DE69737294T2

DE69737294T2 - Verfahren zur abtrennen von alpha-1-proteinase-inhibitor von cohn-fraktion iv1-iv4 paste

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Publication number: DE69737294T2
Application number: DE69737294T
Authority: DE
Inventors: Sung Duk South Pasadena HWANG; Evelyn Chino Hills NARIO; Mark West Covina LEPE; Lyndon Huntington Park LUZ; Hirokazu Arcadia ITO; Kazuo Arcadia TAKECHI
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2017-06-28
Also published as: CZ302102B6; JP5245079B2; CA2259499A1; PL188874B1; CA2259499C; JP4390855B2; WO1998000154A1; CZ300452B6; US5616693A; IL127774A; CA2489773A1; JP2008120822A; DK1762576T3; AU726233B2; DE69737294D1; EP1762576B1; JP2000514647A; BR9710107A; JP2009191076A; PL188873B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Aufreinigung von alpha-1-Proteinase-Inhibitor (alpha-1-Antitrypsin).
Alpha-1-Proteinase-Inhibitor (hier "α-1-PI" oder "alpha-1-PI"), auch bekannt als α-Antitrypsin, ist ein Serumglykoprotein mit einem Molekulargewicht von 52.000. Alpha-1-PI wird in der Leber synthetisiert und ist im Serum in Spiegeln zwischen 150 und 350 mg/dl (äquivalent zu 30–80 μM) anwesend, wenn mit Plasmastandards getestet wird.
Alpha-1-PI wirkt in den Lungen, um neutrophile Elastase, eine Serinprotease, die in großen Mengen zur Zerstörung der alveolaren Wände führen kann, zu inhibieren. In der normalen Lunge stellt alpha-1-PI mehr als 90% der anti-neutrophilen Elastaseprotektion im unteren Respirationstrakt bereit.
Alpha-1-PI Defizienz ist eine autosomal rezessiv erbliche Erkrankung, die durch eine große Anzahl von allelischen Varianten dargestellt wird und in einer allelischen Anordnung, die als das Protease-Inhibitor (PI) System bezeichnet wird, gekennzeichnet worden ist. Diese Allele sind auf der Basis der alpha-1-PI Spiegel, die im Serum verschiedener Individuen vorkommen, gruppiert worden. Normale Individuen haben normale Serum Spiegel von alpha-1-PI (normale Individuen sind als einen PIMM Phänotyp aufweisend bezeichnet worden). Defiziente Individuen haben Serum alpha-1-PI Spiegel von weniger als 35% des durchschnittlichen normalen Spiegels (diese Individuen sind als einen PIZZ Phänotyp aufweisend bezeichnet worden). Null Individuen haben nicht nachweisbares alpha-1-PI Protein in ihrem Serum (diese Individuen sind als einen PI(Null)(Null) Phänotyp aufweisend bezeichnet worden).
Alpha-1-PI Defizienz wird durch geringe Serum (weniger als 35% der durchschnittlichen normalen Spiegel) und Lungen Spiegel von alpha-1-PI gekennzeichnet. Diese defizienten Individuen weisen ein hohes Risiko auf, ein panazinäres Emphysem zu entwickeln. Dieses Emphysem herrscht in Individuen, die PIZZ, PIZ(Null) und PI(Null)(Null) Phänotypen zeigen, vor. Symptome des Zustandes manifestieren sich gewöhnlich in betroffenen Individuen in der dritten bis vierten Dekade des Lebens.
Das Emphysem, das mit alpha-1-PI Defizienz assoziiert ist, entwickelt sich als ein Ergebnis ungenügender alpha-1-PI Konzentrationen im unteren Respirationstrakt, um neutrophile Elastase zu hemmen, was zur Zerstörung des Bindegewebsgerüsts des Lungenparenchyms führt. Individuen mit alpha-1-PI Defizienz haben geringen Schutz gegen die neutrophile Elastase, die durch die Neutrophilen in ihrem unteren Respirationstrakt freigesetzt werden. Dieses Ungleichgewicht von Protease:Protease-Inhibitor in alpha-1-PI defizienten Individuen führt zu chronischer Schädigung und schließlich Zerstörung des Lungenparenchyms und der alveolaren Wände.
