -maltóza: • »· ·· ·· ·· · · · · · « • · · » · · « » · »·· ·· · • · · · · · · ··· *· ·· ··
-xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafinóza: -stachyóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin: Jestliže se hodnotí způsobem podle Mitsuoka a kol. /Rinshoukensa 18, 1163 (1974)/, jsou výše uvedené bakteriologické vlastnosti kmene CM4 stejné, jako veřejně známého kmene Lactobacillus helveticus NCDO-099. Nicméně podle těchto vlastností, které Mitsuoka a kol. nepopsal, se kmen CM4 jasně odlišuje od kmene NCDO-099:
7. aktivita extracelulární proteázy: ne méně než
400 U/OD590
8. produktivita laktotripeptidu, tvorba dvou druhů tripeptidů (VPP a IPP) v množství 60 pg nebo vyšším ve smyslu obsahu VPP na 1 ml fermentované tekutiny při kultivaci v mediu obsahujícím 9 % hmot. odstředěného mléka 24 h při teplotě 37 °C.
Produktivita laktotripeptidu v bodě 8. se měří s použitím odstředěného mléka jako sušiny netužného mléka.
Kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu se může získat tímto screeningem a měřením aktivity extracelulární proteázy.
• · • » • ·
1. Primární screening
Selekce kmene měřením výše ACE inhibiční aktivity ve fermentovaném mléce »· • · • ····
Kmeny pro screening se při teplotě 37 ’C 24 h kultivují v mediu s obsahem 9 % hmot. odstředěného mléka. Po skončení kultivace se měří počet bakterií produkujících kyselinu mléčnou, acidita kyseliny mléčné a ACE inhibiční aktivita. Vyberou se kmeny bakterií produkujících kyselinu mléčnou produkující 1 χ 108 buněk/ml nebo více a projevující aciditu kyseliny mléčné 1,6 % hmot. nebo více a ACE inhibiční aktivitu 40 U/ml. ACE inhibiční aktivita se měří způsobem podle Cushmana a Cheunga /Cushman D.W. a Cheung H.S., Pharmacol., 20, 1637 (1971)/.
2. Sekundární screening
Selekce kmene s vysokou produktivitou laktotripeptidu
Kultivované tekutiny kmenů vybraných primárním screeningem se 10 min odstřeďují při frekvenci otáček 15 000 za min a jejich supernatanty se podrobí HPLC ke kvantifikaci laktotripeptidu. Vyberou se kmeny, které vytvořily ne méně než 50 pg ve smyslu obsahu VPP na 1 ml.
3. Měření aktivity extracelulární proteázy
Každý z kmenů vybraných sekundárním screeningem se kultivuje v mediu obsahujícím 9 % hmot. odstředěného mléka, přičemž jeho pH se udržuje na hodnotě 6. Vzorek se odebere uprostřed logaritmické fáze růstu a smísí se s 1 % hmot. citrátu sodného odstřeďuje se 10 min při frekvenci otáček 15 000 za min ke získání buněk. Získané buňky se promyjí 50mM kyselinou β-glycerolfosforečnou a suspendují v 50mM
Tris-HCl pufru (pH = 7,8), aby se turbidita (OD590) upravila na hodnotu 1. Potom se měří aktivita proteázy na buněčném povrchu. Bude ověřeno, že výsledek je korelativní s produktivitou laktotripeptidu kmenů měřených sekundárním screeningem.
Kmen bakterií produkujících kyselinu mléčnou Lactobacillus helveticus vybraný výše uvedeným způsobem se může identifikovat a rozlišit od ostatních kmenů bakterií produkuj icich produktivitou proteázy.
Bakterie kyselinu mléčnou například tripeptidu a aktivitou výše uvedenou extracelulární produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu mají výhodně vedle výše uvedené produktivity laktotripeptidu a aktivity extracelulární proteázy chromozomální DNA, a tato chromozomální DNA, je-li trávena restríkčními enzymy Pstl a EcoRI, poskytuje fragment DNA o velikosti 15 až 17 kb. Tudíž mohou být bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu jasně odlišeny od jiných kmenů stejného druhu zkoušením, zda tento kmen má chromozomální DNA, která poskytuje takový fragment DNA.
Existence fragmentu DNA o velikosti 15 až 17 kb může být potvrzena extrakcí chromozomální DNA z bakterií produkujících kyselinu mléčnou způsobem podle Leenhoutse a kol. /Leenhouts K., Appl. Environ. Microbiol., 56, 2726 (1990)/, trávením chromozomální DNA Ecol a Pstl, provedením elektroforézy odštěpených fragmentů na 0,8% agarózovém gelu a analýzou výsledku elektroforézy. Po provedení elektroforézy se přítomnost DNA fragmentu jasně potvrdí tak, že se jako ukazatel velikosti podrobí λ fágová DNA trávená restrikčním enzymem Hind III paralelní elektroforéze.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje jako nepostradatelnou složku fermentované mléko φ φ φφ • · *
φφφ
obsahující bakterie produkující kyselinu mléčnou a tripeptid zvolený ze skupiny zahrnující VPP, IPP a jejich směsi. To znamená, že fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje fermentované mléko obsahující laktotripeptid a bakterie produkující kyselinu mléčnou a připraví se fermentací media obsahujícího výživnou látku složenou z peptidu a/nebo proteinů, které zahrnují sekvenci VPP a/nebo IPP bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu. Tudíž se mohou obsahy bakterií produkujících kyselinu mléčnou a tripeptídu vhodně zvolit v závislosti na druhu připravovaného fermentovaného mléčného výrobku. Tento fermentovaný mléčný výrobek může obsahovat získaný fermentovaný výrobek samotný, nebo čištěný fermentovaný výrobek.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje kyselinu DL-mléčnou vytvořenou během fermentace. Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu výhodně obsahuje laktotripeptid v množství 30 až 50 pg ve smyslu obsahu VPP vzhledem k 0,01 g kyseliny DL-mléčné. Množství kyseliny DL-mléčné je přibližně úměrné množství laktotripeptidu. Tudíž jestliže fermentovaný mléčný výrobek obsahuje koncentrované fermentované mléko a obsahuje např. 0,02 g kyseliny DL-mléčné, množství laktotripeptidu je výhodně v rozmezí 60 až 100 pg ve smyslu obsahu VPP. Jestliže fermentovaný mléčný výrobek obsahuje zředěné fermentované mléko a obsahuje např. 0,005 g kyseliny DLmléčné, množství laktotripeptidu je výhodně v rozmezí 15 až 25 pg ve smyslu obsahu VPP. Ačkoliv může fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahovat kyselinu L-mléčnou, která je potravinovým doplňkem k úpravě acidity, je tato kyselina L-mléčná odlišná od kyseliny DL-mléčné vytvořené během fermentace.
