FI68503C - Foerfarande foer framstaellning av enzymatiskt totalhydrolysatav vassleproteiner - Google Patents

Description

R5^1 ΓΒ1 m/^ULUTUSJULKA.SU Π T

lBJ (11) UTLÄGG Nl NGSSKRIFT OODUO

C (45) Patentti myönnetty 10 10 1935 Patent rfddclct (51) Kv.lkt/Int.CI.4 A 23 J 1/20 S U O M I—- FI N L A N D (21) Patenttihakemus — Patentansökning 802011 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 23 06 80 iFh ' ' (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 23.06.80 (41) Tullut julkiseksi — Bllvit offentlig 27 j2 80

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksi panon ja kuul.julkaisun pvm. -

Patent- och registerstyrelsen ' 1 Ansökan utlagd och utl.skriften publieerad 28.Ο6.85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begärd prioritet 26.06.79

Ranska-Frankr i ke (FR) 79161+83 Toteennäy tetty-Styrkt (71) Rou ssel-Uclaf, 33 Boulevard des Invalides, 75007 Paris, Ranska-F rankr i ke(FR) (72) Jean-Louis Maubois, Pace, Loic Roger, Rennes,

Gerard Brule, Rennes, Michel Piot, Rennes, Ranska-Frankrike(FR) {Ib) Leitz inger Oy (5l+) Menetelmä valmistaa entsymaattista kokona i shydrol ysaatt i a heraproteiineista - Förfarande för framstä11 ning av enzymatiskt tota1hydrolysat av vassleproteiner

Oheisen keksinnön kohteena on heran käsittely ja tarkemmin sanoen entsymaattinen hydrolyysiprosessi, jossa käytetään entsyymiä, joka kykenee proteolysoimaan kaikki heran proteiinit, edullisesti pankreatiinia.

Hera on yleisesti tunnettu meijeriteollisuuden sivutuote. Sen koostumus on suurin piirtein sama kuin kuoritun maidon ilman kaseiinia. Happoheraa saadaan tekemällä maito happameksi joko lisäämällä epäorgaanista happoa tai tuottamalla maitohappoa (siirrostamalla maitoon maitohappofermenttejä) lähellä kaseiinin isoelektristä pistettä olevassa pH-arvossa. Hera otetaan talteen juoksettuneen maidon erottamisen jälkeen. Kaseiini saadaan flokkuloitumaan tai koaguloitumaan myös lisäämällä maitoon juoksutinta. Synereesin jälkeen saatua heraa kutsutaan juoksutin-heraksi. Jos flokkuloituminen tapahtuu maidon pH-arvossa tai hieman alhaisemmassa pH-arvossa mutta pH-arvossa yli 5,8 - 6,0, heraa kutsutaan makeaksi heraksi.

2 68503

Hera määritellään sen vuoksi maidon koaguloitumisen laadun perusteella. Juustoteollisuudessa suurin osa heroista on itse asiassa sekaheroja, joissa jokin koagulointitapahtuma on ensisijainen. Makeita heroja saadaan keitetyistä tai keittämättömistä puristetuista juusto-massoista (Emmental, Gruyere, Cheddar, Cantal, Saint-Paulin). Happo-heraa saadaan pääasiassa tuoreiden ji.uustomassojen valmistuksesta ja kaseiinitehtaista. Monenlaisia heroja saadaan myös useimpien pehmeiden juustomassojen ja marmoroitujen juustomassojen (sinihome-juusto) valmistuksesta. Herojen koostumus voi siten vaihdella jokseenkin laajoissa rajoissa riippuen lähtöaineena käytetystä maidosta ja käytetystä juustonvalmistustavasta. Kaikki herat sisältävät mineraa-lirasvoja, jonkinoverran maitohappoa, koagulointientsyymejä kaikkein mielenkiintoisimman jakeen ollessa ilmeisesti typpipitoinen jae.

Itse asiassa juuri typpipitoinen jae oleellisesti sisältää liukoiset maitoproteiinit, joilla on korkea biologinen arvo.

Heran kolme traditionaalista käyttökohdetta ovat olleet levittäminen pelloille, johtaminen vesiväyliin ja käyttö eläinrehuina. Nykyään on jo ehdotettu, että herat käsitellään teollisesti, esimerkiksi väkevöimällä ja kuivaamalla kuljetus-, varastointi- ja säilytyskus-tannusten pienentämiseksi. Uuden teknologian avulla on mahdollista erottaa selektiivisesti, väkevöidä ja puhdistaa heran ainesosat ja muuntaa niiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ja kuitenkin samalla säilyttää ja parantaa niiden ravitsemuksellista laatua. Tällaisten tekniikoiden seurauksena voidaan valmistaa sekä ravitsemukselliselta että teknologiselta kannalta uusia ja vaihtelevia tuotteita. Näistä tekniikoista mainittakoon "demineralisointi" ja molekyylisuodatus. Proteiinien ja rasvan ja toisaalta laktoosien ja mineraalisuolojen molekyylikokojen eron vuoksi ne voidaan erottaa suodattamalla, erityisesti ultrasuodattamälla. Tällöin saadaan runsas-proteiininen liuos, joka muodostaa arvokkaan herajakeen, sekä "laktoo-simehuna" tunnettu liuos, joka sisältää laktoosia ja mineraalisuo-loja.

Vaikkakin proteiinit ovat suhteellisesti katsoen pieni osa heran kuiva-ainepitoisuudesta (alle 12 %), niihin kohdistuva mielenkiinto lisää tämän sivutuotteen arvoa. Proteiinijae, joka oleellisesti si- · sältää liukoisia maitoproteiineja, $-laktoglobuliinia, a-lakta-albu-miinia ja seerumialbumiinia ja immunoglobuliineja, on mielenkiintoinen ravitsemuksellisen arvonsa ja funktionaalisten ominaisuukseensa vuoksi.

3 68503

Maitoproteiineista on saatavissa mielenkiintoista informaatiota H.A. Mc Kenzie'n teoksessa Milk Proteins, volyymit 1 ja 2, Academic Press, New Yörk, 1971. Heroista saaduilla proteiinikonsentraateilla on suuri ravitsemuksellinen arvo: kts. esimerkiksi seuraavia artikkeleita: E. Forsum, Nutritional Evaluation of Whey Protein Concentrates and their Fractions. J. Dairy Sc.57 (6) 665-670 1974; E. Forsum,

Whey Proteins for Food and Feed Supplement, Protein Nutritional Quality of Foods and Feeds, osa II, toim. Marcel Dekker, I.N.C.

New York, 433-470, 1975; E. Forsum, Effect of Dietary Lactose on Nitrogen Utilization of Whey Protein Concentrate and its Corresponding Amino Acid Mixture, Nutrition Reports International, 11 (5), 419-428, 1975; E. Forsum, Use of Whey Protein Concentrate as a Supplement too Maize, Rice and Potatoes. A. Chemical and Biological Evaluation Using Growing Rats, J. Nutrition, 105(2), 147-153, 1977.

Proteiinin tai proteiinipitoisen, typpipitoisen ravintoaineen ravitsemuksellisen arvon määrittämiseksi verrataan oleellisten aminohappojen koostumusta vertailuproteiiniin. Valitusta vertailuproteiinista riippumatta heraproteiinien koostumus on hyvin tasapainoinen. Erityisesti havaitaan lysiinin, tryptofaanin ja treoniinin pitoisuuksien olevan korkeampia, kysteiinipitoisuuden olevan korkeamman maitoon verrattuna ja fenyylialaniinin ja metioniinin pitoisuuksien olevan alhaisia. Lisäksi tiedetään, että pelkän aminohapon olemassaolon ravintoaineessa ei tarvitse välttämättä merkitä, että organismi voi sen ilman muuta täyttää. Käsittely, joka kohdistetaan tuotteeseen ennen sen haihduttamista, voi tehdä eräät aminohapot ainakin osittain käyttökelvottomiksi. C. Cheftel ja H. Cheftel ovat tehneet tämän havainnon teoksessaan Brunissement non Enzymatique, Biochemie et Technologie des Aliments, vol.l (3), 3 Technique de Docuemntation Ed, Pariisi, 1976.

Vanhimmassa tavassa, jolla proteiineja uutetaan herasta, tehdään ne liukenemattomiksi denaturoivalla lämpökäsittelyllä lähellä niiden isoelektristä pistettä olevassa pH-arvossa. Tällaisen tekniikan ilmeinen haitta on, että se denaturoi proteiinit. Proteiinien eristämiseksi saostamalla ja/tai Tkömpleksoimalla" on siten ehdotettu muita menetelmiä. Esimerkkinä voidaan mainita proteiinien adsorboiminen ioninvaihtohartsiin tai kemiallisten reagenssien lisääminen proteiinien kompleksoimiseksi tai saostamiseksi. Nämä eri tekniikat ovat oleellisesti pysyneet laboratoriotasolla. Lisäksi on ehdotettu 68503 kromatograafisiä ioninvaihtomenetelmiä. Vart. B. Mirabel/ Nouveau Procede d'Extraction des Proteins du Lactoserum. Ann. de la Nutrition et de 1'Alimentation, 32 (2-3), 243-253, 1978.

Heraan on sovellettu myös suodattamista geelin läpi. Tällaisella suodatusmenetelmällä on eräitä haittoja. Siinä esiintyy proteiinien esi-väkevöintiä, joiden ei tulisi denaturoitua. Tällöin on olemassa vaara, että muutetaan eri jakeiden välistä resoluutiota. Nämä jakeet on sen jälkeen väkevöitävä ja kuivattava. Tämän menetelmän suorittamisen vaikeus on syy siihen, miksi tätä tekniikkaa on käytetty vain rajoitetusti .

