ES2281104T3 - Proceso para separar el inhibidor de alfa-1-proteinasa de una pasta de fraccion cohn iv-1 + iv-4. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA PURIFICAR EL INHIBIDOR DE LA PROTEINASA (IP) ALFA - 1. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE PROPORCIONAR UNA FRACCION PROTEINICA IMPURA QUE COMPRENDE EL IP ALFA - 1. LA FRACCION PROTEINICA IMPURA SE SUSPENDE EN UNA SOLUCION ACUOSA A UN PH DE 6. SE RECUPERAN LAS PROTEINAS INSOLUBLES Y SE VUELVEN A SUSPENDER EN SOLUCION ACUOSA A UN PH DE 8,5. SE AÑADE PEG PARA PRECIPITAR LAS PROTEINAS AL - 2. A LA PRECIPITACION DE PEG SOBRENADANTE, QUE COMPRENDE IP DE ALFA - 1, SE AÑADE ZNCL 2 PARA PRECIPITAR EL IP DEL ALFA - 1 CRUDO. EL IP DEL ALFA - 1 CRUDO SE VUELVE A SOLUBILIZAR Y SE APLICA A UN SOPORTE DE INTERCAMBIO DE ANIONES. DEL SOPORTE DE INTERCAMBIO DE ANIONES SE RECUPERA UNA FRACCION QUE COMPRENDE EL IP DEL ALFA - 1. EL IP DEL ALFA - 1 PURIFICADO POR EL PROCEDIMIENTO TIENE UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE APROXIMADAMENTE 1,0 UNIDADES/OD 280 .
Description
Proceso para separar el inhibidor de
alfa-1-proteinasa de una pasta de
Fracción Cohn IV_{1} + IV_{4}.
La presente invención se refiere a un proceso
mejorado para la purificación del inhibidor de
alfa-1-proteinasa
(alfa-1-antitripsina).
El inhibidor de
alfa-1-proteinasa (aquí
"\alpha-1-PI" o
"alfa-1-PI"), también conocido
como \alpha-antitripsina, es una
seroglicoproteína con un peso molecular de 52.000. La
alfa-1-PI es sintetizada en el
hígado y está presente en el suero a niveles que oscilan entre 150
y 350 mg/dl (equivalente a 30-80 \muM) cuando se
ensaya con estándares de plasma.
La alfa-1-PI
trabaja en los pulmones inhibiendo la elastasa neutrófila, una
serina-proteasa que, en grandes cantidades, puede
llevar a la destrucción de las paredes alveolares. En el pulmón
normal, la alfa-1-PI proporciona
más del 90% de la protección contra la elastasa neutrófila en el
tracto respiratorio inferior.
La carencia de
alfa-1-PI es un trastorno
hereditario autosomal recesivo desplegado por gran cantidad de
variantes alélicas y se ha caracterizado por una disposición
alélica designada como sistema inhibidor de proteasa (Pi). Estos
alelos se han agrupado en base a los niveles de
alfa-1-PI que se encuentran en el
suero de distintos individuos. Los individuos normales poseen
niveles de alfa-1-PI normales en el
suero (se ha señalado que los individuos normales tenían un
fenotipo PiMM). Los individuos carentes tienen niveles de
alfa-1-PI en suero inferiores al
35% del nivel normal medio (se ha señalado que estos individuos
tenían un fenotipo PiZZ). Ningún individuo tiene la proteína
alfa-1-PI indetectable en su suero
(se ha señalado que estos individuos tenían un fenotipo
Pi(nulo)(nulo)).
La carencia de
alfa-1-PI se caracteriza por niveles
bajos en suero (menos del 35% de los niveles normales medios) y en
los pulmones de alfa-1-PI. Estos
individuos carentes corren el gran riesgo de desarrollar enfisema
panacinar. Este enfisema predomina en aquellos individuos que
presentan fenotipos PiZZ, PiZ(nulo) y Pi(nulo)(nulo).
Normalmente, los síntomas de esta condición se manifiestan en los
individuos afectados en la tercera a cuarta décadas de su vida.
