FI104457B - Proteiinikoostumus ja sen valmistus ja käyttö sekä sitä sisältävät valmisteet ja näiden valmistus - Google Patents

Description

104457

Proteiinikoostumus ja sen valmistus ja käyttö sekä sitä sisältävät valmisteet ja näiden valmistus

Keksinnön kohteena ovat proteiinikoostumus ja sen 5 valmistus ja käyttö sekä sitä sisältävät valmisteet ja näiden valmistus. Erityisesti keksinnön kohteena ovat oleellisesti insuliiniton proteiinikoostumus ja sen valmistus ja käyttö sekä sitä sisältävät valmisteet, kuten oleellisesti insuliinittomat äidinmaidonkorvikkeet ja muut 10 erityisravintovalmisteet, ja näiden valmistus.

Nuoruusiän diabetes eli insuliininpuutoksesta johtuva diabetes mellitus (IDDM) on sairaus, jossa haiman Langerhansin saarekkeiden insuliinia tuottavat beeta-solut ovat tuhoutuneet, mutta saarekkeiden muut solut säilyvät 15 vahingoittumattomina. Kyseinen sairaus puhkeaa yleensä viimeistään lapsuusiässä.

Lukuisista lääketieteellisistä tutkimuksista huolimatta ei vielä tarkasti tiedetä, mitkä tekijät aiheuttavat nuoruusiän diabeteksen puhkeamisen. Tällä hetkellä kuiten-20 kin uskotaan, että lasten riskiin sairastua nuoruusiän diabetekseen vaikuttavat sekä perintötekijät että ympäris-. , tötekijät, kuten ravinto.

Useissa epidemiologisissa tutkimuksissa on mm. to- « « : " dettu, että altistuminen lehmänmaidon proteiineille ime- 25 väisaikana lisää riskiä sairastua nuoruusiän diabetekseen *:"·· (Gerstein, Diabetes Care 17 (1994) 13 - 19) . Epidemiolo- • · • gisten havaintojen perusteella on esitetty useita hypo-teesejä mekanismeista, miten lehmän maidon proteiinit voisivat toimia diabetogeenisinä tekijöinä. On todettu, että 30 immuunivaste naudan seerumialbumiinia (Karjalainen et ai., • · · N. Engl. J. Med. 327 (1992) 302-307), beeta-laktoglobulii-nia (Vaarala et ai., Diabetes 45 (1996) 178-182) tai bee- * · 'V'i ta-kaseiinia (Cavallo et ai., Lancet 348 (1996) 926-28) kohtaan voisi johtaa beeta-solureaktiivisuuteen, mutta 3 5 tähän mennessä naudan insuliinin ei ole edes epäilty ole- · van diabetogeeninen riskitekijä.

• · 2 104457

Lehmänraaidon tiedetään normaalisti sisältävän pieniä määriä naudan insuliinia. Kirjallisuudessa ilmoitettu maidon insuliinipitoisuus vaihtelee määritysmenetelmästä riippuen, mutta esimerkiksi ELISA-menetelmällä on todettu 5 noin 50 ng/ml pitoisuuksia. Maidon insuliinipitoisuus on suurimmillaan (noin 330 ng/ml) heti poikimisen jälkeen, minkä jälkeen pitoisuus alenee saavuttaen vakiotason (noin 46 ng/ml) noin 7 päivän kuluttua poikimisesta (Aranda et ai., J. Dairy Sei. 74 (12) (1991) 4320 - 4325).

10 Hakija on tutkimuksissaan todennut, että tavanomai sen lehmänmaitopohjaisen äidinmaidonkorvikkeen antaminen imeväisikäisille saa aikaan vasta-aineiden, kuten insu-liinivasta-aineiden, tuotannon naudan insuliinia kohtaan. Tavanomaista lehmänmaitopohjaista äidinmaidonkorviketta 15 (Enfamil ) lisäruokintana saaneiden 6 kuukauden ikäisten lasten ja toisaalta yksinomaan rintamaitoa saaneiden samanikäisten lasten IgG-luokan vasta-ainepitoisuudet naudan insuliinia kohtaan on esitetty kuvassa 1. Nämä vasta-aineet ristireagoivat humaani-insuliinin kanssa.