Individuen mit schwerer alpha-1-PI Defizienz zeigen typischerweise endogene Serum alpha-1-PI Spiegel von weniger als 50 mg/dl, wie durch kommerzielle Standards bestimmt wurde. Individuen mit diesen geringen Serum alpha-1-PI Spiegeln weisen ein Risiko über die Lebensdauer ein Emphysem zu entwickeln auf, das größer als 80% ist. Es wird geschätzt, dass mindestens 40.000 Patienten in den Vereinigten Staaten oder 2% all derer mit Emphysem diese Krankheit aufweisen, die aus einem Defekt in dem Gen, das alpha-1-PI kodiert, resultiert. Eine Defizienz in alpha-1-PI stellt eine der häufigsten letalen erblichen Störungen der Kaukasier in den Vereinigten Staaten und Europa dar.
Die Therapie für Patienten mit alpha-1-PI Defizienz richtet sich auf Austausch oder Erhöhung von alpha-1-PI Spiegeln im Serum. Wenn die Serum Spiegel von alpha-1-PI erhöht werden, wird erwartet, dass dies zu höheren Konzentrationen in den Lungen führt und dadurch das Ungleichgewicht neutrophile Elastase:alpha-1-PI in den Lungen korrigiert wird und die Zerstörung von Lungengewebe verhindert oder verlangsamt wird. Studien von normalen und alpha-1-PI defizienten Populationen haben angedeutet, dass die minimalen schützenden Serum alpha-1-PI Spiegel 80 mg/dl oder 11 μM (ungefähr 57 mg/dl; Verwenden von reinen Standards) betragen. Infolgedessen zielt die Erhöhungstherapie in alpha-1-PI defizienten Patienten meist auf das Bereitstellen des minimalen schützenden Serum Spiegels von alpha-1-PI, da Serum alpha-1-PI die Quelle von alveolärem alpha-1-PI ist.
Alpha-1-PI Präparate stehen seit Mitte der 80er Jahre zur therapeutischen Verwendung zur Verfügung. Die hauptsächliche Verwendung ist die Erhöhungs-(Austausch) Therapie für kongenitale alpha-1-PI Defizienz gewesen. Die Halbwertszeit von humanem alpha-1-PI in vivo beträgt 4,38 Tage mit einer Standardabweichung von 1,27 Tagen. Die derzeit empfohlene Dosierung von 60 mg alpha-1-PI/kg Körpergewicht wöchentlich wird geringe Serum Spiegel von alpha-1-PI auf Spiegel über dem schützenden Schwellenwert von 11 μM oder 80 mg/dl wieder herstellen.
Vorher ist alpha-1-PI durch verschiedene Techniken aufgereinigt worden. Ein solches Verfahren kombinierte Chromatographie auf einem Anionenaustauschchromatographiemedium gefolgt durch PEG-Ausfällung. Andere Aufreinigungsverfahren haben PEG-Ausfällung gefolgt durch Anionenaustauschchromatographie oder mehrere PEG-Ausfällungsschritte gefolgt durch Anionenaustauschchromatographie verwendet. Andere haben Kombinationen von PEG-Ausfällung, einem oder mehreren Anionenaustauschchromatographieschritten und Metallchelatchromatographieschritten verwendet. Noch andere Verfahren haben Phasentrennungstechniken, um alpha-1-PI aufzureinigen, verwendet. Spezifische Aktivitäten von 1,26 Einheiten/mg sind für aufgereinigten alpha-1-PI berichtet worden.
