CZ301332B6 - Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku - Google Patents
Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301332B6 CZ301332B6 CZ20070841A CZ2007841A CZ301332B6 CZ 301332 B6 CZ301332 B6 CZ 301332B6 CZ 20070841 A CZ20070841 A CZ 20070841A CZ 2007841 A CZ2007841 A CZ 2007841A CZ 301332 B6 CZ301332 B6 CZ 301332B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- solution
- protein solution
- bentonite
- apolipoprotein
- a1pi
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku, který zahrnuje pridání bentonitu k uvedenému proteinovému roztoku; kontaktování bentonitu s proteinovým roztokem po dobu alespon jedné hodiny; a odstranení bentonitu z uvedeného proteinového roztoku. Tímto zpusobem lze dosáhnout toho, že po odstranení bentonitu roztok obsahuje méne než 0,01 mg/ml jak apolipoproteinu A, tak apolipoproteinu B.
Description
Způsob odstranění apolipoproteinu z proteinového roztoku
Oblast techniky
Tento vynález se týká způsobu odstranění apolipoproteinu z proteinového roztoku pomocí přidání bentonitu.
io Dosavadní stav techniky
Inhibitor α-1-proteinasy (zde též α-1-ΡΙ), známý rovněž, jako α-antitrypsin, je sérový glykoprotein o molekulové hmotnosti 52 000. Tato látka je syntetizována v játrech a je obsažena v séru v množstvích mezi 150 až 350 mg/dl (což je ekvivalentem 30 až 80 μΜ) stanoveno pomocí testoi5 vání plazmovými standardy, α-1-ΡΙ působí v plicích za účelem inhibice neutrofilní elastasy, serinproteasy, jejíž přítomnost ve velkých množstvích může vést k destrukci alveolámích stěn. V normálních plicích zajišťuje a-1P1 více než 90 % anti-neutrofilní ochrany elastasy v nižším dýchacím traktu.
Nedostatek α-1-ΡΙ je autosomální, recesivní dědičná porucha, která se projevuje celou radou allelických variant a která je charakteristická atletickým uspořádáním označovaným jako proteasový inhibiční systém (Pí). Tyto allely jsou seskupeny na bázi hladin α-1-ΡΙ, které jsou dosahovány v séru různých jedinců. Normální jedinci mají normální sérovou hladinu α-1-ΡΙ (normál25 ní jedinci se označují jako jedinci s PiMM fenotypem). Deficientní jednotlivci mají sérovou hladinu α-1-ΡΪ nižší než odpovídá 35 % průměrné normální hladiny (tito jedinci se označují jako jedinci s PiZZ fenotypem). Nuloví jedinci mají nedetekovatelný obsah α-1-ΡΪ proteinu v séru (tito jedinci se označují jako jedinci s Pí(nula) (nula) fenotypem.
Nedostatek α-1-ΡΙ je charakterizován nízkými hladinami α-1-ΡΙ v séru (méně než 35 % průměrné normální hladiny) a v plicích. Tito deficientní jedinci jsou vystaveni vysokému riziku vývoje panacinámího emťyzému. Tento emťyzém převládá u jedinců s fenotypy PiZZ, PiZ(nula) a Pi(nula) (nula). Symptomy tohoto stavu se obvykle projeví u postižených jedinců v třetí nebo čtvrté dekádě jejich života.
Emťyzém spojený s nedostatkem α-1-ΡΙ se rozvíjí v důsledku koncentrací α-1-ΡΙ v nižších částech dýchacího traktu, které jsou nedostatečné pro inhibicí neutrofilní elastasy, což vede k destrukci pletiva pojivové tkáně plicního parenchymu. Jedinci s nedostatkem α-1-ΡΙ jsou málo chráněni proti neutrofilní elastase, uvolňované neutrofily v nižší části dýchacího traktu. Tato nerovnováha proteasa: inhibitor proteasy u jedinců s nedostatkem α-1-ΡΙ se projeví chronickým poškozováním a posléze i destrukcí plicního parenchymu a alveolámích stěn.
Jedinci s vážným nedostatkem α-1-ΡΙ se vyznačují typicky endogenními sérovými hladinami a1 -PI pod 50 mg/dl, dle stanovení standardizovanými postupy. U jedinců s tak nízkými sérovými hladinami α-1-Ρΐ existuje více než 80% riziko, že se u nich během života vyvine emťyzém. Odhaduje se, že alespoň u 40 000 pacientů v USA, neboli u 2 % ze všech pacientů trpících emfyzémem, je toto onemocnění výsledkem poškození genu kódujícího α-1-ΡΙ. Nedostatek α-1-ΡΙ představuje jednu z nejběžnějších dědičných smrtelných poruch u bělochů žijících ve Spojených státech a v Evropě.