20 Koska insuliiniautovasta-aineiden (IAA):n esiinty minen edeltää ja ennustaa IDDM:n puhkeamista, immunisoitu-, , minen naudan insuliinille lehmänmaitopohjaisista tuotteis- ' ' ta voi olla haitallista ja lisätä riskiä sairastua IDDM: - " ään. Tästä syystä on tarve saada markkinoille lehmänmaito- :,v 25 tuotteita ja lehmänmaitopohjaisia tuotteita, jotka eivät '·"· sisällä immunoreaktiivista naudan insuliinia.

Insuliinin puhdistuksessa tuotanto- ja uuttoliuok-sista on perinteisesti käytetty nestekromatograf iaa ja • käänteisfaasikolonnia (Kroeff et ai., J. Chromatogr. 461 30 (1989) 45 - 61; Poli et ai., J. Chromatogr. 539 (1991) 37 • · « - 45; Cox, J. Chromatogr. 599 (1992) 195 - 203; Welinder, \ J. Chromatogr. 542 (1991) 83 - 99), geelisuodatus- tai anioninvaihtokolonnia (WO 90/00176 ja WO 90/00177) tai heikkoa kationinvaihtokolonnia (DE 3511270 AI ja GB 35 2173503 A) . Käänteisf aasi - tai geelisuodatuskromatograf ia « · 1 • · 1 · 104457 3 eivät sellaisenaan sovi maidon käsittelyyn, koska käsitellyn maidon tulisi olla elintarvikekelpoista ja kohtuullisen hintaista.

Missään hakijan tuntemassa tunnettuun tekniikkaan 5 kuuluvassa julkaisussa ei kuitenkaan ole esitetty eikä edes ehdotettu lehmänmaidossa läsnäolevan naudan insuliinin eristämistä tai poistamista.

Hakija on nyt keksinyt, miten lehmänmaidosta saadaan kohtuullisin kustannuksin elintarvikekelpoinen prote-10 iinikoostumus, joka on oleellisesti naudaninsuliiniton ja joka sellaisenaan sopii erityisesti äidinmaidonkorvikkeen, mutta myös muiden erityisravintovalmisteiden proteiini-osaksi .

Keksinnön kohteena on siten oleellisesti insu-15 liiniton proteiinikoostumus, joka on käyttökelpoinen eri- tyisravintovalmisteen proteiiniosana tai kulutusmaidon raaka-aineena ja jolle on tunnusomaista, että se on lehmänmaidosta peräisin oleva rasvaton proteiinipitoinen materiaali, kuten hera, rasvaton maito tai kaseiiniliuos, 20 josta naudan insuliini on oleellisesti poistettu.

Kun maidosta poistetaan rasva ja kaseiini, saadaan . , hera, joka sisältää heraproteiinit. Maidon kokonaisprote- iinista noin 20 prosenttia on heraproteiineja ja loput • " kaseiinia. Juustonvalmistuksen yhteydessä saatavaa heraa '.'.’25 kutsutaan juustoheraksi ja kaseiininvalmistuksen yhteydes- *:**· sä saatavaa heraa puolestaan kutsutaan kaseiiniheraksi.

: Keksinnössä käytettävä hera voi olla mikä tahansa lehmänmaidosta peräisin oleva hera, kuten esimerkiksi • juustohera, juoksetekaseiinihera, happokaseiinihera tai 30 hapan juustohera. Edullisesti hera on juustohera.

• * ·

Heran lisäksi keksinnössä voidaan käyttää lehmän- • · φ maidosta peräisin olevana rasvattomana proteiinipitoisena c i materiaalina rasvatonta maitoa tai rasvattomasta maito- '!"! jauheesta tehtyä vesiliuosta tai maidon kaseiinista tehtyä 35 vesiliuosta, ts. kaseiiniliuosta.