Bakterie produkující kyselinu mléčnou ve fermentovaném • · α
”· ·· · mléčném výrobku podle tohoto vynálezu se mohou buďto sterilizovat po fermentaci, nebo udržovat živé bez sterilizace.
Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může být jogurt, zakysané nápoje obsahující mléko, sýr, připravené potraviny obsahující fermentované kyselé mléko a zdraví prospěšné potraviny obsahující fermentované kyselé mléko. Tudíž fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může obsahovat vedle fermentovaného mléka jako nepostradatelné složky různé látky, které se obvykle přidávají k výrobě takové škály výrobků. Fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu může být ve formě pevné, jako například prášků, granulátů a tablet, nebo tekuté, jako například pasty, gelu a kapaliny.
Způsob výroby fermentovaného mléčného výrobku podle tohoto vynálezu zahrnuje fermentaci media obsahujícího výživnou látku zvolenou ze skupiny, která zahrnuje peptid, protein a jejich směsi obsahující jako součást své sekvence Val-Pro-Pro a/nebo Ile-Pro-Pro, bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou.
Výživná látka v mediu může být některého z typů podle toho, jak dlouhé obsahuje peptidy a/nebo proteiny, které jako součást své sekvence obsahují VPP a/nebo IPP. Výživou látkou může být například živočišné mléko, mléčný kasein, kukuřice, kukuřičný protein, pšenice, pšeničný protein, sójové boby, sójové mléko, odtučněné sójové boby, sójový protein nebo jejich směsi. Zvláště je výhodné použít výživnou látku obsahující živočišné mléko, jako například kravské mléko, kozí mléko, koňské mléko, nebo z nich odstředěná mléka. Obsah sušiny netučného mléka v živočišném mléce není zvláště omezen, ale obvykle je v rozmezí 5 až 20 % hmot.
Není žádné zvláštní omezení množství bakterií • ·
• · produkujících kyselinu mléčnou, kterými se medium inokuluje. Množství k inokulaci je obvykle přibližně 105 až 107 buněk bakterií produkujících kyselinu mléčnou na 1 g výše uvedené určité výživné látky v mediu.
Fermentace se může provádět při teplotě v rozmezí 25 až 50 °C, a výhodně při teplotě v rozmezí 30 až 45 'C po dobu 6 až 30 h, a výhodně po dobu 10 až 24 h, v rozmezí hodnot pH výhodně 3,0 až 4,0, a výhodněji v rozmezí 3,0 až 3,5.
Fermentace se výhodně provede tak, že množství laktotripeptidů není menší než 60 pg ve smyslu obsahu VPP na ml výsledného fermentovaného mléka. Zejména jestliže se jako medium použije kravské mléko obsahující 9 % hmot. sušiny netučného mléka, má fermentace při teplotě 25 až 40 ’C po dobu 12 až 48 h za následek fermentované mléko obsahující laktotripeptid v množství ne menším než 70 pg, ve smyslu obsahu VPP na ml. Obsah sušiny netučného mléka v mediu je přibližně úměrný vytvořenému laktotripeptidů. Například obsahuje-li výživná látka 5 % hmot. sušiny netučného mléka, fermentace podle výše uvedených podmínek by měla mít za následek produkci laktotripeptidů v množství přibližně 33,3 pg ve smyslu VPP obsahu na ml.
Fermentované mléko získané výše uvedenou fermentací se může smísit s výrobkem tak, jak je. Je-li to nutné, může se fermentované mléko před smísením podrobit ředění nebo čištění. Fermentované mléko se může ochladit a skladovat při teplotě 5 °C, a potom smísit s ostatními složkami, aby se připravil výrobek, jako například mražený výrobek. Alternativně se může fermentované mléko podrobit tepelné sterilizaci a je-li to nutné, práškovat sušením rozprašováním, aby se připravil výrobek k distribuci při teplotě místnosti.
Protože fermentovaný mléčný výrobek podle tohoto vynálezu obsahuje fermentované mléko získané fermentací ♦ · « * φ
• r
bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou, může se použít ke snadné přípravě výrobků s vysokým obsahem laktotripeptidu vzhledem k obsahu kyseliny mléčné v přijatelné formě k podávání. Očekává se, že podává-li se člověku fermentovaný mléčný výrobek, projeví se hypotenzívní účinek a protistresový účinek laktotripeptidu.
Protože bakterie produkující kyselinu mléčnou podle tohoto vynálezu mohou svou kultivací v určité výživné látce vytvářet velké množství laktotripeptidu, jsou bakterie a látky z nich užitečné k výrobě široké škály fermentovaných mléčných výrobků, funkčních potravin, zdraví prospěšných potravin, potravin pro určené zdravotní použití, potravin pro určené použití staršími lidi, s hypotenzívním účinkem a stres zmírňujícím účinkem laktotripeptidu.
Příklady provedení vynálezu
Tento vynález bude podrobněji popsán dále s odkazem na příklady, ale tento vynález se na ně neomezuje.
Mezi kmeny v příkladech, je biologických věd
Lactobacillus helveticus použitými kmen CM4 uložen v Národním institutu a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie a bylo mu uděleno přírůstkové číslo FERM BP-6060. Veřejně dostupné kmeny jsou ATCC15009, NCDO-099, JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 a
JCM1004. Jiné kmeny, než výše uvedené kmeny použité v příkladech jsou zvoleny ze sbírky kmenů přihlašovatele.
PŘÍKLAD 1
Selekce kmenů poskytujících fermentované mléko s vysokou ACE inhibiční aktivitou ·» ··
I # · » · · • · > ·
Lactobacillus helveticus inhibični
Screenovalo se 36 kmenů izolovaných z různých mléčných výrobků. ACE aktivita mléka fermentovaného každým z kmenů se měřila tímto způsobem. Každý z kmenů Lactobacillus helveticus se kultivoval při teplotě 37 °C po dobu 24 h v mediu s 9 % hmot. sušiny netučného mléka. Kultivační medium se přidalo do čerstvého media stejného typu v takovém množství, aby nové medium obsahovalo 3 % hmot. kultivačního media.