Die EP 0 097 274 beschreibt ein Verfahren zum Trennen von alpha-1-Proteinase-Inhibitor (PI) aus Blutplasma oder Blutplasma Fraktionen.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein verbessertes Verfahren zum Aufreinigen von alpha-1-PI gerichtet. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer unsauberen Proteinfraktion, vorzugsweise Cohn Fraktion IV₁ + IV₄-Paste, umfassend alpha-1-PI. Die unsaubere Proteinfraktion wird in kaltem Wasser oder Salzlösung bei einem pH von 6 suspendiert, um lösliche Proteine, die Albumin, alpha-2-Globulin (alpha-2-Makroglobulin und Hatoglobulin) und beta-Globulin (Transferrin) einschließen, zu lösen. Die Suspension wird dann filtriert, um unlösliche Proteine, die alpha-1-PI, das mit Wasser (oder Salzlösung) gewaschen wird, einschließen, rückzugewinnen. Die gewaschene unlösliche Proteinfraktion wird dann in Wasser (oder Satzlösung) resuspendiert, und der pH wird auf 8,5 eingestellt. PEG wird zugegeben um alpha-2-Globulin auszufällen. Der Überstand wird rückgewonnen, und ZnCl₂ wird zugegeben, um rohen alpha-1-PI auszufällen. Der rohe alpha-1-PI wird dann in NaEDTA Puffer wieder löslich gemacht und mit Tween 80 und tri-n-Butylphosphat (TNBP) behandelt, um Viren zu inaktivieren. Vorzugsweise wird ein Zucker, wie Sucrose, Maltose, Glucose oder Ähnliches zugegeben, um den alpha-1-PI während der viralen. Inaktivierung zu stabilisieren, um die Ausbeute zu erhöhen.
Die behandelte Lösung wird dann auf ein Anionenaustauschmedium aufgetragen, um alpha-1-PI von anderen verbleibenden Proteinen zu trennen. Die Fraktion, die alpha-1-PI umfasst, wird dann rückgewonnen und vorzugsweise mit Bentonit behandelt, um jegliches Apolipoprotein, das noch vorhanden ist, zu entfernen. Die resultierende gereinigte Lösung von alpha-1-PI wird dann rückgewonnen und konzentriert.
Alpha-1-PI, das durch das vorliegende Verfahren gereinigt wurde, weist eine spezifische Aktivität größer als 1,0 Einheiten/OD₂₈₀ auf. Das vorliegende Verfahren stellt eine Ausbeute von mindestens 1,0 Einheiten/Gramm der Paste und vorzugsweise mehr als 1,3 Einheiten/Gramm der Paste bereit.
Durch Verwendung der vorliegenden Erfindung wird die Qualität und Ausbeute von alpha-1-PI verbessert. Ferner verkürzt das vorliegende Aufreinigungsverfahren die Verarbeitung verglichen mit anderen Verfahren.
Das Verfahren umfasst eine einzigartige Kombination von Aufreinigungsschritten, um ein alpha-1-PI Präparat mit hoher Ausbeute und hoher spezifischer Aktivität herzustellen.
Alpha-1-PI wird aus einer unsauberen Proteinfraktion aufgereinigt. Die unsaubere Proteinfraktion kann Plasma, alpha-1-PI, der durch rekombinante Verfahren hergestellt wurde oder jegliche andere Quelle, die alpha-1-PI Protein umfasst, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die unsaubere Proteinfraktion eine Cohn Fraktion IV₁ + IV₄-Paste, deren Aufbereitung im Stand der Technik gut bekannt ist.
Anfängliche Behandlung von Fraktion IV₁ + IV₄-Paste
Die Fraktion IV₁ + IV₄-Paste (oder eine andere unreine Proteinfraktion) wird in 5 ± 2 Teilen Wasser oder Salzlösung suspendiert, d.h. von 0,05 bis 0,15 M NaCl pro Teil der Fraktion IV₁ + IV₄-Paste bei weniger als 15°C und bei einem pH von 6,0 ± 0,2 für mindestens eine Stunde. Lösliche Proteine, die Albumin, alpha-2-Globulin und beta-Globulin einschließen, werden dann von den unlöslichen Proteinen, die alpha-1-Proteinase-Inhibitor einschließen, durch Filterpresse, Zentrifugation oder ähnlichem abgetrennt. Der Rückstand wird bei weniger als 15°C mit 5 originalen Pastenvolumina Wasser oder Salzlösung bei pH 6 ± 0,2 gewaschen, um zusätzlich lösliches Protein, das physikalisch in der unlöslichen Paste eingeschlossen ist, zu entfernen.
