JP3344497B2 - 新規システインプロテアーゼインヒビター - Google Patents
新規システインプロテアーゼインヒビターInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なシステインプロテ
アーゼインヒビターに関する。本発明の新規システイン
プロテアーゼインヒビターは破骨細胞の骨吸収作用に対
する阻害効果を有し、骨の老化抑制を目的とした食品原
料や医薬品として有用である。
アーゼインヒビターに関する。本発明の新規システイン
プロテアーゼインヒビターは破骨細胞の骨吸収作用に対
する阻害効果を有し、骨の老化抑制を目的とした食品原
料や医薬品として有用である。
【０００２】
【従来の技術】システインプロテアーゼインヒビター
は、活性中心にＳＨ基を持つシステインプロテアーゼの
タンパク質分解活性を阻害する物質であり、動物組織、
細胞、血液中や尿中に見出されている。このようなシス
テインプロテアーゼインヒビターであって蛋白性の物質
はシスタチンと総称されている。これまでに見出された
システインプロテアーゼインヒビターであるシスタチン
は、その分子構造から３つのファミリーに分類されてい
る（Biochem.J., 236, 312 (1986))。この文献によれ
ば、ファミリー１（ステフィンファミリー）にはラット
肝臓由来のシスタチンβ（Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 115, 902 (1983))、ラット表皮由来のシスタチン
α（Biochem. Biophys. Res. Commun., 121, 149 (198
4))やヒトの白血球に見出されたステフィンＡ (Hoppe-S
eyler's Z. Physiol. Chem., 364,1487 (1983))が含ま
れている。これらのシスタチンはいずれも分子量約１２
ＫＤａを示し、糖鎖を持たない。
は、活性中心にＳＨ基を持つシステインプロテアーゼの
タンパク質分解活性を阻害する物質であり、動物組織、
細胞、血液中や尿中に見出されている。このようなシス
テインプロテアーゼインヒビターであって蛋白性の物質
はシスタチンと総称されている。これまでに見出された
システインプロテアーゼインヒビターであるシスタチン
は、その分子構造から３つのファミリーに分類されてい
る（Biochem.J., 236, 312 (1986))。この文献によれ
ば、ファミリー１（ステフィンファミリー）にはラット
肝臓由来のシスタチンβ（Biochem. Biophys. Res. Com
mun., 115, 902 (1983))、ラット表皮由来のシスタチン
α（Biochem. Biophys. Res. Commun., 121, 149 (198
4))やヒトの白血球に見出されたステフィンＡ (Hoppe-S
eyler's Z. Physiol. Chem., 364,1487 (1983))が含ま
れている。これらのシスタチンはいずれも分子量約１２
ＫＤａを示し、糖鎖を持たない。
【０００３】また、ファミリー２には, ヒト尿由来のシ
スタチンＣ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 3024
(1982))、卵白シスタチン (Hoppe-Seyler's Z. Physio
l. Chem., 364, 1487 (1983)) がこのファミリーに分類
され、ウシ初乳由来のシスタチン (FEBS Lett., 186, 4
1 (1985)) もこのファミリーに属する。このファミリー
に属するものは分子量約１３〜１５ＫＤａを示し、ファ
ミリー１と同様に糖鎖を有していない。
スタチンＣ（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 3024
(1982))、卵白シスタチン (Hoppe-Seyler's Z. Physio
l. Chem., 364, 1487 (1983)) がこのファミリーに分類
され、ウシ初乳由来のシスタチン (FEBS Lett., 186, 4
1 (1985)) もこのファミリーに属する。このファミリー
に属するものは分子量約１３〜１５ＫＤａを示し、ファ
ミリー１と同様に糖鎖を有していない。
【０００４】さらに、血漿タンパク質であるヒトキニノ
ーゲン (Biochemistry, 23, 5691 (1984))、ラットのＴ
キニノーゲン（Biochem. Biophys. Res. Commun., 129,
280(1985))など、キニノーゲン類がファミリー３を構
成している。キニノーゲン類は分子量７８ＫＤａの高分
子キニノーゲンと分子量４５ＫＤａの低分子キニノーゲ
ンが存在することが知られている。
ーゲン (Biochemistry, 23, 5691 (1984))、ラットのＴ
