JPH09216834A - 骨形成促進及び骨吸収防止剤 - Google Patents

骨形成促進及び骨吸収防止剤

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JPH09216834A
JPH09216834A JP8045566A JP4556696A JPH09216834A JP H09216834 A JPH09216834 A JP H09216834A JP 8045566 A JP8045566 A JP 8045566A JP 4556696 A JP4556696 A JP 4556696A JP H09216834 A JPH09216834 A JP H09216834A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な骨形成促進又は骨吸収防止材の提供。 【解決手段】 キニノーゲン及びキニノーゲン分解物を
有効成分とする骨形成促進及び骨吸収防止剤。キニノー
ゲン分解物としてキニノーゲンフラグメント１・２が好
ましい。キニノーゲン及びキニノーゲン分解物は飲食
品、医薬、飼料等に配合することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キニノーゲン及び
／又はキニノーゲン分解物を有効成分とする骨形成促進
及び骨吸収防止剤に関する。また、本発明は、キニノー
ゲン及び／又はキニノーゲン分解物を配合した飲食品、
医薬及び飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、
腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織にお
いては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時
には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢
に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アン
カップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組
織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を
生じることになる。このアンカップリングを防止するこ
とができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を
予防することができると考えられている。
【０００３】従来より、アンカップリングを防止し、各
種骨疾患の予防あるいは治療する方法として、（１）食
餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光
浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカル
シウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等
のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシ
ウム剤が使用されている。しかし、これらは必ずしも経
口摂取に適している素材であるとはいえない。
【０００４】軽い運動はジョギングや散歩等が良いとさ
れるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なもので
あり、まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。日
光浴は活性化ビタミンＤ3 の補給という点では良いとさ
れているが、これだけでは不充分である。薬物投与に
は、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 やカルシトニン製剤
等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であると
いうことが知られている。しかし、これらの物質は医薬
そのものであり、食品素材として使用可能なものではな
い。
【０００５】一方、本発明者らは、食品素材として使用
可能な骨強化作用や骨吸収防止作用を有する物質を得る
ために、乳清タンパク質中に存在する骨強化及び骨吸収
防止因子を探索し続けてきた。その結果、逆浸透膜や電
気透析等の処理により、乳清タンパク質の水溶性画分か
ら乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合
物に骨強化作用があることを見出した (特開平4-183371
号公報) 。そして、このタンパク質及びペプチド混合物
の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外
濾過膜処理して得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及
び骨強化作用があることを見出した (特開平5-176715号
公報、特開平5-320066号公報) 。また、乳中に微量にし
か存在しない塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作
用、骨強化作用及び骨吸収防止作用があることを見出し
た (特願平7-207509号) 。
【０００６】
【発明が解決しようとしている課題】本発明者らは、さ
らに、骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収防
止作用を有する塩基性タンパク質について、骨成長促進
作用及び骨吸収防止作用を有する活性本体の分離精製を
試み、その物質を同定したところ、既知物質であるキニ
ノーゲンのフラグメント１・２と同一の物質であること
を見出した。また、キニノーゲン及びキニノーゲン分解
物にも骨成長促進作用及び骨吸収防止作用が存在するこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、
本発明は、キニノーゲン及び／又はキニノーゲン分解物
を有効成分とする新規な骨形成促進又は骨吸収防止剤を
提供することを課題とする。また、本発明は、キニノー
ゲン及び／又はキニノーゲン分解物を配合して骨成長促
進作用及び骨吸収防止作用を賦与した飲食品、医薬品又
は飼料を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明で有効成分として