Léčení pacientů s nedostatkem α-1-ΡΙ je zaměřeno na náhradu nebo zvýšení hladiny α-1-ΡΙ v séru. Očekává se, že zvýší—li se hladina α-1-ΡΙ v séru, zvýší se v důsledku jeho koncentrace v plicích, čímž se upraví nerovnováha neutrofilní elastasa: α-1-ΡΙ v plicích a zabrání se destrukci plicní tkáně, nebo se tento pochod zpomalí. Studie normální a α-1-ΡΙ deficientní populace vedly k vyslovení názoru, že minimální ochranná hladina α-1-ΡΙ v séru odpovídá 80 mg/dl nebo
- 1 CZ 301332 B6 μΜ (přibližně 57 mg/dl; při použití čistých standardů), V důsledku toho je většina terapií a-1PI-deficientních pacientů zaměřena na zajištění minimální ochranné hladiny α-1-ΡΙ v séru, protože sérový α-1-ΡΙ je zdrojem alveolámího α-1-PL
Přípravky s obsahem α-1-ΡΙ pro terapeutické použití jsou dostupné od 80. let 20. století. Hlavní využití nacházejí při terapií spočívající ve zvýšení (náhradě) vrozeného nedostatku α-1-ΡΙ. Poločas lidského α-1-ΡΙ in vivo odpovídá 4,38 dne se standardní odchylkou 1,27 dne. V současnosti doporučovaná dávka 60 mg α-1-Pl/kg tělesné hmotnosti týdně upraví nízkou hladinu a1—PI v séru na hladinu překračující minimální ochrannou hladinu 1 ΙμΜ nebo 80 mg/dl.
Dříve byl α-1-ΡΙ čištěn různými způsoby. Jeden z těchto způsobů kombinuje chromatografií na aniontově-výměnném chromatografickém médiu s následným srážením pomocí PEG. Jiné způsoby čistění využívají srážení pomocí PEG s následnou aniontově-výměnnou chromatografií, nebo několikanásobné srážení pomocí PEG a následnou aniontově-výměnnou chromatografií.
Dále byly použity kombinace srážení pomocí PEG, jednoho ěi více stupňů aniontově-výměnné chromatografie a stupně chromatografie na bázi chelátů kovů.
Další způsoby využívají pro čištění α-1-ΡΙ techniku dělení fází. Pro přečištěný α-1-ΡΙ se uvádí specifické aktivity l,26jedn./mg.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob odstranění apolipoproteinu z proteinového roztoku, při kterém se ke zmíněnému roztoku přidá bentonit, bentonit zůstává v kontaktu s roztokem po dobu alespoň jedné hodiny a následně se z něj odstraní.
Při způsobu podle tohoto vynálezu se bentonit k roztoku přidává v množství od přibližně 0,1 do přibližně 1,0 % hmotn. a výsledkem tohoto způsobuje, že množství apolipoproteinu A a apolipo30 proteinu B, které zbývá v proteinovém roztoku po odstranění bentonitu, je v obou případech nižší než přibližně 0,01 mg/ml.
Bentonit se z roztoku odfiltruje s výhodou pomocí filtrace Cuno®, například tak, jak je popsáno v publikaci „Zeta Plus C Series Filter Medium“, Cuno lne., jejíž obsah je formou odkazu zahrnut v tomto textu.
Způsob podle předmětného vynálezu je v podstatě jedním ze stupňů komplexního zlepšeného způsobu čistění α-1-ΡΙ, který je popsán v následujících odstavcích a který jako celek není předmětem tohoto vynálezu.
Uvedený způsob zahrnuje opatření znečištěné proteinové frakce, s výhodou pastové Cohnovy frakce IV| + IV4, jež obsahuje α-1-ΡΙ. Tato znečištěná proteinová frakce se suspenduje ve studené vodě nebo v solném roztoku při pH přibližně 6, aby došlo k rozpuštění rozpustných proteinů, včetně albuminu, α-2-globulinu (α-2-makroglobulinu a hatoglobulin) a β-globutinu (transferrinu). Suspenze se poté filtruje, čímž se získají nerozpustné proteiny včetně α-1-ΡΙ, které se promyjí vodou (nebo solným roztokem). Frakce promytých nerozpustných proteinů se znovu suspenduje ve vodě (nebo v solném roztoku), hodnota pH se upraví na přibližně 8,5 a přidáním PEG se vysráží α-2-globulin. Supematant se odlije a přidáním chloridu zinečnatého se vysráží surový α-1-ΡΙ. Tato surová látka se znovu rozpustí v NaEDTA pufru a viry se deakti50 vují přidáním činidla Tween 80 a tri-n-butylfosfátu (TNBP). S výhodou se přidá některý ze sacharidů, jako je sacharoza, maltosa, glukosa apod., aby se stabilizoval α-1-ΡΙ v průběhu uvedené deaktivace virů a zvýšil se tak jeho výtěžek.
Takto zpracovaný roztok se nanese na aniontově-výměnné médium za účelem oddělení α-1-ΡΙ od dalších zbývajících proteinů. Frakce obsahující α-1-ΡΙ se oddělí a výhodně se knim přidá bentonit, aby se tak odstranily jakékoli apolipoproteiny, které jsou v této frakci přítomné. Vzniklý přečištěný roztok α-1-ΡΙ se izoluje a zahustí.
Tímto způsobem přečištěný α-1-ΡΙ má specifickou aktivitu větší než 1,0 jedn./OD28o· Tímto s postupem lze dosáhnout výtěžku více než přibližně l,0jedn./g pasty, s výhodou pak více než přibližně 1,3 jedn./g pasty.
Použitím tohoto způsobu se zlepší kvalita i výtěžek α-1-ΡΙ. Dále se tímto způsobem zkrátí doba čistění ve srovnání s jinými způsoby.