Meijeriteollisuudessa on laajalta alettu käyttää maidon käsittelemiseen /N.L. Maubois ja G.Mocquot, Preparation de Fromage ä partir de "Prefromage Liquide obtenu par ultrafiltration du lait", Le Lait, 51 (508)" 495-533,(1970/ ja myös heran käsittelemiseen (R.I.Fenton-May, C.G. Hill ja C.H. Amundson, Use of Ultrafiltration-Reverse Osmosis Systems for the Concentration and Fractionation of Whey, J. Food, Sc., 36(14), 1971). ultrasuodatusta membraanin läpi sen ansiosta, että sekä laitteiston suhteen että havaittujen ilmiöiden ymmärtämisen suhteen on edistytty. Sen aikana, kun hera kulkee ultrasuodatusmembraanin läpi, vesi, liukoiset mineraalit, laktoosi, pienimolekyylipainoiset typpiyhdisteet (peptidit, vapaat aminohapot) ja vesiliukoiset vitamiinit kulkevat membraanin läpi uitrasuodoksena tai permeaattina; toisaalta proteiinit ja niihin liittyvät komponentit (kalsium, fosfori), rasvapalloset ja lipofiiliset aineet pidättyvät ja väkevöityvät vesifaasin pienentyessä: Ne muodostavat "retentaatin" eli proteiinikonsentraatin. Erittäin puhtaan proteiinikonsentraatin saamiseksi on käytettävä sekä ultrasuodatusta että diasuodatusta. Diasuodatuksessa lisätään ultrasuodatusretentaattiin jatkuvasti tai ajoittain vettä tai vesiliuosta, joka sisältää suoloja. Samanaikaisesti tai tämän jälkeen poistetaan yhtä suuri määrä permeaattia. Tällainen toimenpide pienentää suodatettavien aineiden määrää retentaatissa. Varmojen ravitsemuksellisten ominaisuuksien lisäksi konsentraatti-muodossa olevilla heraproteiineilla on mielenkiintoisia funktionaalisia ominaisuuksia. Tästä aiheesta on olemassa lukuisia artikkeleita, kts. esimerkiksi J.E. Kinsella, Functional Properties of Proteins in Foods: a Survey. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1976 .

5 66503

Keksinnön tavoitteena on heraproteiinien uusi käyttötapa, erityisesti ihmisten ravitsemiseen. Lääketieteen ja kirurgian nopean edistymisen ansiosta eloon jää lukuisia potilaita, joille syöminen ja uudelleen sopeutuminen normaaleihin ruokiin on tullut merkittäväksi ongelmaksi' (edistymistä kirurgisessa tekniikassa mutta ei tehohoidossa). Tehohoidon jokaisessa vaiheessa metabolisesta terapiasta normaaliin ravitsemukseen asti ravintoseos on tarkasti sovitettava potilaan vaatimuksiin .

Uusien ravitsemus tekniikoiden, kuten jatkuvan pieninopeuksisen enteerinen ravitsemuksen (kts. E. Levy, Alimentation Enterale Continue, Principe-Technique. Indications, Resultats. 64 (4), 235-256, 1976) avulla on mahdollista käyttää ravinteet optimaalisesti siirtämällä ne suoraan valmiissa tilassa käyttö- tai vaikutuspaikkaansa. Vajaan sulatustapahtuman määrittämisen jälkeen tulee siten kysymykseen toiminnan palauttaminen ja mahdollisesti sen kiihottaminen lähes normaaliin aktiivisuuteen. Tällaisten korviketuotteiden teollisessa valmistuksessa itse asiassa reprodusoidaan in vitro vajaa toiminta, joka voi vaihdella sulattamisen tai pureskelun mahdottomuudesta tiettyihin entsymaattisiin puutteellisuuksiin tai häiriöihin.

Lisäksi tiedetään, että liukoisten maitoproteiinien varsinainen pro-teolyysi tapahtuu suolistossa haimaproteaasien vaikutuksesta. Kts. lähteenä B. Blanc, Digestibility of Proteins, Int. Dairy Federation Comission F, Final Report, Doc. 57, 1976; G.M. Gray ja H.L. Copper, Protein Digestion and Adsorption. Gastroenterology, 61 (535), 1971. Tällä hetkellä ponnistellaan sellaisten entsymaattisten hydrolysaat-tien kehittämiseksi, jotka ihmiskeho pystyy helposti absorboimaan.

Keksinnön kohteena on sellaisten heraproteiinien saanti vesipitoisesta proteiinihydrolysaatista, jotka suoliston limamembraani pystyy suoraan assimiloimaan ja jotka pystyvät kiihottamaan puutteellisia entsyy-misysfceemejä.

Lopuksi mainittakoon, että tunnetaan lukuisia proteiinien, esimerkiksi maitoproteiinien hydrolyysimenetelmiä. Happohydrolyysi tuottaa itse asiassa vapaiden aminohappojen liuoksia. Happohydrolyysi tuhoaa eräitä aminohappoja. Alkalinen hydrolyysi säilyttää tryptofäänin mutta aiheuttaa liukenemattomuutta, joka selvästi pienentää alkuperäisten proteiinikonsentraattien ravintoarvoa.

______ _ II . --- 6 68503

Tunnettua entsymaattista proteolyysiä on jo kauan käytetty analyyttisiin ja ravintotarkoituksiin. Päätavoite on proteiinien tekeminen liukoisiksi. Kirjallisuudessa on melkoisesti mainintoja elintarvike-laatuisten soijapapuproteiinihydrolysaattien lukuisista käyttötarkoituksista (kts. D. Arai, M. Moguchi, S. Kurosawa, H. Kato, M.

Fujimaki, Applying Proteolytic Enzymes on Soybeans, 6-Deodorization Effect, 1970; kalaproteiinien suhteen kts. P. Heviä, J.R. Whitaker ja H.S. Olcott, Solubilization of a Fish Protein Concentrate with Proteolytic Enzymes, J. Agri. Food Chem., 24 (2), 383-385, 1976; tai rapsinauriin käsittelystä kasvis-, mikrobi- tai eläinproteaaseil-la.

Näiden menetelmien soveltaminen teollisessa mitassa maitoproteiinei-hin on kuitenkin pysynyt hyvin rajoitettuna. Entsymaattisella pro-teolyysillä ei ole kemiallisten menetelmien haittoja. Hydrolyysin olosuhteet ovat lieviä ja siten säilyttävät tuotteiden ravitsemuksellisen laadun.

Yleensä hydrolyysi tuottaa peptidejä, joilla on selvä kitkerä maku.

Tämä ominaisuus rajoittaa hydrolysaattien käyttöä ihmisten ravintona. Hydrolysaatin kitkeryysaste riippuu pääasiassa proteiimisubstraatin laadusta ja entsyymien spesifisestä luonteesta. Kitkeryys on ehdotettu poistettavaksi käyttämällä hyväksi eksopeptidaasien vaikutusta. Kts. esimerkiksi S. Arai M. Yamashita, H. Kato, M. Fujimaki, Agri.

Biol. Chem., 34 (729), 1970, ja K.M. Clegg, G. Smith ja A.L. Walker, Production of Enzymatic Hydrolysate of Casin on a Kilogram Scale, J. Food Technol. 9 425-431, 1974. Lisäksi on ehdotettu, että peptidejä modifioitaisiin lisäämällä glutamiinihappoja ennen plasteiini-reaktiota. Myös hydrofobisten aminohappojen poistaminen on mahdollista.

Kaikki tunnetut tekniikat ovat kuitenkin epätyydyttäviä eivätkä voi täyttää tämän keksinnön vaatimuksia. Itse asiassa eksopeptidaasin käytöstä johtuva täydellinen liukeneminen lisää vapaiden aminohappojen pitoisuutta ja tarkemmin sanoen arginiinin, lysiinin, tyrosiinin, valiinin, fenyylialaniinin, metioniinin ja leusiinin pitoisuuksia, minkä suorana seurauksena ylikuormitetaan siirtojärjestelmät vapailla aminohapoilla suolirajalla ja sitten pienennetään hydrolysaattien ravitsemuksellista tehokkuutta. Lisäksi muutetaan hydrolysaateille ominaista laatua, koska itse aminohappojen tasapaino muuttuu, minkä vuoksi vapaita aminohappoja on täydennettävä.

