CN114196730A - 一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法及其检测试剂盒 - Google Patents

一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法及其检测试剂盒 Download PDF

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陈金慧
陈红
郝兆东
施季森
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陆小清
周婷
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Abstract

本发明公开了一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法及其检测试剂盒，属于生物分析技术领域。本发明利用半胱氨酸蛋白酶抑制剂能与木瓜蛋白酶形成紧密的复合物，抑制木瓜蛋白酶的活性，而木瓜蛋白酶能催化N‑苯甲酰‑L‑精氨酸乙酯(底物)水解而释出N‑苯甲酰‑L‑精氨酸，水解产物与4‑(二甲基氨基)肉桂醛(显色剂)结合成有色产物，在540μm处吸光值最大，与浓度呈正比，根据木瓜蛋白酶酶活性测算出半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性。本发明样品需求量少，操作简单，大大节省了成本；从采样到获得检测结果在2小时内，检测时间短，检出限为0.05‑0.22U·min‑1·ml‑1，精度高，重现性好。

Description

一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法 及其检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于比色分析进行检测中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法以及一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测试剂盒。
背景技术
中国鹅掌楸属于木兰科鹅掌楸属(Liriodendron)植物，本属现存2个种，北美鹅掌楸(L.tulipifera Linn.)和中国鹅掌楸(L.chinense(Hemsl.)Sarg.)。中国鹅掌楸是落叶乔木，叶似马褂，故又名马褂木。与同属的北美鹅掌楸被广泛应用在景观种植、生物能源制造、古植物学、系统生物学、植物系统进化等不同领域。虽然鹅掌楸具有良好的观赏价值和重要的科研价值，但其生存状况却令人堪忧，已被列入第一批濒危物种名单，在1999年被定为国家二级重点保护野生植物。据统计，鹅掌楸的自然结实率极低(10％左右)，其群落分布呈点状、断带式。影响鹅掌楸结实率的原因复杂而多样，以虫媒传粉为主的鹅掌楸自然结实率低是推广应用的重要障碍，并且在花蜜分泌方面与北美鹅掌楸存在巨大差异。作为虫媒植物，这可能是中国鹅掌楸结实率低的一个重要原因。
分泌花蜜是许多被子植物为了吸引传粉者，尤其是飞行类昆虫来进行自然杂交繁殖的一种进化适应机制，同时花蜜也作为一种营养物质和能源提供给传粉者。花蜜由称之为蜜腺的专门分泌器官分泌，具有复杂的成分，其分泌时期通常受发育控制。花蜜一般都含有糖类、氨基酸、无机离子、蛋白质和脂类等，有些花蜜还含有生物碱、萜类以及一些挥发性物质等。早在20世纪30年代，植物学家就发现花蜜中存在着各种各样的蛋白质。1935年Beutler首次在椴树属(Tilia)植物花蜜中发现具有活性的蔗糖转化酶。之后人们相继在植物花蜜中检测出了转葡糖苷酶、转果糖苷酶、酪氨酸酶、磷酸酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、酯酶以及苹果酸酯脱氢酶等，并推测这些花蜜蛋白可能在花蜜中起到抵御不利微生物的作用。
广泛存在于动植物组织和体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨，酸蛋白酶彤成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被半胱氨酸蛋白酶破坏，阻止蛋白的降解。进一步研究表明半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有很好的防御作用。植物半胱氨酸蛋酶抑制剂可抑制致病真菌，如赤霉菌和稻瘟病菌等的生长，其作用机制可能与半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制了半胱氨酸肽链内切酶的侵害有关。当植物受到病虫侵害时，体内的抑制剂含量会增加，抑制剂含量高的植株感染病害的几率小。目前尚缺乏能够快速而简单地检测鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法；本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，包括以下步骤：
(1)样品的初步制备
1)将待测中国鹅掌楸花蜜样品采用超微滤膜过滤；
2)利用蛋白质超滤浓缩纯化柱浓缩纯化花蜜，记录浓缩倍数，得到花蜜浓缩液；
(2)样品与酶液的混合与孵育
取花蜜浓缩液与1.5mg/ml的木瓜蛋白酶在缓冲液中混匀，37℃孵育15分钟；缓冲液的配方为：0.1mol/L磷酸钠、0.01mol/L EDTA、0.005mol/L半胱氨酸、0.02％Triton X-100，pH 6.0；
(3)酶液与底物反应与终止
加入5-10mmol/LN-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐，继续37℃孵育15分钟，然后加入1％HCl终止反应；
(4)反应底物的显色
加入0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛，室温静置20分钟后测定复合物OD540值；以每分钟的OD540变化数值为半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性指标，活性指标定义为：每mL花蜜在每mL反应体系中每分钟OD540变化0.01定义为一个酶活力单位；
计算公式为：半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性＝(OD540′-OD540)/T/V/A/0.01；其中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的单位为U/ml，OD540′为不加样品的吸光值，OD540为加入样品的吸光值，T为反应时间，单位为min，V为加入样品体积，单位为ml，A为样品浓缩倍数。
进一步的，将待测中国鹅掌楸花蜜样品采用孔径为0.22μm的超微滤膜过滤。
使用0.22μm的滤膜过滤样品，有效的去除了新鲜花蜜中的微生物和细菌，避免对检测结果造成干扰。
进一步的，利用10K蛋白质超滤浓缩纯化柱浓缩纯化花蜜，记录浓缩倍数，得到花蜜浓缩液。在去除影响检测结果的小分子物质的基础上进一步扩大了含量低的抑制剂的检测浓度范围。
进一步的，N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐、1％HCl和0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛的体积比为1-2：10：4。