Zmíněný způsob Čistění α-1-ΡΙ vychází ze znečištěné proteinové frakce. Touto znečištěnou proteinovou frakcí může být plazma, dále α-1-ΡΙ získaný rekombinantními metodami nebo jakýkoli jiný zdroj obsahující α-1-ΡΙ protein. Ve výhodném provedení je znečištěnou proteinovou frakcí pastová Cohnova frakce IV) + IV4, jejíž příprava je v daném oboru velmi dobře známa.
Výchozí zpracování pastové frakce IV) + IV4.
Pastová frakce IV) + IV4 (nebo jiná znečištěná proteinová frakce) se suspenduje v 5 ± 2 dílech vody nebo solného roztoku, tj. od přibližně 0,05 do přibližně 0,15 M chloridu sodného na 1 díl frakce, tedy IVi + IV4) při teplotě nižší než přibližně 15 °C a pH přibližně 6,0 ± 0,2, a to alespoň přibližně jednu hodinu. Rozpustné proteiny, včetně albuminu, α-2-globulinu a β-globulinu, se poté oddělí od nerozpustných proteinů, včetně inhibitoru α-1-proteinasy, a to pomocí filtračního lisu, odstředění apod. Zbytek se promyje při teplotě nižší než 15 °C vodou nebo solným roztokem při pH 6 ± 0,2, čímž se odstraní jakýkoli další rozpustný protein zachycený fyzicky v nerozpustné pastě, přičemž objem vody nebo solného roztoku použitého k promývání činí přibližně pětinásobek původního objemu pasty.
Bylo zjištěno, že suspendováním pastové frakce IV) + IV4 ve vodě nebo solném roztoku při pH 6,0 ± 0,2 s následným promýváním se odstraní téměř veškerý albumin a vysráží se většina a30 2- a β-proteinů z frakcí IV) + IV4.
Srážení s použitím PEG
Nerozpustný proteinový zbytek se znovu suspenduje v přibližně 5 ± 2 objemech vody na objem zbytku, při pH 8,5 ±0,5, a to při teplotě přibližně 15°C±5°C, výhodně po dobu přibližně 6 hodin, ačkoliv se mohou využít kratší či delší časy. Kratší doby nejsou výhodné, protože výtěžek se s prodlužující se dobou suspendace zvyšuje. Jako optimální kombinace doby suspendace a výtěžku se v současnosti jeví doba 6 hodin. Poté se přidá pevný Tris do konečné koncentrace 10 ± 5μΜ, pevný chlorid sodný do konečné koncentrace 150 ± 20mM a hodnota pH se upraví na
8,0. Následně se přidá polyethylenglykol 3350 (PEG) do konečné koncentrace 15 ± 5 % hmotn.
a reakční směs se míchá přibližně hodinu při teplotě 15 ± 5 °C. PEG se přidává za účelem vysrážení α-2-globulinu.
Sraženina, jež se vyloučí po přidání PEG, se odstraní pomocí filtračního lisu. Filtrační lis se pro45 myje před filtrací i po filtraci roztokem obsahujícím 150 ± 25 mM chloridu sodného a 5 % hmotn. PEG, při pH 8,0 ± 0,5. Alternativně lze sraženinu odstranit odstředěním.
Srážení chloridem zinečnatým
K PEG supematantu se přidá chlorid zinečnatý (l00±I0mM) až do konečné koncentrace 6 ± 5mM a pH roztoku se upraví na 7,5 ± 0,5. Roztok se ochladí na teplotu 5 ± 5 °C a míchá se nejméně hodinu. Chlorid zinečnatý vysráží surový α-1-ΡΙ. Surový α-1-ΡΙ se oddělí filtrací, s výhodou použitím filtrace Prostak®, jak je popsána například v publikaci „Prostak Open-3CZ 301332 B6
Channel Modules“, Millipore Corporation, jejíž obsah je zde zahrnut formou odkazu, nebo odstředěním a filtrát se odstraní, Koncentrovanou suspenzi nebo sraženinu lze pro další upotřebení zmrazit.
Deaktivace virů zpracováním bez použití rozpouštědla
Surový α-1-ΡΙ se znovu rozpustí v přibližně 50mM roztoku NaEDTA s použitím filtrace Prostak a recirkulace. Přidá se sacharid, s výhodou sacharóza, a to v množství přibližně 15 ± 5 % hmotn. (nebo přibližně 0,25 ± 0,05 citranu sodného), které slouží jako stabilizátor během deaktivace io viru. Roztok se míchá při teplotě 15 ± 5 °C, dokud se sacharóza nerozpustí.
Roztok obsahující α-1-ΡΙ se z hlediska viru deaktivuje přidáním rozpouštědla-detergentu. K roztoku α-1-ΡΙ se přidá roztok 10 ± 1% hmotn./obj. polysorbát 80 a 3 ± 0,3 % hmotn. tri—n— butylfosfátu, a to až do konečné koncentrace 1,0 ±0,5% hmotn./obj. polysorbátu-80 is a 0,3 ±0,15% hmotn. tri-n-butylfosfátu. Poté se roztok inkubuje při teplotě 27 °C ± 3 °C, pH 8 ± 0,5 po dobu nejméně 6 hodin, čímž se deaktivují jakékoli viry, které mohou být přítomné v α-1-ΡΙ.