68503

Esimerkkinä mainittakoon tekniikan tasoa kuvaava USA-patentti 2,180,637. Tässä patentissa on esitetty menetelmä, jolla valmistetaan puhdistettuja aminohappoja tietyistä proteiinijakeista, joista parhaimpana pidetään maitokaseiiniä. Menetelmä voi käsittää entsymaat-tisen hydrolyysin emäksisessä mediumissa ja sillä saadaan denaturoi-tumattomien puhtaiden aminohappojen seos. Käyttökelpoisten entsyymien joukossa mainitaan haiman entsyymit. Tällaisella hydrolyysillä saadaan vapaita aminohappoja, kuten on osoitettu USA-patentin 2,180,637 selitysosassa. Tässä patehtissa esitetyn menetelmän tavoitteena on saada proteiinihydrolysaatteja, jotka sisältävät mahdollisimman suuren määrän vapaita aminohappoja kokonaishydrolyysin ansiosta, joka on suoritettava pitämällä entsyymi ja substraatti pitkän aikaa kosketuksessa toistensa kanssa. Saadun tuotteen ei siten välttämättä tarvitse olla vapaa entsyymeistä. USA-patentin 2,180,637 mukaisesti saadun tuotteen koostumus ei sovi vapaan aminohappokoostumuksensa vuoksi tietyille sovellutusaloille, kuten ihmisten tehohoitoon ja terapeuttiseen ravitsemukseen.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat itse asiassa osoittaneet, että pikemminkin on tarkoituksenmukaista käyttää peptidien seoksia vapaiden aminohappojen asemesta (kts. esimerkiksi D.B.A. Silk in Peptide Transport and Hydrolysis, CIBA Foundation Symposium, Elservier Excerpts Medica North. Hollanti, 50, 1977). Sen vuoksi on kehotettava välttämään antamasta tuotteita, jotka oleellisesti sisältävät vapaita aminohappoja, niiden haittojen vuoksi, joita sillä voi olla kliinisen soveltamisen aikana, mikä johtuu siitä, että vapaat aminohapot eivät.ole-välittömästi assimiloitumiskelpoisia eivätkä ole vaarattomia ihmiskeholle (kts. esimerkiksi D.M. Matthews, Intestinal Adsorption of Peptides, Physiological Review, 55 (4), lokakuu 1975). Uudet tutkimukset osoittavat, että tuotteiden "osmolaalisuus" on otettava huomioon. Peptidituotteiden osmolaalisuuden tiedetään olevan paljon vähäisempi kuin vastaavien, vapaita aminohappoja sisältävien tuotteiden. Mitä alhaisempi osmolaalisuus on, sitä paremmin ihmiskeho pystyy assimiloimaan välittömästi. Näin ollen on olemassa tarve tuotteista, jotka ovat välittömästi assimiloituvissa ja vaarattomia ihmiskeholle ja jotka sopivat esimerkiksi terpeuttiseen ravitsemukseen tai ravitsemukseen tehohoidossa.

Hakijoiden tietämän mukaan ei ole koskaan ehdotettu entsymaattisen kokonaishydrolysaatin valmistamista käyttämällä heraproteiineja eikä 8 68503 TT" --- niiden suoraa käyttöä täyttämään ihmisten ravitsemuksen tarkkaan määrätyt vaatimukset.

Teknilliseltä kannalta entsymaattisessa hydrolyysissä tarvitaan useimmiten panostyyppistä reaktorijärjestelmää. Entsyymi lisätään käsiteltävään proteiinipitoiseen liuokseen. Pidemmän tai lyhyemmän viipymä-ajan jälkeen olosuhteissa, jotka ovat suotuisia entsymaattisen aktiivisuuden kannalta ja joissa vaikutetaan substraattiin, pH-arvoa muutetaan ja entsyymi inaktivoidaan lievällä lämpökäsittelyllä. Liukenemattoman jakeen poistamiseen voidaan käyttää sentrifugoimista. Panostyyppisen entsymaattisen hydrolyysitekniikan vuoksi on kuitenkin vaikea käyttää korkeaa entsyymin suhdetta substraattiin. Entsyymin suhteella substraattiin tiedetään, kts. R.C. Robins, Effect of Ratio of Enzymes to Substrate on Amino Acid Patterns Released from Proteins in Vitro, Internat. J. Vit. Nutri, Res., 48, 44-52, 1978, olevan ratkaiseva vaikutus vapaiden aminohappojen ja vapaiden peptidien laatuun proteolyysin aikana. Epäjatkuvassa tai panosmenetelmässä entsyymit on tuhottava hydrolyysin lopussa, kun niitä on ylimäärä.

Tämä on ehdottoman välttämätöntä, kun käytetään edellä mainittuja suuria suhteita.

Myös reaktoreita, joissa entsyymit on sidottu, on ehdotettu käytettäväksi. Näillä on kuitenkin huomattavia haittoja käytännön kannalta.

Itse asiassa entsyymiaktiivisuuden optimiolosuhde tietyissä pH-oloissa riippuu ajasta, joten reaktori ei toimi koko ajan tyydyttävästi. Lisäksi on havaittu bakteriologisia ongelmia, kiinnityspetien tukkeutumista ja proteiinien absorboitumista tukiaineeseen heran käsittelyn tapauksessa. Entsymaattisella reaktiolla on lisäksi taipumus inhibitoitua ajan kuluessa, koska entsyymistä ja proteiinista muodostuu fragmenttikompleksi. Inhiboituminen voi myös johtua substraatin laadusta. Lisäksi on vaikea käyttää monientsyymisiä järjestelmiä, koska entsyymin ja substraatin välillä tapahtuu kilpailevia ilmiöitä ja koska entsyymien stabiilisuudet vaihtelevat ajan mukana. Keksinnössä käytetään hyödyksi jo tietyissä muissa sovellutuksissa tunnettua tapaa, jossa käytetään membraani-entsyymi-reaktoreita. Viitteenä mainittakoon C. Cheftel'in artikkeli Solubilisation Enzymatique Continue du Concentre Proteique de poisson. Essai de recyclage des enzymes. Ann. Technol. Agri., 21(3), 423-433, 1972, jossa on esitetty kalaproteiinikonsentraattien proteo-lyysiin sovellettu membraanireaktori. Ultrasuodatusmembraani pidättää 9 68503 reaktorissa entsyymin liuoksessa, kuten myös proteiinipitoisen substraatin. Vain hydrolyysituotteet, peptidit, eliminoituvat sitä mukaan kun niitä muodostuu. Tällaisen reaktorin käyttö käytännössä ei ole kuitenkaan niin helppoa kuin mitä Cheftel arvioi. Entsyymin on liuennettava substraatti kokonaan ja proteiinipitoisen liuoksen bakteriologisen laadun on oltava moitteeton.

Tällainen on tekniikan taso, mitä tulee heraproteiinien laadun parantumiseen, erityisesti entsymaattisella hydrolyysi1la. Yhteenvetona mainittakoon, että yhdessäkään hakijan tuntemassa viitteessä ei ole ehdotettu entsymaattista heraproteiinin kokonais-hydrolysaattia, joka voitaisiin käyttää täyttämään ihmisten ravitsemuksen tarkkaan määrätyt vaatimukset.

Keksinnön yleisenä tavoitteena on menetelmä valmistaa heraproteiinien entsymaattista kokonaishydrolysaattia, joka sisältää peptidi-hydrolysaattia, jossa ei ole käytännöllisesti katsoen lainkaan jäännösproteiineja ja jonka peptideistä vähintään 50 % sisältää 2-5 aminohappoa. Edullisesti valmistetut hydrolysaatit sisältävät 70 - 90 % typpeä peptideinä, jossa aminohappojen määrä on pienempi kuin 10.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, että heran ultrasuodatusretentaatti saatetaan kosketukseen proteolyyttisen entsyymin kanssa, joka täysin kykenee hajottamaan heraproteiinit ihmiskehon sulatusolosuhteissa, joka entsyymi on pankreatiini haimauutteen tai synteettiseoksen muodossa, joka sisältää trypsiiniä ja kymotrypsiiniä ja muita sekundäärisiä luonnon haimauutteessa esiintyviä entsyymejä, jota entsyymiä käytetään suhteessa substraattiin 8-15 painoprosenttia, edullisesti 12 painoprosenttia, hydro-lyysiä jatketaan, kunnes tuote ei enää lainkaan sisällä jäännös-proteiineja, so. se ei sisällä typpeä, joka saostuu 12-prosentti-sella trikloorietikkahapossa, ja kunnes saadaan peptidihydroly-saatti, jonka peptideistä vähintän 50 % sisältää 2-5 aminohappoa ja jossa vapaiden aminohappojen määrä on alle 15 %, minkä jälkeen saatu hydrolysaatti otetaan talteen.

__- TT" ------ ίο 6 85 0 3

Kuten edellä mainittiin, tällainen menetelmä suoritetaan edullisesti laitteessa, jossa on yhdistetty ultrasuodatuslaitteisto ja memebraa-nientsyymireaktori, mikä sallii jatkuvatoimisen käytön. Tämän yhdistelmän ja heraproteiinien käsittelyyn sovitettujen reaktioparamet-rien valinnan ansiosta keksinnön avulla saadaan näistä proteiineista entsymaattista kokonaishydrolysaattia. Hydrolyysi on tähän mennessä ollut vain osittaista ja juuri tästä seikasta johtuen saadut tuotteet eivät ole täyttäneet tämän keksinnön vaatimuksia.

Lähes kaikki saadut peptidit sisältävät 2 - 5 % aminohappoa, mistä johtuen keksinnön mukainen tuote täyttää spesifiset ravintovaatimuk-set. Vapaita happoja on yleensä 10 - 15 % typpijakeesta. Emäksiset aminohapot (arginiini ja lysiini) ja aromaattiset aminohapot (trypto-faani, fenyylialaniini, tyrosiini) ja leusiini muodostavat oleellisen osan vapaista aminohapoista. Myöhemmät esimerkit havainnollistavat eräiden hydrolysaattiluokkien koostumuksia esimerkkimäisesti.

Flokkulaatiojakeen ja kelluvan jakeen, joka on saatu väkevöimällä haihduttamalla 100 g per litra reaktorista poistuvaa hydrolysaattia, aminohappokoostumuksen samankaltaisuus on osoitus hydrofobisten ja hydrofiilisten ominaisuuksien tasaisesta jakaantumisesta eri peptidi luokkien kesken. Väkevöintiä voidaan jatkaa, kunnes päästään korkeaan kuiva-ainepitoisuuteen, joka voi olla jopa 25 % ennen spraykuivausta.