使用するキニノーゲンは、血管拡張、血圧低下、子宮平
滑筋収縮等の作用を有する生理活性ペプチドのキニンの
前駆体として知られている物質であり、ウシキニノーゲ
ンについては、血漿から分離精製したという報告(Komiy
a,M., Kato,H. and Suzuki,T., J. Biochem.(Tokyo), v
ol.76, p.811,1974) 、牛乳から分離精製したという報
告(Wilson,W.E., Lazarus,L.H. and Tomer,K.B., J. Bi
ol. Chem., vol.264, p.17777, 1989)、遺伝子の塩基配
列についての報告(Kitamura,N., Takagaki,Y., Furuto,
S., Tanaka,T., Nawa,H. and Nakanishi,S., Nature, v
ol.305, p.545, 1983 等) がなされている。
【０００８】このキニノーゲンについては、例えば、ウ
シの血漿を陰イオン交換樹脂に接触させてキニノーゲン
を含む画分を吸着させ、塩化ナトリウムの濃度を徐々に
高めて溶出した後、この溶出画分を陽イオン交換樹脂に
接触させてキニノーゲンを含む画分を吸着させ、塩化ナ
トリウムの濃度を徐々に高めて溶出する。そして、ゲル
濾過クロマトグラフィーによりキニノーゲンを得ること
ができる。
【０００９】本発明で有効成分として使用するキニノー
ゲンフラグメント１・２は、ウシ高分子キニノーゲンを
カリクレインというプロテアーゼで消化して生じる分解
物の一つである。ウシ高分子キニノーゲンは、一本のポ
リペプチドからなる分子量約80キロダルトン (ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動による）の糖タンパク質で
あり、Ｎ末端側より、重鎖、ブラジキニン、フラグメン
ト１・２及び軽鎖という一次構造を有している。この中
で、重鎖部分と軽鎖部分は分子内ジスルフィド結合によ
り架橋されている。カリクレインによる消化で、まず、
ブラジキニンが遊離し、次いで、フラグメント１・２が
遊離する。ブラジキニンは血管拡張、血圧低下、子宮平
滑筋収縮等の作用を有する９個のアミノ酸からなる生理
活性ペプチドであり、フラグメント１・２は 110個のア
ミノ酸からなる分子量約14キロダルトンのタンパク質
で、そのアミノ酸組成はヒスチジンとリジンに比較的富
み、塩基性領域を形成している。これまでに、フラグメ
ント１・２の機能については明らかにされていなかっ
た。また、ウシ血漿中には、ブラジキニンは含むがフラ
グメント１・２は含まない低分子キニノーゲンも存在す
る。
【００１０】このキニノーゲンフラグメント１・２につ
いては、例えば、ウシの血漿より調製したキニノーゲン
を血漿由来のカリクレインで消化し、ゲル濾過クロマト
グラフィーにより重鎖・軽鎖複合体、フラグメント１・
２、ブラジキニンの順で溶出するので、このようにして
フラグメント１・２を得ることができる(Han,Y.N., Kat
o,H., Iwanaga,S., Oh-ishi,S. and Katori,M., J. Bio
chem.(Tokyo), vol.83, p.213, 1978)。
【００１１】本発明で有効成分として使用するキニノー
ゲン分解物は、キニノーゲンをカリクレイン、プラスミ
ン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイ
ン、Ｖ８プロテアーゼ、サーモライシン等のプロテアー
ゼで限定分解し、ゲル濾過ＨＰＬＣで分子量 100〜70,0
00としたペプチド混合物である。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明の骨形成促進及び骨吸収防
止剤は、キニノーゲン、あるいはキニノーゲンフラグメ
ント１・２、その他のキニノーゲン分解物を有効成分と
する。また、このキニノーゲン、キニノーゲンフラグメ
ント１・２あるいはその他のキニノーゲン分解物を、牛
乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケ
ット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に配合しても良
いし、錠剤や粉末等の医薬としても良い。さらに、塩化
カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻、
牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好なカルシウム剤
を併用することにより、骨形成促進作用を一層高めるこ
とができる。
【００１３】本発明の骨形成促進及び骨吸収防止剤は、
成人の場合、１日当たり 100ng〜10mgを数回に分けて摂
取すれば良い。このように、本発明の骨形成促進及び骨
吸収防止剤を摂取することにより、骨粗鬆症等の各種骨
疾患を予防又は改善することができる。なお、キニノー
ゲンあるいはキニノーゲンフラグメント１・２、その他
のキニノーゲン分解物等は、元来、血漿や乳由来の成分
であり、ラットにおける急性毒性は認められなかった。
また、これらの有効成分を飼料に含有させて、家畜や家
禽等の骨形成を促進させたり、骨吸収を防止させること
もできる。
【００１４】次に、本発明を実施例をあげて説明する。
【実施例１】既知の方法(Shimada,T., Sugo,T., Kato,
H. and Iwanaga,S., J. Biochem.(Tokyo), vol.92, p.6
79, 1982)に従い、ウシ血漿キニノーゲンを調製した。
すなわち、10リットルのウシ血漿を50mMの塩化ナトリウ
ムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化した
DEAE−セファデックスA-50カラム(200×100mm)に供し、
塩化ナトリウム濃度を 600mMまで次第に高め、吸着した
タンパク質を溶出した。キニノーゲンは塩化ナトリウム
濃度が約 300mMとなったところで溶出した。これを透析
により脱塩し、次いで、0.2Mの塩化ナトリウムを含む50
mM酢酸緩衝液(pH6.3)で平衡化したCM−セファデックスC
-50カラム (80×200mm)に供し、塩化ナトリウム濃度を
0.8Mまで次第に高め、吸着したタンパク質を溶出した。
キニノーゲンは塩化ナトリウム濃度が約0.6Mとなったと
ころで溶出した。これを透析により脱塩し、次いで、1.
