FI94088C

FI94088C - Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista

Info

Publication number: FI94088C
Application number: FI921097A
Authority: FI
Inventors: Olli Tossavainen; Pekka Linko; Matti Harju; Marko Tapani Outinen
Original assignee: Valio Oy
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 1995-07-25
Also published as: FI94088B; TR28539A; WO1993017581A1; FI921097A0; US5547687A; FI921097A

Description

94088

Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoi-sista koostumuksista

Keksinnön kohteena on menetelmä fenyylialaniinin 5 poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista, jolloin saadaan hyvänmakuisia, ainakin lähes fenyylialaniinittömiä proteiinihydrolysaattikoostumuksia.

Saatu proteiinipitoinen koostumus, josta fenyyli-alaniini on poistettu joko kokonaan tai ainakin suurelta 10 osin, sopii käytettäväksi erikoisravintovalmisteena tai sen komponenttina, erityisesti fenyyliketonuriaa (PKU) sairastavien potilaiden ruokavaliossa.

Proteiinilähteen valinnalla ei voida vähentää fenyylialaniinin saantia ravinnosta, koska fenyylialaniinia 15 on kaikissa eläin- ja kasviproteiineissa noin 4-6 %. PKU-potilaan onkin syytä välttää runsaasti proteiinia sisältäviä ruoka-aineita kuten kananmunaa, kalaa, lihaa ja juustoa. Muiden välttämättömien aminohappojen tarpeen tyydyttämiseksi potilaan tulisikin käyttää kliinisiä proteiini-20 valmisteita, joista fenyylialaniini on joko kokonaan tai osittain poistettu.

Fenyyliketonuria on synnynnäinen sairaus, joka hoitamattomana aiheuttaa jo muutaman viikon kuluttua syntymästä vakavia aivovaurioita ja usein myös kuoleman. Poti-; 25 laalta puuttuu kyky tuottaa fenyylialaniinihydroksylaasia (EC 1. 14.16.1), joka muuttaa ravinnosta saatavan aminohapon, fenyylialaniinin tyrosiiniksi. Fenyylialaniinin ja sen pyruvaatti-, laktaatti- ja asetaattijohdannaisten kertyminen vereen ja selkäydinnesteeseen aiheuttaa pakkoliik-30 keitä, anemiaa, ihon karhenemista ja lopulta aivovaurioita. Taudin voi todeta myös potilaan virtsan kohonneesta fenyyliasetyyliglutamiinipitoisuudesta, mistä tauti onkin saanut nimensä.

2 94088

Yhdysvalloissa sekä suuressa osassa Eurooppaa yksi vastasyntynyt 11 000 - 15 000:sta sairastaa fenyyliketon-uriaa. Irlannissa tauti on yleisempi, siellä yksi lapsi 4500:sta on PKU-potilas. Suomessa fenyyliketonuria on 5 erittäin harvinainen eikä vastasyntyneiden taipumusta fe-nyyliketonuriaan tutkita. Maissa, joissa PKU:aa esiintyy, jokainen lapsi testataan 1-2 viikon kuluessa syntymästä seuraamalla veren fenyylialaniinipitoisuutta. Jos fenyyli-alaniinin määrä veressä kohoaa jatkuvasti, taudin hoitami-10 nen on syytä aloittaa viimeistään kolmen viikon kuluttua syntymästä.

Tarkasti valvottu dieetti on toistaiseksi ainoa käytännöllinen hoitokeino. Kun ravinnosta saatavan fenyy-lialaniinin määrä pystytään pitämään tietyissä rajoissa, 15 potilaan veren fenyylialaniinipitoisuus pysyy sallituissa rajoissa (20-40 mg/1). Fenyylialaniinin sietokyky kasvaa iän myötä, ja dieetti on yleensä voitu lopettaa noin 8 vuoden iässä. Uusimpien tutkimustulosten mukaan dieettiä pitäisi kuitenkin jatkaa pidempään, mikä asettaa entistä 20 suurempia vaatimuksia erikoisravintovalmisteen maulle.

Taudin hoitoon valmistetaan aminohapposeoksia, joista puuttuu fenyylialaniini. Tällaisesta "PKU-proteii-nista" tehdään vastasyntyneille maitoa lisäämällä proteiiniin tarvittavat muut komponentit, kuten rasva, vesi, lak-• 25 toosi yms.. PKU-proteiinista voidaan tehdä myös muita val miita PKU-valmisteita korvaamalla elintarvikkeen valmistuksessa käytettävä proteiini fenyylialaniinittomalla ami-nohapposeoksella.