Fermentace dále probíhala 24 h při teplotě 37 °C. Po ukončení fermentace se měřila acidita kyseliny mléčné (% hmot.), množství peptidu v syrovátce (mg/ml), počet buněk a ACE inhibični aktivita (U/ml). Výsledky ukazuje tabulka 1. 7 kmenů z 36 kmenů mělo velmi slabou schopnost fermentace. 15 kmenů vytvořilo fermentované mléko s aciditou vytvořené kyseliny mléčné ne menší než 1,6 % hmot. Z 15 kmenů bylo vybráno 8 kmenů s ACE inhibični aktivitou ne menší než 40 U/ml syrovátky ve svém fermentovaném mléce.
Měření ACE inhibični aktivity fermentovaného mléka
ACE
Cushmana
Pharmacol inhibični aktivita se měřila způsobem podle
S., každé
Cheunga /Cushman D. W. a Cheung H 20, 1637 (1971)/. To znamená, že fermentované mléko se odstřeďovalo při frekvenci otáček 15 000 za min po dobu 5 min, aby se dostal supernatant (syrovátka). Syrovátka se k měření vhodně zředila. Do zkumavky se vpravilo 80 μΐ zředěné syrovátky, smísilo se s 0,2 ml 0,lM kyseliny borité jako pufru (obsahujícího 0,3 M NaCI, pH = 7,3) obsahujícím jako substrát 5 mM hippurylhistidinleucinu (Hip-His-Leu, vyrobený společností Sigma Chemicals Co.), a dále se smísilo s 20 μΐ roztoku enzymu (0,1 U/ml, vyrobený společností Sigma Chemicals Co.). Výsledná směs se nechala reagovat 30 min při teplotě 37 C a • ♦ potom se k ukončení reakce smísila s 250 μΐ IN kyseliny chlorovodíkové. Následně se směs smísila s 1,7 ml ethylacetátu, 20 s mísila a potom odstřeďovala 10 min při frekvenci otáček 3 000 za min, aby se znovu získalo 1,4 ml ethylacetátové fáze (vrchní fáze). Vrchní fáze se zahřívala 40 min při teplotě 120 °C, aby se odstranilo rozpouštědlo, smísila se s 1 ml destilované vody a mísila přibližně 20 s. U extrahované kyseliny hippurové se měřila absorbance při 228 nm. Aktivita enzymu v jednotkách se vypočítala podle dále uvedeného vztahu s tím, že jako jedna jednotka se definuje množství, které poskytne 50% inhibici ACE aktivity.
množství enzymu (jednotka) = (A-B)/(A-C) x 100 x 1/50 kde
A představuje absorbanci při 228 nm bez vzorku,
B představuje absorbanci při 228 nm se vzorkem a
C představuje absorbanci při 228 nm jak bez enzymu, tak bez vzorku.
Kvantitativní analýza množství peptidu ve fermentovaném ‘ mléce
Kvantitativní analýza peptidu se uskutečnila způsobem OPA /Charch F. C. a kol., J. Dairy Sci., 66, 1219 (1883)/.
Jako standardní látka k vytvoření kalibrační křivky se použil kasein trávený trypsinem.
• tf tftf » ♦ · » tftf tf · · . · · • tf »· · ·
Tabulka 1
| Kmeny | Acidita (% hmot.) | Množství peptidů (mg/ml) | Počet buněk (χ 108 buněk/ml) | ACE inhibiční aktivita (U/ml) |
| Kmen 1 | - | - | - | - |
| Kmen 2 | - | - | - | - |
| Kmen 3 | - | - | - | - |
| Kmen 4 | - | - | - | - |
| Kmen 5 | - | - | - | - |
| Kmen 6 | - | - | - | - |
| Kmen 7 | - | - | - | |
| Kmen 8 | 0,498 | 1,59 | 0,29 | 26,4 |
| Kmen 9 | 2,022 | 1, 99 | 9, 53 | 34 , 5 |
| Kmen 10 | 1,709 | 2,10 | 8,53 | 24,5 |
| Kmen 11 | 0, 615 | 1,76 | 1,28 | 29, 1 |
| Kmen 12 | 0,411 | 1,35 | 0, 38 | 17 , 6 |
| Kmen 13 | 0, 917 | 1,57 | 3, 63 | 19,9 |
| Kmen 14 | 1, 026 | 1, 71 | 5, 78 | 9, 4 |
| Kmen 15 | 0, 517 | 1,59 | 0, 56 | 26, 9 |
| Kmen 16 | 1,532 | 4, 69 | 5, 97 | 102, 5 |
| Kmen 17 | 2,101 | 2,01 | 6, 09 | 98,9 |
| Kmen 18 | 1,783 | 1, 94 | 5,38 | 21,9 |
| Kmen 19 | 1, 955 | 1,69 | 5,31 | 100, 6 |
| Kmen 20 | 2,095 | 1,74 | 7,16 | 61,4 |
| Kmen 21 | 1,963 | 2,03 | 6, 05 | 125, 3 |
| Kmen 22 | 1,798 | 2,85 | 6, 19 | 54,2 |
| Kmen 23 | 1,604 | 2,32 | 6,81 | 36,6 |
| Kmen 24 | 1, 932 | 1,77 | 7,97 | 47,7 |
| Kmen 25 | 1,885 | 1,51 | 4, 91 | 18, 3 |
| Kmen 2 6 | 1,862 | 1,46 | 5, 69 | 26,2 |
• * • 44«
Tabulka 1-pokračování
| Kmeny | Acidita (% hmot.) | Množství peptidů (mg/ml) | Počet buněk (x 10e buněk/ml) | ACE inhibični aktivita (U/ml) |
| Kmen 27 | 1,063 | 3, 01 | 2,78 | 76,9 |
| Kmen 28 | 0, 457 | 1, 98 | 0, 50 | 52,4 |
| Kmen 29 | 0,516 | 2,55 | 1, 13 | 92,6 |
| JCM1006 | 1, 872 | 2, 35 | 6, 97 | 48,5 |
| JCM1062 | 1,109 | 2, 60 | 8,50 | 78, 4 |
| JCM1103 | 1,244 | 1,36 | 3, 69 | 31,0 |
| ATCC10797 | 1,359 | 2, 11 | 8,56 | 13,8 |
| ATCC15009 | 1,454 | 1,81 | 5,16 | 16, 6 |
| NCDO-099 | 1,769 | 2,76 | 6, 59 | 25,5 |
| CM4 | 1, 635 | 3, 12 | 4,44 | 130, 0 |
Selekce kmenů s vysokou produktivitou laktotripeptidu
Následně se u 8 výše vybraných kmenů s vysokou ACE inhibični aktivitou, které poskytly fermentované mléko, měřil obsah VPP a IPP v jimi fermentovaném mléce.
ml fermentovaného mléka se odstřeďoval 10 min při frekvenci otáček 15 000 za min. Nashromáždil se jeho supernatant, to znamená syrovátka. 0,3 ml syrovátky se podrobilo adsorpci na Sep-Pak Cartridge (vyrobeno Waters lne.), promyla se destilovanou vodou a potom eluovala 5 ml methanolu. Eluát se vysušil odstřeďovánim a za sníženého tlaku. Vysušený produkt se rozpustil v 0,3 ml 0,05% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové, a podrobil HPLC analýze (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) za těchto podmínek: Výsledky ukazuje tabulka 2.