キニノーゲン（Biochem. Biophys. Res. Commun., 129,
280(1985))など、キニノーゲン類がファミリー３を構
成している。キニノーゲン類は分子量７８ＫＤａの高分
子キニノーゲンと分子量４５ＫＤａの低分子キニノーゲ
ンが存在することが知られている。
【０００５】システインプロテアーゼインヒビターの有
用な作用の１つして、ウィルスの増殖阻害作用が確認さ
れている (Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 107
2(1985))。また、骨疾患モデルの動物の骨より、カルシ
ウムの遊離を抑制する作用を示すことから、特開平２−
２２３５２９号公報には抗アレルギー剤や骨疾患治療剤
としての用途が開示されている。また特開昭６１−２２
５１３０号公報には卵白由来のシスタチンを精製し、こ
れを抗ウイルス剤として使用する技術が開示されてい
る。
用な作用の１つして、ウィルスの増殖阻害作用が確認さ
れている (Biochem. Biophys. Res. Commun., 127, 107
2(1985))。また、骨疾患モデルの動物の骨より、カルシ
ウムの遊離を抑制する作用を示すことから、特開平２−
２２３５２９号公報には抗アレルギー剤や骨疾患治療剤
としての用途が開示されている。また特開昭６１−２２
５１３０号公報には卵白由来のシスタチンを精製し、こ
れを抗ウイルス剤として使用する技術が開示されてい
る。
【０００６】また特開昭６４−２５８２号公報にはシス
タチンαの合成遺伝子、特開平１−７１４９２号公報に
はシスタチンＢの合成遺伝子、特開平１−１５７３９０
号公報にはシスタチンＡの合成遺伝子がそれぞれ開示さ
れており、遺伝子操作によりシスタチンを生産すること
も可能となってきた。
タチンαの合成遺伝子、特開平１−７１４９２号公報に
はシスタチンＢの合成遺伝子、特開平１−１５７３９０
号公報にはシスタチンＡの合成遺伝子がそれぞれ開示さ
れており、遺伝子操作によりシスタチンを生産すること
も可能となってきた。
【０００７】近年、高齢化の進展にともない、破骨細胞
の骨吸収に起因する骨粗鬆症が急増している。現在、破
骨細胞の吸収活性を押える医薬として、カルシトニン製
剤がある。しかしこの製剤は、医薬品として、サケやウ
ナギ由来のホルモンを利用したホルモン製剤であり、食
品素材から得られ、食品素材として使えるような安全な
物質についてはあまり検討されていないのが現状であ
る。
の骨吸収に起因する骨粗鬆症が急増している。現在、破
骨細胞の吸収活性を押える医薬として、カルシトニン製
剤がある。しかしこの製剤は、医薬品として、サケやウ
ナギ由来のホルモンを利用したホルモン製剤であり、食
品素材から得られ、食品素材として使えるような安全な
物質についてはあまり検討されていないのが現状であ
る。
【０００８】
【解決しようとする課題】本発明者らは，食品素材から
得られる安全でしかも食品素材として使えるような物質
について検索した。特に、乳中に存在することが知られ
ているシステインプロテアーゼインヒビターについて検
討をすすめたところ、従来乳由来のシスタチンとして知
られているものと明らかに異なる、新規なシスタチン様
物質を見出した。従って本発明は、乳由来の新規なシス
タチン様システインプロテアーゼインヒビターを提供す
ることを課題とする。
得られる安全でしかも食品素材として使えるような物質
について検索した。特に、乳中に存在することが知られ
ているシステインプロテアーゼインヒビターについて検
討をすすめたところ、従来乳由来のシスタチンとして知
られているものと明らかに異なる、新規なシスタチン様
物質を見出した。従って本発明は、乳由来の新規なシス
タチン様システインプロテアーゼインヒビターを提供す
ることを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明により提供される
新規なシスタチン様システインプロテアーゼインヒビタ
ーは乳から得ることができるものであり、下記の特性に
より特定される。 （１）固定化したカルボキシメチル化パパインに結合性
を有する。 （２）パパインに対する阻害活性を有する。 （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で５７±５Ｋ
Ｄａを示す。 （４）パス染色陽性。 なお、等電点ｐＩについては、通常５．５±０．１を示
す。
新規なシスタチン様システインプロテアーゼインヒビタ
ーは乳から得ることができるものであり、下記の特性に
より特定される。 （１）固定化したカルボキシメチル化パパインに結合性
を有する。 （２）パパインに対する阻害活性を有する。 （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で５７±５Ｋ
Ｄａを示す。 （４）パス染色陽性。 なお、等電点ｐＩについては、通常５．５±０．１を示
す。