El enfisema asociado a la carencia de
alfa-1-PI se desarrolla como
resultado de concentraciones insuficientes de
alfa-1-PI para inhibir la elastasa
neutrófila en el tracto respiratorio inferior, lo que conduce a la
destrucción de la estructura del tejido conectivo del parénquima
pulmonar. Los individuos con carencia de
alfa-1-PI poseen poca protección
contra la elastasa neutrófila liberada por los neutrófilos en el
tracto respiratorio inferior. Este desequilibrio entre
proteasa:inhibidor de proteasa en los individuos carentes de
alfa-1-PI resulta en un daño
crónico del parénquima pulmonar y de las paredes alveolares y
finalmente su destrucción.
Los individuos con carencia severa de
alfa-1-PI muestran típicamente
niveles endógenos de alfa-1-PI en
suero inferiores a 50 mg/dl, según lo determinan los estándares
comerciales. Los individuos con estos bajos niveles de
alfa-1-PI en suero corren un riesgo
de más de un 80% de desarrollar enfisema durante su vida. Se estima
que al menos 40.000 pacientes en Estados Unidos, o el 2% de todos
los que padecen enfisema, padecen esta enfermedad como resultado de
un defecto en el gen codificador para
alfa-1-PI. Una carencia en
alfa-1-PI representa uno de los
trastornos hereditarios letales más comunes de los caucásicos en
Estados Unidos y Europa.
La terapia para los pacientes con carencia de
alfa-1-PI se dirige hacia la
sustitución o el aumento de los niveles de
alfa-1-PI en el suero. Si se
incrementan los niveles en suero de
alfa-1-PI, se espera que se consigan
mayores concentraciones en los pulmones y, por tanto, se corrija el
desequilibrio elastasa
neutrófila:alfa-1-PI en los
pulmones, impidiendo la lenta destrucción del tejido pulmonar.
Estudios en poblaciones normales y carentes de
alfa-1-PI han sugerido que los
niveles protectores mínimos de
alfa-1-PI en suero son de 80 mg/dl o
11 \muM (aproximadamente 57 mg/dl; utilizando los estándares
puros). En consecuencia, la mayoría de las terapias para aumentar
en los pacientes carentes de
alfa-1-PI apuntan a proporcionar el
nivel protector mínimo en suero de
alfa-1-PI, ya que la
alfa-1-PI en el suero es la fuente
de la alfa-1-PI alveolar.
Se dispone de preparaciones de
alfa-1-PI para su uso terapéutico
desde mediados de los años 80. su principal uso ha sido en la
terapia de aumento (sustitución) para la carencia congénita de
alfa-1-PI. La vida media de la
alfa-1-PI humana in vivo es
de 4,38 días, con una desviación estándar de 1,27 días. La
dosificación actualmente recomendada, de 60 mg de
alfa-1-PI por kg de peso corporal
por semana, restaurará los bajos niveles en suero de
alfa-1-PI a niveles por encima del
nivel protector umbral de 11 \muM u 80 mg/dl.
Anteriormente ya se había purificado la
alfa-1-PI mediante varias técnicas.
Uno de estos procesos combinaba la cromatografía en un medio
cromatográfico de intercambio aniónico seguida de precipitación con
PEG. Otros procedimientos de purificación utilizan la precipitación
con PEG seguida de cromatografía de intercambio aniónico, o
múltiples etapas de precipitación con PEG seguidas de una
cromatografía de intercambio aniónico. Otros han empleado
combinaciones de precipitación con PEG, una o más etapas de
cromatografía de intercambio aniónico y etapas de cromatografía en
quelatos metálicos. Todavía otros métodos han utilizado técnicas de
separación de fases para purificar la
alfa-1-PI. Se han comunicado
actividades específicas de 126 unidades/mg para la
alfa-1-PI purificada.
La EP 0.097.274 describe un método para separar
el inhibidor de alfa-1-proteinasa
(PI) del plasma sanguíneo o de fracciones de plasma sanguíneo.
La presente invención se dirige a un proceso
mejorado para purificar la
alfa-1-PI. El proceso comprende
proporcionar una fracción impura de proteína, preferentemente una
pasta de Fracción Cohn IV_{1} + IV_{4} que comprende la
alfa-1-PI. La fracción impura de
proteína se suspende en agua fría o en una solución salina a pH 6
para disolver las proteínas solubles, incluyendo albúmina,
alfa-2-globulina
(alfa-2-macroglobulina y
hatoglobulina) y beta-globulina (transferrina).