Tällainen kaupallinen valmiste on esimerkiksi PK 30 AID III -niminen tuote (valmistaja Scientific Hospital : Supplies, Englanti). Tällaiset oleellisesti vain vapaista aminohapoista koostuvat valmisteet maistuvat kitkeriltä ja ne saattavat aiheuttaa osmoottista ripulia. Lisäksi vapaat aminohapot imeytyvät elimistöön huonommin kuin esimerkiksi 35 di- ja tripeptidit.

94088 3

Joitakin menetelmiä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiineista tai proteiinipitoisista koostumuksista jo tunnetaan. Vanhimmassa näistä tunnetuista menetelmistä proteiini ensin pilkotaan vapaiksi aminohapoiksi happohyd-5 rolyysillä, minkä jälkeen fenyylialaniini poistetaan seoksesta aktiivihiilellä (ks. esim. DD-patenttijulkaisu 283 256). Tämän tunnetun prosessin heikkoutena on kuitenkin huono saanto, sillä yleensä vain korkeintaan 50 % aminohapoista saadaan talteen loppujen aminohappojen adsor-10 hoituessa aktiivihiileen. Usein myös muut hydrofobiset aminohapot adsorboituvat lähes kokonaan aktiivihiileen, jolloin niitä on lisättävä jälkeenpäin tuotteeseen. Adsor-benttina käytettyä aktiivihiiltä ei myöskään kyetä regeneroimaan, joten menetelmä on erittäin kallis.

15 Fenyylialaniini on saatu poistetuksi proteiinin happohydrolysaatista myös vahvaa anioninvaihtohartsia käyttäen (US-patenttijulkaisu 4 384 136 ja GB-patenttijulkaisu 2 103 221 A). Anioninvaihtohartsi ei kuitenkaan sovellu hyvin teolliseen tuotantoon, koska sen käyttö vaatii 20 puskuriliuosten käyttöä.

Lopez-Bajoneron et ai. esittivät julkaisussa J. Food Sei., 56(4) (1991) 938-942 menetelmän, jossa fenyyli-alaniinia poistettiin proteiinipitoisista koostumuksista. Tällöin rasvatonta maitojauhetta tai kaseinaattia hydroly- · 25 soitiin ensin Aspergillus oryzae-kannan tuottamalla prote- aasilla ja sen jälkeen papaiinilla. Hydrolysaattia käsiteltiin proteiiniin nähden kolminkertaisella määrällä aktiivihiiltä, jolloin 92 % fenyylialaniinista poistui 50 % proteiinisaannolla.

30 Mockenberg et ai. puolestaan esittivät julkaisussa t Research in Food Science and Nutrition, 3 (1983) 3-4 mene- » »« telmän, jossa happohydrolyysi korvattiin kaksivaiheisella subtilisiini-Pronase -entsyymihydrolyysillä, jonka tarkoituksena oli vapauttaa C-terminaaliset aromaattiset amino-35 hapot vapaiksi aminohapoiksi. Fenyylialaniini poistui kui- 4 94088 tenkin kokonaan vasta 425 % aktiivihiilimäärällä, jolloin myös proteiinitypestä hävisi 50 %.

Japanissa ryhdyttiin 1970-luvun alussa tutkimaan mahdollisuuksia tuottaa PKU-proteiinia entsymaattisin me-5 netelmin. Tavoitteena oli parantaa makua sekä tehdä tuotteesta "proteiinimaisempaa". Useita toimivia prosesseja onkin kehitetty laboratoriomittakaavassa [ks. Yamashita et ai., J. Food Sei., 41 (1976) 1029-1032; Fujimaki et ai., US-patenttijulkaisu 4 016 147; Mowlah et ai. Raportti, 10 Technical Research Institute, Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Japani (1985) 29-39; Arai et ai., Agric. Biol. Chem., 50 (1986) 2929-2931; Owada et ai., Advances in Neonatal Screening, Elsevier Science Publishers B.V., 1987, s. 205-208; Maeda et ai., Agric. Biol. Chem., 51 (1987) 15 1501-1507]. Prosessien haittapuolia ovat kuitenkin kalliit erikoisentsyymit sekä geelisuodatuksen soveltumattomuus tuotantomittakaavaan.