I · « « « * « • · · 4 104457

Keksinnön mukainen oleellisesti insuliiniton prote-iinikoostumus voidaan sopivasti valmistaa keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että 5 a) lehmänmaidosta peräisin oleva nestemäinen rasva ton proteiinipitoinen materiaali johdetaan insuliininpois-tokäsittelyyn, jolloin se ensin mahdollisesti kirkastetaan ja sen jälkeen johdetaan pH-arvon ollessa 5,2 - 5,6, 10 Na+ - tai K+-muotoon regeneroidulla vahvalla kationinvaihto- hartsilla täytetyn pylvään läpi, b) vaiheessa a) saatu nestemäinen proteiinipitoinen materiaali konsentroidaan ultra- ja diasuodattamalla käyttäen 15 kalvoja, jotka ovat 6 000 - 20 000 D cut-off -kalvoja, saatu proteiinikonsentraatti haihdutetaan ja mahdollisesti kuivataan proteiinijauheeksi, c) mahdollisesti 1) vaiheessa b) saadusta proteiinikonsentraatista 20 tai proteiinijauheesta muodostetaan veteen liuos, jonka proteiinipitoisuus on 1 - 20 %, 2) vaiheessa cl) saatu proteiiniliuos hydrolysoi- i i daan entsymaattisesti proteaaseilla ja • 3) vaiheessa c2) hydrolysoitu proteiiniliuos ult- :Y:25 rasuodatetaan, ja d) mahdollisesti johdetaan vaiheessa c) saatu pro- ;·. teiinihydrolysaatti hydrofobiseen kromatografiakäsittelyyn • · · ··· ja • · · e) vaiheessa c) tai d) saatu liuos haihdutetaan ja 30 kuivataan jauheeksi.

i · « *·* ’ Vaiheessa a) lehmänmaidosta peräisin oleva neste- *.* · mäinen rasvaton proteiinipitoinen materiaali johdetaan « « « « * «ti insuliininpoistokäsittelyyn, jolloin oleellisesti kaikki tai ainakin merkittävä osa kyseisessä materiaalissa ole- > 35 vasta naudan insuliinista saadaan poistettua. Insuliinin- 104457 5 poistossa kyseistä lehmänmaidosta peräisin olevaa nestemäistä materiaalia käsitellään vahvalla kationin-vaihtohartsilla. Lisäksi se voidaan kirkastaa esimerkiksi mikrosuodattamalla tai sentrifugoimalla. Hera voidaan täs-5 sä vaiheessa kirkastaa myös ultrasuodattamalla.

Parhaat insuliininpoistotulokset saadaan kuitenkin silloin kun puhdistettava materiaali ensin kirkastetaan edellä mainitulla tavalla ja sen jälkeen sitä käsitellään vahvalla kationinvaihtohartsilla.

10 Hera, kuten juusto- tai kaseiinihera on edullisinta puhdistaa naudan insuliinista vahvalla kationinvaihtohartsilla. Sopivia kationinvaihtohartseja ovat esimerkiksi Amberlite C-20 (Rohm & Haas, Ranska) ja Spherosil S (Rhone -Poulenc, Ranska). Puhdistettava hera, jonka pH on las-15 kettu arvoon 5,2 - 5,6 elintarvikelaatuisella hapolla, esimerkiksi HCl:lla, tai ioninvaihdolla, johdetaan 3-65 °C:ssa sopivasti huoneenlämpötilassa Na+- tai K+-muotoon regeneroidulla vahvalla kationinvaihtohartsilla täytetyn pylvään läpi. Panosprosessissa syöttönopeus ja -tilavuus 20 voivat vaihdella, mutta sopivasti syöttönopeus on 1 - 10 pylvääntilavuutta (BV) / h ja syöttötilavuus on 5 - 60 BV, . . edullisesti 20 BV. pH-alueella 5,2 - 5,6 heran proteiinit : ovat yleensä negatiivisesti varautuneita, mutta insuliini : " on positiivisesti varautunut, sillä sen isoelektrinen pis- ' 25 te on 5,6 (Erkama, Biokemia, s. 185). Tällöin ainakin oleellinen osa herassa olevasta naudan insuliinista sitou- • · j tuu kationinvaihtohartsiin negatiivisesti varautuneiden heraproteiinien mennessä pylvään läpi.

Edullisesti hera puhdistetaan naudan insuliinista 30 vahvalla kationinvaihtohartsilla pH:ssa 5,4.

• · » .·... Vahvalla kationinvaihtohartsilla puhdistetussa he- • · · rassa ei todettu lainkaan naudan insuliinia electro spray -massaspektrometrillä.

Myös rasvattoman lehmänmaidon ja maidon kaseiinista 35 tehdyn vesiliuoksen, ts. kaseiiniliuoksen naudaninsu- « 4 104457 6 liinipitoisuutta voidaan alentaa merkittävästi vastaavalla käsittelyllä vahvalla kationinvaihtohartsilla. Tällöin kaseiiniliuoksen insuliinipitoisuus alenee ainakin noin 65 % ja rasvattoman maidon insuliinipitoisuus puolestaan ale-5 nee ainakin noin 40 %.