Použitý přístroj:
• 9 • *9 « 9 ·· « ♦ « ·
Hitachi L4000 UV detektor (při 215 nm) programovatelná pumpa L6200 vyhřívaná kolona L5030 (35 ”C)
Podmínky eluce: rychlost proudění 0,5 ml/min
Eluent: vodný roztok obsahující 0,3M NaCI a 0,05% kyselinu trifluoroctovou
Kolona: Asahipak GS320 (Φ 3,9 x 600 mm)
Protože ACE inhibiční aktivita IPP na jednotku hmotnosti je l,7násobná než VPP, vypočítal se obsah laktotripeptidu ve smyslu obsahu VPP z měřených množství IPP a VPP podle dále uvedeného vztahu.
Výsledky ukazuje tabulka 2.
převedené množství laktotripeptidu (pg ve smyslu obsahu VPP na ml) = množství IPP (pg/ml) x 1,7 + množství VPP (pg/ml)
Tabulka 2
| Kmeny | Množství peptidu pg/ml syrovátky | Acidita (% hmot.) | ||
| VPP | IPP | Množství laktotripeptidu ve smyslu obsahu VPP | ||
| Kmen 17 | 15,2 | 11, 1 | 34,0 | 1,5 |
| Kmen 19 | 11,2 | 7,3 | 23,7 | 1,4 |
| Kmen 20 | 13,0 | 8,1 | 26, 8 | 1,6 |
| kmen 21 | 16,6 | 11,4 | 36, 0 | 1,6 |
| kmen 22 | 15,8 | 12,1 | 36, 3 | 1,5 |
| kmen 24 | 12,6 | 8,7 | 27,4 | 1,6 |
| JCM1006 | 12, 9 | 9,3 | 28,6 | 1,3 |
| CM 4 | 38,5 | 23,5 | 78,5 | 1,9 |
Mléko fermentované kmenem CM4 obsahovalo největší množství laktotripeptidu ve smyslu obsahu VPP, to znamená
78,5 pg/ml syrovátky. Ostatních sedm kmenů poskytlo průměrné množství 34,2 pg/ml syrovátky.
Měření aktivity extracelulární proteázy
Aktivita extracelulární proteázy se měřila u 16 kmenů, které poskytly relativně dobré výsledky schopnosti fermentace ukázané v tabulce 1. Měřeni se provádělo způsobem podle Yamamoto a kol. /Yamamoto N. a kol., J. Biochem. 114, 740 (1993)/, založeného na způsobu Twininga a kol. /Twining S., Anal. Biochem. 143, 3410 (1984)/. To znamená, že každý kmen se kultivival v mediu s obsahem 9 % hmot. sušiny mléka, jehož pH se udržovalo na hodnotě 6,0. Vzorek se odebral uprostřed logaritmické fáze růstu a k vyjasnění mléčného media se smísil s citrátem sodným tak, že konečná koncentrace byla 1 % hmot. Směs se odstřeďovala 10 min při frekvenci otáček 5 000 za min, aby se shromáždily buňky. Buňky se promyly 50mM roztokem kyseliny β-glycerolfosforečné a suspendovaly v 50mM Tris-HCl pufru (s hodnotou pH = 7,8), aby se upravila turbidita (OD590, to znamená, že se měřila absorbance při 590 nm) na hodnotu 1. 30 pl suspenze se smísilo s 20 pl 0,4% fluorescein-kaseinu (vyroben společností Sigma Chemicals Co.) a inkubovalo se 1 h při teplotě 42 °C. Směs se dále smísila se 120 pl 5% roztoku kyseliny trichloroctové, nechala se 20 min stát a 10 min se odstřeďovala při frekvenci otáček 15 000 za min. 60 pl supernatantu se přidalo ke 3 ml 500mM Tris-HCl pufru (s hodnotou pH = 8,3) a měřila se jeho intenzita fluorescence detekcí fluorescence při 525 nm vytvořené při excitační vlnové délce 490 nm. Vypočítala se aktivita extracelulární proteázy v jednotce s tím, že jedna jednotka se definuje jako množství enzymu, které za výše uvedených podmínek projevuje 1% intenzitu fluorescence. Výsledky ukazuje tabulka 3.
Tabulka 3
| Kmeny | u/od590 |
| kmen 17 | 136,7 |
| Kmen 18 | 102,8 |
| kmen 19 | 103,2 |
| kmen 20 | 89, 9 |
| kmen 21 | 80,1 |
| kmen 22 | 243,3 |
| kmen 23 | 116, 6 |
| kmen 24 | 116, 6 |
| kmen 2 5 | 192,6 |
| kmen 2 6 | 108,4 |
| JCM1006 | 185,7 |
| JCM1062 | 96, 5 |
| JCM1103 | 176, 3 |
| ATCC15009 | 168,1 |
| ATCC10797 | 106, 5 |
| NCDO-099 | 229,7 |
| CM4 | 452, 6 |
Aktivita kmene CM4 Lactobacillus helveticus byla nejvyšší, to znamená 450 U/OD590 . Průměrná aktivita ostatních 16 kmenů byla 141 U/OD590, která je přibližně třetinou aktivity kmene CM4.
► φφ « • ♦ · ♦ • φ · · φφφ · · φ φ · ·
PŘÍKLAD 2
Ζ 11 kmenů vybraných v příkladu 1 ze 3 6 kmenů Lactobacillus helveticus se extrahovala chromozomální DNA způsobem podle Leenhoutse a kol. /Leenhouts K., Appl. Environ. Microbiol. 56, 2726 (1990)/, byla trávena různými restrikčními enzymy a podrobila se elektroforéze v 0,8% agarózovém gelu k analýze způsobem elektroforézy.