Es wurde festgestellt, dass beim Suspendieren der Fraktion IV₁ + IV₄-Paste in Wasser oder Salzlösung bei pH 6,0 ± 0,2 und nachfolgenden Waschschritten fast das ganze Albumin und das meiste des alpha-2- und beta-Proteins im Fraktion IV₁ + IV₄-Fällungsprodukt entfernt wird.
PEG-Ausfällung
Der unlösliche Proteinrückstand wird in 5 ± 2 Volumina Wasser bei pH von 8,5 ± 0,5 pro Volumen des Rückstandes bei einer Temperatur von ungefähr 15°C ± 5°C für vorzugsweise 6 Stunden, obwohl kürzere oder längere Zeiten verwendet werden können, resuspendiert. Kürzere Zeiten sind nicht bevorzugt, da sich die Ausbeute verbessert, wenn die Dauer verlängert wird. Sechs Stunden ist derzeit als die optimale Kombination von Verfahrenszeit und Ausbeute bevorzugt. Festes Tris wird dann bis zu einer Endkonzentration von 10 ± 5 mM zugegeben, und festes NaCl wird bis zu einer Endkonzentration von 150 ± 20 mM zugegeben, und der pH wird auf 8,0 eingestellt. Polyethylenglykol 3350 (PEG) wird dann bis zu einer End konzentration von 15 ± 5% w/w zugegeben und wird bei 15 ± 5°C für ungefähr eine Stunde gemischt. PEG wird zugegeben, um alpha-2-Globulin auszufällen.
Das PEG Fällungsprodukt, das sich bildet, wird durch eine Filterpresse entfernt. Die Filterpresse wird vor und nach dem Filtrieren mit einer Lösung, die 150 ± 25 mM NaCl und 15 ± 5% w/w PEG enthält, bei einem pH von 8,0 ± 0,5 gewaschen. Alternativ kann das Fällungsprodukt durch Zentrifugation entfernt werden.
ZnCl₂-Ausfällung
ZnCl₂ (100 ± 10 mM) wird zu dem PEG Überstand bis zu einer Endkonzentration von 6 ± 5 mM zugegeben, und die Lösung wird auf pH 7,5 ± 5 eingestellt. Die Lösung wird auf 5 ± 5°C gekühlt und für mindestens eine Stunde gemischt. Das ZnCl₂ fällt rohen alpha-1-PI aus. Der rohe alpha-1-PI wird durch Filtration, vorzugsweise durch Prostak^TM-Filtration, wie zum Beispiel in "Prostak Open-Channel Modules" von Millipore Corporation beschrieben, oder durch Zentrifugation konzentriert, und das Filtrat wird entfernt. Die konzentrierte Suspension oder das Fällungsprodukt kann für zukünftige Verarbeitung eingefroren werden.
Virale Inaktivierung durch Lösungsmittel verzögerte Behandlung
Der rohe alpha-1-PI wird wieder löslich gemacht in 50 mM NaEDTA durch Prostak durch Rezirkulieren. Ein Zucker, vorzugsweise Sucrose, in einer Menge von 15 ± 5% w/w (oder ungefähr 0,25 ± 0,05 M Na₃ Citrat) wird als ein Stabilisator während viraler Inaktivierung zugegeben. Die Lösung wird bei 15° ± 5°C gemischt bis die Sucrose gelöst ist.
Die alpha-1-PI enthaltende Lösung ist durch Lösungsmittel-Detergens Behandlung Virus inaktiviert. Eine Lösung von 10 ± 1% w/v Polysorbital 80 und 3 ± 0,3% w/w tri-n-Butylphosphat wird zu der alpha-1-PI Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1,0 ± 0,5% w/v Polysorbat-80 und 0,3 ± 0,15% w/w tri-n-Butylphosphat zugegeben. Die Lösung wird dann bei 27° ± 3°C, pH 8 ± 0,5 für nicht weniger als 6 Stunden inkubiert, um jegliche Viren, die in dem alpha-1-PI anwesend sein können, zu inaktivieren.