【００１０】本発明物質の分子量は、乳由来のシスタチ
ンとして知られている物質の分子量が、上記したように
１２ＫＤａまたは１３〜１５ＫＤａであるのと比較して
遙に大であり、さらに過ヨウ素酸シッフ染色法(periodi
c acid Schiff staining) によるパス染色陽性であるこ
とから糖鎖の存在が推定される。これに対して、乳由来
の既知のシスタチンは糖鎖が結合していない。またキニ
ノーゲンとして知られているシスタチンファミリーの物
質と比較した場合、本発明物質の分子量は５７±５ＫＤ
ａであり、これに対してキニノーゲンの分子量は７８Ｋ
Ｄａの高分子キニノーゲンと分子量４５ＫＤａの低分子
キニノーゲンが知られており、分子量測定により本発明
物質はこれらの物質と明確に区別できる。このように、
本発明により提供される物質は新規シスタチン様システ
インプロテアーゼインヒビターということができる。さ
らに後述するように本発明物質は乳中から分離されるシ
スタチンファミリー１の物質と比較して、システインプ
ロテアーゼの阻害活性が２倍程度高いという特徴を有し
ている。
ンとして知られている物質の分子量が、上記したように
１２ＫＤａまたは１３〜１５ＫＤａであるのと比較して
遙に大であり、さらに過ヨウ素酸シッフ染色法(periodi
c acid Schiff staining) によるパス染色陽性であるこ
とから糖鎖の存在が推定される。これに対して、乳由来
の既知のシスタチンは糖鎖が結合していない。またキニ
ノーゲンとして知られているシスタチンファミリーの物
質と比較した場合、本発明物質の分子量は５７±５ＫＤ
ａであり、これに対してキニノーゲンの分子量は７８Ｋ
Ｄａの高分子キニノーゲンと分子量４５ＫＤａの低分子
キニノーゲンが知られており、分子量測定により本発明
物質はこれらの物質と明確に区別できる。このように、
本発明により提供される物質は新規シスタチン様システ
インプロテアーゼインヒビターということができる。さ
らに後述するように本発明物質は乳中から分離されるシ
スタチンファミリー１の物質と比較して、システインプ
ロテアーゼの阻害活性が２倍程度高いという特徴を有し
ている。
【００１１】本発明物質はヒト、ウシなど哺乳動物の乳
から回収することができるが、特にウシ乳中から容易に
回収することができる。本発明物質は泌乳期間のうち特
に初乳中に大量に含有されるが、通常の乳中にも含有さ
れる。これらの乳を原料として、上述の文献に記載され
ているように、代表的なシステインプロテアーゼである
パパインなどの親和性によるアフィニティークロマトグ
ラフィー等の操作により分離することができる。
から回収することができるが、特にウシ乳中から容易に
回収することができる。本発明物質は泌乳期間のうち特
に初乳中に大量に含有されるが、通常の乳中にも含有さ
れる。これらの乳を原料として、上述の文献に記載され
ているように、代表的なシステインプロテアーゼである
パパインなどの親和性によるアフィニティークロマトグ
ラフィー等の操作により分離することができる。
【００１２】すなわち、ウシ脱脂初乳に、終濃度0.5Mと
なるようにNaClを添加し、これをカルボキシメチル化パ
パイン固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーに供し、ウシ初乳シスタチンと共に、シスタチン
より高分子量のシステインプロテアーゼインヒビターの
濃縮画分を調製する。この画分には既知のシスタチンと
本発明物質を含有している。特に、NaClの添加により非
特異的吸着を抑制し、比活性の高い濃縮画分を調製でき
る。さらに、この画分をゲル濾過クロマトグラフィー等
のクロマトグラフィーによって、本発明物質であるシス
タチン様システインプロテアーゼインヒビターと既知の
シスタチンを分離することができる。精製にあたって
は、この他に蛋白質の精製方法として知られている逆相
クロマトグラフィーやＨＰＬＣなどの方法を組み合わせ
ても良い。
なるようにNaClを添加し、これをカルボキシメチル化パ
パイン固定化担体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーに供し、ウシ初乳シスタチンと共に、シスタチン
より高分子量のシステインプロテアーゼインヒビターの
濃縮画分を調製する。この画分には既知のシスタチンと
本発明物質を含有している。特に、NaClの添加により非
特異的吸着を抑制し、比活性の高い濃縮画分を調製でき
る。さらに、この画分をゲル濾過クロマトグラフィー等
のクロマトグラフィーによって、本発明物質であるシス
タチン様システインプロテアーゼインヒビターと既知の
シスタチンを分離することができる。精製にあたって
は、この他に蛋白質の精製方法として知られている逆相
クロマトグラフィーやＨＰＬＣなどの方法を組み合わせ
ても良い。
【００１３】本発明物質のパパイン対する阻害活性は B
arrettらの方法 ("Methods in enzymology" Vol.80 198