Luego se filtra la suspensión para recuperar las proteínas
insolubles, incluida la alfa-1-PI
que se lava con agua (o con una solución salina). A continuación, la
fracción proteica insoluble lavada se resuspende en agua (o en una
solución salina) y se ajusta el pH a 8,5. Se añade PEG para
precipitar la alfa-2-globulina. Se
recupera el sobrenadante y se añade ZnCl_{2} para precipitar la
alfa-1-PI bruta. La
alfa-1-PI bruta entonces se
resolubiliza en un tampón NaEDTA y se trata con Tween 80 y con
fosfato de tri-n-butilo (TNBP) para
inactivar los virus. Preferentemente, se añade un azúcar, como
sacarosa, maltosa, glucosa o similar, para estabilizar la
alfa-1-PE durante la inactivación
viral, con lo que se incrementa la producción.
Posteriormente se aplica la solución tratada a
un medio de intercambio aniónico para separar la
alfa-1-PI de otras proteínas
remanentes. La fracción que comprende la
alfa-1-PI se recupera entonces y se
trata preferentemente con bentonita para eliminar la
apolipo-proteína todavía presente. La solución
purificada resultante de alfa-1-PI
es entonces recuperada y concentrada.
La alfa-1-PI
purificada por el presente proceso tiene una actividad específica
superior a 1,0 unidades/OD_{280}. El presente proceso proporciona
un rendimiento de al menos 1,0 unidad/gramo de pasta y es
preferentemente superior a 1,3 unidades/gramo de pasta.
Al utilizar la presente invención, se mejoran la
calidad y rendimiento de la
alfa-1-PI. Además, el presente
proceso de purificación acorta el procesamiento en comparación con
otros procesos.
El proceso comprende una combinación única de
las etapas de purificación para producir un alto rendimiento y una
gran actividad específica de la preparación de
alfa-1-PI.
La alfa-1-PI se
purifica a partir de una fracción impura de proteína. La fracción
impura de proteína puede ser plasma,
alfa-1-PI producida por métodos
recombinantes o cualquier otra fuente que comprenda la proteína
alfa-1-PI. En una realización
preferente, la fracción impura de proteína es una pasta de Fracción
Cohn IV_{1} + IV_{4}, cuya preparación es bien conocida en la
técnica.
La pasta de Fracción IV_{1} + IV_{4} (u otra
fracción impura de proteína) se suspende en 5 \pm 2 partes de
agua o de solución salina, es decir 0,05 a 0,15 M de NaCl, por cada
parte de pasta de Fracción IV_{1} + IV_{4}, a menos de 15ºC y a
un pH de 6,0 \pm 0,2, durante al menos una hora. Las proteínas
solubles, incluida la albúmina,
alfa-2-globulina y
beta-globulina, se separan entonces de las proteínas
insolubles, incluido el inhibidor de
alfa-1-proteinasa, mediante un
filtro de prensa, centrifugación o similar. Se lava el residuo a
menos de 15ºC con 5 volúmenes de agua o de solución salina de la
pasta original a un pH de 6 \pm 0,2 para eliminar la proteína
soluble adicional físicamente retenida en la pasta insoluble.
Se ha descubierto que al suspender la pasta de
Fracción IV_{1} + IV_{4} en agua o en una solución salina a un
pH de 6,0 \pm 0,2, y con los lavados posteriores, se elimina casi
la totalidad de la albúmina y la mayoría de las proteínas
alfa-2- y beta del precipitado de la Fracción
IV_{1} + IV_{4}.
El residuo de proteína insoluble se resuspende
en 5 \pm 2 volúmenes de agua a un pH de 8,5 \pm 0,5 por volumen
de residuo a una temperatura de aproximadamente 15ºC \pm 5ºC
durante 6 horas preferentemente, aunque se puedan utilizar tiempos
más cortos o más largos. No son preferentes tiempos más cortos ya
que la producción mejora a medida que el período aumenta.
Actualmente es preferente una duración de seis horas como
combinación óptima del tiempo de proceso y producción. A
continuación se añade Tris sólido hasta una concentración final de
10 \pm 5 mM y se añade NaCl sólido hasta una concentración final
de 150 \pm 20 mM y se ajusta el pH a 8,0. Entonces se añade
polietilenglicol 3350 (PEG) hasta una concentración final del 15
\pm 5% en peso/peso y se mezcla a 15 \pm 5ºC durante
aproximadamente una hora. Se añade PEG para precipitar la
alfa-2-globulina.