Bylo zjištěno, že přítomnost sacharidu, například sacharózy, jakožto stabilizátoru během deakti20 vace viru pomocí přídavku rozpouštědla-detergentu zvyšuje výtěžek α-1-ΡΙ v jednotkách ve srovnání s kontrolním pokusem, tj. s deaktivací viru v roztoku α-1-ΡΙ přídavkem rozpouštědladetergentu bez použití sacharidu jakožto stabilizátoru. Zvýšení výtěžku činí s výhodou nejméně 10 %, s výhodou nejméně 20 % a nejvýhodněji nejméně 30 %.
Po inkubaci se ošetřený roztok α-1-ΡΙ ochladí na 0°C až -10 °C, pH se potom upraví na 8,0 ±0,1.
Aniontově-výměnná chromatografie
Upravený roztok se zředí přibližně jedním objemem vody na objem upraveného roztoku. Zředěný roztok se dále nanese na předem ekvilibrované chromatografické médium QAE nebo na jiné podobné médium pro výměnu aniontů, jež váže α-1-ΡΙ, což umožňuje oddělení této látky od jiných proteinů. Lze použít buď vsádkovou chromatografíi nebo sloupcovou chromatografíi. Jakmile se α-1-ΡΙ absorbuje na médium, promyje se toto pufrem obsahujícím 20 ± 10 mM chloridu sodného a 20 ± 10 mM dihydrogenfosforečnanu sodného (NalfPOt) při pH 8 ± 1, čímž se odstraní nenavázané podíly, včetně β-proteinů. Poté se z chromatografíckého média pro výměnu aniontů vymyje α-1-ΡΙ, a to eluci promývací kapalinou, která obsahuje 100 ± 50 mM chloridu sodného a 20 ± 10 mM fosforečnanu sodného, při pH 8 ± 1, Eluát obsahující α-1-ΡΙ se jímá pro další zpracovávání.
Po odstranění α-1-ΡΙ se médium pro výměnu aniontů vyčistí postupným promytím následujícími složkami: vodným roztokem obsahujícím 2 ± 0,2 mM chloridu sodného a 20 ± 10 mM fosforečnanu sodného, pH8±l; vodou pro injekce (WFI); vodným roztokem obsahujícím 500mM hydroxidu sodného; a potom znovu WFI. Chromatografické médium se potom uchovává v rozto45 ku obsahujícím 2 ± 0,2 M roztoku chloridu sodného, 20 ± 10 mM roztoku fosforečnanu sodného, pH 8± 1.
Zpracovávání eluátu s obsahem α-1-ΡΙ
Takto získaný eluát se zpracuje způsobem podle předmětného vynálezu.
Roztok, který se získá způsobem podle tohoto vynálezu se zahušťuje pomocí ultrafiltrační membrány, dokud aktivita α-1-ΡΙ není alespoň lOjedn./ml. Koncentrovaný produkt se dále
-4CZ 301332 B6 filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,45 μπι, čímž se odstraní jakýkoli částicovitý materiál, a-1PI se filtruje technologií „Plánová“, čímž se odstraní virus, sterilně se filtruje přes filtr s póry o velikosti 0,22 pm, filtrát se rozdělí do lékovek a pro uskladnění se lyofilizuje. α-1-ΡΙ se skladuje při teplotě 2 ± 8 °C.
Lyotilizovaný α-1-ΡΙ se může znovu rozpustit ve sterilní vodě za účelem podání pacientovi.
Testy aktivity α-1-ΡΙ to Chromogenní test se může využít k detekci α-1-ΡΙ aktivity rekonstituovaného α-1-ΡΙ. Test využívá trypsin-sensitivní chromogenní substrát, ze kterého se v přítomnosti trypsinu uvolňuje p-nitroanilin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Uvolněný p-nitroanilin se detekuje při vlnové délce 405 nm. α-1-ΡΙ inhibuje uvolňování p-nitroanilinu ze substrátu. Aktivita α-1-ΡΙ v produktu se stanoví porovnáním s kalibrační křivkou aktivity α-1-ΡΙ. Pri chromogenním testu rekonstituovaného lyofilizovaného α-1-ΡΙ, připraveného výše popsaným způsobem, je vykazována specifická aktivita alespoň přibližně 1,0 jedn./OD28o>
Podávání
Pacientovi lze podávat α-1-ΡΙ infuzemi rychlostí přibližně 0,08 ml/kg tělesné hmotnosti za minutu po dobu prvních 10 minut. Pokud si pacient na nic nestěžuje, lze rychlost podávání zvýšit na tolerovanou míru. Pokud je toto podávání tolerováno, lze následné infuze témuž pacientovi podávat zvýšenou rychlostí. Dojde-li k opaku, sníží se rychlost podávání nebo se infuze přeruší do vymizení symptomů. Poté lze infuzi obnovit, a to rychlostí, jež je pacientem tolerována. Mají25 li se podávat vysoké dávky, pak lze několik ampulí α -1-ΡΙ spojit s použitím aseptické techniky do prázdného, sterilního i.v. ínfuzního zásobníku.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 - referenční
600 g pastové frakce IVj + IV4 zCohnova frakcionačního schématu se suspenduje při teplotě
5 aC a pH 6,0 v 1800 ml vody, bez jakékoli titrace po dobu jedné hodiny. Po skončení suspendace se suspenze filtruje při tlaku 10 CP přes filtr (Cuno). Filtrát se izoluje, testuje a změří se specifická aktivita (S. A.) α-1-ΡΙ (A1PI) a optická hustota při 280 nm (OD28Qnm). Pasta zbylá ve filtračním lisu se promyje 600 ml vody o teplotě 5 °C, filtrát se jímá a tento postup se opakuje čtyřikrát. Všechny filtráty se spojí, testují a měří se specifická aktivita (S. A.) a optická hustota (ODígonm). Hmotnost výsledné pasty: 3S0 g. Specifická aktivita a optická hustota vzorků získaných tímto postupem je popsána v následující tabulce I.