0M塩化ナトリウム及び３mMのＥＤＴＡを含むトリス−塩
酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化したセファデックスG-150 カ
ラム (40×1,000mm)に供し、溶出したキニノーゲンを透
析により脱塩し、凍結乾燥して高分子キニノーゲン15.2
mgを得た。
【００１５】
【実施例２】既知の方法(Han,Y.N., Kato,H., Iwanaga,
S. and Suzuki,T., J. Biochem.(Tokyo), vol.79, p.12
01, 1976) に従い、実施例１で得られた高分子キニノー
ゲンをプロテアーゼ処理してキニノーゲン分解物を調製
した。すなわち、高分子キニノーゲン５mgを0.2M炭酸水
素アンモニウム(pH 8.0) 2.5mlに溶解し、ウシ血漿由来
のカリクレイン５μg を加えて、37℃で１時間反応させ
た後、80℃で10分間加熱することにより酵素反応を終結
させた。そして、反応生成物を透析により脱塩し、凍結
乾燥してキニノーゲン分解物４mgを得た。
【００１６】
【実施例３】実施例２で得られたキニノーゲン分解物２
mgを0.2M炭酸水素アンモニウム(pH8.0)で平衡化したセ
ファデックスG-75カラム (40×1,000mm)に供し、フラク
ションコレクターを用いて分画した。タンパク質の検出
は280nm の吸収によった。このゲル濾過カラムクロマト
グラフィーでは、文献(Han,Y.N. et al., J.Biochem.(T
okyo),vol.79, p.1201, 1976) で報告されているように
分子量の大きい順に溶出するので、３つ現れるピークの
中、２番目を分取し、透析により脱塩した後、凍結乾燥
してキニノーゲンフラグメント１・２ 0.2mgを得た。
【００１７】
【実施例４】既知の方法(Wilson,W.E., Lazarus,L.H. a
nd Tomer,K.B., J. Biol. Chem., vol.264, p.17777, 1
989)に従い、牛乳からキニノーゲンを調製した。すなわ
ち、牛乳 100リットルを遠心分離(5,000×g 、20分間)
して脱脂した脱脂乳に塩酸を添加してpHを 4.6に調整
し、生成した沈澱物を遠心分離(5,000×g 、20分間) し
て除去した。そして、この上澄みのpHを 6.4に調整し、
10％メタノールを含む10mMリン酸緩衝液(pH 6.4)で平衡
化したDEAE−セファデックスA-50カラム(200×100mm)に
供して、塩化ナトリウム濃度を 1,000mMまで次第に高
め、吸着したタンパク質を溶出した。キニノーゲンは塩
化ナトリウムが約 400mMとなったところで溶出した。こ
れを透析により脱塩し、次いで、10％アセトニトリルを
含む10mM酢酸アンモニウム(pH 4.0)で平衡化したCM−セ
ファデックスC-50カラム (80×200mm)に供し、グアニジ
ン塩酸濃度を0.4Mまで次第に高め、吸着したタンパク質
を溶出した。キニノーゲンはグアニジン塩酸濃度が約0.