El precipitado de PEG que se forma se elimina en
un filtro de prensa. Se lava el filtro de prensa antes y después de
la filtración con una solución que contiene 150 \pm 25 mM NaCl y
un 15 \pm 5% en peso/peso PEG a un pH de 8,0 \pm 0,5.
Alternativamente, se puede eliminar el precipitado por
centrifugación.
Se añade ZnCl_{2} (100 \pm 10 mM) al
sobrenadante de PEG hasta una concentración final de 6 \pm 5 mM y
se ajusta el pH de la solución a 7,5 \pm 0,5. Se enfría la
solución a 5 \pm 5ºC y se mezcla durante al menos una hora. El
ZnCl_{2} hace precipitar alfa-1-PI
bruta. La alfa-1-PI bruta se
concentra por filtración, preferentemente por filtración
Prostak^{TM}, por ejemplo tal como se describe en "Prostak
Open-Channel Modules", Millipore Corporation, o
por centrifugación, y se retira el filtrado. La suspensión
concentrada o el precipitado puede congelarse para su procesamiento
posterior.
Se resolubiliza la
alfa-1-PI bruta en 50 mM NaEDTA
mediante Prostak por recirculación. Se añade un azúcar,
preferentemente sacarosa, en una cantidad de un 15 \pm 5% en
peso/peso (o aproximadamente 0,25 \pm 0,05 M de Na_{3} citrato)
como estabilizador durante la inactivación viral. Se mezcla la
solución a 15 \pm 5ºC hasta que se disuelva la sacarosa.
La solución que contiene la
alfa-1-PI se inactiva de todo virus
mediante tratamiento con disolvente-detergente. Una
solución del 10 \pm 1% en peso/volumen de
polisorbital-80 y del 3 \pm 0,3% en peso/peso de
fosfato de tri-n-butilo es añadida
a la solución de alfa-1-PI hasta una
concentración final de 1,0 \pm 0,5% en peso/volumen de
polisorbato-80 y de 0,3 \pm 0,15% en peso/peso de
fosfato de tri-n-butilo. Se incuba
entonces la solución a 27 \pm 3ºC, pH 8 \pm 0,5, durante 6
horas mínimo para inactivar cualquier virus que pueda estar presente
en la alfa-1-PI.
Se ha descubierto que la presencia de azúcar,
por ejemplo de sacarosa, como estabilizante durante la inactivación
viral por tratamiento con disolvente-detergente
aumenta la producción de unidades de
alfa-1-PI en comparación con un
control, es decir la solución de
alfa-1-PI inactivada de todo virus
con detergente-disolvente sin azúcar como
estabilizante. El aumento de la producción se sitúa preferentemente
en al menos el 10%, con más preferencia en al menos el 20% y en
particular en al menos el 30%.
Después de la incubación, se enfría la solución
de alfa-1-PI tratada a
0-10ºC y se ajusta el pH a 8,0 \pm 0,1.
La solución tratada con
disolvente-detergente se diluye entonces con
aproximadamente 1 volumen de agua por volumen de solución tratada
con disolvente-detergente. Se aplica entonces la
solución diluida a un medio cromatográfico
pre-equilibrado de QAE (columna de cromatografía) u
otro medio similar de intercambio aniónico que se una a la
alfa-1-PI, dejando que otras
proteínas se separen de la
alfa-1-PI. Se puede utilizar una
cromatografía por lotes o en columna. Después de que la
alfa-1-PI haya sido absorbida en el
medio, se lava con un tampón que contiene 20 \pm 10mM NaCl y 20
\pm 10mM fosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}), a un pH de 8 \pm
1, para eliminar el material suelto, incluidas las
beta-proteínas. Se eluye entonces la
alfa-1-PI del medio de cromatografía
de intercambio aniónico con un lavado de elución que contiene 100
\pm 50 mM NaCl y 20 \pm 10 mM de fosfato de sodio, a un pH de 8
\pm 1. Se recoge el eluato que incluye la
alfa-1-PI para otro
procesamiento.