Maitoproteiineista saaduilla hydrolysaateilla tiedetään olevan erinomainen biologinen arvo. Ne täyttävät sen vuoksi potilaiden, jotka kärsivät haiman toiminnanvajavuuksista, tai metaboliapotilainen ravin-tovaatimukset. Keksintöä voidaan siten soveltaa suoraan dieettiravin-toihin, jotka ihmiskeho kykenee täysin assimiloimaan, koska ne pystyvät kulkemaan suoliesteen läpi ja siten sulavat ja assimiloituvat hyvin. Keksinnön eräänä kohteena on siten tehohoitoon tarkoitettu ravinto, joka sisältää aktiivisena ainesosana keksinnön mukaista, heraproteiinien entsymaattien kokonaishydrolysaattiin perustuvaa tuotetta, mahdollisesti yhdistelmänä neutraalin väliaineen kanssa, joka sopii oraaliseen syöttämiseen tai enteraaliseen antamistapaan.

Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena voidaan käyttää mitä tahansa heraa. Esimerkiksi voidaan käyttää teollista alkuperää olevaa 68503 11 heraa, erityisesti sekoitettuna herojen kanssa, jotka on saatu sekoittamalla erilaisten juustojen valmistuksen heroja. Voidaan käyttää heraa, joka on valmistettu raa'asta maidosta tai lämpökäsitellystä maidosta saostamalla maitohapolla tai juoksuttimella. Eräänä muunnelmana voidaan kuitenkin käyttää myös rekonstituoitua heraa. Alkuperäinen hera voi olla kuorimisen jälkeen lämpökäsitelty esimerkiksi lämpötilassa noin 58 - 60°C. Sen jälkeen se voi olla väkevöity haihduttamalla. Sen jälkeen esikonsentraatti mahdollisesti laimennetaan laktoosin liiallisen kiteytymisen estämiseksi ja pidetään lämpötilassa noin 4°C. Tarkoituksenmukaista on käyttää heraproteiinikonsentraatteja, jotka on rekonstituoitu jauheesta.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu heraproteiineihin riippumatta menetelmästä, jolla ne on valmistettu. Heraproteiinit voivat siten olla eristettyjä millä tahansa tunnetulla tavalla ennen entsymaattista hydrolyysiä. Proteiinit voidaan esimerkiksi saada koaguloitumaan kuumentamalla. Proteiinit saadaan kuitenkin parhaiten ultrasuodatta-malla heraa, koska tämä toimenpide ei aiheuta lainkaan denaturoitumista. Eri syistä, esimerkiksi taloudellisista syistä keksinnön mukaista menetelmää voidaan menestyksellisesti soveltaa proteiineihin, jotka on saostettu herasta lämmön avulla.

Hera tai esikonsentraatti on edullisesti puhdistettu ultrasuodatta-malla tai diasuodattamalla. Tämän jälkeen eri retentaatit kuivataan, esimerkiksi spray-kuivaamalla.

Ultrasuodatuksen aikana käytetään ammattimiehilie tunnettuja tapoja, esimerkiksi tapoja, joita on havainnollistettu selityksen alussa mainituissa viitteissä. Erittäin puhtaan proteiinikonsentraatin valmistaminen suoritetaan yleensä kahdessa vaiheessa: Yksinkertainen ultrasuodatus ja sen jälkeen diasuodatus. Ultrasuodatusmembraanit ovat tavanomaisia: Sellaisia, joiden tiedetään pidättävän kaikki liukenevat heraproteiinit. Niiden erotusraja on yleensä välillä 500 ja 50.000. Membraanit voivat olla laadultaan minkälaisia tahansa. Ne voivat olla epäorgaanisia membraaneja sekä orgaanisia membraaneja. Orgaanisista membraaneista mainittakoon esimerkkeinä membraanit, jotka koostuvat seuraavista materiaaleista: Polyolefiini, polyakry-lonitriili, polyvinyylikloridi, selluloosa-asetaatti, polykarbonaatti tai muut samankaltaiset materiaalit. Epäorgaanisista membraaneista voidaan käyttää kaikenlaatuisia huokoisia substraatteja, jotka täyttä-

Il --- 12 68503 vat edelliset määritelmät. Kaikki nämä käsitteet ovat yleensä tunnettuja maidon tai heran ultrasuodatusta tunteville eikä niitä tarvitse sen vuoksi selittää yksityiskohtaisemmin.

Parhaimmat tulokset on saatu membraaneilla, joita on markkinoilla saatavissa kauppanimellä "Nuclepore". Näitä membraaneja on kuvattu H.W. Ballew'in, Nuclepore Corporation, 1978, esitekirjasessa nimeltä "Basics of Filtration and Separation". Nämä membraanit muodostuvat polykarbonaattikalvosta, jota on säteilytetty ionipommittamalla.

Huokoset ovat tarkkaan rajattuja sylinterimäisiä reikiä, joiden halkaisijan tarkkuus on + 15 %. Sen lisäksi, että nämä mikrosuodatus-membraanit pystyvät poistamaan liukenemattomat proteiinipitoiset, lipidi- tai lipoproteiinituotteet, ne pystyvät myös pidättämään mikro-organismit ja toimimaan ylimääräisenä sterilointikeinona.

Heran ultrasuodatuksen optimaalisten olosuhteiden aikaansaamiseksi käytännössä säädetään pH tiettyyn arvoon, yleensä välille 6 ja 7, heran alkuperästä (happokoagulointi tai juoksutinkoagulointi) riippuen. pH: n säätö voi oleellisesti parantaa laitteen suorituskykyä. Parantuminen korostuu, kun pH säädetään sen jälkeen, kun hera on esikuumen-nettu 80°C:een 15 sekunniksi (kts. J.F. Hayes, J.A. Dunkerly, L.L.

Muller ja A.T. Griffin, Studies on Whey Processing by Ultrafiltration II. Improving Premeation Rates by Preventing Fouling. The Australian L. of Dairy Tech., 38 (3), 132-140, 1974) . Permeutumisnopeuksia voidaan lisäksi parantaa poistamalla eräät mineraalit. Heran johtaminen ultra-suodatusmembraanin läpi, jonka erotusrajakynnys on natiivien proteiinien molekyylipainon yläpuolella, poistaa myös mikro-organismit, kaseiinihiukkaset ja aggregaattimuotoiset liukoiset proteiinit. Tämä heran esisuodatus lisää permeutumisnopeutta: kts. D.N. Lee ja R.L.

Merson, Chemical Treatments of Cottage Cheese whey to Reduce Fouling of Ultrafiltration Membrane, J. of Food Sc., 41, 778-786, 1976 ja D.N. Lee ja R.L. Merson, Prefiltration of Cottage Cheese whey to Reduce Fouling of Ultrafiltration Membranes, J. of Food Sc. 41, 403-410, 1976. Nämä tekijät ovat havainneet, että ultrasuodatusnopeut-ta voidaan parantaa lisäämällä epäorgaanista suolaa, kuten kalsium-kloridia tai natriumkloridia. Tätä käsittelyä voidaan harkita suoritettavaksi suodatuksen aikana, jotta saataisiin erittäin puhtaita proteiinikonsentraatteja optimiolosuhteissa.

Keksinnön eräässä edullisessa suoritusmuodossa yhdistetään heran ultra- 68503 13 suodatusvaiheeseen vaihe, jossa entsymaattisesti hydrolysoidaan heran ultrasuodatusretentaatti. Heraproteiinien saamistavasta riippumatta suoritetaan entsymaattinen hydrolyysi jatkuvatoimisesti lisäämällä proteiinikonsentraattia reaktiovyöhykkeeseen tarkoituksella saada se hyvin kosketukseen entsyymin kanssa, reaktiotuotteet poistetaan johtamalla ne reaktiovyöhykkeestä ultrasuodatusvyöhykkeeseen, jossa jatkuvatoimisesti poistetaan permeaattia, joka muodostaa peptidihydrolysaatin eli tuotteen, johon keksinnöllä on pyritty, ja jatketaan reaktiota, kunnes permeaatti on entsymaattinen kokonais-hydrolysaatti. Ultrasuodätusvyöhykkeessä voi olla kierrätys -reaktio-vyöhykkeeseen .

Syistä, jotka liittyvät, sekä reaktoreiden hyvään toimintaan että valmiiden tuotteiden päämäärään, heran ei-proteiiniyhdisteet on poistettava mahdollisimman hyvin. Siten on tarkoituksenmukaista, että mainitussa uitrasuodatusretentaatissa proteiini-kuiva-aineen pitoisuus on mahdollisimman korkea. Juuri näistä syistä on ehdotettu diasuodatusta ultrasuodatuksen jälkeen. Siinä tapauksessa, että mukana on pieni määrä jäännöslaktoosia, joka voi aiheuttaa useita haittoja valmiin tuotteen koostumukselle, tämä sokeri voidaan hydrolysoida. Kokeet ovat osoittaneet, että heraproteiinikonsentraattien entsymaattisella esihydrolyysillä ei ole haitallista vaikutusta muuhun proteiinihydrolyysiin. Seuraavassa tarkastellaan entsymaat-tisen reaktion parametreja, jotka ovat hyvin tärkeitä entsymaattisen kokonaishydrolysaatin valmistamiselle.