-5CZ 301332 B6
Tabulka 1
Aktivita A1PI a O.D. 280 nm frakcí vymytých vodou
Vzorek | Objem (»1) | A1FI (jada./nl) | Celkový A1PI (jedu.) | O.D. 280 na | S.A. (jadn./QD) |
Promytí 0 | 1450 | 0,06 | 87 | 22,2 | 0,003 |
Promytí 1 | 600 | 0,1 | 60 | 29,9 | 0,003 |
Promytí 2 | 600 | 0,08 | 48 | 25,5 | 0,003 |
Promytí 3 | 600 | 0,04 | 24 | 13,0 | 0,003 |
Promytí 4 | 600 | 0 | 0 | 4,8 | 0 |
Promytí 5 | 600 | 0 | 0 | 3,0 | 0 |
Příklad 2 - referenční to
350 g výsledné pasty z příkladu 1 se resuspenduje v 1050 ml vody při pH 8,5 a teplotě 18 °C po dobu 6 hodin. Přidá se pevný Tris do koncové koncentrace lOmM a pevný chlorid sodný do koncové koncentrace 150mM, pH se upraví na hodnotu 8,0, Dále se přidá polyethylenglykol (PEG 3350) do koncové koncentrace 15 % (hmotn.) a výsledná směs se míchá jednu hodinu při
18 °C. Vzniklá sraženina se odstraní pomocí filtračního lisu s 10 CP filtrem, čímž se získá supernatant. Pasta ve filtračním lisu se následně promývá roztokem s obsahem 15 % (hmotn.) polyethylenglykolu PEG-3350, 10 mM Tris a 150 mM chloridu sodného. Filtrát a filtrát z následného promývání se spojí. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
Tabulka 2
PEG-3350 srážení
Vzorek | Qbjen (al) | A1PI (jedn./ml) | Celkový A1PI (jedn.) | O.D. 280 na | S.A. (jedn. /OD) |
Resusp. | 1400 | 1,063 | 1488 | 13,32 | 0,0798 |
PEG- filtrát | 2465 | 0,513 | 1265 | 2,16 | 0,2375 |
-6CZ 301332 B6
Příklad 3 - referenční
K získanému filtrátu PEG-3350 z příkladu 2 se přidává chlorid zinečnatý do koncové koncentra5 ce 2mM, hodnota pH se upraví na 7,5 a teplota se sníží na 5 °C, čímž dojde k vysrážení surového
A1PI. Po jedné hodině míchání se surový A1PI odfiltruje pomocí filtrace Prostak a získaná suspenze se znovu rozpustí v roztoku NaEDTA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
io Tabulka 3
Srážení chloridem zineěnatým
Vzorek | Objat (al) | A1PI (jeda./al) | Celkový A1PI (jeda.) | O.D. 280 na | S.A. (jeda./OD) |
Prostak filtrát | 2200 | 0,0159 | 35 | 0,15 | 0,106 |
NaEDTA resusp. | 264 | 4,305 | 1065 | 13,72 | 0,3138 |
Příklad 4 - referenční
Sacharóza v množství 16,7 % (hmotn.) se přidá k rekonstituovanému NaEDTA roztoku z příkla20 du 3 a výsledná směs se míchá pří teplotě 18 °C až do úplného rozpuštění sacharózy. K tomuto roztoku se přidá polysorbát-80 do konečné koncentrace 1,0 % a tri-n-butylfosfát do konečné koncentrace 0,3 %. Roztok se dále inkubuje při teplotě 27,5 °C po dobu alespoň 6 hodin, aby došlo k deaktivaci možného kontaminujícího lipidem obaleného viru. Po skončení inkubace se roztok ochladí na 5 °C a hodnota pH se upraví na 8,0. Pro kontrolu se výše uvedený postup opakuje bez přidání sacharózy. Stabilita A1PI během působení rozpouštědla-detergentu (SD) v přítomnosti 16,7% sacharózy a bez sacharózy (kontrolní pokus) je vyjádřena v následující tabulce 4.