Es ist festgestellt worden, dass die Anwesenheit von Zucker, z.B. Sucrose, als ein Stabilisator während viraler Inaktivierung durch Lösungsmittel-Detergens Behandlung die Ausbeute von alpha-1-PI in Einheiten verglichen mit einer Kontrolle, d.h. alpha-1-PI Lösung, viral inaktiviert durch Lösungsmittel-Detergens ohne Zucker als ein Stabilisator, erhöht. Die Erhöhung der Ausbeute beträgt vorzugsweise mindestens 10%, weiter bevorzugt mindestens 20% und noch weiter bevorzugt mindestens 30%.
Nach der Inkubation wird die behandelte alpha-1-PI Lösung auf 0°–10°C gekühlt, und der pH wird auf 8,0 ± 0,1 eingestellt.
Anionenaustauschchromatographie
Die SD behandelte Lösung wird dann mit ungefähr 1 Volumen Wasser pro Volumen SD behandelter Lösung verdünnt. Die verdünnte Lösung wird dann auf ein prääquilibriertes QAE Chromatographiemedium oder ein anderes ähnliches Anionenaustauschmedium, das alpha-1-PI bindet, aufgetragen, um zu ermöglichen, dass andere Proteine von dem alpha-1-PI abgetrennt werden. Entweder Batch- oder Säulenchromatographie können verwendet werden. Nachdem alpha-1-PI auf dem Medium absorbiert worden ist, wird es mit einem Puffer, der 20 ± 10 mM NaCl und 20 ± 10 mM Natriumphosphat (NaH₂PO₄) enthält, bei einem pH von 8 ± 1 gewaschen, um ungebundenes Material, das beta-Proteine einschließt, zu entfernen. Alpha-1-PI wird dann von dem Anionenaustauschchromatographiemedium mit einem Elutionswaschschritt, der 100 ± 50 mM NaCl und 20 ± 10 mM Natriumphosphat enthält, bei einem pH von 8 ± 1 eluiert. Das Eluat, das alpha-1-PI einschließt, wird zur weiteren Verarbeitung gesammelt.
Nach dem Entfernen von alpha-1-PI wird das Anionenaustauschmedium durch Waschen mit aufeinander folgend: einer wässrigen Lösung, die 2 ± 0,2 M NaCl, 20 ± 10 mM Natriumphosphat, pH 8 ± 1, enthält; dann Wasser zur Injektion (englisch: water for injection (WFI)); dann einer wässrigen Lösung, die 500 mM NaOH enthält; und schließlich WFI gereinigt. Das Chromatographiemedium wird dann in 2 ± 0,2 M NaCl, 20 ± 10 mM Natriumphosphat, pH 8 ± 1, gelagert.
Behandlung von alpha-1-PI enthaltendem Eluat
Das Eluat, das alpha-1-PI enthält, wird vereinigt und mit 0,1 bis 1,0% w/w Bentonit für ungefähr eine Stunde oder mehr behandelt, um die Menge von Apoplipo Protein vorzugsweise auf weniger als 0,01 mg/ml Apolipoprotein A und weniger als 0,01 mg/ml Apolipoprotein B zu verringern. Das Bentonit wird durch Filtration, vorzugsweise durch Cuno^®-Filtration, wie zum Beispiel in "Zeta Plus^® C Series Filter Medium" von Cuno Inc. beschrieben, entfernt. Die resultierende Lösung wird durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert bis die alpha-1-PI Aktivität mindestens 10 Einheiten/ml beträgt. Das konzentrierte Produkt wird dann durch einen 0,45 Mikron Filter filtriert, um jegliches partikuläres Material zu entfernen. Der alpha-1-PI wird dann Planova filtriert, um Viren zu entfernen, durch einen 0,22 Mikron Filter steril filtriert, um auf Röhrchen verteilt und zur Lagerung lyophilisiert zu werden. Alpha-1-PI wird bei 2–8°C gelagert.
Der lyophilisierte alpha-1-PI kann in sterilem Wasser zur Verabreichung an Patienten wieder gelöst werden.