Ensiksikin reaktiovyöhykkeen pH on säädettävä välille 7 ja 9 käytettyjen entsyymien laatu huomioonottaen. Näiden entsyymien on kyettävä kokonaan hajottamaan heraproteiinit ihmiskehon sulatusolosuhteissa. Entsyymeistä käytetään parhaiten pankreatiinia, joka on trypsiiniä, kymotrypsiiniä ja muita proteolyyttisiä entsyymejä sisältävä monimutkainen seos. Käytännössä käytetään kaupallisesti helposti saatavissa olevaa haimauutetta. Tarvittaessa voidaan käyttää kuitenkin myös synteettisestä seoksesta saatuja entsyymejä, joiden koostumus en lähellä pankreatiinin koostumusta. Nämä seokset sisältävät siten oleellisesti trypsiiniä ja kymotrypsiiniä, tarvittaessa muiden sekundääristen, luonnon haimauutteessa läsnäolevien entsyymien kanssa. Keksinnön mukaisesti on havaittu, että pankreatiinin ja muiden samanlaisten entsyymien, jotka täyttävät keksinnön vaatimukset, stabiilisuus on suurimmillaan pH-arvossa välillä 7 ja 9 ja mieluummin välillä

TT

14 7 ja 8,5. 6850 3

Entsymaattisessa reaktiovyöhykkeessä on valvottava melko tarkasti lämpötiloja. Itse asiassa on havaittu, että lämpötila vaikuttaa pH:ta enemmän entsyymien aktiivisuuteen. Kokeet ovat osoittaneet, keksinnön mukaisesti, että trypsiinillä reaktiovyöhykkeen korkein lämpötila ei saa olla suurempi kuin 54°C ja kymotrypsiinillä tämä lämpötila ei saa ylittää 45°C. Käytännössä, kun käytetään pankreatii-nia, päädytään siten kompromissiin, jolloin otetaan huomioon suoliston proteolyysin optimaaliset olosuhteet (lämpötila on välillä 37 ja 40°C) ja se seikka, että korkeampi lämpötila on vähemmän suotuisa eliöiden kehittymiselle ja mahdollistaa suuremmat ultrasuodatusno-peudet. Lämpötilat noin 40°C on havaittu sopiviksi keksinnön tarpeiden kannalta.

Reaktion pH- ja lämpötilaparametrit liittyvät ilmeisestikin toisiinsa. pH-välille 7,5 - 8,5 sopivat siten lämpötilat noin 40 - 45°C.

Toinen tärkeä parametri reaktiovyöhykkeessä on entsyymikonsentraation suhde proteiinikonsentraatioon. Tämän suhteen on oltava korkea, kuten proteiinin in vivo hajotuksessakin. Pankreatiinin tapauksessa hyviä tuloksia on saatu, kun pankreatiini/substraatti-suhde on noin 8 -15 %, erityisesti noin 12 %.

Kaikki edellä mainitut parametrit valittiin niin, että kaikki proteiinit proteolysoituvat. Tällä tavoin vältetään lisäämästä niiden konsentraatiota reaktiossa ajan funktiona. Entsymaattisen hydrolyysin reaktoriin syötetty proteiiniliuos ei lisäksi saa sisältää ei-proteii-nikomponentteja, jotka membraani pystyy pidättämään. Membraanin on myös tehokkaasti pidätettävä entsyymi. Lisäksi, koska kyseessä ovat kulutukseen tarkoitetut tuotteet, käyttöolosuhteet eivät saa edistää mikrobien kasvua.

Optimaalisen entsyymihydrolyysin aikaansaamiseksi on tarkoituksenmukaista valita huolellisesti ultrasuodatusmembraani, jota käytetään entsyymireaktorin yhteydessä. Käytetyt membraanit ovat mitä tahansa tyyppiä, orgaanisia tai epäorgaanisia. Ne voivat olla tämän laatuisessa laitteessa tunnetusti käytettyinä moduleina. Hyviä tuloksia antanut membraanirakenne on moduli, joka muodostuu ontoista kuiduista. Havainnollisena esimerkkinä mainittakoon, että voidaan käyttää membraaneja, 68503 15 joita on kaupallisesti saatavissa Amicon'lta kauppanimellä HIO P 5 (erotusraja 5000) ja H10P10 (erotusraja 10.000) sekä membraaneja, joita on kaupallisesti saatavissa Romicon'lta kauppanimellä PM 2 (erotusraja 2.000) tai PM 50 (erotusraja 50.000).

Tärkeää on valita membraani, joka käytössä voi täyttää oheisen keksinnön vaatimukset ja joka erityisesti tehokkaasti pidättää entsyymin ja jolla on tyydyttävä suorituskyky, erityisesti käyttöiän suhteen. Käsiteltävä raaka-aine, so. herasta saatu proteiini liuos, voi sisältää komponentteja, jotka ovat haitallisia membraanin hyvän toiminnan kannalta. Heran valmistuksen yhteydessä voi olla mukana liukenematon proteiinijae tavanomaisesta lämpökäsittelystä, 72°C 15 sekuntia, johtuen. Tästä syystä on suositeltavaa poistaa etukäteen tämä proteiinijae suurinopeuksisen sentrifugoinnin avulla. Hera voi sisältää myös jakeen, joka sisältää oleellisesti lipidejä ja lipoproteiini-komplekseja. Vaikkakin näillä komponenteilla on suuri molekyylikoko, niitä ei voi sentrifugoida. Niiden kerääntyminen entsyymireaktorista katsoen membraanin eteen voi rajoittaa reaktorin toimintaa.

Keksinnön erään suositellun suoritusmuodon mukaisesti käytetään membraaneja, joiden reiät ovat tarkkaan määritellyt.

Keksinnön mukaisten proteiinihydrolysaattien lopullinen käyttökohde vaatii myös, että reaktoriin tulevilla tuotteilla on oltava hyvä, biologisesti terveellinen laatu. Puristejuuston valmistuksessa käytetty laajalti levinnyt kaliumnitraatin lisääminen maitoon voi merkitä sitä, että hera, joka on tämän menetelmän sivutuote, on hylättävä tai alistettava ylimääräiseen demineralisointikäsittelyyn elektro-dialysoimalla tai ioninvaihtoreaktorissa, jossa jäännösnitraattipitoi-suuden katsotaan olevan liian korkea.

Myöskään ei ole hyväksyttävää, että mukana on vetyperoksidia, jota antiseptisesti käytetään laajalti heran bakteriologisessa stabiloinnissa.

Oheisen keksinnön mukaisen menetelmän suositeltu lähtöaine on hera, joka on mineraalihappoja käyttävän kaseiinivalmistuksen sivutuote, valmistusmenetelmänsä ja koostumuksensa (alhainen rasvapitoisuus ja pieni bakteeripopulaatio) vuoksi.

Il 16 68503

Kuten edellä mainittiin, on tärkeää pitää reaktiovyöhykkeessä emäksinen pH suuruusluokkaa 7-9, jotta sallittaisiin proteiinikonsentraa-tin täydellinen hajoavuus. Tätä tarkoitusta varten reaktiovyöhykkee-seen johdetaan jatkuvatoimisesti tai ajoittain emäksistä yhdistettä, joka voi olla natriumhydroksidi tai -karbonaatti, kaliumhydroksidi tai -karbonaatti, kalsiumhydroksidi, ammoniumhydroksidi tai näiden yhdisteiden seos. Kyseeseen tulevan emäksisen yhdisteen valinta riippuu lopputuotteen lopullisesta käytöstä. Valinnan kannalta määräävä kriteeri on tuotteen natrium-, kalium-, kalsium- tai ammoniumioni-pitoisuus.

Ammattimiehellä on siten käytettävissään monta parametria hänen yrittäessään saada parhaat tulokset ja suorittaa heraproteiinin entsymaat-tinen kokonaishydrolyysi. On huomattava, että itse valittavat arvot voivat riippua entsyymireaktorin koosta sekä käytettyjen laitteistojen laadusta.

Heraproteiinien hydrolyysiä on tarköituksenmukaista jatkaa, kunnes saadaan entsymaattisia hydrolysaatteja, jotka eivät sisällä havaittavissa määrin proteiineja. Sen jälkeen hydrolysaatti saatetaan kosketukseen entsyymireaktorin ultrasuodatusmodulin membraanin kanssa.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa kahdessa erillisessä vaiheessa: Ensimmäinen vaihe käsittää entsymaattisen hydrolyysin ja toinen vaihe ultrasuodatuksen. Kummankin näiden vaiheiden suorittamiseen tarkoitettu laitteisto voi olla erillinen tai integroitu. Menetelmä voidaan eräänä muunnelmana suorittaa myös jatkuvatoimisesti. jolloin mainitut kaksi vaihetta suoritetaan yhdessä ainoassa laitteessa. Käsittelyn ensimmäisten hetkien aikana, esimerkiksi noin ensimmäisen tunnin aikana, permeaatti (neste, joka läpäisee membraanin) kierrätetään takaisin hydrolyysivyöhykkeeseen, jotta saavutettaisiin heraproteiinien haluttu hydrolysoituminen. Kun kokonaishydrolyysi on saavutettu, johdetaan käsiteltävä proteiinikonsentraatti reaktoriin samalla nopeudella kuin permeaatti. Käyttöolosuhteissa, joissa lämpötila on noin 40°C ja pH pidetään reaktiovyöhykkeessä arvossa 8,0, reaktoriin syötetyn liuoksen proteiinipitoisuus on noin 80 g per litra ja pankreatiini/substraatti-suhde on noin 12 %, "jatkuva" kokonaiskäyttÖaika on suuruusluokkaa 7-8 tuntia.

17 68503

On huomattava, että heraproteiinin konsentraattiliuoksen esikäsittely lämmöllä ei paranna sen hajoamista kokonaisuutena.

Proteolysoidun konsentraattiliuoksen proteiineista seerumialbumiini hydrolysoituu vaikeimmin pankreatiinia käytettäessä.

Keksinnön mukaan valmistetuilla tuotteilla on lukuisia sovellutuksia tai käyttökohteita ravitsemuksessa ja terapiassa. Keksinnön mukaiset tuotteet ovat luonteeltaan sellaisia, että ne laukaisevat suoliston reseptoreiden vaikutuksesta sisäisten haimahormoonien (esimerkiksi insuliini ja glukangoni) erittymisen ja gastrointestinaalisten hor-moonien (esimerkiksi gastriini, mahan polypeptidi-inhibiittori) erittymisen.