2Mとなったところで溶出した。これを透析により脱塩
し、次いで、1.0M塩化ナトリウム及び３mMのＥＤＴＡを
含むトリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)で平衡化したセファデ
ックスG-150 カラム (40×1,000mm)に供し、溶出したキ
ニノーゲンを透析により脱塩し、凍結乾燥して牛乳由来
のキニノーゲン 1.2mgを得た。
【００１８】
【実施例５】既知の方法(Han,Y.N., Kato,H., Iwanaga,
S. and Suzuki,T., J. Biochem.(Tokyo), vol.79, p.12
01, 1976) に従い、実施例４で得られた牛乳由来のキニ
ノーゲンをプロテアーゼ処理してキニノーゲン分解物を
調製した。すなわち、牛乳由来のキニノーゲン 0.5mgを
0.2M炭酸水素アンモニウム(pH 8.0) 2.5mlに溶解し、ブ
タ血漿由来のカリクレイン 0.5μg を加えて、37℃で１
時間反応させた後、80℃で10分間加熱することにより酵
素反応を終結させた。そして、反応生成物を透析により
脱塩し、凍結乾燥してキニノーゲン分解物 0.4mgを得
た。
【００１９】
【実施例６】実施例５で得られたキニノーゲン分解物
0.2mgを0.2M炭酸水素アンモニウム(pH 8.0)で平衡化し
たセファデックスG-75カラム (40×1,000mm)に供し、フ
ラクションコレクターを用いて分画した。タンパク質の
検出は280nm の吸収によった。このゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーでは、文献(Han,Y.N.et al., J.Bioche
m.(Tokyo),vol.79, p.1201, 1976)で報告されているよ
うに分子量の大きい順に溶出するので、３つ現れるピー
クの中、２番目を分取し、透析により脱塩した後、凍結
乾燥してキニノーゲンフラグメント１・２ 0.02mg を得
た。
【００２０】
【試験例１】実施例１〜６で得られた物質について骨芽
細胞増殖作用を調べた。すなわち、マウス骨芽細胞MC3T
3-E1細胞を10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flow
Laboratories社製) で、２×104/mlの細胞数で96穴プレ
ートに播種し、５％ＣＯ2 存在下、37℃で24時間培養
し、試験用培養細胞とした。そして、培地を牛胎児血清
を含まないα−ＭＥＭ培地に交換し、実施例１〜６で得
られた画分を最終濃度10μg/mlとなるよう培地に添加し
て、37℃で18時間培養した。これに 3Ｈ−チミジン0.02
MBq を添加して２時間経過後、セルハーベスターで細胞
をグラスフィルターに回収し、液体シンチレーションカ
ウンターで取り込まれた放射性物質を測定することによ
り細胞増殖活性を調べた。対照として、無添加のものと
ＥＧＦ（上皮成長因子）を添加したものを用い、無添加
のものの細胞増殖活性を 100％としたときのそれぞれの
細胞増殖活性 (％) で表した。その結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例１〜６で得られた物質を添加した群
はいずれも無添加群に比べ細胞増殖活性が増加してお
り、ＥＧＦ添加群に匹敵する骨芽細胞増殖作用を有する
ことが判った。 なお、骨芽細胞ＵＭＲ株を使用して行
った試験においても、同様の結果が得られた。
【００２３】
【試験例２】実施例１〜６で得られた物質について骨吸
収防止作用を調べた。すなわち、生後10〜20日齢のＩＣ
Ｒ系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、５
％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液中で骨を機械的に細
切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この細胞を象
牙片の上に約２×106 細胞を５％牛胎児血清を含むα−
ＭＥＭ溶液でスポットした。２時間後、試験試料が最終
濃度で10μg/mlとなるように５％牛胎児血清を含むα−
ＭＥＭ溶液を加え、５日間培養し、既存の破骨細胞の骨
吸収活性を調べた。
【００２４】骨吸収防止作用の評価は、培養後、象牙片
上の細胞を剥がしてヘマトキシリン染色し、PIASLA-555
により画像解析して骨吸収窩(pit) の数を測定した。対
照として、無添加のものとＥＧＦ（上皮成長因子）を添
加したものを用い、無添加のものの骨吸収活性を 100％
としたときのそれぞれの骨吸収活性 (％) で表した。そ
の結果を表２に示す。実施例１〜６で得られた物質を添
加した群は、いずれも無添加群に比べ骨吸収活性が抑制
されており、骨吸収防止作用を有することが判った。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【実施例７】表３に示した配合で原料を混合した後、容
器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸収
防止作用を賦与した飲料を製造した。
【００２７】
【表３】 ────────────────────── 混合異性化糖 15.0 (重量％) 果汁 10.0 クエン酸 0.5 実施例１で得られた物質 0.0005 香料 0.1 カルシウム 0.5 水 73.9 ──────────────────────
【００２８】
【実施例８】表４に示した配合で原料を混合した後、加