1, pp771) に準じて測定することができる。即ち ０．
１Ｍベンゾイル-D,L- アルギニン-4- ニトロアニリド(B
ezoil-D,L-arginine-4-nitroanilide)ジメチルスルホキ
シド溶液を基質とし、測定用の緩衝液として、２ｍＭの
ＥＤＴＡを含む、２０ｍＭリン酸緩衝液に使用直前にシ
ステインを終濃度８ｍＭとなるように添加した溶液を用
いて、比色法により酵素の活性を測定することによっ
て、酵素の阻害率を求める方法である。本発明の新規シ
ステインプロテアーゼインヒビターは乳中のシスタチン
の活性を上回っている。乳中のシスタチンを対照として
阻害活性を測定した場合、蛋白質あたりの阻害活性は２
倍程度の阻害率を示す。
arrettらの方法 ("Methods in enzymology" Vol.80 198
1, pp771) に準じて測定することができる。即ち ０．
１Ｍベンゾイル-D,L- アルギニン-4- ニトロアニリド(B
ezoil-D,L-arginine-4-nitroanilide)ジメチルスルホキ
シド溶液を基質とし、測定用の緩衝液として、２ｍＭの
ＥＤＴＡを含む、２０ｍＭリン酸緩衝液に使用直前にシ
ステインを終濃度８ｍＭとなるように添加した溶液を用
いて、比色法により酵素の活性を測定することによっ
て、酵素の阻害率を求める方法である。本発明の新規シ
ステインプロテアーゼインヒビターは乳中のシスタチン
の活性を上回っている。乳中のシスタチンを対照として
阻害活性を測定した場合、蛋白質あたりの阻害活性は２
倍程度の阻害率を示す。
【００１４】また、この本発明システインプロテアーゼ
インヒビターは、ＰＡＳ染色で陽性を示し、糖鎖の存在
が確認される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で
は、還元及び非還元状態でいずれも５７ＫＤａを示し
た。本発明物質をゲル等電点電気泳動法（Fast system
Pharmacia社製) により等電点を測定したところ、ｐＩ
が、５．４−５．６を示した。
インヒビターは、ＰＡＳ染色で陽性を示し、糖鎖の存在
が確認される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定で
は、還元及び非還元状態でいずれも５７ＫＤａを示し
た。本発明物質をゲル等電点電気泳動法（Fast system
Pharmacia社製) により等電点を測定したところ、ｐＩ
が、５．４−５．６を示した。
【００１５】本発明物質は乳中に常在する蛋白質であ
り、その安全性は高いものと考えられる。従って、既知
のシスタチンに見出される、抗ウイルス剤、抗アレルギ
ー剤、骨疾患治療剤として用いることが可能であり、必
要に応じて製剤化するか、あるいは単独で用いることが
可能である。また食品や飲料中に混入させて用いること
もできる。医薬品として用いる場合には経口剤、座剤な
どが例示できる。また蛋白質製剤は通常注射剤として用
いられることが多いが、本発明物質においても同様に薬
学的に有効な量の本発明物質を含有させ、製薬学的に許
容しうる安定剤、賦形剤、等張化剤、無痛化剤、防腐
剤、緩衝剤などを含有させて注射剤とすることもでき
る。
り、その安全性は高いものと考えられる。従って、既知
のシスタチンに見出される、抗ウイルス剤、抗アレルギ
ー剤、骨疾患治療剤として用いることが可能であり、必
要に応じて製剤化するか、あるいは単独で用いることが
可能である。また食品や飲料中に混入させて用いること
もできる。医薬品として用いる場合には経口剤、座剤な
どが例示できる。また蛋白質製剤は通常注射剤として用
いられることが多いが、本発明物質においても同様に薬
学的に有効な量の本発明物質を含有させ、製薬学的に許
容しうる安定剤、賦形剤、等張化剤、無痛化剤、防腐
剤、緩衝剤などを含有させて注射剤とすることもでき
る。
【００１６】以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【実施例１】 新規システインプロテアーゼインヒビターの精製 （１）インヒビター活性測定 システインプロテアーゼに対するインヒビター活性は、
パパインに対する阻害活性を Barrett らの方法 ("Meth
ods in enzymology" Vol.80 1981, pp771) に準じて測
定した。０．１Ｍベンゾイル-D,L- アルギニン-4- ニト
ロアニリドジメチルスルホキシド溶液を基質とし、測定
用の緩衝液として、２ｍＭのＥＤＴＡを含む、２０ｍＭ
リン酸緩衝液に使用直前にシステインを終濃度８ｍＭと
なるように添加した。パパインを０．５ｍｇ／ｍｌの濃
度で、システインを含まない測定用緩衝液に溶解した。
また、反応停止用溶液として３０％酢酸溶液を使用し
た。測定は、以下の手順で行った。測定用チューブに１
ｍｌシステインを含むリン酸緩衝液と０．１ｍｌのパパ
