JPH0773507B2

JPH0773507B2 - 低分子量ペプチド組成物およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0773507B2
Application number: JP63291090A
Authority: JP
Inventors: 守冨田; 康夫福渡; 吉隆田村; 弘子大島; 昌信野尻
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1988-11-19
Filing date: 1988-11-19
Publication date: 1995-08-09
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPH02138991A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、蛋白質を酸素加水分解し、分解生成物の分子
量分画により、原料蛋白質の抗原制を認めない、含有さ
れるペプチドの分子量が1000以下、遊離アミノ酸含有量
が20wt％以下、芳香族アミノ酸含有量が全アミノ酸量の
1.0wt％以下のペプチド組成物及びその製造方法に関す
る。

［技術の背景及び従来技術］従来から、蛋白質の可溶化、消化吸収の有効性、食餌ア
レルギーの予防および治療、芳香族アミノ酸代謝異常の
治療及び栄養補給の目的で、ペプチド混合物あるいは、
アミノ酸混合物を製造することが行なわれてきた。しか
しながら、これら混合物は、各々の目的を満たすもの
の、すべての目的を満たすものではなく、病気の合併等
により上記すべての目的を満たすペプチド組成物が求め
られてきた。

最近では、腸管吸収の面から、低分子量ペプチドが、蛋
白質栄養源として極めて有効であることが研究者等によ
り明らかにされてきた。又、遊離アミノ酸が腸管におけ
る浸透圧を高め、輸送系の負担を引き起こし、栄養効率
を低下させることも明らかにされてきている（栄養と食
糧,31;247（1978）。特公昭57−45560,特公昭62−58713
等では、一定の大きさ（分子量500〜1500程度）のペプ
チド混合物の製造法が示され、又その栄養効率の面で有
用であることが示されている。従って消化吸収及び栄養
生理の面から、遊離アミノ酸含有量が少なく、分子量を
規定したペプチド組成物が求められている。

又、先天的あるいは肝臓疾患により、芳香族アミノ酸の
代謝能力が低下あるいは停止し、脳内に芳香族アミノ酸
が蓄積することで生じる脳疾患に対しては従来、蓄積し
てしまうアミノ酸を除いたアミノ酸混合物あるいは、ペ
プチド混合物が供されてきた（JJPEN,9;343（1987）、
化学と生物,25;332（1984））。しかしながらこれら
は、高い遊離アミノ酸含有率を示したり、抗原性が減少
していない等の問題点を有していた。

又、最近、食餌蛋白質由来のアレルギー患者数が急増
し、全国社会福祉協議会全国保母会の調査（1988）によ
れば、乳児の８％程度が食餌蛋白質由来のアレルギーを
もつ報告としている。これら患者に対しては、特公昭54
−36235で示されるような、抗原性のない蛋白質分解物
が供されている。しかしながらこれらは、遊離アミノ酸
含有率が高く、浸透圧，風味，消化吸収あるいは、栄養
生理面から問題点を有していた。

又、フェニルアラニン，チロシン欠乏食が、腫瘍細胞の
増殖を著しく抑制し、特にフェニルアラニン，チロシン
欠乏食が、白血病患者治療食餌として著効のあることが
報告されている（栄養学雑誌,26;39（1968））。又、こ
れらは病態栄養の特殊性から、抗原性がなく吸収性のよ
いものが好ましくこれらの目的を満たす組成物が求めら
れていた。

［発明が解決しようとする問題点］このように、従来作られてきた蛋白質分解物、あるいは
アミノ酸混合物は、さまざまな状況に応じて利用できる
ものの、その利用範囲は制限されており、全ての状況に
対応しうる低分子量ペプチド組成物の製造方法は今だ確
立されていない。

［発明の目的及び発明の要約］従って本発明の目的は、前記従来技術の欠点を改善し、
含まれるペプチドの分子量が、1000以下で、抗原性を認
めず、遊離アミノ酸含有量が、20wt％以下で、芳香族ア
ミノ酸含有量が、全アミノ酸の1.0wt％以下である低分
子量ペプチド組成物及びその製造方法を提供することに
ある。

本発明者等は、蛋白質原料の芳香族アミノ酸の90％以上
を遊離アミノ酸状態にすることで、原料蛋白質の抗原性
をかなり低減させることができることを見出し、パンク
レアチンとエキソペプチダーゼあるいは、パンクレアチ
ンと他のプロテアーゼとエキソペプチダーゼの複合酵素
系を用いることにより、原料蛋白質から90％以上の芳香
族アミノ酸を遊離アミノ酸にまで分解し、抗原性を著し
く低減できることを見出した。この酵素分解物を排除限
界分子量10000以下、好ましくは、1000以下のゲル過
剤を使用し、さらに好ましくは、芳香族アミノ酸に吸着
性を示す疎水性側鎖たとえばカルボキシル基やブチル
基、フェニル基あるいは、疎水的部位をもつゲル担体を
使用し、溶出液に水あるいは、芳香族アミノ酸の吸着性
を高める目的で２〜15％エタノール溶液を用い、カラム
高10〜30cmのカラムで分画することにより、目的とする
低分子量ペプチド組成物を得る方法を完成した。