Después de retirar la
alfa-1-PI, el medio de intercambio
aniónico se limpia por lavado con, consecutivamente, una solución
acuosa que contiene 2 \pm 0,2 M NaCl, 20 \pm 10 mM fosfato de
sodio, pH de 8 \pm 1; luego con agua para inyección (WFI);
después, con una solución acuosa que contiene 500 mM NaOH; y
finalmente con WFI. Se almacena entonces el medio de cromatografía
en 2 \pm 0,2 M NaCl, 20 \pm 10mM fosfato de sodio, pH de 8 \pm
1.
El eluato que contiene la
alfa-1-PI se combina y se trata con
un 0,1 a 1,0% (peso/peso) de bentonita durante aproximadamente una
hora o más para reducir la cantidad de
apolipo-proteína, preferentemente a menos de 0,01
mg/ml de apolipo-proteína A y menos de 0,01 mg/ml de
apolipo-proteína B. Se elimina por filtración la
bentonita, preferentemente por filtración Cuno®, por ejemplo, tal
como se describe en "Zeta Plus® C Series Filter Medium", Cuno
Inc. La solución resultante se concentra en una membrana de
ultrafiltración hasta que la actividad de
alfa-1-PI sea de al menos 10
unidades/ml. Se filtra entonces el producto concentrado a través de
un filtro de 0,45 micras para eliminar cualquier materia
particulada. La alfa-1-PI se filtra
entonces con Planova para eliminar virus, se filtra de forma
estéril a través de un filtro de 0,22 micras para ser distribuida en
frascos y se liofiliza para su almacenamiento. Se almacena la
alfa-1-PI a
2-8ºC.
La alfa-1-PI
liofilizada puede redisolverse en agua estéril para su
administración a los pacientes.
Se puede utilizar un ensayo cromogénico para
detectar la actividad alfa-1-PI de
la alfa-1-PI reconstituida. El
ensayo utiliza un sustrato cromogénico sensible a la tripsina que
libera p-nitroanilina en presencia de tripsina (suministrada
por Sigma Chemical Co. de St Louis, Missouri). La
p-nitroanilina liberada es detectada a 405 nm. La
alfa-1-PI inhibe la liberación de
p-nitroanilina desde el sustrato. La actividad de
alfa-1-PI en el producto se
determina con referencia a una curva estándar de actividad de
alfa-1-PI. El ensayo cromogénico de
la alfa-1-PI liofilizada
reconstituida preparada de acuerdo con el proceso anterior muestra
una actividad específica de al menos 1,0 unidad/OD_{280}.
La alfa-1-PI
puede ser infundida en un paciente a una velocidad de 0,08 ml/kg de
peso corporal, por minuto, durante los primeros 10 minutos. Si el
paciente no experimenta molestias, se puede aumentar la velocidad
según se tolere. Si se tolera, las infusiones posteriores al mismo
paciente pueden realizarse a una velocidad más alta. Si ocurrieran
efectos adversos, se debería reducir la velocidad o interrumpir la
infusión hasta que se calmen los síntomas. Entonces se puede seguir
con la infusión a una velocidad que sea tolerada por el
paciente.
Si se deben administrar grandes dosis, se pueden
agrupar varios frascos de alfa-1-PI
reconstituida en un recipiente de infusión I.V. vacío estéril por
técnicas asépticas.
Una pasta de Fracción IV_{1} + IV_{4} (600
g) procedente del esquema de fraccionamiento de Cohn se suspendió
en 1.800 ml de agua a 5ºC a un pH de 6,0 sin ninguna valoración
durante una hora. Al completarse la suspensión, se filtró ésta a
través de un filtro 10 CP (Cuno) mediante un filtro de prensa. Se
recogió el filtrado, se analizó y se midió la actividad específica
(A.E.) de la alfa-1-PI (A1PI) así
como la densidad óptica a 280 nm (OD_{280 \ nm}). La pasta del
filtro de prensa se lavó con 600 ml de agua a 5ºC y se recogió el
filtrado. Se repitió este procedimiento cuatro veces más y se
recogieron todos los filtrados, se analizaron y se midió la
actividad específica (A.E.) de A1PI y OD_{280 \ nm}. Se obtuvieron
350 g de la pasta resultante. En la siguiente Tabla 1 se describe
la actividad de A1PI y OD_{280 \ nm} de todas las muestras del
proceso.