イン溶液を入れ、３７℃で５分間インキュベートした。
次いで、試料溶液０．１ｍｌ基質溶液３０μｌを加え攪
拌した。３７℃で３０分間反応後、０．２ｍｌの反応停
止液を加え、４１０ｎｍの吸光度を測定した。インヒビ
ター活性は以下の数１式より求めた。
パパインに対する阻害活性を Barrett らの方法 ("Meth
ods in enzymology" Vol.80 1981, pp771) に準じて測
定した。０．１Ｍベンゾイル-D,L- アルギニン-4- ニト
ロアニリドジメチルスルホキシド溶液を基質とし、測定
用の緩衝液として、２ｍＭのＥＤＴＡを含む、２０ｍＭ
リン酸緩衝液に使用直前にシステインを終濃度８ｍＭと
なるように添加した。パパインを０．５ｍｇ／ｍｌの濃
度で、システインを含まない測定用緩衝液に溶解した。
また、反応停止用溶液として３０％酢酸溶液を使用し
た。測定は、以下の手順で行った。測定用チューブに１
ｍｌシステインを含むリン酸緩衝液と０．１ｍｌのパパ
イン溶液を入れ、３７℃で５分間インキュベートした。
次いで、試料溶液０．１ｍｌ基質溶液３０μｌを加え攪
拌した。３７℃で３０分間反応後、０．２ｍｌの反応停
止液を加え、４１０ｎｍの吸光度を測定した。インヒビ
ター活性は以下の数１式より求めた。
【００１７】
【数１】 比活性〔unit/mg]＝（A0−A1）×1.43／ 8.8×30× WS A0 : インヒビターフリーの吸光度 AI : サンプルの吸光度 WS : サンプル溶液中のタンパク質量[mg]
【００１８】（２）濃縮画分の調製法 分娩後１日以内に搾乳したウシ初乳９ｌから遠心分離に
より脱脂乳を調製し、終濃度０．５ＭとなるようにＮａ
Ｃｌを添加した。カルボキシメチル化パパインをトレシ
ルトヨパール（Tresyl-Toyopearl, 東ソー製) に結合さ
せた担体を５０φ×１５０ｍｍのカラムへ充填後、０．
５Ｍ ＮａＣｌ溶液で平衡化し、先のＮａＣｌを添加し
た脱脂乳を通液し、システインプロテアーゼインヒビタ
ーを吸着させた。通液後、０．５Ｍ ＮａＣｌ 溶液と
０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．５Ｍ ＮａＣｌ
溶液で順次カラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ酢酸−
０．５ＭＮａＣｌ溶液でシステインプロテアーゼインヒ
ビターを溶出させた。溶出画分を直ちに１Ｍ ＮａＯＨ
溶液で中和し、４４６ｍｌの濃縮画分を得た。
より脱脂乳を調製し、終濃度０．５ＭとなるようにＮａ
Ｃｌを添加した。カルボキシメチル化パパインをトレシ
ルトヨパール（Tresyl-Toyopearl, 東ソー製) に結合さ
せた担体を５０φ×１５０ｍｍのカラムへ充填後、０．
５Ｍ ＮａＣｌ溶液で平衡化し、先のＮａＣｌを添加し
た脱脂乳を通液し、システインプロテアーゼインヒビタ
ーを吸着させた。通液後、０．５Ｍ ＮａＣｌ 溶液と
０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．５Ｍ ＮａＣｌ
溶液で順次カラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ酢酸−
０．５ＭＮａＣｌ溶液でシステインプロテアーゼインヒ
ビターを溶出させた。溶出画分を直ちに１Ｍ ＮａＯＨ
溶液で中和し、４４６ｍｌの濃縮画分を得た。
【００１９】（３）シスタチンおよび新規システインプ
ロテアーゼインヒビターの単離法 （１）で調製した濃縮画分を分画分子量６ＫＤａのフォ
ローファイバー型ＵＦ膜（旭化成製）により３０ｍｌに
濃縮した。次いで、あらかじめ充填し、０．１Ｍ炭酸水
素アンモニウム緩衝液で平衡化した Sephacryl Ｓ−２
００ＨＲ (Pharmacia 製) カラム (５０φ×７５０ｍ
ｍ）に通液した。２８０ｎｍの紫外部吸収をモニターし
たところ、タンパク質は３つの画分に分離され、その内
２つの画分にインヒビター活性が認められた。このイン
ヒビター活性を示す画分を回収し、凍結乾燥により、２
４０ｍｇの新規システインプロテアーゼインヒビターお
よび、６．４ｍｇの乳由来シスタチンをそれぞれ得た。
表１に各精製過程の精製度を示す。
ロテアーゼインヒビターの単離法 （１）で調製した濃縮画分を分画分子量６ＫＤａのフォ
ローファイバー型ＵＦ膜（旭化成製）により３０ｍｌに
濃縮した。次いで、あらかじめ充填し、０．１Ｍ炭酸水
素アンモニウム緩衝液で平衡化した Sephacryl Ｓ−２
００ＨＲ (Pharmacia 製) カラム (５０φ×７５０ｍ
ｍ）に通液した。２８０ｎｍの紫外部吸収をモニターし
たところ、タンパク質は３つの画分に分離され、その内
２つの画分にインヒビター活性が認められた。このイン
ヒビター活性を示す画分を回収し、凍結乾燥により、２
４０ｍｇの新規システインプロテアーゼインヒビターお
よび、６．４ｍｇの乳由来シスタチンをそれぞれ得た。