即ち、本発明は、原料蛋白質をパンクレアチンを主体と
する複合酵素系を用いて分解し、不溶性成分を除いた
後、ゲル過により、ペプチド部分を回収することで、
遊離アミノ酸含有量及び芳香族アミノ酸含有量を減少さ
せ、含まれるペプチドの分子量が、1000以下で、抗原性
を認めず、遊離アミノ酸含有量が20wt％以下で、芳香族
アミノ酸含有量が20wt％以下である低分子量ペプチド組
成物及びその製造方法である。

［本発明の具体的な説明］以下、本発明の技術構成について詳述する。

（１）酵素分解物の調製１）10wt％カゼイン溶液（ph8.0）に、乳酸菌抽出物、
アスペルギルス属由来プロテアーゼ，パンクレアチンを
それぞれ1000活性単位ずつ混合した酵素溶液を蛋白質1g
当り３種の活性単位の和が3000単位となるように添加し
50℃で分解し、経時的に分解度を測定し、ホルモール態
窒素／全窒素（％）が20,30,42（％）になった時点で90
℃５分間加熱失活する。失活後、沈殿物がなくなるまで
過し、凍結乾燥する。この凍結乾燥品を以下、サンプ
ルA,B,Cとする。

２）10wt％乳清蛋白質溶液（pH7.0）に上記方法の酵素
を添加し、上記方法と同様にして分解度、32％,42％の
分解物を調製する。この凍結乾燥品を以下、サンプルE,
Fとする。

３）10wt％カゼイン溶液（pH8.0）に蛋白質1g当り1500
活性単位のパンクレアチンを連続的あるいは、段階的に
３〜５時間に分割して添加し、２〜5wt％水酸化ナトリ
ウムでpH8.0に維持し、15時間分解後乳酸菌抽出物を蛋
白質1g当り1500活性単位添加し、さらに分解を継続し全
体で20〜24時間分解し、90℃５分間加熱失活する。失活
後、沈殿物がなくなるまで過し、凍結乾燥する。この
凍結乾燥品を以下、サンプルＤとする。

分解物の調製に用いた酵素は、特に限定したものではな
く、トリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，エラ
スターゼ，プロリン特異性プロテアーゼ,Staphylococcu
sプロテアーゼ，パパイン，ペプシン，サーモリシン等
が利用できる。又、エキソペプチダーゼとして、カルボ
キシペプチダーゼY,Ashergillusプロテアーゼ,Sterptom
ycesプロテアーゼ,Rhizopusプロテアーゼ，乳酸菌プロ
テアーゼが利用できる。本実験に使用した乳酸菌抽出物
は、ラクトバチルス・ヘルベティカスを培養し、特公昭
48−43878の方法により1g当り20000活性単位を有する乳
酸菌抽出物を得た。

又、分解に使用する酵素量は、蛋白質原料1g当り3000〜
5000活性単位となるように、パンクレアチンとエキソペ
プチダーゼあるいは、パンクレアチンと他のプロテアー
ゼとエキソペプチダーゼを混合あるいは、分けて添加す
る。

温度条件は、40〜55℃、又pH条件は、酵素添加前に原料
蛋白質が変性しない範囲で、最適pHに調整し、好ましく
は少なくとも１時間そのpHを維持する。

（２）芳香族アミノ酸遊離率の測定自動アミノ酸分析計により、全アミノ酸及び遊離アミノ
酸を分析した。

前期（１）において作成した、サンプルＡ〜Ｆのアミノ
酸分析の結果を表１に示した。

表１に示されるように分解度の上昇に伴って芳香族アミ
ノ酸遊離率が上昇していることが分る。

（３）抗原性試験前記（１）において作成したサンプルＡ〜Ｆの抗原性
は、ELISA抑制試験により測定した。

Nunc社製96穴プレートを用い、原料蛋白質をコーティン
グし、洗浄後、ウサギ抗カゼイン血清と各種分解調製物
との混合液を反応させ、洗浄後Zymed Laboratories製ア
ルカリフォスターゼ標識抗体ウサギIgGを反応させ、洗
浄後、酵素基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリ
ウムを加え、30分後に5N水酸化ナトリウムで反応を停止
させ、反応産物をマイクロプレートリーダーで測定した
（日本小児アレルギー学会誌,1;36（1987））。