Alpha-1-PI Aktivitätstests
Ein chromogener Test kann verwendet werden, um alpha-1-PI Aktivität des wieder hergestellten alpha-1-PI nachzuweisen. Der Test verwendet ein Trypsin sensitives chromogenes Substrat, das p-Nitroanillin in der Anwesenheit von Trypsin (geliefert durch Sigma Chemical Co. aus St. Louis, Missouri) freisetzt. Das freigesetzte p-Nitroanillin wird bei 405 nm nachgewiesen. Alpha-1-PI hemmt die Freisetzung von p-Nitroanillin vom Substrat. Die Aktivität von alpha-1-PI in dem Produkt wird durch Bezug auf eine Standard alpha-1-PI Aktivitätskurve bestimmt. Ein chromogener Test von wieder hergestelltem lyophilisierten alpha-1-PI, der gemäß dem obigen Verfahren aufbereitet wurden, zeigt eine spezifische Aktivität von mindestens 1,0 Einheit/OD₂₈₀.
Verabreichung
Alpha-1-PI kann einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von 0,08 ml/kg Körpergewicht pro Minute für die ersten 10 Minuten infundiert werden. Falls der Patient keinerlei Beschwerden wahrnimmt, kann die Geschwindigkeit, solange sie toleriert wird, erhöht werden. Falls sie toleriert wird, können nachfolgende Infusionen an denselben Patienten mit höheren Geschwindigkeiten erfolgen. Wenn Nebenwirkungen auftreten sollte die Geschwindigkeit verringert oder die Infusion unterbrochen werden bis die Symptome abklingen. Die Infusion kann dann mit einer Geschwindigkeit, die vom Patienten toleriert wird, wieder aufgenommen werden.
Wenn große Dosen verabreicht werden müssen, können mehrere wieder hergestellte Röhrchen von alpha-1-PI in einem leeren, sterilen I.V. Infusionsbehälter durch Verwenden aseptischer Technik, vereinigt werden.
Beispiel 1
Fr. IV₁ + IV₄-Paste (600 g) des Cohn Fraktionierungsschemas wurde in 1800 ml Wasser bei 5°C bei einem pH von 6,0 ohne jegliche Titration für eine Stunde suspendiert. Nach Fertigstellung der Suspension wurde die Suspension durch 10 CP Filter (Cuno) durch eine Filterpresse filtriert. Das Filtrat wurde gesammelt, getestet, und die alpha-1-PI (A1PI) spezifische Aktivität (S.A.) und die optische Dichte bei 280 nm (OD_280nm) wurden gemessen. Die Paste in der Filterpresse wurde mit 600 ml Wasser bei 5°C gewaschen, und das Filtrat wurde gesammelt. Dieses Verfahren wurde vier weitere Male wiederholt, und sämtlich Filtrate wurden gesammelt, getestet, und die A1PI spezifische Aktivität (S.A.) und die OD_280nm wurden gemessen. Die 350 g der resultierenden Paste wurden erhalten. Die A1PI Aktivität und die OD_280nm sämtlicher Verfahrensproben werden in der folgenden Tabelle 1 beschrieben.