Em. menetelmiin sisältyvässä kaksivaiheisessa prosessissa käytetään ensin pepsiiniä, joka pilkkoo raaka-20 aineena käytetyn heraproteiinin spesifisesti niin, että fenyylialaniini jää peptidin karboksyylipäähän. Fenyyli-alaniini vapautetaan edelleen vapaaksi aminohapoksi karboksipeptidaasilla tai kaupallisella entsyymivalmis-teella, joka sisältää karboksipeptidaasiaktiivisuutta 25 (esim. subtilisiini, Pronase).

Em. menetelmiin sisältyvässä yksivaiheisessa proteiinin hydrolyysissä puolestaan käytetään entsyymiä, joka sisältää sekä endo- että eksopeptidaasiaktiivisuuksia. Fenyylialaniini erotetaan seoksesta geelikromatografiällä.

30 Tunnetut menetelmät fenyylialaniinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista eivät toistaiseksi ole olleet tyydyttäviä teollista tuotantoa ajatellen. On siten jatkuvasti tarve teollisessa mitassa toimivasta, taloudellisesti aikaisempaa edullisemmasta ja tehokkaammasta mene-35 telmästä fenyylialaniinin poistamiseksi proteiineista tai 5 94088 proteiinipitoisista koostumuksista, jolla menetelmällä saataisiin myös aikaisempaa paremman makuista, oleellisesti fenyylialaniinitöntä proteiinituotetta.

Nyt on yllättäen keksitty tapa, jolla yllä esitetyt 5 ongelmat voidaan välttää ja samalla saadaan hyvällä saannolla fysiologisesti hyvälaatuista ja erinomaisen makuista PKU-proteiinihydrolysaattia.

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan oleellisesti fenyylialaniinitöntä proteiinikoostumusta, joka si-10 sältää runsaasti ravitsemuksellisesti arvokkaita di- ja tripeptidejä ja vain noin 25 paino-% vapaita aminohappoja. Tämä tuote on maultaan erinomainen eikä se maistu kitkerältä. Lisäksi se liukenee hyvin lämpimään veteen.

Lisäksi keksinnön mukainen menetelmä soveltuu hyvin 15 teolliseen tuotantoon ja se koostuu yksinkertaisista yksikköprosesseista. Menetelmä on varsinaisesti kaksi-vai-heinen. Ensimmäisessä vaiheessa proteiinipitoinen koostumus hydrolysoidaan entsymaattisesti ja toisessa vaiheessa näin saatua proteiinihydrolysaattia käsitellään adsorptio-20 hartsilla. Lisäksi tässä menetelmässä käytetty adsoptio-hartsi voidaan regeneroida yksinkertaisesti elintarviketeollisuudessa yleisesti käytettävällä lipeällä, jolloin hartsi on heti valmis uudelleenkäytettäväksi. Hartsin ad-sorptiokyvyssä ei ole todettu heikentymistä useiden kymme-25 nien hydrolysaattipanos-regenerointisyklien jälkeen.

0 0

Keksinnön kohteena on siten menetelmä fenyyliala-niinin poistamiseksi proteiinipitoisista koostumuksista, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että a) proteiinipitoisen koostumuksen sisältämä prote- 30 iini pilkotaan entsymaattisesti proteolyyttisellä entsyy- t millä proteiinihydrolysaatiksi, jonka hydrolysoitumisaste on noin 30 - 60 %, b) näin saatu proteiinihydrolysaatti ultrasuodate-taan ja permeaatti otetaan talteen, 35 c) haluttaessa liuoksen pH:ta säädetään alueella 2 - 10 suolahapolla tai lipeällä, • 6 94088 d) näin saatu proteiinihydrolysaatti johdetaan ad-sorptiohartsilla täytetyn pylvään läpi lineaarivirtausno-peudella 0,1 - 1,3 m/h lämpötilassa 5 - 65 °C, e) pylvästä eluoidaan vedellä lineaarivirtausnopeu-5 della 0,1 - 1,3 m/h, f) otetaan talteen jae, josta fenyylialaniini on poistettu, g) tarvittaessa talteenotetusta jakeesta poistetaan suoloja, ja 10 h) lopuksi talteenotettu jae konsentroidaan kuiva- ainepitoisuuteen 70 - 80 paino-% ja haluttaessa kuivataan.