その結果を図1,2に示した。

図１は、原料蛋白質をカゼインとした時の芳香族アミノ
酸の遊離率と抗原性との関係を示している。○は原料蛋
白質であるカゼイン，▲は芳香族アミノ酸の遊離率が3
0.2％（サンプルＡ），△は55.1％（サンプルＢ），▼
は90.8％（サンプルＣ），□は91.7％（サンプルＤ）を
示している。

この図によれば、50％の抑制のかかる調製物濃度は、カ
ゼインで10^0.6（μg/ml）、サンプルＡで10³（μg/m
l）、サンプルＢで10⁵（μg/ml）、サンプルC,Dでは、
最高濃度でも50％の抑制がかからなかった。つまり芳香
族アミノ酸が30％遊離したものはカゼインの約1/400
に、55％のものが、約1/30000には抗原性が低減し、90
％以上では、抗原性が消失していた。

図２は、乳清蛋白質を原料蛋白質とした時の芳香族アミ
ノ酸の遊離率と抗原性との関係を示している。○は原料
蛋白質である乳清蛋白質を、△は芳香族アミノ酸の遊離
率が56.1％（サンプルＥ）、▼は90.7％（サンプルＦ）
を示している。

この図によれば、原料蛋白質がカゼインの場合と同様に
乳清蛋白質内の芳香族アミノ酸の遊離率が高まるにつれ
て抗原性が低下し、90％以上の遊離率で抗原性が認めら
れなくなることが明らかとなった。

（４）分画方法前記（１）で得られた抗原性を認めず、芳香族アミノ酸
が90％以上遊離したサンプルＣ及びサンプルＦを使用し
下記方法によりペプチド組成物を分画した。この時の溶
出グラフを図３と図４に示した。

図３は、Sephadex G−15（ファルマシア製）２×11cmカ
ラムを使用し、前記（１）で得られたカゼイン酵素分解
物（サンプルＣ）を20wt％に溶解し、1mlをアプライ
後、0.71ml/分の流速で水溶出させた時のグラフを示し
ている。実線はペプチド結合の吸収を示す220nmにおけ
る吸光度、点線は芳香族環の吸収を示す280nmにおける
吸光度を示している。溶出量10〜20mlまでをペプチド分
画としてアミノ酸分析と抗原性試験を実施した。

芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の0.4wt％であっ
た。又、遊離アミノ酸含有量は17wt％であった。抗原性
試験では、使用したサンプルＣ同様認められなかった。
溶出量20ml以降の分画は、芳香族アミノ酸含有量、遊離
アミノ酸含有量が顕著に増加し、本発明組成物は、溶出
量20mlまでに溶出されていることがわかった。

図４は、Sephadex G−10（ファルマシア製）２×11cmカ
ラムを使用し、前記（１）で得られた乳清蛋白質酵素分
解物（サンプルＦ）を20wt％に溶解し、1mlをアプライ
後、0.7ml/分の流速で12％エタノール溶液で溶出させた
た時のグラフを示している。前記同様、実線は220nm、
点線は280nmの吸光度を示している。溶出量10〜20mlま
でをペプチド分画としてアミノ酸分析と抗原性試験を実
施した。

その結果、芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の0.5w
t％であった。又遊離アミノ酸含有量は18wt％であっ
た。抗原性試験では、使用したサンプルＦ同様認められ
なかった。溶出量20ml以降の分画は芳香族アミノ酸含有
量、遊離アミノ酸含有量が顕著に増加し、本発明組成物
は、溶出量20mlまでに溶出されていることがわかった。

又、この他のゲル過剤として、 Sephacryl S−100（ファルマシア製）。TSK−GEL TOYOP
EARK HW−40（東ソー製）等が使用でき、溶出液として
塩を含む水溶液も使用できる。

（５）分子量測定前記（４）でサンプルＣを分画した。抗原性がなく芳香
族アミノ酸含有量が全アミノ酸量の1.0wt％以下で、遊
離アミノ酸含有量が20wt％以下であるペプチド組成物の
分子量を測定した。

図５は、上記組成物をSephadex G−25を使用し水溶出に
より分子量を測定したグラフである。この結果により、
本発明のペプチド組成物に含まれるペプチドは、分子量
1000以下であることがわかった。同様にサンプルＦの分
画物も含まれるペプチドの分子量は、1000以下であるこ
とがわかった。