Tabulka 4
Stabilita A1PI během úpravy pomocí rozpouštědla-detergentu v přítomnosti sacharózy
Vzorek | Obj«> (al) | A1PI (jeda./al) | Celkový X1PI (jodn.) | % A1PI z NaEDTA |
SD-A1PI | 311 | 3,35 | 1042 | 97,8 |
Kontrola | 293 | 2,13 | 624 | 58,6 |
-7CZ 301332 B6
Příklad 5 - referenční
K získanému SD AI Pl roztoku z příkladu 4 se přidá 311 g destilované vody, aby se snížila iontová síla před nanesením na QAE kolonu. Roztok se nanese na 300 ml předem ekvilibrované QAE kolony pro výměnu iontů s průtokem 12 ml/min. Kolona se promyje s použitím 6 ml solného fosfátového pufru (20mM NaCl, 20mM NaH2PO4, pH 8,0). Dále se A1P1 eluuje pomocí 1,8 1 solného fosfátového pufru (lOOmM chlorid sodný 20mM NaH2PO4, pH 8,0).
lontoměničové médium se postupně promyje: 2M NaCl, 20mM NaH2PO4, pH 8,0, 500mM ío NaOH a destilovanou vodou. Chromatografické médium se uchovává v 2M roztoku chloridu sodného, 20mM NaH2PO4, pH 8,0. Spojené frakce s obsahem AI Pl se testují a výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 5.
Tabulka 5
QAE-iontová chromatografíe
Vzorek | Objea (Bl) | JklPI (jedn./al) | Celkový A1PI (jeda.) | O.D. 280 na | S.A. (jedn./OD) |
Eluát | 1500 | 0,62 | 930 | 0,58 | 1,058 |
Příklad 6 - provedení způsobu podle tohoto vynálezu
Ke spojenému eluátu z příkladu 5 se přidají 3,0 g depyrogenovaného bentonitu a vzniklá směs se 25 míchá jednu hodinu při 20 °C. Bentonit se odstraní filtrací (Cuno). Filtrát se zahustí ultrafiltrací.
Koncentrát se filtruje (Plánová) a dále se sterilně filtruje v sériích. Filtrát se rozdělí do lékovek a lyofílizuje se za účelem skladování. Všechny procesní vzorky byly testovány a výsledky jsou shrnuty v tabulce 6.
Tabulka 6
Vzorek | Objem (ml) | A1PI (j»dn./ml) | Celkový A1PI (jeda.) | O. D. 280 na | S. A. (jedn./OD) |
Filtrát (Cuno) | 1710 | 0,52 | 885 | 0,385 | 1,351 |
Koncentrát | 75 | 11,6 | 870 | 8,092 | 1,434 |
Konečný vzorek | 92 | 0,4 | 865 | 6,225 | 1,510 |
-8CZ 301332 B6
Vynález není jakkoli omezen na popsané konkrétní příklady provedení. Odborníkovi je zřejmé, že ve výše popsaných výhodných provedeních lze provést změny materiálů, stupňů a procesních parametrů, aniž by došlo k vybočení z rozsahu tohoto vynálezu. V souladu s tím není rozsah předmětného vynálezu omezen na výše popsané příklady. Naopak, rozsah vynálezu je definován následujícími patentovými nároky.
Claims (3)
10 PATENTOVÉ NÁROKY
1. Způsob odstranění apolipoproteinu z proteinového roztoku, vyznačující se tím, že zahrnuje:
- přidání bentonitu k uvedenému proteinovému roztoku;
- kontaktování bentonitu s proteinovým roztokem po dobu alespoň jedné hodiny; a
- odstranění bentonitu z uvedeného proteinového roztoku.
20
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že bentonit se do uvedeného proteinového roztoku přidává v množství od 0,1 do 1,0 % hmotn.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství apolipoproteinu A a apolipoproteinu B zbývající v proteinovém roztoku po odstranění bentonitu je v obou případech
25 nižší než 0,01 mg/ml.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/673,064 US5616693A (en) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ301332B6 true CZ301332B6 (cs) | 2010-01-20 |
Family
ID=24701177
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20070842A CZ302102B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob zvýšení výtežku jednotek proteinu v proteinovém roztoku podrobeném deaktivaci viru pomocí pridání rozpouštedla-detergentu |
CZ0435698A CZ300452B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob cištení inhibitoru alfa-1-proteinasy |
CZ20070841A CZ301332B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20070842A CZ302102B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob zvýšení výtežku jednotek proteinu v proteinovém roztoku podrobeném deaktivaci viru pomocí pridání rozpouštedla-detergentu |
CZ0435698A CZ300452B6 (cs) | 1996-07-01 | 1997-06-27 | Zpusob cištení inhibitoru alfa-1-proteinasy |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5616693A (cs) |
EP (2) | EP1762576B1 (cs) |
JP (3) | JP4390855B2 (cs) |
KR (1) | KR20000022480A (cs) |
AT (2) | ATE420111T1 (cs) |
AU (1) | AU726233B2 (cs) |
BR (1) | BR9710107B1 (cs) |
CA (2) | CA2259499C (cs) |
CZ (3) | CZ302102B6 (cs) |
DE (2) | DE69739212D1 (cs) |
DK (2) | DK1762576T3 (cs) |
ES (2) | ES2281104T3 (cs) |
IL (1) | IL127774A (cs) |
PL (3) | PL188830B1 (cs) |
PT (2) | PT1762576E (cs) |
WO (1) | WO1998000154A1 (cs) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5616693A (en) * | 1996-07-01 | 1997-04-01 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for seperating alpha-1-proteinase inhibitor from COHN IV1 +1V4 paste |
AU3731400A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-21 | Trustees Of University Technology Corporation, The | Methods and compositions useful in inhibiting apoptosis |
US6489308B1 (en) | 1999-03-05 | 2002-12-03 | Trustees Of University Of Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric-oxide-induced clinical conditions |