Kaikissa eläin- ja kasviproteiineissa on todettu olevan noin 4-6 paino-% fenyylialaniinia proteiinin kokonaismäärästä laskettuna.

15 Prosessin ensimmäisessä vaiheessa proteiinipitoisen koostumuksen sisältämä proteiini pilkotaan entsymaattisesti proteolyyttisellä entsyymillä siten, että hydrolysoitu-misaste on n. 30 - 60 %.

Käsiteltävä proteiinipitoinen koostumus voi olla 20 mikä tahansa muitakin välttämättömiä aminohappoja kuin fenyylialaniinia sisältävä proteiinipitoinen koostumus, esimerkiksi heraproteiini tai soijaproteiinikonsentraatti. Heraproteiinissa proteiinipitoisuus voi vaihdella välillä 35 - 85 paino-%. Soijaproteiinikonsentraatin tyypillinen .· 25 proteiinipitoisuus on noin 52 paino-%.

Lähtöaineen proteiinipitoisuus vaikuttaa tuotteen proteiinipitoisuuteen. Koska on suotavaa, että tuote sisältää mahdollisimman paljon proteiinia, lähtöaineen proteiinipitoisuuden tulisi olla mahdollisimman korkea, suo-30 tavimmin yli 70 paino-%.

Proteolyyttisenä entsyyminä käytetään edullisesti pankreatiinia, jonka sopiva käyttömäärä on noin 3 paino-% proteiinin määrästä laskettuna.

Entsymaattisessa käsittelyssä fenyylialaniini va-35 pautuu vapaiksi aminohapoiksi noin 70 - 90-%risesti. Saa- • · 94088 7 dun proteiinihydrolysaatin proteiinista n. 3,6 - 3,8 % on fenyylialaniinia.

Entsymaattisen hydrolyysin jälkeen proteiinihydro-lysaatti ultrasuodatetaan pilkkoutumattoman proteiinin ja 5 suurimolekyylisten peptidien poistamiseksi ja permeaatti otetaan talteen.

Talteenotettu permeaatti konsentroidaan haihduttamalla kuiva-ainepitoisuuteen 20 - 60 paino-%. Näin saatu konsentraatti voidaan johtaa suoraan jatkokäsittelyyn tai 10 sitä voidaan säilöä +5 °C:ssa ennen jatkokäsittelyä. Kuiva-ainepitoisuuden 20 - 60 paino-% omaava konsentraatti voidaan haluttaessa myös kuivata esimerkiksi sumutuskui-vaimella ennen jatkokäsittelyä. .

Ennen adsorptiohartsikäsittelyä proteiinihydroly-15 saattikonsentraatti tai -jauhe liuotetaan kuumaan veteen siten, että liuoksen kuiva-ainepitoisuudeksi tulee 20 - 30 paino-%.

Adsorptiohartsikäsittely voidaan suorittaa liuoksen pH:n ollessa 2 - 10, mutta edullisinta on käsitellä hart-20 silla neutraalia liuosta, jonka pH on 6,5 - 7,0. Tällöin ei tarvita pH-säätöä hydrolyysivaiheen jälkeen. Haluttaessa liuoksen pH:ta voidaan kuitenkin säätää elintarvikelaa-tuisella suolahapolla (HC1) tai lipeällä (NaOH).

Prosessin toisessa vaiheessa proteiinihydrolysaatti : 25 johdetaan adsorptiohartsilla täytetyn pylvään läpi lineaa- rivirtausnopeudella 0,1 - 1,3 m/h. Adsorboitumisprosessi vaatii tietyn minimireaktioajan, jonka kokeellisesti on määritetty olevan riittävä, kun lineaarivirtaus ei ole suurempi kuin 1,3 m/h. Adsorptio paranee hieman tätä alem-30 pia lineaarivirtausnopeuksia käytettäessä, mutta prosessiin kuluva aika vastaavasti pitenee, mikä nostaa kustannuksia.

Adsorptiohartsina käytetään edullisesti hydrofobista polystyreenirunkoista hartsia. Sopivia hartseja ovat 35 mm. Amberlite XAD 4 ja Amberlite XAD 16, joita valmistaa Rohm & Haas (Ranska).