表１に各精製過程の精製度を示す。
【００２０】
【表１】 各精製過程の精製度 ───────────────────────────── インヒビター活性 タンパク質 容量 [unit/mg] [unit] [mg/ml] [mg] [ml] ───────────────────────────── 脱脂乳 0.0001 145.9 180.0 1395(g) 7600 濃縮画分 0.197 104.4 1.19 530 446 CPI1) 0.405 96.9 1.69 239 141 coCys2) 0.240 1.5 0.0783 6.38 81.5 ───────────────────────────── 1) 新規システインプロテアーゼインヒビター 2) 乳由来シスタチン
【００２１】図１には、濃縮画分および、単離した新規
システインプロテアーゼインヒビター、乳由来シスタチ
ンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。また、新規シス
テインプロテアーゼインヒビターの特性を下記表２にま
とめた。
システインプロテアーゼインヒビター、乳由来シスタチ
ンのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。また、新規シス
テインプロテアーゼインヒビターの特性を下記表２にま
とめた。
【００２２】
【表２】 初乳システインプロテアーゼインヒビターの特性 ──────────────────────── 分子量 等電点 糖鎖1) ──────────────────────── CPI 57kDa 5.4-5.6 ＋ coCys 13kDa 9.0 以上 − ──────────────────────── 1) pass 染色による定性
【００２３】表１から、カルボキシメチル化パパインア
フィニティークロマトグラフィーによる濃縮画分の調製
では、精製倍率が約２０００倍、回収率も７０％を上回
っており、効率の良い方法であることが確認できた。ま
た、最終的に単離した新規システインプロテアーゼイン
ヒビターは、従来からその存在が認められていた初乳シ
スタチンより約１．６倍高い比活性を示した。図１か
ら、新規システインプロテアーゼインヒビターおよび乳
由来シスタチン共に単一バンドを示し、不純物は認めら
れず、還元及び非還元条件下でも変化が無いことから、
両者共に単一のポリペプチドから成ることが示された。
この結果から、本法により従来１種類と考えられていた
画分から純粋な２種のインヒビターを同時に単離できる
ることが確認された。
フィニティークロマトグラフィーによる濃縮画分の調製
では、精製倍率が約２０００倍、回収率も７０％を上回
っており、効率の良い方法であることが確認できた。ま
た、最終的に単離した新規システインプロテアーゼイン
ヒビターは、従来からその存在が認められていた初乳シ
スタチンより約１．６倍高い比活性を示した。図１か
ら、新規システインプロテアーゼインヒビターおよび乳
由来シスタチン共に単一バンドを示し、不純物は認めら
れず、還元及び非還元条件下でも変化が無いことから、
両者共に単一のポリペプチドから成ることが示された。
この結果から、本法により従来１種類と考えられていた
画分から純粋な２種のインヒビターを同時に単離できる
ることが確認された。
【００２４】
【実施例２】 破骨細胞の骨吸収作用に対する阻害効果 全骨細胞を、１３日齢授乳マウス（ＩＣＲ種, 静岡動物
センター）の大腿骨より調製した。摘出した骨の軟組織
を取り除き，α-Modified minimun essentialmedium
(α-MEM, Flow Laboratories, (McLean, VA))で５分間
細かく破砕した。この破砕物を、さらに tube mixer で
３０秒間激しく撹拌し、３分間静置することにより大き
な破砕物を除いて、破骨細胞を含む全骨細胞を用いた。
象牙片は、象牙塊をダイヤモンドカッターで厚さ１５０
μｍに切断後直径６ｍｍの円形に切り抜くことにより作
製した。次いで、７５％エタノールで滅菌後、α−ＭＥ
Ｍで洗浄し９６ｗｅｌｌプレートに移した。
センター）の大腿骨より調製した。摘出した骨の軟組織
を取り除き，α-Modified minimun essentialmedium
(α-MEM, Flow Laboratories, (McLean, VA))で５分間
細かく破砕した。この破砕物を、さらに tube mixer で
３０秒間激しく撹拌し、３分間静置することにより大き
な破砕物を除いて、破骨細胞を含む全骨細胞を用いた。
象牙片は、象牙塊をダイヤモンドカッターで厚さ１５０
μｍに切断後直径６ｍｍの円形に切り抜くことにより作
製した。次いで、７５％エタノールで滅菌後、α−ＭＥ
Ｍで洗浄し９６ｗｅｌｌプレートに移した。
【００２５】既存の破骨細胞によって、卵白由来シスタ
チン、乳由来シスタチン、乳由来高分子システインプロ