Insuliini analysoitiin näytteistä electro spray -massaspektrometrillä (VG Quattro II, VG BioTech, Altrincham, Englanti) käyttäen esikäsittelynä fraktiointia nes-tekromatografin (Hewlett Packard HPLC 1090, Hewlett 10 Packard Co. Saksa) C18-käänteisfaasikolonnilla (eluentit: A: 0,05 % trifluorietikkahappo (TFA) vedessä, B: asetonit-riili (Acn) + 0,05 % TFA, gradientti: 15 % -> 40 % 20 min:ssa, 40 % -> 100 % 10 minrssa). Insuliinia sisältävä fraktio pakkaskuivattiin, liuotettiin uudelleen konsent-15 roiduksi liuokseksi ja johdettiin massaspektrometriin.

Heraa voidaan puhdistaa naudan insuliinista kirkastamalla hera esimerkiksi mikrosuodattamalla, ultrasuodat-tamalla tai sentrifugoimalla, jolloin herasta saadaan pois jäännöskaseiini ja muut suurimolekyyliset proteiinit, joi-20 hin insuliini hydrofobisena proteiinina on sitoutunut.

Mikrosuodatuksessa puhdistettava hera johdetaan , , sopivasti 10 - 60 °C:ssa mikrosuodatuskalvojen läpi, jotka I; : kalvot ovat 0,05 - 1,4 mikrometrin kalvoja, edullisesti : 0,1 mikrometrin kalvoja.

'.','25 Ultrasuodatuksessa puhdistettava hera puolestaan "’*· käsitellään ultrasuodatuskalvoilla, jotka edullisesti ovat : kalvoja, joiden cut-off -arvo on 50 000 - 200 000 Dalto- :":'l nia.

Sentrifugoinnissa heraa käsitellään edullisesti 30 nopeudella 1 000 - 10 000 kierrosta / min.

• ti #·.·# Kirkastuskäsittely alentaa heran naudaninsuliinipi- * « φ toisuutta 6 - 10 %.

Kirkastuskäsittely ja kationinvaihtohartsikäsittely alentavat molemmat käsiteltävän, lehmänmaidosta peräisin 35 olevan materiaalin naudan insuliinipitoisuutta, mutta par-

I · I

7 104457 haat tulokset saadaan kun kyseinen materiaali ensin kirkastetaan ja sen jälkeen johdetaan kationinvaihtohartsikä-sittelyyn. Parhaat tulokset saadaan heran käsittelyssä, jolloin edullisin kirkastusmenettely on mikrosuodatus.

5 Vaiheessa a) naudan insuliinista puhdistettu prote- iinipitoinen materiaali, edullisesti hera konsentroidaan ultra- ja diasuodatuksella riittävän proteiinipitoisuuden aikaansaamiseksi, minkä jälkeen näin saatu proteiinikon-sentraatti haihdutetaan ja mahdollisesti kuivataan prote-10 iinijauheeksi. Tällöin naudan insuliinista ainakin merkit tävästi puhdistettu materiaali, kuten hera, jonka materiaalin pH on säädetty arvoon noin 6,5 elintarvikelaatuisel-la emäksellä, esimerkiksi NaOH:lla tai Ca(OH)2:lla, tai ioninvaihdolla, johdetaan ultra- ja diasuodatukseen, jol-15 loin puoliläpäisevän kalvon avulla suurempimolekyyliset proteiinit saadaan eroon laktoosista, suoloista ja pienem-pimolekyylisistä proteiineista, kuten insuliinista, jonka molekyylipaino on noin 5734 D. Puoliläpäisevän kalvon cutoff -arvo on sopivasti 6 000 - 20 000 D, edullisesti 20 10 000 D ja puoliläpäisevänä kalvona voidaan käyttää esi merkiksi polyeetterisulfonikalvoa, jonka cut-off -arvo on 10 000 D.

Vaiheessa a) saatu hera voidaan konsentroida koko-naiskonsentrointisuhteella, joka sopivasti on noin 120. 25 Tällöin vaiheessa a) käsitelty hera ultrasuodatetaan edul- lisesti 10 000 D cut off -kalvoilla ensin esimerkiksi kon-sentrointisuhteella 10, minkä jälkeen retentaatti laimen-:*·*; netaan lähtötilavuuteen ja suodatetaan uudelleen suhteella 12, jolloin kokonaiskonsentrointisuhteeksi tulee 120. Näin 30 saatu heraproteiinikonsentraatti, jonka proteiinipitoisuus • · * on noin 90 % kuiva-aineesta, haihdutetaan ja kuivataan • · · “* • · · *. jauheeksi esimerkiksi sumutuskuivauksella tai pakkas- kuivauksella.