Jako výsledek byl mezi fragmenty DNA chromozomu kmene CM4 pozorován charakteristický fragment trávený EcoRI a Pstl (ukazuje šipka 1 v obr. 1). Takový fragment u fragmentů chromozomů jiných kmenů než CM4 nebyl pozorován, a u většiny jiných kmenů byly pozorovány kratší fragmenty než charakteristický fragment kmene CM4 (ukazuje šipka 2 v obr. 1). Molekulová hmotnost charakteristického fragmentu se měřila srovnávací elektroforézou tak, že ukazateli velikosti byly produkty λ fágové DNA trávené Hind III (23,1 kb, 9,4 kb, 6,6 kb, 4,4 kb, 2,3 kb a 2,0 kb ve smyslu rostoucí pohyblivosti) a byla nalezena přibližně 16 kb. Tudíž bylo ověřeno, že kmen CM4 má chromozomální DNA, která trávením EcoRI a Pstl poskytuje DNA fragment s molekulovou hmotností asi 16 kb. Také bylo ověřeno, že jiné kmeny než CM4 mají chromozomální DNA, která poskytuje běžný fragment DNA s molekulovou hmotností okolo 13 kb.
PŘÍKLAD 3
Fermentované mléko bylo vytvořeno kmenem CM4 Lactobacillus helveticus vybraným v příkladu 1. Kmen CM4 se kultivoval 12 h při teplotě 37 °C ve 100 g 9% hmot. odstředěného mléka. Následně se 3 kg čerstvého media inokulovaly kultivovaným odstředěným mlékem a kultivovaly h při teplotě 37 ’C. Po ukončení fermentace se všechno fermentované mléko (počet buněk kmene CM4:
6,3 χ 108 buněk/ml) použilo jako iniciátor fermentace 100 kg 9% hmot. odstředěného mléka po dobu 20 h při teplotě 32 C. Po ukončení fermentace bylo ve fermentovaném mléce obsaženo 74,8 pg/ml laktotripeptidu. Obsah kyseliny mléčné byl 1,9 % hmot.
kg získaného fermentovaného mléka se smísilo se 4 kg krystalového cukru, 3 kg vody a 0,15 kg silného
V methoxypektinu a homogenizovalo se, aby se dostalo 50 kg jogurtového nápoje. Jogurtový nápoj měl výhodnou jemnou chuť, hodnotu pH = 3,6 a obsahoval živé buňky kmene CM4 v množství 4,6 χ 108 buněk/g.
PŘÍKLAD 4
26,5 kg fermentovaného mléka získaného v příkladu 3 se smísilo se 45,0 kg krystalového cukru, 4,7 kg silného maltózového sirupu a 13,8 kg vody. 10 kg 3 % hmot. silného roztoku methoxypektinu se za míšení přidalo ke směsi. Výsledná směs se homogenizovala použitím laboratorního homogenizátoru (vyroben ATV Gaulin, lne., model 15M-8BA) za • podrobení tlaku 150 kg/cm2 a rychlosti proudění 2500 ml/min.
jí Homogenizovaná tekutina se smísila s vanilkovou příchutí a sterilizovala zahřátím na 85 C. Tímto způsobem sterilizované fermentované mléko se za horka nalilo do 200ml skleněných lahví. Zjišťoval se obsah laktotripeptidu ve sterilizovaném fermentovaném mléčném výrobku. Bylo nalezeno, že obsah laktotripeptidu odpovídal takovému, jaký byl ve fermentovaném mléce před sterilizací. Také bylo nalezeno, že obsah kyseliny mléčné byl 0,5 % hmot.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou mající dále uvedené bakteriologické vlastnosti, přičemž tyto bakterie, kultivují-li se v mediu živočišného a mléka obsahujícího 9 % hmot. sušiny netučného mléka . vytvářejí tripeptidy Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro v množství ne ’ menším než 60 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml media a tyto bakterie projevují aktivitu extracelulární proteázy ne menší než 400 U/OD590:*· morfologické vlastnosti:1. tvar buňky: tyčinka
- 2. pohyblivost: žádná
- 3. tvorba spór: žádná
- 4. gramovo barvení: positivní fyziologické vlastnosti1. produkce katalázy: negativní2. produkce indolu: negativní3. redukce nitrátu: negativní4. aerobní růst: fakultativně anaerobní
- 5. tvorba DL-kyseliny mléčné z glukózy homolaktickou fermentaci bez tvorby plynů
- 6. degradace uhlovodíků-glukóza: +-laktóza: +-mannóza: +-fruktóza: + r-galaktóza: +-sacharóza: -maltóza: -xylóza: -rhamnóza: -cellobióza: -trehalóza: -melibióza: -rafinóza: -stachýóza: -mannitol: -sorbitol: -eskulin: -salicin: -.2. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1, kde uvedené bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou jsou z kmene CM4, uloženého v Národním institutu biologických věd a Agentuře pro humánní technologie průmyslových věd a technologie pod přírůstkovým číslem FERM BP-6060.3. Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1, kde uvedené bakterie produkující kyselinu mléčnou mají chromozomální DNA, která je-li trávena restrikčními enzymy Pstl a EcoRI, poskytuje fragment DNA o velikosti 15 až 17 kb.4. Fermentovaný mléčný výrobek, vyznačující se tím, že obsahuje bakterie produkující kyselinu mléčnou podle nárokuI2/R# .• · • ····1 a tripeptid zvolený ze skupiny zahrnující Val-Pro-Pro,Ile-Pro-Pro a jejich směsi.5. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že dále obsahuje kyselinu DL-mléčnou, kdy tento výrobek obsahuje 30 až 50 pg řečeného tripeptidu ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na 0,01 g uvedené kyseliny DL-mléčné.6. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že bakterie produkující kyselinu mléčnou podle nároku 1 jsou živé.
- 7. Fermentovaný mléčný výrobek podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedený fermentovaný mléčný výrobek je zvolený ze skupiny zahrnující jogurt, zakysané mléčné nápoje, sýr, upravené potraviny obsahující fermentované kyselé mléko a zdraví prospěšné potraviny obsahující fermentované kyselé mléko.
- 8. Způsob výroby fermentovaného mléčného výrobku podle nároku 4, vyznačující se tím, že zahrnuje fermentací media bakteriemi produkujícími kyselinu mléčnou podle nároku 1, které obsahuje výživnou látku zvolenou ze skupiny zahrnující peptid, protein a jejich směsi obsahující sekvence Val-ProPro a Ile-Pro-Pro.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená výživná látka je zvolena ze skupiny zahrnující živočišné • 4 • · · • 444 *·♦ ·· mléko, mléčný kasein, kukuřici, kukuřičný protein, pšenici, pšeničný protein, sójové boby, sójové mléko, odtučněné sójové boby, sójový protein a jejich směsi.* feI f
- 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že fermentace se provádí 6 až 60 h při teplotě 25 až 50 'C.