Keksinnön mukaan valmistettuja tuotteita voidaan käyttää terapeuttisessa ravitsemuksessa tai tehohoitolääkkeenä. Ne parantavat leikatun suolen sulatushäiriöt niin, että tietyn ajan kuluttua saavutetaan ravitsemuksellinen autonomia ja potilaan letkuruotinta voidaan lopettaa. Keksinnön mukaisia tuotteita voidaan yleisimmin käyttää terapeuttisena ravintona tai lääkkeinä hoidettaessa ruonsulatus-infektioita, kuten gastriittia, peptisiä ulkuksia, ileiittiä, infektoituneita suolia ja koliittia.

Keksinnön mukaan valmistettujen tuotteiden fysikaalisen muodon (vesipitoiseen mediumiin liukeneva jauhe) vuoksi antamistapa ei aiheuta mitään ongelmia. Näitä tuotteita voidaan antaa sellaisenaan enteraalista tietä, esimerkiksi sekoittamalla normaalin ruoan kanssa. Ne voivat olla myös seoksina tavallisten apuaineiden kanssa, esimerkiksi oraaliseen antamiseen sopivina seoksina. Sopivia seoksia voivat siten olla pillerinä tai kapselina tunnettujen apuaineiden kanssa, joita ovat esimerkiksi talkki, magnesiumstearaatti, hienojakoinen piidioksidi tai mikä tahansa mu samanlainen ammattimiehelle tuttu väliaine.

Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan esimerkkien avulla. Seuraavassa esimerkissä käytetään laitetta, jota on kuvattu mukaanliitetyissä pii- _ _ ___ τι- ----- --- 18 68503 rustuksissa, joissa:

Kuvio 1 on kaaviollinen yleiskuva laitteesta.

Kuvio 2 on virtauskaavio, joka esittää kuvion mukaisessa laitteessa käytettyä membraani-entsyymireaktoria.

Kuten kuviossa 1 on esitetty, laitteisto käsittää ultrasuodatusyksi-kön ja entsyymireaktorin. Hera johdetaan putken 1 läpi lämmönvaihtimen 2 ja sentrifuugierottimen 3 läpi ennenkuin se johdetaan itse ultrasuodatusmoduliin. Kuumennettu hera, josta sentrifugoituva liukenematon aines on poistettu, johdetaan putken 4 kautta säiliöön 5, johon samaan aikaan syötetään vettä putken 6 kautta. Vettä käytetään jatkuvatoimisesti diasuodatukseen. Itse ultrasuodatusmodulia on merkitty yleisellä viitenumerolla 7. Ultrasuodatusmembraanin pidät tätinä retentaatti eli konsentraatti otetaan talteen putken 8 kautta. Numerolla 9 on merkitty laite, jolla säädetään retentaatin pH sekä sen konsentraatio. Sen jälkeen, kun nämä vaiheet on tehty, retentaatti johdetaan putken 10 kautta puskurisäiliöön 11, josta se poistetaan hydrolysoituvaksi entsyymireaktorissa. Tätä varten hera kulkee puskurisäiliöön 11 yhdistetyn putken 12 kautta entsyymi-reaktoriin, jota on merkitty yleisellä viitenumerolla 13. Hydrolysaat-ti, joka muodostaa halutun lopullisen tuotteen, otetaan talteen putken 14 kautta.

Erityiskokeita varten hera tai esikonsentraatti ultrasuodatettiin DDS-modulissa, jonka pinta-ala oli 9 m ja joka oli varustettu BR 6 P membraanilla, jota on kaupallisesti saatavissa De Danske Sukker Fabrik-yhtiöltä. Ultrasuodatus tehdään panoksina 50°C lämpötilassa. Pelkästään ultrasuodattamalla tai lisäksi diasuodattamalla saadut eri retentaatit spray-kuivattiin.

Kuviossa 2 on esitetty membraani-entsyymireaktori. Siihen kuuluu ensiksikin reaktioastia, jota on merkitty yleisellä viitenumerolla 15. Heraproteiinit syötetään jatkuvatoimisesti putken 16 kautta. Laitteella 17 mitataan ja säädetään reaktioastian pH neutraloimalla peptidisidosten hajotessa vapautuneet H+-ionit. Laite on pH stat Mettler, johon kuuluu jännitteenvahvistin, ekvivalenttipisteen valitsija sekä automaattinen reagenssin jakopyretti. Reacrenssi on edellä 68503 19 mainittu emäksinen yhdiste. Elektrodin ei ole havaittu asiaankuulumattomasi kuluvan tai hajoavan. Hydrolyysituote poistetaan reaktioas-tiasta 18 pneumaattisen kalvopumpun 19 avulla. Eräs käytännön esimerkki on Amicon-pumppu, malli LP 20A, jonka pumppausnopeus on 720 litraa tunnissa 1,7 barin paineella. Pumpun poistopuolella tuote kulkee putkeen 20 ja sieltä esisuodattimeen 21, jonka huokoisuus on 150 mikronia. Viitenumerolla 22 on merkitty ultrasuodatusmoduli. Esimerkissä käytetään Amicon Company'n DC 10 S systeemiä, jonka ultra-suodatuspatruunat muodostuvat ontoista kuiduista. Permeaatti, joka otettiin talteen putkesta 23, on haluttu peptidihydrolysaatti. Ultra-suodatusmodulista 22 tuleva retentaatti poistettiin putken 24 kautta, johdettiin lämmönvaihtimeen 25 ja kierrätettiin putken 26 kautta takaisin reaktioastiaan 15.

Käytetyt membraanit olivat onttokuitutyyppisiä ja ominaisuuksiltaan seuraavat:

Tyyppi Erotusraja Pinta-ala Valmistaja HIO P 5 500 0,9 m2 Amicon HIO P 5 10.000 - PM 2 2.000 1,4 m Romicon PM 50 50.000 Jäljempänä raportoiduissa kokeissa käytettiin Emmental ja Saint-Paulin-herojen seoksesta saatua teollista heraa, jonka pH oli välillä 6,2 ja 6,4. Kuorimisen jälkeen heraa käsiteltiin noin 15 sekuntia 58 - 60°C:ssa. Sen jälkeen se voitiin väkevöidä haihduttamalla kuiva-ainepitoisuuteen noin 50 %. Laktoosin liiallisen kiteytymisen välttämiseksi tämä esikonsentraatti laimennettiin sen jälkeen 2,5-kertaisesti ja jäähdytettiin lähes 4°C:een ennenkuin se varastoitiin yön yli. Eräät jäljempänä seuraavissa esimerkeissä käytetyt herat valmistettiin in situ raakamaidosta tai lämpökäsitellystä maidosta saos tantalla maitohapolla tai juoksuttimella.

Tavanomaisissa koeolosuhteissa proteiinikonsentraatti rekonstituoitiin reaktioastiassa 15 proteiinipitoisuuteen lOO g/1. Reaktiolämpötiläksi __ - II.

20 68503 asetettiin noin 40°C. Laite 17 mittaa ja säätää pH:n. Lämpötilan tasapainoituttua ja pH:n säädön jälkeen lisättiin äkillisesti rekonstituoitua entsyymiä (pankreatiini). pH säädettiin reaktiovyöhyk-keessä lisäämällä jatkuvasti alkalista yhdistettä. Kukin poistettu panos saostettiin 12-prosenttisessa dikloorietikkahapossa. Proteolyy-siä seurattiin määrittämällä kelluva liukoinen typpi sekä vapautuneet NH2-ryhmät.

Hera-, ultrasuodos- ja hydrolysaattinäytteiden kuiva-ainepitoisuus määritettiin kuivaamalla uunissa 7 tuntia 102 - 105°C:ssa.

Typpipitoisuus määritettiin mikrokj>eldahl-menetelmällä Technicon autoanalysaattorilla:

Kokonaistyppipitoisuus saatiin mittaamalla suoraan laimennuksen jälkeen (typpipitoisen aineksen kokonaismäärä).

Ei-proteiininen typpipitoisuus (NPN) määritettiin mittaamalla sen jälkeen, kun proteiinit oli saostettu 12-prosenttisella trikloori-etikkahapolla.

Tuhkapitoisuus määritettiin AOAC-menetelmällä (AOAC standardi, 1945).

Kivennäisaineiden pitoisuus määritettiin atomiabsorption avulla Technitron 1200 laitteella G.K. Murphy'n ja V. Rhea'n raportin mukaisesti Determination of Major Cations in Milk by Atomic Absorption Spectrophotometry, J. Diary Sc., 50, 313-317 (1967) Brule'n et ai, modifioimana Etude de la Teneur en Mineraux des Produits Obtenus lors de 1'Ultrafiltration du Lait sur Membrane, Le Lait, 539-540, 600-615, 1974.

Vapaiden NH2~ryhmien määrä määritettiin ninhydriinireaktiolla, Hirs et ai. J. Biol. Chem. 219, 1190 (1956), trinitrobentseenisulfonihapon avulla, Fields, Biochem, J. 124, 581-590 (1971).

Aminohappojen määrän määritys tapahtui Spackman'in et ai menetelmällä, Anal. Chem. 30, 1190 (1958). Peptidejä (2 mg) hydrolysoitiin 24 tuntia, 48 tuntia ja 96 tuntia llO°C:ssa tyhjiössä suljetuissa koeputkissa 1 ml:11a 6N suolahappoa, joka oli tislattu kahdesti. Tulokset on 21 68503 ilmoitettu grammoina per 100 g aminohappoja sen jälkeen, kun tulokset on korjattu hydrolyysin aikaisen treoniinin, seriinin, kystiinin ja tyros iiriin tuhoutumisen suhteen.