Perinteisesti ultra- ja diasuodatettu heraprote-35 iinijauhe, jonka proteiinipitoisuus on 70 - 80 %, sisältää •« · 8 104457 43 - 48 mikrogrammaa insuliinia / gramma jauhetta (noin 60 mikrogrammaa insuliinia / gramma proteiinia).

Sitä vastoin keksinnön mukaisen menetelmän vaiheiden a) ja b) mukaisesti saatu heraproteiinijauhe sisältää 5 merkittävästi vähemmin naudan insuliinia kuin edellä mai nittu perinteisesti ultra- ja diasuodatettu heraproteiini jauhe. Vahvalla kationinvaihtohartsilla vaiheessa a) naudan insuliinista puhdistetusta herasta valmistetussa heraproteiinijauheessa ei todettu lainkaan naudan insulii-10 nia electro spray -massaspektrometrillä. Näin saatu oleel lisesti insuliiniton proteiinikoostumus sopii sellaisenaankin esimerkiksi äidinmaidonkorvikkeiden ja muiden erityisravintovalmisteiden raaka-aineeksi, koska sen sisältämä heraproteiini on ravitsemuksellisesti erittäin 15 korkealaatuista eikä tarvitse muita proteiineja ravin- tosisällyksen täydentämiseksi.

Kationinvaihtohartsikäsittely voidaan tehdä myös esimerkiksi rasvattomalle maidolle tai vesiliuoksena olevalle maidon kaseiinille, joka on edullinen proteiinival-20 miste. Naudaninsuliinijäämä voidaan poistaa kaseiiniliuok- sesta vastaavalla tavalla kuin maidosta. Heraproteiinia heikomman ravintoarvonsa vuoksi kaseiini ei kuitenkaan ole yhtä suositeltavaa äidinmaidonkorvikkeen yksinomaiseksi proteiinilähteeksi kuin heraproteiini.

25 Mikäli keksinnön mukaisen proteiinikoostumuksen naudaninsuliinipitoisuutta halutaan vielä alentaa, voidaan sen valmistukseen liittää entsymaattinen hydrolyysi ja :*·*: mahdollisesti vielä hydrofobinen kromatografiakäsittely.

Tällöin vaiheessa b) saadusta proteiinikonsentraatista tai 30 proteiinijauheesta muodostetaan veteen liuos, jonka pitoi- • · · suus on 1 - 20 %, edullisesti noin 5 %. Liuoksen pH sääde-• · · 1 * • · · tään arvoon noin 8,5 esimerkiksi Ca(OH)2:lla ja lämpötila noin arvoon 50 °C, minkä jälkeen liuokseen lisätään eläin-tai mikrobiperäisiä entsyymejä, siten, että ne hydrolysoi-3 5 vat tehokkaasti erityisesti naudan insuliinin prote- « « < * « 9 104457 iiniketjun sidoksia. Tällaisia proteaaseja ovat mm. kymot-rypsiini, subtilisiini Carlsberg -seriiniproteaasi, subti-lisiini BPN' -seriiniproteaasi, Aspergillus oryzean serii-ni- ja metalloproteaasit, papaiini, Bacillus subtilis 5 -neutraaliproteaasi, termolysiini, Streptomyces griseuksen seriini- ja metalloproteaasit, pepsiini, Endothica pa-rasitican hapanproteaasi ja pankreatiini. Hydrolyysin annetaan jatkua 8 tunnin ajan. Hydrolyysissä naudan insuliini pilkkoutuu korkeintaan viiden aminohapon pituisiksi 10 peptideiksi, jotka eivät aiheuta immuunivastetta eivätkä sisällä aiemman insuliinimolekyylin sisältämiä epitooppe-ja. Näin saatu hydrolyysiseos johdetaan pilkkoutumattomien suurikokoisten molekyylien poistamiseksi ultrasuodatukseen tiheän ultrasuodatuskalvon läpi, joka sopivasti on 2 000 D 15 cut-off -kalvo. Saatu permeaatti kuivataan esimerkiksi sumutuskuivauksella jauheeksi. Saadussa tuotteessa ei ole todettavissa naudan insuliinia.