WO2000051625A1 (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-08 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of herpes viruses |
US6849605B1 (en) * | 1999-03-05 | 2005-02-01 | The Trustees Of University Technology Corporation | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of viral infections |
US6462180B1 (en) | 1999-11-24 | 2002-10-08 | Bayer Corporation | Method of preparing α-1 proteinase inhibitor |
NZ526940A (en) | 2000-12-14 | 2005-06-24 | Bayer Healthcare Llc | Method of preparing alpha-1 proteinase inhibitor |
KR100406870B1 (ko) * | 2001-05-25 | 2003-11-21 | 주식회사 두산 | 침전법을 이용한 계란 난황에서의 유용 수용성 성분의분리방법 및 침전 부산물의 이용 방법 |
EP1417301B1 (en) * | 2001-08-07 | 2006-11-02 | Novozymes A/S | Carbohydrates and polyols for dissolving protein crystals |
DE60325731D1 (en) * | 2002-07-01 | 2009-02-26 | Novozymes As | Monopropylenglykol als fermentationszusatz |
US7777006B2 (en) | 2002-12-31 | 2010-08-17 | Csl Behring L.L.C. | Method for purification of alpha-1-antitrypsin |
US20040220242A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Leland Shapiro | Inhibitors of serine protease activity, methods and compositions for treatment of nitric oxide induced clinical conditions |
PL2520654T3 (pl) | 2003-08-26 | 2017-08-31 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Inhibitory aktywności proteazy serynowej i ich zastosowanie w sposobach i kompozycjach do leczenia zakażeń bakteryjnych |
US7807435B2 (en) * | 2005-08-11 | 2010-10-05 | Baxter International Inc. | Method for the purification of alpha-1 proteinase inhibitor (a1PI) |
GB0524432D0 (en) * | 2005-11-30 | 2006-01-11 | Nhs Blood & Transplant | Method |
US20080124303A1 (en) * | 2005-12-12 | 2008-05-29 | Cavit Sciences, Inc | Methods and compositions for treatment of viral infections |
WO2007112953A1 (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Baxter Internaional Inc. | Process for the purification of recombinant alpha 1-antitrypsin involving a step of anion exchange chromatography |
US8772240B2 (en) | 2006-05-19 | 2014-07-08 | Baxter International Inc. | Ethanol dependence of alpha1 antitrypsin C-terminal lys truncation by basic carboxypeptidases |
CA3012117A1 (en) | 2011-05-27 | 2012-12-06 | Baxalta Incorporated | Fusions of psa with serpins and other therapeutic proteins |
EP3628327A1 (en) | 2011-06-24 | 2020-04-01 | The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
EP2802653A4 (en) | 2012-01-10 | 2015-09-02 | Univ Colorado Regents | ALPHA-1 ANTITRYPSIN FUSION MOLECULE COMPOSITIONS, METHODS AND USES THEREOF |
TWI629283B (zh) | 2012-02-23 | 2018-07-11 | 巴克斯歐塔公司 | 來自血漿中的免疫球蛋白之i-iv-1部分沉澱 |
US9353165B2 (en) | 2012-07-25 | 2016-05-31 | Grifols, S.A. | Purification of cell culture derived alpha1 protease inhibitor |
CA2943938A1 (en) | 2013-03-29 | 2014-10-02 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions and methods for preparing a subject for organ or non-organ implantation |
IL267923B2 (en) | 2018-08-02 | 2023-06-01 | Grifols Worldwide Operations Ltd | The composition containing the most concentrated alpha-1 type protein inhibitor and a method for obtaining it |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4056614A (en) * | 1972-09-22 | 1977-11-01 | Marc Bonneau | Immunity depressant medicine |
JPS6317899A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Green Cross Corp:The | ハプトグロビンの精製方法 |
WO1995035306A1 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating alpha1-proteinase inhibitor from cohn fraction iv1 and iv4 paste |
EP1762576A1 (en) * | 1996-07-01 | 2007-03-14 | Baxter International Inc. | Process for separating alpha-1-proteinase inhibitor from Cohn Fraction IV1+IV4 paste |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2770616A (en) * | 1951-01-29 | 1956-11-13 | Protein Foundation Inc | Fractionation of proteinaceous materials in blood plasma and liver tissue |
US2761808A (en) * | 1952-09-06 | 1956-09-04 | Ortho Pharma Corp | Plasma fractionation process |
JPS52128205A (en) * | 1976-04-16 | 1977-10-27 | Green Cross Corp:The | Prophylactic and therapeutic drugs for cerebro-vascular contraction |
US4439358A (en) * | 1982-06-17 | 1984-03-27 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
US4379087A (en) * | 1982-06-17 | 1983-04-05 | Cutter Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
US4540573A (en) * | 1983-07-14 | 1985-09-10 | New York Blood Center, Inc. | Undenatured virus-free biologically active protein derivatives |
DE3426903A1 (de) * | 1984-07-20 | 1986-01-23 | Biotest Pharma GmbH, 6000 Frankfurt | Eine immunglobulinpraeparation in kombination mit einer anderen pharmakologisch wirksamen praeparation zur verwendung bei der behandlung von krankheiten |
US4684723A (en) * | 1985-09-11 | 1987-08-04 | Miles Laboratories, Inc. | Method of separating proteins from aqueous solutions |
US4697003A (en) * | 1985-11-01 | 1987-09-29 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor |
US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
US4629567A (en) * | 1986-03-07 | 1986-12-16 | Smithkline-Rit | Alpha-1-antiprotease purification |