8 94088

Hartsikäsittely voidaan yleensä suorittaa lämpötilassa 5 - 65 eC. Fenyylialaniini ja sitä sisältävät peptidit nimittäin adsorboituvat hartsiin pH:n ollessa 2-10 ja lämpötilan ollessa 5-65 °C. Edullisin hartsikäsitte-5 lylämpötila on noin 30 eC, jolloin liuoksen jäähdytykseen tai lämmitykseen ei tarvitse käyttää lisäenergiaa.

Näin käsiteltyä hartsilla täytettyä pylvästä eluoi-daan vedellä samalla virtausnopeudella, jolla proteiini-hydrolysaattia edellä johdettiin ko. pylvääseen. PKU-pro-10 teiini eluoituu pylväästä ennen fenyylialaniinia ja fenyy- lialaniinia sisältäviä peptidejä siten, että lähes fenyy-lialaniiniton jae saadaan eristetyksi. Kuvassa 1 on esitetty graafisesti fenyylialaniinin ja fenyylialaniinia sisältävien peptidien erottuminen proteiinihydrolysaatista 15 adsorptiohartsipylvään avulla.

Tarvittaessa talteenotetusta, lähes fenyylialanii-nittömästä jakeesta poistetaan suoloja, kuten ylimääräistä kloridia tai natriumia esimerkiksi elektrodialyysillä.

Lopuksi lähes fenyylialaniinitön tuotejae konsent-20 roidaan kuiva-ainepitoisuuteen 70 - 80 paino-%. Tuotejae voidaan haluttaessa kuivata jauheeksi kylmä- tai sumutus-kuivauksella .

Fenyylialaniinin poistumisaste proteiinikoostumuk-sesta on n. 92 - 100 %. Täten menetelmällä voidaan valmis-: 25 taa PKU-proteiinia, jonka fenyylialaniinipitoisuus on al haisempi kuin aiemmin käytetyissä proteiinin hydrolyysiin perustuvissa menetelmissä (fenyylialaniinin poistumisaste 90 - 95 %). Prosessin kokonaisproteiinisaanto on 45 - 65 % sen mukaan, kuinka fenyylialaniinitön tuotteesta halutaan. 30 Tietyllä poistumisasteella saanto on joka tapauksessa parempi kuin kirjallisuudessa esitetyissä menetelmissä.

Menetelmä voidaan toteuttaa joko siten, että hart-sikäsittely suoritetaan välittömästi hydrolysointivaiheen jälkeen tai siten, että hartsikäsittely suoritetaan myö-35 hemmin.

94088 9

Keksinnön mukaisen menetelmän edullisuutta lisää se, että käytetty adsorptiohartsi voidaan regeneroida 4 % ' lipeällä, minkä jälkeen hartsia voidaan käyttää uudelleen.

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadun oleelli-5 sesti fenyylialaniinittömän proteiinituotteen aminohappo-profiili on välttämättömien aminohappojen osalta hyvä (taulukko 1). Ainoastaan tyrosiinin ja metioniinin lisäykset ovat välttämättömiä. Tuote sisältää runsaasti ravitsemuksellisesti arvokkaita di-ja tripeptidejä sekä n. 25 % 10 vapaita aminohappoja. Tuotteen maku on markkinoilla oleviin tuotteisiin verrattuna erinomainen. Lisäksi jauhe liukenee hyvin lämpimään veteen.

Keksinnön mukaisesti saatua proteiinipitoista koostumusta, josta fenyylialaniini on poistettu joko koko-15 naan tai ainakin suurelta osin, voidaan käyttää erikois-ravintovalmisteena tai erikoisravintovalmisteen valmistuksessa.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan keksintöä yksityiskohtaisemmin.

20 Esimerkki 1

Liuotettiin 100 kg 35 - 90 paino-% proteiinia sisältävää heraproteiinikonsentraattia (Kuivamaito Oy, Lapinlahti) 1900 litraan lämmintä vettä (5 % liuos kuiva-aineen suhteen). Kuumennettiin jatkuvasti sekoittaen 20 25 min 65 °C kontaminaatioiden eliminoimiseksi. Jäähdytettiin 50 °C:een ja pH säädettiin 8,5:een 5 M Ca(0H)2:lla. Lisättiin 3 paino-% pankreatiinia proteiinin määrästä laskettuna ja hydrolysoitiin 6 tuntia. pH: n annettiin laskea 7,0tään, missä se pidettiin 5 M Ca(0H)2:lla. Hydrolyysin 30 jälkeen liuos pastöroitiin (95 °C, 5 min), jäähdytettiin ja ultrasuodatettiin 40 °C:ssa cut-off 20 000 -kalvoilla. Permeaatti otettiin talteen ja konsentroitiin haihduttamalla n. 50 % kuiva-ainepitoisuuteen.