Los 350 g de pasta resultante del Ejemplo 1
fueron resuspendidos en 1.050 ml de agua a un pH 8,5 y a una
temperatura de 18ºC durante 6 horas. Se añadió Tris sólido hasta
una concentración final de 10 mM y se añadió NaCl sólido hasta una
concentración final de 150 mM y se ajustó el pH a 8,0. Se añadió
polietilenglicol (PEG-3350) hasta una concentración
final del 15% (peso/peso) y se mezcló a 18ºC durante una hora. El
precipitado resultante se retiró en un filtro de prensa con un
filtro 10 CP para recuperar el sobrenadante. La pasta del filtro de
prensa se lavó posteriormente con la solución que contenía un 15% en
peso/peso de PEG-3350, 10 mM Tris y 150mM NaCl. Se
combinaron el filtrado y el filtrado post-lavado. Se
resume el resultado en la siguiente Tabla 2.
Al filtrado de PEG-3350
recuperado procedente del Ejemplo 2, se añadió ZnCl_{2} hasta una
concentración final de 2 mM, se ajustó el pH a 7,5 y se bajó la
temperatura a 5ºC para precipitar la A1PI bruta. Después de mezclar
durante una hora, se filtró la A1PI bruta mediante filtración
Prostak para su concentración y la suspensión resultante se
resolubilizó con una solución de NaEDTA. Se resume el resultado en
la siguiente Tabla 3.
Se añadió sacarosa en una cantidad del 16,7%
(peso/peso) a la solución de NaEDTA resolubilizada en el Ejemplo 3
y se mezcló a 18ºC hasta que la sacarosa estuviera completamente
disuelta. A esta solución se añadió polisorbato-80
en una concentración final del 1,0% y fosfato de
tri-n-butilo en una concentración
final del 0,3%. Se incubó esta solución a 27,5ºC durante no menos
de 6 horas para inactivar cualquier posible virus envuelto en
lípidos contaminante. Después de la incubación, se enfrió la
solución a 5ºC y se ajustó el pH a 8,0. Como control, se repitió el
procedimiento anterior excepto que no se añadió sacarosa. La
estabilidad de A1PI durante el tratamiento con
disolvente-detergente (DD) en presencia del 16,7% de
sacarosa (DD AIPI) y sin sacarosa (control) se presenta en la
siguiente Tabla 4.
A la solución de DD AIPI del Ejemplo 4 se
añadieron 4,311 g de agua destilada para bajar la fuerza iónica
antes de su carga en una columna QAE. Esta solución se cargó en 300
ml de la columna preequilibrada de intercambio iónico QAE con un
caudal de 12 ml/minuto. Se lavó la columna con 6 l de tampón fosfato
salino (20 mM NaCl, 20 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 8,0). La A1PI se
eluyó con 1,8 l de tampón fosfato salino (100 mM NaCl, 20 mM
NaH_{2}PO_{4}, pH 8,0).
El medio de intercambio iónico se limpió por
lavado secuencial con 2 M NaCl, 20 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 8,0,
500 mM NaOH y agua destilada. Se almacenó el medio de cromatografía
en 2 M NaCl, 20 mM NaH_{2}PO_{4}, pH 8,0. Se analizaron las
fracciones agrupadas que contenían la A1PI y se presenta el
resultado en la siguiente Tabla 5.
Al eluato agrupado que resultaba del Ejemplo 5
se añadieron 3,0 g de bentonita despirogenada y se mezcló a 20ºC
durante una hora. Se eliminó la bentonita por filtración Cuno. Se
concentró el filtrado por ultrafiltración. El concentrado se filtró
con Planova y se filtró de forma estéril en serie. Se distribuyó el
filtrado en frascos y se liofilizó para su almacenamiento. Se
analizaron todas las muestras del proceso y se presenta el resultado
en la siguiente
Tabla 6.
Tabla 6.
Claims (18)
1. Proceso para purificar el inhibidor
de alfa-1-proteinasa que
comprende:
proporcionar una fracción impura de proteína que
comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa;
suspender la fracción impura de proteína que
comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa en una solución
acuosa, a un pH de 6, durante un tiempo suficiente para que se
disuelvan las proteínas solubles;
filtrar la suspensión y recuperar las proteínas
insolubles;
resuspender la proteína insoluble en una
solución acuosa, en la cual se ajusta a 8,5 el pH de la solución
acuosa que contiene la proteína insoluble;
añadir PEG a la proteína insoluble resuspendida
para precipitar la
\alpha-2-globulina;
recuperar el sobrenadante de la precipitación de
PEG, sobrenadante que comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa;
añadir ZnCl_{2} al sobrenadante para
precipitar el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta;
recuperar el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta;
solubilizar el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta
recuperado;
aplicar el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta solubilizado
a un medio de intercambio iónico; y
recuperar una fracción que comprende el
inhibidor de alfa-1-proteinasa
purificada del medio de intercambio iónico.
2. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fracción impura de proteína que
comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa está suspendida en
3 a 7 volúmenes de solución acuosa por cada parte de fracción
impura de proteína que comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa.
3. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la solución acuosa se selecciona de
entre el grupo formado por agua y soluciones que contienen NaCl en
una concentración de 0,05 a 0,15 M.
4. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque se añade PEG a una concentración del 10%
al 20% en peso/peso.
5. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el pH del sobrenadante procedente de la
precipitación de PEG se ajusta a 7,5.
6. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque se añade ZnCl_{2} en una concentración
de 1 a 11 mM.
7. Proceso según la reivindicación 1 que
comprende además el tratamiento del inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta recuperado
de la precipitación con ZnCl_{2} para inactivar todo contaminante
viral.
8. Proceso según la reivindicación 7,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta es tratado
con disolvente y detergente.
9. Proceso según la reivindicación 8,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta es tratado
con fosfato de tri-n-butilo y
polisorbato 80.
10. Proceso según la reivindicación 8,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta es tratado
con el 0,15 al 0,45% en peso/volumen de fosfato de
tri-n-butilo y el 0,5 al 1,5% en
peso/volumen de polisorbato 80.
11. Proceso según la reivindicación 1 que
comprende además la adición de bentonita al eluyente que contiene
el inhibidor de
alfa-1-proteinasa.
12. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada tiene
una actividad específica superior a 1,0 unidad/OD_{280}.
13. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada tiene
un rendimiento de al menos 1 unidad por gramo de pasta de Fracción
IV_{1} + IV_{4}.
14. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque
se añade PEG a la solución acuosa que contiene
la proteína insoluble resuspendida a una concentración del 10% al
20% en peso/peso para precipitar las
\alpha-2-globulinas;
el pH del sobrenadante de PEG se ajusta a
7,5,
el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta se recupera
por filtración prostak,
el inhibidor de
alfa-1-proteinasa bruta
resolubilizada se trata con disolvente y detergente para inactivar
todo contaminante viral, y
la fracción que comprende el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada es
tratada con bentonita para adsorber las
apolipo-proteínas.
15. Proceso según la reivindicación 14 que
comprende además el tratamiento de la fracción recuperada que
comprende la ultrafiltración de la solución que contiene el
inhibidor de alfa-1-proteinasa
purificada.
16. Proceso según la reivindicación 15 que
comprende además la liofilización de la solución ultrafiltrada que
contiene el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada.
17. Proceso según la reivindicación 14,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada tiene
una actividad específica superior a 1,0 unidad/OD_{280}.
18. Proceso según la reivindicación 14,
caracterizado porque el inhibidor de
alfa-1-proteinasa purificada tiene
un rendimiento de al menos 1,0 unidad/g de pasta de Fracción
IV_{1} + IV_{4}.