Tryptofaanin määrä määritettiin erikseen Spies1 in menetelmällä (1957) käyttämällä kolorimetrista reaktiota paradimetyyliaminobents-aldehydin kanssa pronaasilla hydrolysoimisen jälkeen.

Optiset tiheydet 280 nm:ssä ja 420 nm:ssä (NH^-ryhmien määrän määrittäminen TNBS:llä), 570 nm:ssä (NH2-ryhmien määrän määrittäminen nih-hydriinillä) tai identifioimiseen tarvittu proteiinien, peptidien tai aminohappojen absorptiospektrikäyrä mitattiin Beckamn type Acata VI spektrofotometrillä kvartSikennossa 1 cm optisella tiellä.

Trypsiinin jäännösaktiivisuus peptidihydrolysaateissa mitattiin Hummel'in menetelmällä, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 1393 (1959), seuraamalla synteettisen yhdisteen, p-tolueenisulfonyyli-L-arginiini-metyyliesterin (TAME) hydrolysoitumisesta johtuvaa absorption kasvua 247 nmrssä.

Liukoisten proteiinien (laktoglobuliini, laktoalbumiini, seerumial-bumiini) kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen määrittäminen herassa, retentaateissa, ultrasuodoksissa, proteiinikonsentraatissa ennen hydrolyysiä, sen jälkeen ja sen aikana suoritettiin elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeeliäsä Aschaffenburg'in menetelmällä (kts. Protein Phenotyping by Direct Polyacrylamide Gel electrophoresis of Whole Milk, Biochem. Biphys., Acta, 82, 188-191 (1964) modifiointi: Geelinä käytettiin joko 5 % tai 9 % akryyliamidin ja bisakryyliami-din 1:1 seosta (Cyanogum:Apelab, Pariisi).

Levyt käsiteltiin amidomustalla ja väri poistettiin 10-prosenttisella etikkahapolla, minkä jälkeen tulokset luettiin Philips-densitomet-rillä.

Proteiinien, peptidien ja vapaiden aminohappojen erottaminen molekyy-lipainonsa perusteella tehtiin suodattamalla Sephadex-geelien (Pharmacia) läpi.

Erotettavien ainesosien laadun funktiona käytettiin seuraavia geelejä: 68503 22

Erotettavat ainesosat Geelin laatu Eluentti

Proteiinit-proteiinit G,nn Fosfaattipuskuri 1UU pH 7,5

Proteiinit-suuret peptidit G7C. Fosfaattipuskuri /b pH 7,5

Peptidit-peptidit G^qG^^ 30 % etikkahappo

Peptidit-vapaat aminohapot G^ 30 % etikkahappo

Eluentit analysoitiin mittaamalla optinen tiheys 280 nm:ssä ja mittaamalla vapaat NH2~ryhmät ninhydriinillä.

Peptidit ja aminohapot fraktioitiin isoelektrisen pisteensä ja varauksensa funktiona käyttämällä kationisia ioninvaihtohartseja (AG 50 x V?2 - Biorad Laboratory Richmond, Kalifornia) . Peptidihydro-lysaatti saatettiin kosketukseen hartsin kanssa panoksissa eri pH-arvoissa. Kontakti- ja laskeutumisajan jälkeen analysoitiin kelluva osa.

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä käytettiin yleistyypiltään kuviossa 1 esitetynlais-ta laitetta sekä kuviossa 2 esitetyn tyyppistä entsyymireaktoria.

Hera käsiteltiin ensin sentrifuugierottimessa 3 15 minuuttia nopeudella lOOO g ennen johtamistaan laitteeseen.

Käytetty entsyymi oli herasta saatu pankreatiini, jota kaupallisesti

on saatavissa kauppanimellä SIGMA, ja jonka aktiivisuus oli 4 NF

(ranskalainen standardi). Entsyymireaktorin reaktioastiassa olivat reaktio-olosuhteet seuraavat:

Lämpötila 40°C

pH pidettiin 8,0:ssa

Proteiinipitoisuus reaktoriin syötetyssä liuoksessa 80 g/1

Pankreatiini/substraatti-suhde 0,12

Heraporteiinien hydrolysoitumista seurattiin elektroforeesin avulla polyakryyliamidigeelissä. Tuloksia on kuvattu kuviossa 3. Tämä kuvio esittää reaktion eri vaiheita hetkellä 0 minuuttia, 7 minuuttia ja 70 minuuttia. Elektroforeesikäyrät vastaavat heraproteiinien liukenemista. Kuvion 3 alaosassa oleva kaavio kuvaa eri proteiinien kulkeutumista, jossa kuvassa ft-laktoglobuliini on merkitty lyhennyksellä β-lakto, cl- 68503 laktalbumiini on esitetty lyhennyksellä α-lakta ja häränseerumialbu-miini on esitetty lyhennyksellä BSA.

Polyakryyliamidigeeliä voidaan käyttää 9 % konsentraatiossa. Kuviossa 3 esitetyt tulokset osoittavat, että proteiinien hydrolysoitumisno-peus on erilainen. B-laktoglobuliini hydrolysoituu nopeammin kuin a-laktalbumiini, joka vuorostaan on nopeampi kuin seerumialbumiini. Seerumialbumiini kestää ainakin osittain proteolyysiä. Heran härkä-seerumialbumiinia ei voida sen vuoksi hydrolysoida kokonaan. Kuvio 4 on samanlainen kuvio kuin kuvio 3, mutta siinä on esitetty reaktorin jatkuvatoimisesta käytöstä saadut tulokset. 9-prosenttisessa polyakryyliamidissa tehdyt heraprofceiinikonsentraatin jatkuvatoimiset hydrolyysit, jossa entsyymireaktorissa on käytetty pankreatiinia, elektroforeesimittaukset vahvistavat, että häränseerumialbumiini kerääntyy reaktoriin.

Sen jälkeen, kun reaktoria oli käytetty 3 tuntia, astian pohja puhdistettiin diasuodattamalla ja analysoitiin. Tulokset on esitetty kuvion 5 käyrästössä. Kuvio 5 esittää diasuodattamalla (Sephadex G-100 geeli, fosfaattipuskuri, pH 7,5) tehdyn puhdistamisen jälkeen niiden ainesosien molekyylijakaantumaa, joita on entsyynireaktorissa hera-proteiinikonsentraattien pankreatiinihydrolyysin lopussa. Suodatus-käyrä osoittaa, että mukana on kolme ryhmää:

Ensimmäinen ryhmä, jolla on korkein molekyylipaino, korkea absorptio 280 nm:ssä (dip-ilmiö) ja alhainen KH^-pitoisuus.

Toinen ryhmä, jonka elektroforeettinen kuva ja absorptiospektri 280 nmrssä vastaa häränseerumialbumiinia.

Kolmas ryhmä, jolla on alhainen molekyylipaino, so. peptidit.

Esimerkit 2 ja 3

Myös näiden esimerkkien kohteena on heraproteiinien jatkuva liukeneminen pankreatiinin vaikutuksesta entsyymireaktorissa. Käyttöolosuhteet on esitetty taulukossa I.

_ ____ Tl 24 68503

Taulukko I

Esimerkki 2 Esimerkki 3

Membraanin erotusraja 5.000 5.000

Lämpötila 40°C 37°C

pH 8,5 8,5

Proteiinipitoisuus alussa 84,4 g/1 82 g/1

Käytetty emäs 2N KOH 2N KOH

Entsyymi/substraatti-suhde 11,8 % 12,6 %

Esihydrolyysiaika 2 tuntia 11/2 tuntia

Reaktoriin syötetyn liuoksen proteiinipitoisuus 45 g/1 50 g/1 Näissä kahdessa kokeessa pysyi näennäinen hydrolysoitumisaste (liukoinen typpi/kokonaistyppi) permeaatissa vakiona pienestä entsyymi-syötöstä johtuen. Reaktorin toiminta kesti 7-8 tuntia.

Tulokset on parhaiten nähtävissä kuvioiden 6 ja 7 käyrästöissä. Reaktioaika on merkitty tunteina abskissalle ja kyseisten tuotteiden kuiva-aineen tai proteiinien konsentraatio ordinaatalla g/l:na.

Käyrät (a) ja (b) kuvioissa 6 ja 7 esittävät vastaavasti permeaatin ja ultrasuodatusretentaatin hydrolysoitumisastetta, kun taas käyrä (c) esittää retentaatin kuiva-aineuutetta.

Seuraavassa karakterisoidaan saatuja hydrolysaatteja. Kuvio 8 esittää entsyymin ja substraatin kontaktiajan funktiona niiden peptidien molekyylijakaantumaa, jotka on saatu hydrolysoimalla pankreatiinilla heraproteiinikonsentraattia. Mittaukset suoritettiin suodattamalla Sephadex G 50 geelin läpi ja eluoimalla 30-prosenttisella etikkaha-polla. Kuvio 8 osoittaa entsyymin ja substraatin kontaktiajan vaikutuksen. Kuvio 9 esittää molekyylijakaantumaa peptideistä, jotka on saatu hydrolysoimalla pankreatiinilla heraproteiinikonsentraattia entsymaattisen kokonaishydrolyysin jälkeen. Mittaukset tehtiin Sephadex G 15 geelillä (eluointi 30-prosenttisella etikkahapolla). Kuten kuvio 9 osoittaa, kaikkien saatujen peptidien koko oli pienempi kuin 2.000 ja pääosa sijaitsi dipeptidin ja dekapeptidin välillä. Vapaiden aminohappojen määrä on pieni. Määrityksen mukaan se on pienempi kuin 10<j%. Eri membraanien, joilla on erilaiset erotusrajat, 25 68503 käyttö osoittaa, että ei ole olemassa mitään eroa peptidien välillä, jotka on saatu membraaneilla, joilla erotusraja on 5.000, ja peptidien välillä, jotka on saatu membraaneilla, joilla on erotusraja 10.000. Kuvio 10 osoittaa, että pakreatiinihydrolysaatin, joka on kulkenut membraanin, jonka erotusraja on 5.000, läpi, johtaminen membraanin läpi, jonka erotusraja on 15.000, muuntaa peptidien molekyylijakaantumista kuvaavaa käyrää. Tämä kuvio havainnollistaa siten mahdollisuutta muuntaa peptidien jakaantumaa ultrasuodattamalla alkuperäinen kokonaishydrolysaatti, joka on saatu käsittelemällä ensin membraanilla, jonka erotusraja on 5.000, PM 2 membraanilla, jonka erotusraja on 1.500 - 2.000. Mittaukset on suoritettu Sephadex G 15 geelillä (eluointi 30-prosenttisella etikkahapolla).