以下に実施例を用いて本発明を説明する。

［実施例１］市販カゼイン200gを10％水酸化ナトリウムを使用し、pH
8.0に調整し10wt％となるように溶解した。90℃10分間
加熱殺菌後、45℃に調整し、パンクレアチンＦ（天野製
薬）10g、プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬）2g、
乳酸菌抽出物（（１）酵素分解物の調整項記載）4gを加
え45℃で24時間酵素加水分解した。90℃５分間加熱失活
後、過により沈殿物を除去した。これを凍結乾燥し凍
結乾燥品170gを得た。アミノ酸分析の結果、芳香族アミ
ノ酸の遊離率は90.7％であった。この凍結乾燥品18gを2
0wt％水溶液とし、不溶解物を除去した後、Sephadex G
−10 10×20cmカラムで溶出した。溶出液には、イオン
交換水を使用し、流速は10ml/分とした。溶出量200〜50
0mlを分画し凍結乾燥し、乾燥物6gを得た。アミノ酸分
析の結果、芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の0.5w
t％であり、遊離アミノ酸含有量は、18.5％であった。
又、ELISA抑制試験では、原料カゼインの抗原性は認め
られず、又Ｇ−25による分子量測定では含まれるペプチ
ドの分子量は100以下であった。

［実施例２］市販乳清蛋白質粉末200gを脱イオン水に溶解し8wt％水
溶液とした。フィルター過による除菌後、45℃に調整
し又、５％水酸化ナトリウムでpH7.3にコントロールし
たまま、パンクレアチンＦ（天野製薬）2gずつ30分おき
に６回添加し、15時間後アクチナーゼAS（科研製薬）1.
5gを加え全体で120時間分解した。90g5分間加熱失活後
過により沈殿物を除去した。これを凍結乾燥し凍結乾
燥品165gを得た。アミノ酸分析の結果、芳香族アミノ酸
の遊離率は90.3％であった。この凍結乾燥品5gを20wt％
水溶液とし、不溶解物を除去した後、Sephadex G−25 5
×15cmカラムで溶出した。溶出液には、12％エタノール
を使用し、流速は10ml/分とした。溶出量200〜500mlを
分画し、凍結乾燥し、乾燥物1.5gを得た。アミノ酸分析
の結果、芳香族アミノ酸含有量は全アミノ酸量の0.5wt
％であり、遊離アミノ酸含有量は、19.3％であった。
又、ELISA抑制試験の結果、原料乳清蛋白質の抗原性は
認められず、又Ｇ−25による分子量測定では含まれるペ
プチドの分子量は、1000以下であった。

本発明は、含まれるペプチドの分子量が、1000以下であ
り、抗原性を呈さず、遊離アミノ酸含有量が20wt％以下
で、組成物中の芳香族アミノ酸含有量が、全アミノ酸量
の1.0wt％以下であることを特徴とする、蛋白質原料全
体を窒素源として得られる低分子量ペプチド組成物及び
その製造方法である。以下に本発明における効果を説明
する。

［本発明の効果］本発明による低分子量ペプチド組成物には、種々の用途
が考えられる。

本発明の組成物は、非抗原性，吸収良好性という特徴が
あり、アレルギー患者，体力減少，疾病等による腸管免
疫機構異常患者，アレルギー性下痢症患者，乳幼児，術
前術後患者等に、経口的あるいは胃，腸に直接投与する
蛋白質栄養源として利用できる。

又、本発明の組成物は、芳香族アミノ酸含有量が低減化
されているため、先天的芳香族アミノ酸代謝異常患者，
肝疾患による芳香族アミノ酸代謝異常患者，癌患者の食
餌療法剤として利用できる。

又、本発明の製造方法により、上記用途に使用しうる低
分子量ペプチド組成物を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、カゼイン酵素分解物の芳香族アミノ酸の遊離率
と抗原性の関係を示したグラフである。図２は、乳清蛋白質酵素分解物の芳香族アミノ酸の遊離
率と抗原性の関係を示したグラフである。図３は、カゼイン酵素分解物（サンプルＣ）のSephadex
G−15による溶出グラフである。図４は、乳清蛋白質酵素分解物（サンプルＦ）のSephad
ex G−10による溶出グラフである。図５は、低分子量ペプチド組成物のSephadex G−25によ
る溶出グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】含まれるペプチドの分子量が、1000以下で
あり、抗原性を呈さず、遊離アミノ酸含有量が、20wt％
以下で、組成物中の芳香族アミノ酸含有量が、全アミノ
酸量の1.0wt％以下であることを特徴とする、蛋白質原
料全体を窒素源として得られる低分子量ペプチド組成
物。
【請求項２】蛋白質原料全体を蛋白質分解酵素により、
原料蛋白質の抗原性を認めなくなるまで、かつ、原料蛋
白質に含まれる芳香族アミノ酸が、90wt％以上遊離アミ
ノ酸になるまで分解し、分解後、ゲル過法により、ペ
プチド部分を回収することで、特許請求の範囲第１項記
載の低分子量ペプチド組成物を製造する方法。