- 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že fermentace se provádí za podmínek, kdy množství tripeptidů Val-Pro-Pro a Ile-Pro-Pro vytvořené ve vytvořeném fementovaném mléce je 60 pg ve smyslu obsahu Val-Pro-Pro na ml.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9277949A JP3028411B2 (ja) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | トリペプチド高生産性ラクトバチルス・ヘルベチカス乳酸菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001082A3 true CZ20001082A3 (cs) | 2001-01-17 |
| CZ291067B6 CZ291067B6 (cs) | 2002-12-11 |
Family
ID=17590526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001082A CZ291067B6 (cs) | 1997-09-26 | 1998-02-05 | Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6534304B1 (cs) |
| EP (1) | EP1016709B1 (cs) |
| JP (1) | JP3028411B2 (cs) |
| KR (1) | KR100404154B1 (cs) |
| CN (1) | CN1149279C (cs) |
| AR (1) | AR017153A1 (cs) |
| AT (1) | ATE294230T1 (cs) |
| AU (1) | AU734422B2 (cs) |
| BG (1) | BG64422B1 (cs) |
| BR (1) | BR9813218A (cs) |
| CA (1) | CA2304985C (cs) |
| CZ (1) | CZ291067B6 (cs) |
| DE (1) | DE69829983T2 (cs) |
| ES (1) | ES2237834T3 (cs) |
| HU (1) | HU225980B1 (cs) |
| IN (1) | IN188418B (cs) |
| MY (1) | MY118157A (cs) |
| PL (1) | PL188675B1 (cs) |
| PT (1) | PT1016709E (cs) |
| SK (1) | SK284755B6 (cs) |
| TR (1) | TR200000854T2 (cs) |
| TW (1) | TW526268B (cs) |
| WO (1) | WO1999016862A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA988659B (cs) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE305224T1 (de) * | 1999-01-11 | 2005-10-15 | Calpis Co Ltd | Verfahren zur herstellung von sauermilch enthaltend ein inhibitionspeptid fuer ein angiotensin konvertierendes enzym sowie ein verfahren zur herstellung von milchserum |
| FR2793257B1 (fr) * | 1999-05-06 | 2001-07-27 | Gervais Danone Sa | Bacteries lactiques a proprietes anxiolytiques, et leurs utilisations |
| FI113741B (fi) * | 1999-11-01 | 2004-06-15 | Valio Oy | Menetelmä verenpainetta alentavia peptidejä sisältävän tuotteen valmistamiseksi |
| JP4633876B2 (ja) * | 1999-11-11 | 2011-02-16 | カルピス株式会社 | トリペプチドの製造方法 |
| FI112031B (fi) | 2002-02-25 | 2003-10-31 | Valio Oy | Biologisesti aktiivisen tuotteen uusi käyttö |
| WO2003082019A2 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-09 | Chr. Hansen A/S | Peptides with anti-hypertensive properties |
| JP4499564B2 (ja) * | 2002-08-09 | 2010-07-07 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | 抗高血圧特性を有するペプチドの製造方法 |
| CA2509627A1 (en) | 2003-01-06 | 2004-07-22 | Unilever Plc | Fermented milk product comprising tripeptide vpp and/or ipp |
| TWI344371B (en) * | 2003-03-18 | 2011-07-01 | Suntory Holdings Ltd | Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides |
| US7718171B2 (en) | 2003-04-07 | 2010-05-18 | Chr. Hansen A/S | Reducing heart rate in mammals using milk derived fermentation products produced using Lactobacillus helveticus |
| JP2006525003A (ja) * | 2003-05-05 | 2006-11-09 | ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ | Ｉｐｐおよび／またはｖｐｐを含む加水分解カゼイン製品 |
| JP4680571B2 (ja) * | 2003-12-25 | 2011-05-11 | カルピス株式会社 | 経口摂取用保湿剤 |
| US20070224285A1 (en) * | 2004-03-31 | 2007-09-27 | Calpis Co., Ltd | Agent for Preventing or Suppressing Hepatopathy and Functional Food for Preventing or Suppressing Hepatopathy |
| EP1741437A4 (en) * | 2004-03-31 | 2009-06-24 | Calpis Co Ltd | FUNCTIONAL FOOD FOR ENHANCING THE ENDOGENOUS MELATONIN SECRETION RHYTHM AND FUNCTIONAL FOOD FOR IMPROVING CIRCADIAN RHYTHM |
| WO2006004105A1 (ja) * | 2004-07-05 | 2006-01-12 | Calpis Co., Ltd. | ペプチド混合物の製造法、抗高血圧ペプチド含有発酵乳の製造法及び抗高血圧ペプチド製剤の製造法 |
| BRPI0514903A (pt) | 2004-09-03 | 2008-06-24 | Hansens Lab | proteìnas vegetais ou leite fermentado compreendendo ligando de receptor e uso dos mesmos |
| JPWO2006095764A1 (ja) * | 2005-03-09 | 2008-08-14 | カルピス株式会社 | 皮膚における紫外線感受性抑制剤及び機能性飲食品 |
| JP5160889B2 (ja) * | 2005-06-24 | 2013-03-13 | カルピス株式会社 | 表皮細胞分化及び角化促進剤 |
| CA2616789A1 (en) * | 2005-07-26 | 2007-02-01 | Calpis Co., Ltd. | Process for production of fermented milk and fermented milk beverage/food |
| CN1903052B (zh) * | 2005-07-26 | 2010-04-28 | 天津科技大学 | 具有酪蛋白磷酸肽、抗血管紧张素转化酶肽和低聚半乳糖乳清粉的制备方法 |
| CN101420968B (zh) | 2006-02-14 | 2011-12-21 | 卡尔皮斯株式会社 | 血管扩张药 |
| DK1992352T3 (da) * | 2006-02-14 | 2014-06-10 | Calpis Co Ltd | Middel til anvendelse i forbyggelsen af aterosklerosis |
| PL1820851T3 (pl) | 2006-02-20 | 2012-07-31 | Gervais Danone Sa | Szczepy Lactobacillus helveticus nie fermentujące laktozy |
| EP1820405B1 (fr) * | 2006-02-20 | 2011-03-30 | Compagnie Gervais Danone | Nouvelles souches de Lactobacillus Helveticus |
| DE602006005330D1 (de) * | 2006-02-20 | 2009-04-09 | Gervais Danone Sa | Neue Stämme von Lactobacillus helveticus |
| DK1820849T3 (da) * | 2006-02-20 | 2009-04-27 | Gervais Danone Sa | Nye stammer af Lactobacillus helveticus |
| JP2009537492A (ja) * | 2006-05-15 | 2009-10-29 | ヴァリオ・リミテッド | 治療上有用なペプチドの新規用途 |
| CN101505607B (zh) | 2006-06-16 | 2013-06-26 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 细菌 |
| NZ597178A (en) * | 2006-09-04 | 2012-08-31 | Megmilk Snow Brand Co Ltd | Agent comprising Lactobacillus helveticus for accelerating the increase in and/or preventing the decrease in blood adiponectin level, and visceral fat accumulation inhibitor |
| JP2008214253A (ja) | 2007-03-02 | 2008-09-18 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 内臓脂肪減少剤 |