Tabelle 1: A1PI Aktivität und O.D. 280 nm von Wasser gewaschenen Fraktionen
Beispiel 2
Die resultierenden 350 g der Paste aus Beispiel 1 wurden in 1050 ml Wasser bei einem pH von 8,5 bei einer Temperatur von 18°C für 6 Stunden resuspendiert. Festes Tris wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben, und festes NaCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben, und der pH wird auf 8,0 eingestellt. Polyethylenglykol (PEG 3350) wurde bis zu einer Endkonzentration von 15% (w/w) zugegeben und wurde bei 18°C für eine Stunde gemischt. Das resultierende Fällungsprodukt wurde durch eine Filterpresse mit einem 10 CP Filter entfernt, um den Überstand rückzugewinnen. Die Paste in der Filterpresse wurde mit der Lösung, die 15% (w/w) PEG-3350, 10 mM Tris und 150 mM NaCl enthält, nachgewaschen. Das Filtrat und Nachwaschfiltrat wurden vereinigt. Das Ergebnis wird in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 2: PEG-3350-Ausfällung
Beispiel 3
Zu dem rückgewonnenen PEG-3350 Filtrat aus Beispiel 2 wurde ZnCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, der pH wurde auf 7,5 eingestellt, und die Temperatur wurde auf 5°C gekühlt, um rohes A1PI auszufällen. Nach einer Stunde Mischen wurde das rohe A1PI durch Prostak-Filtration zur Konzentration filtriert, und die resultierende Suspension wurde mit NaEDTA Lösung wieder löslich gemacht. Das Ergebnis wird in der folgenden Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: ZnCl₂-Ausfällung
Beispiel 4
Sucrose in einer Menge von 16,7% (w/w) wurde zu der durch NaEDTA wieder löslich gemachten Lösung aus Beispiel 3 zugegeben und bei 18°C bis die Sucrose vollständig gelöst war, gemischt. Zu dieser Lösung wurde Polysorbat-80 in einer Endkonzentration von 1,0% und tri-n-Butylphosphat in einer Endkonzentration von 0,3% zugegeben. Diese Lösung wurde bei 27,5°C für nicht weniger als 6 Stunden inkubiert, um jegliche möglichen kontaminierenden Lipid umhüllten Viren zu inaktivieren. Nach der Inkubation wurde die Lösung auf 5°C gekühlt, und der pH wird auf 8,0 eingestellt. Als eine Kontrolle wurde das obige Verfahren mit Ausnahme, dass keine Sucrose zugegeben wurde, wiederholt. Die Stabiltät von A1PI während der Lösungsmittel-Detergens (SD) Behandlung in der Anwesenheit von 16,7% Sucrose (SD A1PI) und ohne Sucrose (Kontrolle) wird in der folgenden Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Stabilität von A1PI während der SD Behandlung in der Anwesenheit von Sucrose
Beispiel 5
Zu der resultierenden SD A1PI Lösung aus Beispiel 4 wurden 311 g destilliertes Wasser zugegeben, um die ionische Stärke vor Beladen auf eine QAE Säule zu erniedrigen. Diese Lösung wurde auf 300 ml einer prääquilibrierter QAE Ionenaustauschsäule mit einer Fließgeschwindigkeit von 12 ml/Minute geladen. Die Säule wurde mit 6 l Salzphosphat Puffer (20 mM NaCl, 20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0) gewaschen. Der A1PI wurde mit 1,8 l Salzphosphat Puffer (100 mM NaCl, 20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0) eluiert.
Das Ionenaustauschmedium wurde durch Waschen mit aufeinander folgend: 2 M NaCl, 20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0, 500 mM NaOH und destilliertem Wasser gereinigt. Das Chromatographiemedium wurde in 2 M NaCl, 20 mM NaH₂PO₄, pH 8,0 gelagert. Die vereinigten Fraktionen, die A1PI enthalten, wurden getestet, und das Ergebnis wird in der folgenden Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5: QAE Ionenchromatographie
Beispiel 6
Zu dem vereinigten Eluat, das aus Beispiel 5 resultiert, wurden 3,0 g depyrogeniertes Bentonit zugegeben und bei 20°C für eine Stunde gemischt. Das Bentonit wurde durch Cuno-Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wurde Planova filtriert und in Reihen steril filtriert. Das Filtrat wurde auf Röhrchen verteilt und zur Lagerung lyophilisiert. Sämtliche Verfahrensproben wurden getestet, und das Ergebnis wird in der folgenden Tabelle 6 dargestellt.