Konsentroitu proteiinihydrolysaatti kuivattiin jau-35 heeksi sumutuskuivaamalla.

10 94088

Esimerkki 2

Toimittiin kuten esimerkissä 1, mutta kuivaamisen sijasta 50 % kuiva-ainepitoisuuteen konsentroitua per-meaattia säilöttiin 5 °C:ssa jatkotoimenpiteitä varten.

5 Prosessin kokonaissaanto oli parempi kuin esimer kissä 1 koska vältyttiin hydrolysaatin sumutuskuivaukseen liittyvältä hävikiltä.

Esimerkki 3

Liuotettiin 12,5 g esimerkin 1 mukaan tehtyä prote-10 iinihydrolysaattijauhetta 37,5 cm3:iin 80 - 90 °C vettä. Saadun proteiinihydrolysaattiliuoksen pH oli n. 6,5 - 7,0, jolloin pH-säätöä ei tässä vaiheessa tarvittu lainkaan. Liuos, joka sisälsi 25 paino-% kuiva-ainetta, josta noin 70 % oli proteiinia, pumpattiin 30 °C:ssa 180 cm3 XAD-4 -15 adsorptiohartsipylvääseen tilavuusvirtausnopeudella 60 cm3/h, mikä vastasi lineaarivirtausnopeutta 0,3 m/h. Prote-iinihydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä eluoitiin vedellä samalla virtausnopeudella.

Proteiinisaanto oli n. 50 %. Tuotejakeen proteii-20 nista oli fenyylialaniinia n. 0,5 %.

Esimerkki 4

Liuotettiin 7,5 g esimerkin 1 mukaan tehtyä prote-iinihydrolysaattijauhetta 30 cm3:iin 80 - 90 °C vettä. 20 % liuos (pH 6,5 - 7,0) pumpattiin 180 cm3 XAD-16 -adsorp-j' 25 tiohartsipylvääseen lineaarivirtausnopeudella 0,9 m/h läm pötilassa 30 °C. Proteiinihydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä eluoitiin vedellä samalla virtausnopeudella.

Proteiinisaanto oli n. 50 % ja kuiva-ainesaanto n.

30 55 %. Tuotejakeen proteiinista oli fenyylialaniinia n. 0,4 %.

i

Esimerkki 5

Toimittiin muuten samoin kuin esimerkissä 4, mutta lämpötila oli 65 °C. Lämpötilan nostaminen paransi hartsi-35 pylvään mikrobiologista säilyvyyttä, mutta lisäsi energia- • · 4 11 94088 kustannuksia sekä pienensi mahdollisesti hartsin elinikää. Tuotteen laatu ja saanto pysyivät ennallaan.

Esimerkki 6

Toimittiin muuten samoin kuin esimerkissä 4, mutta 5 lämpötila oli 5 °C. Lämpötilan alentaminen paransi hartsi-pylvään mikrobiologista säilyvyyttä, mutta lisäsi energiakustannuksia. Tuotteen laatu ja saanto pysyivät ennallaan. Esimerkki 7

Liuotettiin 2,1 kg esimerkin 1 mukaan tehtyä prote-10 iinihydrolysaattijauhetta 10,5 litraan 80 - 90 °C vettä.

20 % liuos (pH 6,5 - 7,0) pumpattiin 50 1 XAD-16 -adsorp- tiohartsipylvääseen lineaarivirtausnopeudella 1,3 m/h lämpötilassa 55 °C. Proteiinihydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä eluoitiin vedellä samalla virtausno-15 peudella.

Proteiinisaannolla 50 % fenyylialaniinia oli proteiinin määrästä n. 0,3 %, saannolla 45 % saatiin jae, joka ei sisältänyt lainkaan fenyylialaniinia. Tiedot tuoteja-keen (50 % proteiinisaannolla) koostumuksesta on esitetty 20 taulukoissa 1 ja 2.