一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测试剂盒，包括木瓜蛋白酶、酶解反应缓冲液、酶解底物、终止液和显色液；酶解反应缓冲液的配方为0.1mol/L磷酸钠、0.01mol/LEDTA、0.005mol/L半胱氨酸、0.02％Triton X-100，pH 6.0；酶解底物为N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐；终止液为1％HCl；显色液为0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛。
进一步的，木瓜蛋白酶的浓度为1.5mg/ml；N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐的浓度为5-10mmol/L。
1％HCl和0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛均为体积百分数，用水稀释配制而成。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明利用半胱氨酸蛋白酶抑制剂能与木瓜蛋白酶形成紧密的复合物，抑制木瓜蛋白酶的活性，而木瓜蛋白酶能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(底物)水解而释出N-苯甲酰-L-精氨酸，水解产物与4-(二甲基氨基)肉桂醛(显色剂)结合成有色产物，在540μm处吸光值最大，与浓度呈正比，根据木瓜蛋白酶酶活性测算出半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性。本发明克服了花蜜中酶种类多，干扰强的特点，样品需求量少，操作简单，大大节省了成本；从采样到获得检测结果在2小时内，检测时间短，检出限为0.05-0.22U·min-1·ml-1，精度高，重现性好。
附图说明
图1为实施例1加入花蜜浓缩液样本体积与抑制剂的标准曲线图；
图2为实施例2加入花蜜浓缩液样本体积与抑制剂的标准曲线图；
图3为实施例3加入花蜜浓缩液样本体积与抑制剂的响应曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，包括以下步骤：
(1)将2000μl花蜜样品采用孔径为0.22μm的超微滤膜过滤；
(2)将过滤后的花蜜加入到10K蛋白质超滤浓缩纯化柱中，2000g，离心15min，浓缩纯化花蜜，离心后花蜜浓缩液为100μl，浓缩倍数为20倍；
(3)分别取4，8，12，24，36μl花蜜浓缩液与1ml的1.5mg/ml的木瓜蛋白酶在缓冲液(0.1mol/L磷酸钠，0.01mol/L EDTA，0.005mol/L半胱氨酸，0.02％Triton X-100，pH 6.0)混匀，37℃孵育15分钟；
(4)加入50μl的10mmol/L的N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐(底物)，继续37℃孵育15分钟，然后加入500μl的1％HCl终止反应；
(5)最后加入200μl 0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛(显色剂)，室温静置20分钟后测定复合物OD540值。以每分钟的OD540变化数值为半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性指标，活性指标定义为：每mL花蜜在每mL反应体系中每分钟OD540变化0.01定义为一个酶活力单位。
计算公式为：抑制剂活性(U/m1)＝ΔOD540min-1ml-1＝(OD540′-OD540)/T/V/A/0.01。
OD540′为不加样品的吸光值，OD540为加入样品的吸光值，T为反应时间(min)，V为加入样品体积(m1)，A为样品浓缩倍数。
最终根据加入不同体积的花蜜浓缩液，得到加入体积与抑制剂活性的标准曲线，如图1所示，R2＝0.9723，在一定范围内符合标准曲线，证明结果可靠。
实施例2
一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，包括以下步骤：
(1)将2000μl花蜜样品采用孔径为0.22μm的超微滤膜过滤；
(2)将过滤后的花蜜加入到10K蛋白质超滤浓缩纯化柱中，2000g，离心15min，浓缩纯化花蜜，离心后花蜜浓缩液为100μl，浓缩倍数为20倍；
(3)分别取12，24，36，48，60，72μl花蜜浓缩液与1ml的1.5mg/ml的木瓜蛋白酶在缓冲液(0.1mol/L磷酸钠，0.01mol/L EDTA，0.005mol/L半胱氨酸，0.02％Triton X-100，pH6.0)混匀，37℃孵育15分钟；
(4)加入50μl的10mmol/L的N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐(底物)，继续37℃孵育15分钟，然后加入500μL的1％HCl终止反应；
(5)最后加入200μl 0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛(显色剂)，室温静置20分钟后测定复合物OD540值。以每分钟的OD540变化数值为半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性指标，活性指标定义为：每mL花蜜在每mL反应体系中每分钟OD540变化0.01定义为一个酶活力单位。
计算公式为：抑制剂活性(U/ml)＝ΔOD540min-1ml-1＝(OD540′-OD540)/T/V/A/0.01。
OD540′为不加样品的吸光值，OD540为加入样品的吸光值，T为反应时间(min)，V为加入样品体积(ml)，A为样品浓缩倍数。
最终根据加入不同体积的花蜜浓缩液，得到加入体积与抑制剂活性的标准曲线，如图2所示，R2＝0.9803，在一定范围内符合标准曲线，证明结果可靠。
实施例3
一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，包括以下步骤：
(1)将8000μl花蜜样品采用孔径为0.22μm的超微滤膜过滤；
(2)将过滤后的花蜜加入到10K蛋白质超滤浓缩纯化柱中，2000g，离心15min，浓缩纯化花蜜，离心后花蜜浓缩液为400μl，浓缩倍数为20倍；
(3)分别取48，60，72，84，96μl花蜜浓缩液与1ml的1.5mg/ml的木瓜蛋白酶在缓冲液(0.1mol/L磷酸钠，0.01mol/L EDTA，0.005mol/L半胱氨酸，0.02％Triton X-100，pH6.0)混匀，37℃孵育15分钟；
(4)加入50μl的10mmol/L的N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐(底物)，继续37℃孵育15分钟，然后加入500μl的1％HCl终止反应；
(5)最后加入200μl 0.05％的4-(二甲基氨基)肉桂醛(显色剂)，室温静置20分钟后测定复合物OD540值。以每分钟的OD540变化数值为半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性指标，活性指标定义为：每mL花蜜在每mL反应体系中每分钟OD540变化0.01定义为一个酶活力单位。
计算公式为：抑制剂活性(U/ml)＝ΔOD540min-1ml-1＝(OD540′-OD540)/T/V/A/0.01。
OD540′为不加样品的吸光值，OD540为加入样品的吸光值，T为反应时间(min)，V为加入样品体积(ml)，A为样品浓缩倍数。
最终根据加入不同体积的花蜜浓缩液，得到加入体积与抑制剂活性的标准曲线，如图3所示，R2＝0.8482，不符合标准曲线要求，因此在此样品体积范围内结果不可靠。