| TWI414305B (zh) * | 2007-03-27 | 2013-11-11 | Calpis Co Ltd | 腎衰竭預防劑 |
| CN101678071A (zh) * | 2007-03-27 | 2010-03-24 | 卡尔皮斯株式会社 | 肾衰竭预防剂 |
| EP2303030A1 (en) * | 2008-06-12 | 2011-04-06 | Nestec S.A. | Lactobacillus helveticus strains for producing hypotensive peptides |
| ATE544350T1 (de) * | 2008-12-29 | 2012-02-15 | Unilever Nv | GEFRORENE SÜßWARENPRODUKTE UND GETRÄNKE, DIE THEOBROMIN UND KOFFEIN ENTHALTEN |
| WO2011095389A1 (en) * | 2010-02-04 | 2011-08-11 | Unilever Nv | Use of theobromine for lowering central blood pressure |
| CA2798911C (en) | 2010-05-19 | 2018-07-03 | Unilever Plc | Theobromine for increasing hdl-cholesterol |
| JP2010183918A (ja) * | 2010-06-01 | 2010-08-26 | Calpis Co Ltd | トリペプチドの製造方法 |
| JP5797891B2 (ja) * | 2010-11-09 | 2015-10-21 | カルピス株式会社 | Ｎｏｎ−ｄｉｐｐｅｒ型血圧日内変動による疾病発症リスク軽減剤 |
| AU2011327288B2 (en) * | 2010-11-09 | 2015-05-07 | Asahi Group Holdings, Ltd. | Lactobacillus helveticus having high proteolysis activity |
| RU2453593C1 (ru) * | 2011-04-21 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Бифилюкс" | Штамм lactobacillus helveticus, используемый для получения продукции, содержащей лактобактерии |
| US20120328735A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Naoto Uchida | Process for preparing casein-derived peptides by fermentation of lactic acid bacteria |
| DE102012016127A1 (de) | 2011-08-31 | 2013-02-28 | Daniel Elias | Bioaktive, regenerative Mischung zur Herstellung eines Ergänzungsnahrungsmittels |
| MX369465B (es) | 2012-08-22 | 2019-11-08 | Kraft Foods Group Brands Llc | Queso procesado con componentes lácteos cultivados y método de fabricación. |
| CN102960444A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-03-13 | 陕西科技大学 | 一种基于瑞士乳杆菌发酵的含ace抑制肽的羊奶的制备方法 |
| CN104450574B (zh) * | 2014-12-10 | 2017-05-10 | 生合生物科技（南京）有限公司 | 一种瑞士乳杆菌lh43及其制作乳酸菌饮料的方法 |
| RU2577112C1 (ru) * | 2014-12-25 | 2016-03-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Горский государственный аграрный университет" | Штамм lactobacillus helveticus вкпм в-11175, полученный на доступных питательных средах |
| CN107674848A (zh) * | 2017-09-20 | 2018-02-09 | 云南乍甸乳业有限责任公司 | 一种酸奶发酵菌种的制备方法 |
| CN111227049B (zh) * | 2018-11-29 | 2022-08-12 | 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 | 一种维持褐色植物基酸奶货架期内组织状态稳定性的方法 |
| CN109517763B (zh) * | 2018-12-27 | 2022-03-22 | 内蒙古农业大学 | 瑞士乳杆菌h11及其应用 |
| CN110226687A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-09-13 | 宁波依萃健生物科技有限公司 | 一种解酒护肝组合物及制备方法 |
| DK3845069T3 (da) * | 2019-12-30 | 2022-11-28 | Gervais Danone Sa | Saccharosenegativ streptococcus thermophilus til anvendelse i fremstilling af fermenterede produkter |
| CN111979286B (zh) * | 2020-08-31 | 2021-11-26 | 鲁东大学 | 一种发酵法与酶法联合制备贝类高f值寡肽的方法 |
| CN112616925A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-09 | 光明乳业股份有限公司 | 一种双蛋白发酵乳及其制备方法 |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3846560A (en) | 1971-07-22 | 1974-11-05 | Quaker Oats Co | Process of making a base for protein beverages |
| US3876806A (en) | 1971-10-14 | 1975-04-08 | Quaker Oats Co | Process for the preparation of acid soluble polypeptides and carbonated beverages containing same |
| US4107334A (en) | 1976-10-13 | 1978-08-15 | Pfizer Inc. | Modified protein |
| CH636248A5 (fr) | 1979-03-09 | 1983-05-31 | Nestle Sa | Procede de preparation d'un hydrolysat de proteines purifie. |
| JPS60262561A (ja) | 1984-06-08 | 1985-12-25 | House Food Ind Co Ltd | 大豆蛋白質水溶液の処理方法 |
| US4585757A (en) | 1984-07-27 | 1986-04-29 | Texas Tech University Health Sciences Center | Hypotensive active peptides |
| US4687840A (en) | 1986-02-11 | 1987-08-18 | Texas Tech University Health Sciences Center | Hypotensive active peptides |
| GB8823429D0 (en) * | 1988-10-05 | 1988-11-09 | Agricultural Genetics Co | Method for accelerated ripening of cheddar & related hard type cheese |
| MY109493A (en) | 1989-07-07 | 1997-02-28 | Nestle Sa | Protein hydrolysis. |
| NL9000422A (nl) | 1990-02-21 | 1991-09-16 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor de bereiding van een gefermenteerd melkprodukt. |
| DE69124274T2 (de) | 1990-02-27 | 1997-08-14 | Agency Ind Science Techn | Oligopeptide, sie enthaltende pharmazeutische und Futterzusammensetzung und Benützung von Oligopeptiden |
| DE69127020T2 (de) | 1990-05-18 | 1998-01-29 | Morinaga Milk Industry Co Ltd | Milchproteinhydrolysate und Zusammensetzungen zur Verwendung als Haar- und Hautbehandlungsmittel |
| JP2571734B2 (ja) | 1991-08-23 | 1997-01-16 | 株式会社ヤクルト本社 | 乳酸菌飲料 |
| US5486461A (en) | 1991-11-08 | 1996-01-23 | Novo Nordisk A/S | Casein hydrolyzate and method for production of such casein hydrolyzate |
| FI94088C (fi) | 1992-03-13 | 1995-07-25 | Valio Oy | Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista |
| US5418218A (en) | 1992-07-10 | 1995-05-23 | The University Of Maryland At Baltimore | Histidyl-proline diketopiperazine (cyclo his-pro) a cns-active pharmacologic agent |
| JP2782142B2 (ja) | 1992-07-23 | 1998-07-30 | カルピス株式会社 | アンジオテンシン変換酵素阻害剤及びその製造法 |
| JP2782153B2 (ja) * | 1992-11-09 | 1998-07-30 | カルピス株式会社 | アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの製造法 |
| US5656268A (en) | 1995-04-21 | 1997-08-12 | Sorodsky; Michael | Biological product |
| US5618689A (en) | 1995-05-25 | 1997-04-08 | Nestec S.A. | Enhanced procedures for preparing food hydrolysates |