Claims

Verfahren zum Aufreinigen von alpha-1-Proteinase-Inhibitor, umfassend: das Bereitstellen einer unsauberen Proteinfraktion, umfassend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, das Suspendieren der unsauberen Proteinfraktion, umfassend alpha-1-Proteinase-Inhibitor, in einer wäßrigen Lösung bei einem pH von 6 für eine Dauer, die ausreichend ist, dass sich lösliche Proteine lösen, das Filtrieren der Suspension und das Rückgewinnen von unlöslichen Proteinen, das Resuspendieren von unlöslichem Protein in einer wäßrigen Lösung, wobei der pH der wäßrigen Lösung, die das unlösliche Protein enthält, auf 8,5 eingestellt wird, das Zugeben von PEG zu dem resuspendierten unlöslichen Protein, um α-2-Globulin auszufällen, das Rückgewinnen des Überstandes von der PEG-Ausfällung, wobei der Überstand alpha-1-Proteinase-Inhibitor umfaßt, das Zugeben von ZnCl₂ zu dem Überstand, um den rohen alpha-1-Proteinase-Inhibitor auszufällen, das Rückgewinnen des rohen alpha-1-Proteinase-Inhibitors, das Löslichmachen des rückgewonnenen rohen alpha-1-Proteinase-Inhibitors, das Anwenden des löslich gemachten rohen alpha-1-Proteinase-Inhibitors auf ein Anionenaustauschmedium und das Rückgewinnen einer Fraktion, welche aufgereinigten alpha-1-Proteinase-Inhibitor umfaßt, von dem Anionenaustauschmedium.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die unsaubere Proteinfraktion, die alpha-1-Proteinase-Inhibitor umfaßt, in von 3 bis 7 Volumina wäßriger Lösung für jeden Teil an unsauberer Proteinfraktion, die alpha-1-Proteinase-Inhibitor umfaßt, suspendiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wäßrige Lösung aus der Gruppe, bestehend aus Wasser und Lösungen, die NaCl in einer Konzentration von 0,05 bis 0,15 M enthalten, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das PEG zu einer Konzentration von 10% bis 20% w/w gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH des Überstands aus der PEG-Ausfällung auf 7,5 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ZnCl₂ zu einer Konzentration von 1 bis 11 mM gegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Behandeln des rohen alpha-1-Proteinase-Inhibitors, der aus der ZnCl₂-Ausfällung rückgewonnen wurde, um jede viralen Kontaminierungen zu inaktivieren.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der rohe alpha-1-Proteinase-Inhibitor mit einem Lösungsmittel und einem Detergens behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der rohe alpha-1-Proteinase-Inhibitor mit tri-n-Butylphosphat und Polysorbat 80 behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der rohe alpha-1-Proteinase-Inhibitor mit 0,15 bis 0,45% w/v tri-n-Butylphosphat und 0,5 bis 1,5% w/v Polysorbat 80 behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Zugeben von Bentonit zu dem Elutionsmittel, welches alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der aufgereinigte alpha-1-Proteinase-Inhibitor eine spezifische Aktivität von größer als 1,0 Einheiten/OD₂₈₀ aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der aufgereinigte alpha-1-Proteinase-Inhibitor eine Ausbeute von mindestens 1 Einheit pro Gramm Fraktion IV₁ + IV₄-Paste aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei PEG zu der wäßrigen Lösung, die resuspendiertes unlösliches Protein enthält, zu einer Konzentration von 10% bis 20% Gewicht/Gewicht gegeben wird, um α-2-Globuline auszufällen, der pH des PEG-Überstandes auf 7,5 eingestellt wird, der rohe alpha-1-Proteinase-Inhibitor durch Prostak-Filtration rückgewonnen wird, der wieder löslich gemachte rohe alpha-1-Proteinase-Inhibitor mit einem Lösungsmittel und einem Detergens behandelt wird, um jede viralen Kontaminierungen zu inaktivieren, und die Fraktion, die aufgereinigten alpha-1-Proteinase-Inhibitor umfaßt, mit Bentonit behandelt wird, um Apolipoprotein zu adsorbieren.
Verfahren nach Anspruch 14, weiter umfassend das Behandeln der rückgewonnenen Fraktion, umfassend das Ultrafiltrieren der Lösung, die aufgereinigten alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.
Verfahren nach Anspruch 15, weiter umfassend das Lyophilisieren der ultrafiltrierten Lösung, die aufgereinigten alpha-1-Proteinase-Inhibitor enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der aufgereinigte alpha-1-Proteinase-Inhibitor eine spezifische Aktivität von größer als 1,0 Einheiten/OD₂₈₀ aufweist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der aufgereinigte alpha-1-Proteinase-Inhibitor eine Ausbeute von mindestens 1,0 Einheiten/g Fraktion IV₁ + IV₄-Paste aufweist.