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| US6849605B1 (en) * | 1999-03-05 | 2005-02-01 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
| WO2000051623A2 (en) | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide-induced clinical conditions |
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| US6462180B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-08 | Bayer Corporation | Method of preparing α-1 proteinase inhibitor |
| WO2002048176A1 (en) | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Bayer Corporation | Method of preparing alpha-1 proteinase inhibitor |
| KR100406870B1 (ko) * | 2001-05-25 | 2003-11-21 | 주식회사 두산 | 침전법을 이용한 계란 난황에서의 유용 수용성 성분의분리방법 및 침전 부산물의 이용 방법 |
| DK1417301T3 (da) * | 2001-08-07 | 2007-03-12 | Novozymes As | Carbonhydrater og polyoler til oplösning af proteinkrystaller |
| US20060127974A1 (en) * | 2002-07-01 | 2006-06-15 | Novozymes A/S | Mpg added to fermentation |
| US7777006B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
| US20040220242A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Leland Shapiro | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide induced clinical conditions |
| US7850970B2 (en) | 2003-08-26 | 2010-12-14 | The Regents Of The University Of Colorado | Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of bacterial infections |
| US7807435B2 (en) | 2005-08-11 | 2010-10-05 | Baxter International Inc. | Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI) |
| GB0524432D0 (en) * | 2005-11-30 | 2006-01-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
| US20080124303A1 (en) * | 2005-12-12 | 2008-05-29 | Cavit Sciences, Inc | Methods and compositions for treatment of viral infections |
| SI1999262T1 (sl) * | 2006-03-30 | 2012-12-31 | Baxter Healthcare S.A. | Postopek za čiščenje rekombinantnega alfa 1-antitripsina, ki vključuje stopnjo anionske izmenjevalne kromatografije |
| WO2007134800A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Baxter International Inc. | Ethanol dependence of alpha1 antitrypsin c-terminal lys truncation by basic carboxypeptidases |
| EP3808378A1 (en) | 2011-05-27 | 2021-04-21 | Baxalta GmbH | Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same |
| EP3628327A1 (en) | 2011-06-24 | 2020-04-01 | The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
| CA2896951A1 (en) | 2012-01-10 | 2013-07-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
| TWI629283B (zh) | 2012-02-23 | 2018-07-11 | 巴克斯歐塔公司 | 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱 |
| US9353165B2 (en) | 2012-07-25 | 2016-05-31 | Grifols, S.A. | Purification of cell culture derived alpha1 protease inhibitor |
| WO2014160768A1 (en) | 2013-03-29 | 2014-10-02 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for preparing a subject for organ or non-organ implantation |
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Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2770616A (en) * | 1951-01-29 | 1956-11-13 | Protein Foundation Inc | Fractionation of proteinaceous materials in blood plasma and liver tissue |
| US2761808A (en) * | 1952-09-06 | 1956-09-04 | Ortho Pharma Corp | Plasma fractionation process |
| US4056614A (en) * | 1972-09-22 | 1977-11-01 | Marc Bonneau | Immunity depressant medicine |
| JPS52128205A (en) * | 1976-04-16 | 1977-10-27 | Green Cross Corp:The | Prophylactic and therapeutic drugs for cerebro-vascular contraction |
| US4439358A (en) * | 1982-06-17 | 1984-03-27 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4379087A (en) * | 1982-06-17 | 1983-04-05 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
| DE3426903A1 (de) * | 1984-07-20 | 1986-01-23 | Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt | Eine immunglobulinpraeparation in kombination mit einer anderen pharmakologisch wirksamen praeparation zur verwendung bei der behandlung von krankheiten |
| US4684723A (en) * | 1985-09-11 | 1987-08-04 | Miles Laboratories, Inc. | Method of separating proteins from aqueous solutions |
| US4697003A (en) * | 1985-11-01 | 1987-09-29 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
| US4629567A (en) * | 1986-03-07 | 1986-12-16 | Smithkline-Rit | Alpha-1-antiprotease purification |
| JPS6317899A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Green Cross Corp:The | ハプトグロビンの精製方法 |
| JPS63132898A (ja) * | 1986-11-26 | 1988-06-04 | Meito Sangyo Kk | 蛋白質の分離精製方法 |
| US5114917A (en) * | 1986-12-24 | 1992-05-19 | John Lezdey | Treatment of inflammation using alpha 1-antichymotrypsin |
| US4829054A (en) * | 1987-04-13 | 1989-05-09 | Miles Laboratories, Inc. | Method of decreasing lung damage in a host following the onset of gram negative septicemia/endotoxemia |
| ES2053606T3 (es) * | 1987-04-27 | 1994-08-01 | Miles Inc | Metodo de preparacion de un inhibidor de alfa-1-proteinasa de alta pureza. |
| IL86417A (en) * | 1987-05-22 | 1992-09-06 | Armour Pharma | Process for the inactivation of pathogens in biological or pharmaceutical material by mixing with aqueous solution containing a sugar(alcohol)and neutral salts as stabilizers |
| US5073487A (en) * | 1989-01-30 | 1991-12-17 | Athens Research And Technology, Inc. | Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor |
| FR2672895B1 (fr) * | 1991-02-15 | 1995-05-12 | Transgene Sa | Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee. |
| US6284874B1 (en) * | 1994-06-17 | 2001-09-04 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste |
| US5610285A (en) * | 1994-08-24 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
| US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
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