テアーゼインヒビターの骨吸収阻害効果を調べるため
に、２００μｌのα−ＭＥＭに５％牛胎児血清を補った
培地で３×１０5 の細胞を象牙片上で３７℃、ＣＯ2 イ
ンキュベーター (５％ＣＯ2,９５％ air) で２時間培養
した。その後、卵白由来シスタチン、乳由来シスタチ
ン、乳由来高分子システインプロテアーゼインヒビター
を各１μｇ／ｍｌの濃度含む培地に置き換え、２日毎に
培地交換しながら培養した。培養終了後、９６ｗｅｌｌ
プレート上で Handyengine （吉田精工）を１０秒間作
用させることにより細胞を取り除き、酸性ヘマトキシリ
ン(sigma) で３分間染色した。破骨細胞によって、形成
された骨吸収窩の総面積は、画像解析装置(PIAS-LA55,
PIAS) を用いて計測した。象牙片上の骨吸収窩は、顕微
鏡 (対物レンズ, ×２ＴＶカメラ接続レンズ，×１４）
からビデオカメラにより画像として取り込み、フィルタ
ー処理および、ノイズ除去後２値化（黒、白）して、面
積を測定した。
チン、乳由来シスタチン、乳由来高分子システインプロ
テアーゼインヒビターの骨吸収阻害効果を調べるため
に、２００μｌのα−ＭＥＭに５％牛胎児血清を補った
培地で３×１０5 の細胞を象牙片上で３７℃、ＣＯ2 イ
ンキュベーター (５％ＣＯ2,９５％ air) で２時間培養
した。その後、卵白由来シスタチン、乳由来シスタチ
ン、乳由来高分子システインプロテアーゼインヒビター
を各１μｇ／ｍｌの濃度含む培地に置き換え、２日毎に
培地交換しながら培養した。培養終了後、９６ｗｅｌｌ
プレート上で Handyengine （吉田精工）を１０秒間作
用させることにより細胞を取り除き、酸性ヘマトキシリ
ン(sigma) で３分間染色した。破骨細胞によって、形成
された骨吸収窩の総面積は、画像解析装置(PIAS-LA55,
PIAS) を用いて計測した。象牙片上の骨吸収窩は、顕微
鏡 (対物レンズ, ×２ＴＶカメラ接続レンズ，×１４）
からビデオカメラにより画像として取り込み、フィルタ
ー処理および、ノイズ除去後２値化（黒、白）して、面
積を測定した。
【００２６】その結果を図２に示した。卵白由来シスタ
チン（Ｅｗ−Ｃｙｓ）、乳由来シスタチン（Ｃｏ−Ｃｙ
ｓ）、新規乳由来システインプロテアーゼインヒビター
（ＨＭ−Ｃｙｓ）ともに、骨吸収を抑制しており、本発
明の新規システインプロテアーゼインヒビターの骨吸収
阻害効果が最も高かった。このことから、これらのタン
パク質は、破骨細胞に直接作用して骨吸収を抑制してい
ることが示唆された。また、これらの物質はいずれも繊
維芽細胞、骨芽細胞の増殖には全く影響を及ぼさず、毒
性も示さなかった。
チン（Ｅｗ−Ｃｙｓ）、乳由来シスタチン（Ｃｏ−Ｃｙ
ｓ）、新規乳由来システインプロテアーゼインヒビター
（ＨＭ−Ｃｙｓ）ともに、骨吸収を抑制しており、本発
明の新規システインプロテアーゼインヒビターの骨吸収
阻害効果が最も高かった。このことから、これらのタン
パク質は、破骨細胞に直接作用して骨吸収を抑制してい
ることが示唆された。また、これらの物質はいずれも繊
維芽細胞、骨芽細胞の増殖には全く影響を及ぼさず、毒
性も示さなかった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により新規システインプロテアー
ゼインヒビターが提供される。本発明により提供される
物質は既知のシスタチンと比較して高いシステインプロ
テアーゼ阻害活性を有し、破骨細胞に直接作用して骨吸
収を抑制するなどシスタチンと同様の生理活性を示す。
ゼインヒビターが提供される。本発明により提供される
物質は既知のシスタチンと比較して高いシステインプロ
テアーゼ阻害活性を有し、破骨細胞に直接作用して骨吸
収を抑制するなどシスタチンと同様の生理活性を示す。
【図１】乳由来のシスタチンと本発明により得た新規シ
ステインプロテアーゼインヒビターのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のパターンを示す。
ステインプロテアーゼインヒビターのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のパターンを示す。
１，３，６：分子量マーカー ２：システインプロテアーゼ濃縮物 ４：乳由来シスタチン（還元状態） ５：乳由来シスタチン（非還元状態） ７：新規システインプロテアーゼインヒビター（還元状
態） ８：新規システインプロテアーゼインヒビター（非還元
状態）
態） ８：新規システインプロテアーゼインヒビター（非還元
状態）
【図２】乳由来シスタチン、新規システインプロテアー
ゼインヒビター、卵白由来シスタチンの０．１マイクロ
モル当たりの骨吸収阻害活性を示す。
ゼインヒビター、卵白由来シスタチンの０．１マイクロ