» ♦ 12 94088

Taulukko 1: Esimerkin 7 mukaan tehdyn, sumutus- kuivatun PKU-proteiinihydrolysaatin aminohappokoostumus 5 Aminohappo mg/g %

Asp 88,4 12,6

Thr 49,41 7,0

Ser 37,87 5,4

Glu 156,38 22,3 10 Gly 11,01 1,6

Ala 36,64 5,2

Vai 45,7 6,5

Cys 12,07 1,7

Met 12,63 1,8 15 Ile 31 4,4

Leu 57,95 8,3

Tyr 20,65 2,9

Phe 2,37 0,3

Lys 90,96 13,0 20 His 12,92 1,8

Arg 18,36 2,6

Pro 16,87 2,4

Trp + + 25 Yhteensä 701,19 100 • · 94088 13

Taulukko 2: Esimerkin 7 mukaan tehdyn, sumutus- kuivatun PKU-proteiinihydrolysaatin koostumus

Proteiini 66,0 % 5 Tuhka 6,0 %

Vesi 4,4 %

Laktoosi 12,1 %

Natrium 12,7 g/kg proteiinia 10 Kalium 26,1 g/kg proteiinia

Kalsium 5,8 g/kg proteiinia

Kloridi 6,1 g/kg proteiinia

Fosfori 3,2 g/kg proteiinia 15 Esimerkki 8

Mitattiin 4,2 kg esimerkin 2 mukaisesti tehtyä pro-teiinihydrolysaattikonsentraattia 6,3 kg:aan vettä. Saatu liuos, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 20 paino-% ja pH 6,7, pumpattiin 50 1 XAD-16 -adsorptiohartsipylvääseen lineaa-20 rivirtausnopeudella 1,3 m/h lämpötilassa 55 °C. Proteii-nihydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä elu-oitiin vedellä samalla virtausnopeudella.

Proteiinisaanto oli n. 50 % ja kuiva-ainesaanto n.

55 %. Tuotejakeen proteiinista oli fenyylialaniinia n. 0,3 ·.. 25 %.

Esimerkki 9

Liuotettiin 22 g esimerkin 1 mukaan tehtyä proteii-nihydrolysaattijauhetta 88 cm3:iin 80 - 90 °C vettä. Liuoksen pH säädettiin 30 % HCl:llä pH 3,5:een ja liuos pumpat-30 tiin 180 cm3 XAD-16 -adsorptiohartsipylvääseen lineaari-virtausnopeudella 0,9 m/h lämpötilassa 65 °C. Proteiini-hydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä eluoi-tiin vedellä samalla virtausnopeudella.

Proteiinisaanto oli n. 52 %. Tuotejakeen proteii-35 nista oli fenyylialaniinia n. 0,1 %.

14 94088

Ylimääräisen kloridin poistamiseksi tuoteliuos elektrodialysoitiin, minkä jälkeen se kuivattiin sumutus-kuivauksella .

Esimerkki 10 5 Toimittiin vastaavasti kuin esimerkissä 4, paitsi että liuoksen pH nostettiin 10,0reen 10 % NaOHrlla ennen hartsikäsittelyä. Voimakkaasti emäksisenä liuos ei tarvinnut voimakasta kuumennuskäsittelyä kirkastuakseen.

Proteiinisaanto oli n. 45 %. Tuoteliuoksessa fenyy-10 lialaniinia oli proteiinista 0,4 %.

Ylimääräinen natrium poistettiin liuoksesta elekt-rodialyysillä, minkä jälkeen liuos kuivattiin kylmäkui-vauksella.

Esimerkki 11 15 Liuotettiin 104 g soijaproteiinijauhoa (52 % prote iinipitoisuus) 1400 cm3:iin vettä. Kuumennettiin 65 °C:ssä 20 min, minkä jälkeen jäähdytettiin 50 °C:een. pH säädettiin 5 M Ca(OH)2:lla 8,5:een. Lisättiin 1,62 g pankreatii-nia (3 % proteiinin määrästä). pH:n annettiin laskea 7,0-20 :aan, minkä jälkeen hydrolysoitiin pH 7,0:ssa 5 h. pH säädettiin hydrolyysin aikana 5 M Ca(0H)2:lla. Hydrolysaatti ultrasuodatettiin cut-off 10 000 -kalvolla, permeaatti otettiin talteen ja konsentroitiin kuiva-aineeltaan 20 %-:iseksi.