Claims (6)

1.一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测中国鹅掌楸花蜜样品采用超微滤膜过滤；
2)利用蛋白质超滤浓缩纯化柱浓缩纯化花蜜，记录浓缩倍数，得到花蜜浓缩液；
3)取花蜜浓缩液与木瓜蛋白酶在缓冲液中混匀，37℃孵育15分钟；所述缓冲液的配方为：0.1mol/L磷酸钠、0.01mol/L EDTA、0.005mol/L半胱氨酸、0.02％Triton X-100，pH6.0；所述木瓜蛋白酶的浓度为1.5mg/ml；
4)加入5-10mmol/L N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐，继续37℃孵育15分钟，然后加入1％体积百分数HCl终止反应；
5)最后加入0.05％体积百分数的4-(二甲基氨基)肉桂醛，室温静置20分钟后测定复合物OD540值；以每分钟的OD540变化数值为半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性指标，计算公式为：半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性＝(OD540′-OD540)/T/V/A/0.01；其中，OD540′为不加样品的吸光值，OD540为加入样品的吸光值，T为反应时间，V为加入样品体积，A为样品浓缩倍数；半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性的单位为U/ml，T的单位为min；V的单位为ml。
2.根据权利要求1所述的中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，其特征在于，步骤1)中，将待测中国鹅掌楸花蜜样品采用孔径为0.22μm的超微滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，其特征在于，步骤2)中，利用10K蛋白质超滤浓缩纯化柱浓缩纯化花蜜，记录浓缩倍数，得到花蜜浓缩液。
4.根据权利要求1所述的中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测方法，其特征在于，N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐、1％体积百分数HCl和0.05％体积百分数的4-(二甲基氨基)肉桂醛的体积比为1-2∶10∶4。
5.一种中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测试剂盒，其特征在于，包括木瓜蛋白酶、酶解反应缓冲液、酶解底物、终止液和显色液；所述酶解反应缓冲液的配方为0.1mol/L磷酸钠、0.01mol/L EDTA、0.005mol/L半胱氨酸、0.02％Triton X-100，pH 6.0；所述酶解底物为N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐；所述终止液为1％体积百分数HCl；所述显色液为0.05％体积百分数的4-(二甲基氨基)肉桂醛。
6.根据权利要求5所述的中国鹅掌楸花蜜中半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性检测试剂盒，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的浓度为1.5mg/ml；所述N-苯甲酰-DL-精氨酸β-萘胺盐酸盐的浓度为5-10mmol/L。
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