モル当たりの骨吸収阻害活性を示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ：インヒビター無添加 Ｃｏ−Ｃｙｓ：乳由来シスタチン０．１μＭ添加 ＨＭ−Ｃｙｓ：新規システインプロテアーゼインヒビタ
ー０．１μＭ添加 ＥＷ−Ｃｙｓ：卵白シスタチン０．１μＭ添加
ー０．１μＭ添加 ＥＷ−Ｃｙｓ：卵白シスタチン０．１μＭ添加
フロントページの続き (72)発明者 久米川 正好 埼玉県川越市霞ケ関３−１−16 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/51 A23L 1/305 C12N 9/99 A61K 38/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】下記特性を有する乳由来のシステインプロ
テアーゼインヒビター。 （１）固定化したカルボキシメチル化パパインに結合性
を有する。 （２）パパインに対する阻害活性を有する。 （３）SDS-PAGEによる分子量測定で57±5KDaを示す。 （４）パス染色陽性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08419193A JP3344497B2 (ja) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | 新規システインプロテアーゼインヒビター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08419193A JP3344497B2 (ja) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | 新規システインプロテアーゼインヒビター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH072896A JPH072896A (ja) | 1995-01-06 |
| JP3344497B2 true JP3344497B2 (ja) | 2002-11-11 |
Family
ID=13823588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08419193A Expired - Fee Related JP3344497B2 (ja) | 1993-03-18 | 1993-03-18 | 新規システインプロテアーゼインヒビター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3344497B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3073439B2 (ja) * | 1996-02-08 | 2000-08-07 | 雪印乳業株式会社 | 骨形成促進及び骨吸収防止剤 |
| JP4592127B2 (ja) * | 1999-03-30 | 2010-12-01 | 雪印乳業株式会社 | 骨吸収抑制剤 |
| US6649590B2 (en) * | 2000-06-09 | 2003-11-18 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Method of producing fractions containing a high concentration of milk basic cystatin and decomposition products thereof |
| AU784087B2 (en) * | 2000-06-09 | 2006-02-02 | Megmilk Snow Brand Co., Ltd. | Method of producing fractions containing a high concentration of milk basic cystatin and decomposition products thereof |
| US20050148504A1 (en) * | 2002-11-29 | 2005-07-07 | Nobuhiko Katunuma | Cysteine protease inhibitor |
| CN114196730A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-18 | 南京林业大学 | 一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法及其检测试剂盒 |
-
1993
- 1993-03-18 JP JP08419193A patent/JP3344497B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH072896A (ja) | 1995-01-06 |
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