25 Esimerkki 12

Mitattiin 38 cm3 esimerkin 11 mukaisesti tehtyä pro-teiinihydrolysaattia. Liuoksen pH säädettiin 30 % HClrllä arvoon 6,8 ja liuos pumpattiin 180 cm3 XAD-16 -adsorptio-hartsipylvääseen lineaarivirtausnopeudella 0,9 m/h lämpö-30 tilassa 65 °C. Proteiinihydrolysaattiliuospanoksen syötön jälkeen pylvästä eluoitiin vedellä samalla virtausnopeudella.

Proteiinisaanto oli n. 55 %, fenyylialaniinia 0,3 % proteiinista (taulukko 3). Tuote oli hyvän makuinen eikä 35 lainkaan kitkerä.

94088 15

Taulukko 3: Soijaproteiinin ja soijaproteiinista valmistetun PKU-proteiinin aminohappokoostumus (%) 5 Soijaproteiini PKU-proteiini (% proteiinista) (% proteiinista)

Asp 12,3 12,9

Thr 4,2 4,3

Ser 5,4 6,0 10 Glu 20,9 22,9

Gly 4,5 3,7

Ala 4,6 6,1

Vai 4,8 4,9

Cys 1,1 0,3 15 Met 1,2 0,8

Ile 4,7 2,5

Leu 7,7 3,5

Tyr 2,8 4,2

Phe 5,0 0,3 20 Lys 6,6 10,3

His 2,8 2,3

Arg 6,8 11,1

Pro 4,8 2,0 #> 25 Tot 100,0 100,0

Esimerkki 13 PK AID III:n, pankreatiinihydrolysaatin sekä hart-sikäsitellyn pankreatiinihydrolysaatin makuvertailussa 30 testiin osallistujat (6 kpl) antoivat pisteitä 0-3 seuraa-van asteikon mukaisesti: 0 = ei lainkaan kitkerä 1 = hieman kitkerä 2 = selvästi kitkerä 35 3 = erittäin kitkerä.

16 94088

Patenttihakemuksessa kuvatulla menetelmällä valmistetun PKU-proteiinin pisteiden keskiarvo oli 0,2, PK AID III:n 1,8 ja entsyymikäsitellyn proteiinin 3,0. Kaikkien osallistujien mielestä patenttihakemuksessa kuvatulla me-5 netelmällä valmistettu PKU-proteiini oli selvästi vähiten kitkerä, viiden osallistujan mielestä ei lainkaan kitkerä.

Claims

94088
1. Menetelmä fenyylialaniinin poistamiseksi prote-iinipitoisista koostumuksista, tunnettu siitä, 5 että a) proteiinipitoisen koostumuksen sisältämä proteiini pilkotaan entsymaattisesti proteolyyttisellä entsyymillä proteiinihydrolysaatiksi, jonka hydrolysoitumisaste on noin 30 - 60 %, 10 b) näin saatu proteiinihydrolysaatti ultrasuodate- taan ja permeaatti otetaan talteen, c) haluttaessa liuoksen pH:ta säädetään alueella 2 - 10 suolahapolla tai lipeällä, d) näin saatu proteiinihydrolysaatti johdetaan 15 adsorptiohartsilla täytetyn pylvään läpi lineaarivirtaus- nopeudella 0,1 - 1,3 m/h, lämpötilassa 5-65 °C, e) pylvästä eluoidaan vedellä lineaarivirtaus-nopeudella 0,1 - 1,3 m/h, f) otetaan talteen jae, josta fenyylialaniini on 20 poistettu, g) tarvittaessa talteenotetusta jakeesta poistetaan suoloja, ja h) lopuksi talteenotettu jae konsentroidaan kuiva-ainepitoisuuteen 70 - 80 paino-% ja haluttaessa kuivataan. ..25 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinipitoinen koostumus on heraproteiinia tai soijaproteiinia.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteolyyttinen entsyymi on 30 pankreatiini.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pankreatiinia käytetään noin 3 paino-% proteiinin määrästä laskettuna.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen me- 35 netelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa b) tai- • · 94088 teenotettu permeaatti konsentroidaan ja kuivataan edullisesti sumutuskuivauksella jauheeksi, joka ennen jatkokäsittelyä liuotetaan kuumaan veteen.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me-5 netelmä, tunnettu siitä, että adsorptiohartsina käytetään hydrofobista polystyreenirunkoista hartsia.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että adsorptiohartsilla täytetyn pylvään läpi johdetaan proteiinihydrolysaatti- 10 liuosta, jonka pH on 6,5 - 7,0.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsikäsittelyläm-pötila on noin 30 °C. *
9. U 8 8