Saatujen tuotteiden koostumuksista tehtiin lisää mittauksia määrittämällä, mitkä jakeet olivat dialysoitavissa ja mitkä eivät. Dialyysin erotusraja sijaitsee noin molekyylipainon 2.000 kohdalla. Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty heraproteiinikonsentraatin pankreatiinihyd-rolysaatin dialysoituvan jakeen I ja dialysoimattoman jakeen II aminogrammit.

68503 26

Taulukko 2 I+ Il+i

Ile 7,0 5,70

Leu 10,96 7,52

Lys 8,92 9,10

Met 2,20 2,10

Cys + Cyst 2,0 3,70

Phe 3,63 1,91

Tyr 3,03 5,80

Thr 6,70 6,70

Trp 1,62 1,13

Vai 6,20 5,40

Arg 2,72 2,17

His 1,98 1,34

Ala 5,16 4,19

Asp 11,07 11,80

Glu 15,82 20,21

Gly 1,92 1,95

Pro 5,98 8,96

Ser 4,70 5,10 I+ Heraproteiinin pankreatiinihydrolysaatin dialysoituva osa (ensimmäinen ultrasuodos) II++ Heraproteiinin pankreatiinihydrolysaatin dialysoitumaton osa (ensimmäinen ultrasuodos)

Tulokset on ilmoitettu grammoina per 100 granmaa proteiinia paitsi tryptofäänille (grammoina per 100 granmaa pakastekuivattua jauhetta) .

Pankreatiinihydrolysaatin karakterisoimiseksi edelleen sitä saatettiin kosketukseen kationihartsin kanssa 7 g hartsia per 100 ml hydrolysaat-tia, jonka peptidipitoisuus oli 36 g/1. Ne pidettiin keskenään kosketuksessa 2 tuntia ympäröivässä lämpötilassa ja eri pH-arvoissa.

Kuviot 11a, 11b ja 11c esittävät niiden peptidien molekyylijakaantumaa, jotka eivät olleet kiinnittyneet kationihartsiin vastaavasti 27 68503 pH-arvoissa 2, 5 ja 7,5. Niiden välttämättömät aminohapot (prosentteina alkuperäisestä hydrölysaatista) on esitetty kuviossa 12 pylväin. Pylvästöjen aminohappojärjestys vasemmalta oikealle on: Ile, Leu, Lys, Met, Cys, Phe, Tyr, Thr, Trp ja Vai.

Peptidien sitoutumisen havaitaan olevan erilainen reaktion pHrsta riippuen. pH-arvossa 2 pienet peptidit ja vapaat aminohapot sitoutuvat ensisijaisesti suurempiin verrattuna. Jälkimmäiset sisältävät vähän lysiiniä, kysteiiniä, tyrosiinia, fenyylialaniinia ja trypto-faania. Kun pH tulee lähelle neutraalia, typen sitoutuminen pienenee. pH-arvossa 7,5 kelluvan osan aminohappokoostumus on hyvin lähellä alkuperäisen hvdrolysaatin koostumusta.

Nämä eri tulokset osoittavat, että hydrolysaatti on mahdollista fraktioida tällä tekniikalla. Muuttamalla reaktion pH:ta, hartsien laatua ja niiden konsentraatiota, on mahdollista saada täsmälliset ominaisuudet omaavia peptidijakeita.

Lisäkokeita ehtiin ultrasuodattamalla kokonaishydrolysaatti membraa-nien läpi, joiden erotusraja oli noin 2.000 ja jotka pystyivät osittain pidättämään peptidit, joiden molekyylipaino oli yli 1.500.

Kuvio 13 esittää peptidien ja vapaiden aminohappojen, joita on jakeessa, joka permeoituu 2.000 erotusrajan membraanin (Sephadex G 15 geeli, 30 % etikkahappoa) läpi, molekyylijakaantumaa. Pankrea-tiinihydrolysaatin permeaattijae sisältää vähän kysteiiniä ja runsaasti fenyylialaniinia ja tryptofaania verrattuna alkuperäiseen hydrolysaattiin. Kuvio 14 esittää välttämättömiä aminohappoja'(ilmoitettuna prosentteina niiden määrästä alkuperäisessä hydrolysaatissa), peptideitä ja vapaita aminohappoja, joita on jakeessa, joka permeoituu 2.000 erotusrajan membraanin läpi.

Esimerkki 4

Toimintaolosuhteet olivat samanlaiset kuin esimerkeissä 2 ja 3. Peptidihydrolysaatti väkevöitiin ja sen jälkeen kuivattiin. Jauheella oli seuraavassa määritellyt ominaisuudet: 28 6850 3

Kemiallinen analyysi 100 g

Kuiva-ainepitoisuus 96,3

Typpipitoisen aineen kokonaismäärä 72,0* 74,2** 76,6***

Tuhka 11,0

Pelkistävät sokerit 0

Rasvat 0

Mineraaliaineet

Ca 0,94

Na 0,30 K 4,1

Typpipitoisuus analysoitiin mikrojeldhal-menetelmällä. Jauhe laimennet!in * 2 % natriumsitraattiin ** 0,5N NaOH:iin *** tislattuun veteen

Tulokset laskettiin: typpi x 6,38, saostaminen 12-prosenttisella TCA:11a: nil NPN-määrä kelluvalla N/100 jauhella: 11 g Aminogrammi

Ile 6,0 Arg 2,7

Leu 9,9 His 1,7

Lys 9,2 Ala 4,9

Cys 1,8 Asp 9,5

Phe 3,2 Glu 17,6

Thr 6,7 Gly 1,7

Tyr 3,6 Pro 6,2

Trp 2,0 Ser 5,5

Vai 5,5 Met 2,0

Claims (8)

29 68503

1. Menetelmä valmistaa entsymaattista kokonaishydrolysaattia hera-proteiineista, tunnettu siitä, että heran ultrasuodatus-retentaatti saatetaan kosketukseen proteolyyttisen entsyymin kanssa, joka täysin kykenee hajottamaan heraproteiinit ihmiskehon sulatus-olosuhteissa, joka entsyymi on pankreatiini haimauutteen tai syn-teettiseoksen muodossa, joka sisältää trypsiiniä ja kymotrypsiiniä ja muita sekundäärisiä luonnon haimauutteessa esiintyviä entsyymejä, jota entsyymiä käytetään suhteessa substraattiin 8-15 painoprosenttia, edullisesti 12 painoprosenttia, hydrolyysiä jatketaan, kunnes tuote ei enää lainkaan sisällä jäännösproteiineja, so. se ei sisällä typpeä, joka saostuu 12-prosenttisella trikloorietikka-hapolla, ja kunnes saadaan peptidihydrolysaatti, jonka peptideistä vähintään 50 % sisältää 2-5 aminohappoa ja jossa vapaiden aminohappojen määrä on alle 15 %, minkä jälkeen saatu hydrolysaatti otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan erittäin puhdas proteiinikonsentraatti kohdistamalla heraan ultrasuodatus, johon liittyy tai jota seuraa d i asuodatu s.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennen ultrasuodatusta herasta poistetaan liukenemattomat jakeet sentrifugoimalla.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heraproteiinien saamisen jälkeen proteiinikonsentraatti mikrosuodatetaan lipidisten jäännösjakeiden, lipo-proteiinien ja mikro-organismien poistamiseksi.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uitrasuodatusretentaatti hydrolysoidaan jatkuvatoimisesti entsyymeillä johtamalla proteiinikonsentraatti reaktiovyöhykkeeseen tavoitteena saattaa se tehokkaaseen kosketukseen entsyymin kanssa, reaktiotuotetta poistetaan jatkuvatoimisesti _ - ΤΓ^ 30 685 0 3 ja johdetaan reaktiovyöhykkeestä ultrasuodatusvyöhykkeeseen, josta samoin poistetaan jatkuvatoimisesta permeaattia, joka muodostaa halutun tuotteen, ja reaktiota jatketaan kunnes permeaatti on entsymaattinen kokonaishydrolysaatti, jota permeaattia kierrätetään takaisin uitrasuodatusvyöhykkeestä reaktiovyöhykkeeseen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH säädetään reaktiovyöhykkeessä arvoon välillä 7-9, edullisesti 7,5 - 8,5, lisäämällä emäksistä reagenssia, joka on natriumhydroksidi, natriumkarbonaatti, kaiiumhydroksidi, kalium karbonaatti, kalsiumhydroksidi tai ammoniumhydroksidi tai kahden tai useamman edellä mainitun seos.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolyysi suoritetaan lämpötilassa 37 - 45°C, edullisesti lämpötilassa 40°C.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymireaktori on varustettu tehokkaasti entsyymiä pidättävillä membraaneilla. 3i 68503