JPS63132898A (ja) * | 1986-11-26 | 1988-06-04 | Meito Sangyo Kk | 蛋白質の分離精製方法 |
US5093316A (en) * | 1986-12-24 | 1992-03-03 | John Lezdey | Treatment of inflammation |
US4829054A (en) * | 1987-04-13 | 1989-05-09 | Miles Laboratories, Inc. | Method of decreasing lung damage in a host following the onset of gram negative septicemia/endotoxemia |
DE3877041T2 (de) * | 1987-04-27 | 1993-04-22 | Miles Inc | Verfahren zur herstellung von hochgereinigtem alpha-1-proteinase-inhibitor. |
IL86417A (en) * | 1987-05-22 | 1992-09-06 | Armour Pharma | Process for the inactivation of pathogens in biological or pharmaceutical material by mixing with aqueous solution containing a sugar(alcohol)and neutral salts as stabilizers |
US5073487A (en) * | 1989-01-30 | 1991-12-17 | Athens Research And Technology, Inc. | Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor |
FR2672895B1 (fr) * | 1991-02-15 | 1995-05-12 | Transgene Sa | Procede de purification d'une proteine fortement glycosylee. |
US5610285A (en) * | 1994-08-24 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Purification of α-1 proteinase inhibitor using novel chromatographic separation conditions |
-
1996
- 1996-07-01 US US08/673,064 patent/US5616693A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-03-31 US US08/829,223 patent/US5981715A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 EP EP06025342A patent/EP1762576B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 CZ CZ20070842A patent/CZ302102B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 PT PT06025342T patent/PT1762576E/pt unknown
- 1997-06-27 AT AT06025342T patent/ATE420111T1/de active
- 1997-06-27 DK DK06025342T patent/DK1762576T3/da active
- 1997-06-27 DE DE69739212T patent/DE69739212D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 CA CA002259499A patent/CA2259499C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-27 ES ES97932347T patent/ES2281104T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 DE DE69737294T patent/DE69737294T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 CZ CZ0435698A patent/CZ300452B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 JP JP50433698A patent/JP4390855B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 ES ES06025342T patent/ES2320919T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 CZ CZ20070841A patent/CZ301332B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 PT PT97932347T patent/PT944392E/pt unknown
- 1997-06-27 AT AT97932347T patent/ATE352569T1/de active
- 1997-06-27 BR BRPI9710107-9A patent/BR9710107B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 EP EP97932347A patent/EP0944392B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-27 PL PL97330934A patent/PL188830B1/pl unknown
- 1997-06-27 PL PL97363606A patent/PL188873B1/pl unknown
- 1997-06-27 DK DK97932347T patent/DK0944392T3/da active
- 1997-06-27 CA CA002489773A patent/CA2489773A1/en not_active Abandoned
- 1997-06-27 IL IL12777497A patent/IL127774A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-06-27 WO PCT/US1997/011256 patent/WO1998000154A1/en active Application Filing
- 1997-06-27 KR KR1019980710920A patent/KR20000022480A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-06-27 AU AU35831/97A patent/AU726233B2/en not_active Expired
- 1997-06-27 PL PL97363607A patent/PL188874B1/pl unknown
-
2008
- 2008-01-04 JP JP2008000174A patent/JP4588770B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-06-02 JP JP2009133123A patent/JP5245079B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4056614A (en) * | 1972-09-22 | 1977-11-01 | Marc Bonneau | Immunity depressant medicine |
JPS6317899A (ja) * | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Green Cross Corp:The | ハプトグロビンの精製方法 |
WO1995035306A1 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Alpha Therapeutic Corporation | Process for separating alpha1-proteinase inhibitor from cohn fraction iv1 and iv4 paste |
EP1762576A1 (en) * | 1996-07-01 | 2007-03-14 | Baxter International Inc. | Process for separating alpha-1-proteinase inhibitor from Cohn Fraction IV1+IV4 paste |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ301332B6 (cs) | Zpusob odstranení apolipoproteinu z proteinového roztoku | |
JP2008120822A6 (ja) | タンパク質溶液からアポリポタンパク質を除去する方法 | |
US6284874B1 (en) | Process for separating α1-proteinase inhibitor from cohn fraction IV1 and IV4 paste | |
JP4324102B2 (ja) | フィブリノーゲンの調製方法 | |
ZA200601206B (en) | Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution | |
US20150031621A1 (en) | Method for purification of complement factor h | |
CA2538998C (en) | Large scale preparation of alpha-1 proteinase inhibitor and use thereof | |
JP2012140452A (ja) | α−1プロテイナーゼインヒビター(a1PI)を精製するための方法 | |
AU743904B2 (en) | Purification of proteins | |
NO324627B1 (no) | Fremgangsmate ved opprenskning av antitrombin-III | |
MXPA06001112A (en) | Process for preparing an alpha-1-antitrypsin solution |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20170627 |