| US6372282B1 (en) | 1996-12-23 | 2002-04-16 | Dsm N.V. | Method for producing a protein hydrolysate |
| US6221423B1 (en) | 1998-04-13 | 2001-04-24 | Protein Technologies Int'l Inc. | Short-chained peptide material |
| AU2001247334A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-09-24 | Monsanto Company | Novel peptides with anti-hypertensive activity |
| WO2001068113A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-09-20 | Monsanto Technology Llc | Anti-hypertensive peptides |
| CA2391063A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Hiroshi Miyakawa | Protein hydrolyzate, manufacuring method therefor, and foods and drinks containing the protein hydrolyzate |
| US20030040475A1 (en) | 2001-01-16 | 2003-02-27 | Yasuhiro Toba | Agents for improving lipid metabolism and reducing high blood pressure |
| US6815426B2 (en) | 2001-02-16 | 2004-11-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Angiogenesis-inhibitory tripeptides, compositions and their methods of use |
| AU2002302385B2 (en) | 2001-03-09 | 2005-10-06 | Unilever Plc | Fermented milk product |
| US6589574B2 (en) | 2001-03-19 | 2003-07-08 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for preparation of protein-hydrolysate from milk protein |
-
1997
- 1997-09-26 JP JP9277949A patent/JP3028411B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-05 AU AU57802/98A patent/AU734422B2/en not_active Ceased
- 1998-02-05 AT AT98901520T patent/ATE294230T1/de active
- 1998-02-05 BR BR9813218-0A patent/BR9813218A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-02-05 DE DE69829983T patent/DE69829983T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-05 KR KR10-2000-7003224A patent/KR100404154B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 US US09/508,840 patent/US6534304B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-05 WO PCT/JP1998/000481 patent/WO1999016862A1/ja active IP Right Grant
- 1998-02-05 EP EP98901520A patent/EP1016709B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-05 PT PT98901520T patent/PT1016709E/pt unknown
- 1998-02-05 ES ES98901520T patent/ES2237834T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-05 HU HU0003744A patent/HU225980B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 SK SK435-2000A patent/SK284755B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 CA CA002304985A patent/CA2304985C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-05 PL PL98339343A patent/PL188675B1/pl unknown
- 1998-02-05 CZ CZ20001082A patent/CZ291067B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-05 CN CNB988115301A patent/CN1149279C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-05 TR TR2000/00854T patent/TR200000854T2/xx unknown
- 1998-09-17 IN IN2795DE1998 patent/IN188418B/en unknown
- 1998-09-22 TW TW087115782A patent/TW526268B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-09-23 MY MYPI98004363A patent/MY118157A/en unknown
- 1998-09-25 ZA ZA988659A patent/ZA988659B/xx unknown
- 1998-09-25 AR ARP980104806A patent/AR017153A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-04-26 BG BG104382A patent/BG64422B1/bg unknown
-
2002
- 2002-12-05 US US10/310,628 patent/US7282354B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20001082A3 (cs) | Bakterie Lactobacillus helveticus produkující kyselinu mléčnou s vysokou produktivitou tripeptidu, fermentovaný mléčný výrobek a způsob jeho výroby | |
| Hati et al. | Comparative growth behaviour and biofunctionality of lactic acid bacteria during fermentation of soy milk and bovine milk | |
| do Amaral Santos et al. | Co-culture fermentation of peanut-soy milk for the development of a novel functional beverage | |
| JP3695648B2 (ja) | 抗高血圧性ジペプチドおよびトリペプチドを産生するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ | |
| JP5898220B2 (ja) | テクスチャを改変する乳酸菌株 | |
| CN110129243B (zh) | 豆酸奶适制性菌株、菌剂及其应用 | |
| CN101421390B (zh) | 不发酵乳糖的瑞士乳杆菌菌株 | |
| Ahtesh et al. | Processing and sensory characteristics of a fermented low‐fat skim milk drink containing bioactive antihypertensive peptides, a functional milk product | |
| Şengül | Microbiological characterization of Civil cheese, a traditional Turkish cheese: microbiological quality, isolation and identification of its indigenous Lactobacilli | |
| CA2468905A1 (en) | Cheese flavour ingredient and method of its production | |
| Al-Kotami et al. | Detection and isolation of lactic acid bacteria and its use as local starters in Syrian Akawi cheese processing. | |
| Kathiriya et al. | Significance of growth rate, acceptability of fermented milk and release of peptides by lactic cultures | |
| PL241893B1 (pl) | Sposób przeprowadzenia selekcji mikroorganizmów proteolitycznych, sposób wytwarzania hydrolizatu białek serwatkowych, zawierającego bioaktywne peptydy i hydrolizat białek serwatkowych | |
| MXPA00002575A (en) | Lactobacillus helveticus bacterium having high capability of producing tripeptide, fermented milk product, and process for preparing the same | |
| JP2003325193A (ja) | 抗菌活性物質の製造方法 | |
| CN116828988A (zh) | 用于制备发酵产品的乳酸菌组合物 | |
| AHTESH et al. | RESEARCH Processing and sensory characteristics of a fermented low-fat skim milk drink containing bioactive antihypertensive peptides, a functional milk product |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130205 |