圧成型して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与
した錠剤を製造した。
【００２９】
【表４】 ─────────────────────── 含水結晶ブドウ糖 93.5 (重量％) 実施例２で得られた物質 0.005 カルシウム 5.0 シュガーエステル 1.0 香料 0.5 ───────────────────────
【００３０】
【実施例９】表５に示した配合で原料を混合し、ドウを
作成して成型した後、焙焼して、骨形成促進作用及び骨
吸収防止作用を賦与したビスケットを製造した。
【００３１】
【表５】 ────────────────────── 小麦粉 50.0 (重量％) 砂糖 20.0 食塩 0.5 マーガリン 12.5 卵 12.1 水 3.7 炭酸水素ナトリウム 0.1 重炭酸アンモニウム 0.2 炭酸カルシウム 0.5 実施例１で得られた物質 0.005 ──────────────────────
【００３２】
【実施例１０】表６に示した配合で原料を混合した後、
容器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸
収防止作用を賦与したゼリーを製造した。
【００３３】
【表６】 ────────────────────── 果糖 20.0 (重量％) グラニュー糖 15.0 水飴 5.0 寒天 1.0 実施例４で得られた物質 0.0005 香料 0.11 カルシウム 0.1 水 58.39 ──────────────────────
【００３４】
【実施例１１】表７に示した配合で原料を混合した後、
85℃で乳化して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を
賦与したプロセスチーズを製造した。
【００３５】
【表７】 ────────────────────── ゴーダチーズ 43.0 (重量％) チェダーチーズ 43.5 クエン酸ナトリウム 2.0 実施例４で得られた物質 0.005 乳由来カルシウム 1.0 水 10.5 ──────────────────────
【００３６】
【実施例１２】12重量％還元脱脂乳を90℃で20分間加熱
殺菌した後、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactoba
cillus acidophilus)及びストレップトコッカス・サー
モフィルス(Streptococcus thermophilus) をそれぞれ
接種し、２種類のスターターカルチャーを得て両者を等
量混合した。そして、表８に示した配合で原料を混合し
た後、発酵させて、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用
を賦与したヨーグルトを製造した。
【００３７】
【表８】 ─────────────────────── ヨーグルトミックス 97.0 (重量％) スターターカルチャー 3.0 実施例４で得られた物質 0.0005 ───────────────────────
【００３８】
【実施例１３】表９に示した配合で原料を混合し、骨形
成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与した乳児用調製粉
乳を製造した。
【００３９】
【表９】 ──────────────────────── 脱脂乳 75.61 (重量％) 乳清タンパク質濃縮物 2.36 乳糖 13.86 ミネラル混合物 0.32 水溶性ビタミン混合物 0.32 脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53 実施例４で得られた物質 0.001 ────────────────────────
【００４０】
【実施例１４】表１０に示した配合で原料を混合して、
骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したイヌ飼育
用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００４１】
【表１０】 ────────────────────── 大豆粕 12.0 (重量％) 脱脂粉乳 14.0 大豆油 4.0 コーン油 2.0 パーム油 28.0 トウモロコシ澱粉 15.0 小麦粉 9.0 ふすま 2.0 ビタミン混合物 9.0 ミネラル混合物 2.0 セルロース 3.0 実施例１で得られた物質 0.001 ──────────────────────
【００４２】
【発明の効果】本発明のキニノーゲン及び／又はキニノ
ーゲン分解物を有効成分とする骨形成促進又は骨吸収防
止剤は、ごれを投与すると骨粗鬆症等の各種骨疾患の予
防や改善に有用である。また、これらの有効成分を飲食
品、医薬、飼料等に配合すると骨形成を促進し、骨吸収
を防止して、骨粗鬆症等の各種骨疾患を予防したり改善
する効果を奏する。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 キニノーゲン及び／又はキニノーゲン分
    解物を有効成分とする骨形成促進又は骨吸収防止剤。
  2. 【請求項２】 キニノーゲン分解物が、キニノーゲンフ
    ラグメント１・２である請求項１記載の骨形成促進又は
    骨吸収防止剤。
  3. 【請求項３】 キニノーゲン及び／又はキニノーゲン分
    解物を配合した飲食品、医薬又は飼料。
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