Jos naudan insuliinin hydrolyysituotteet halutaan poistaa seoksesta mahdollisimman tarkasti, voidaan edellä 20 saatu heraproteiinihydrolysaatti johtaa sopivasti 10 % liuoksena hydrofobiseen kromatografiakäsittelyyn, joka poistaa hydrolysaatista hydrofobiset peptidit ja niiden mukana mahdolliset naudan insuliinin hydrolyysituotteet.

; ' Kyseinen hydrofobinen kromatografiakäsittely voi-

I I

: : 25 daan tehdä sopivasti hydrofobisella adsorptiohartsilla, ·:··; kuten Amberlite XAD-16 -hartsilla (Rohm St Haas, Ranska) , • mutta se voidaan tehdä myös aktiivihiilellä, joka myös • pystyy poistamaan hydrofobisia yhdisteitä. Tuotantomitta- • · · kaavassa kyseinen kromatografiakäsittely voidaan tehdä ... 30 käytännöllisesti pylväässä, jonne pakatun adsorptiohartsin • · · ·]/ tai aktiivihiilen läpi käsiteltävä liuos johdetaan. Pyi- • · · ’·[ ’ vään läpi tullut liuos otetaan talteen, haihdutetaan ja kuivataan jauheeksi. Näin saatu jauhe ei sisällä nyky-·:··;' menetelmillä havaittavia määriä naudan insuliinia. Tuot- ‘.35 teen aminohappokoostumus on kuitenkin muuttunut jonkin • · • · 104457 10 verran hydrofobisten aminohappojen kohdalla, joten pieni määrä fenyylialaniinia ja tyrosiinia joudutaan lisäämään ravintovalmisteiden valmistuksen yhteydessä.

Edullisimmin naudan insuliini poistetaan lehmän-5 maidosta peräisin olevasta rasvattomasta proteiinipitoi- sesta materiaalista, edullisesti herasta vahvalla ka-tioninvaihtohartsilla, minkä jälkeen näin käsitelty nestemäinen proteiinipitoinen materiaali konsentroidaan ultra-ja diasuodatuksella. Mikrosuodatus esikäsittelynä on edul-10 lista, koska insuliini on usein tarttuneena makromolekyy- leihin, kuten kaseiinipölyyn tai denaturoituneeseen hera-proteiiniin, jotka voidaan poistaa sopivasti mikrosuoda-tuksen avulla. Mikäli em, menetelmillä ei ole saavutettu tuotteen riittävän alhaista naudaninsuliinipitoisuutta, 15 sitä on mahdollista alentaa edelleen entsymaattisen hydro- lyysin ja siihen mahdollisesti liitettävän hydrofobisen kromatografiän avulla.

Äidinmaidonkorvikkeet koostetaan perinteisesti maidosta, kermasta, kasviöljystä, vähäsuolaisesta hera-20 jauheesta, kivennäisistä ja vitamiineista, joista maito, kerma ja vähäsuolainen herajauhe sisältävät naudan insuliinia. Heraproteiini on ravintoarvoltaan hyvin kor- I; kealuokkaista, joten se soveltuu ainoaksi proteiiniläh- : " teeksi äidinmaidonkorvikkeeseen ja muihinkin erityisravin- V,' 25 tovalmisteisiin.

"**ί Keksinnön mukaista oleellisesti insuliinitonta pro- teiinikoostumusta voidaan käyttää äidinmaidonkorvikkeen ja muidenkin erityisravintovalmisteiden proteiiniosana sekä esimerkiksi kulutusmaidon raaka-aineena. Tällöin saadaan 30 valmiste, joka ei sisällä naudan insuliinia, joten se ei • · · myöskään aiheuta immunisoitumista naudan insuliinille eikä • · · *. siten lisää riskiä sairastua IDDM:ään.

·'/«· Keksinnön kohteena on myös oleellisesti insu- liiniton äidinmaidonkorvike samoin kuin oleellisesti insu-35 liiniton erityisravintovalmiste, joille on tunnusomaista, « * « 104457 11 että niiden proteiiniosa on lehmänmaidosta peräisin oleva rasvaton proteiinipitoinen materiaali, kuten hera, rasvaton maito tai kaseiiniliuos, edullisesti hera, josta naudan insuliini on oleellisesti poistettu.

5 Keksinnön mukaiselle menetelmälle oleellisesti in- suliinittoman äidinmaidonkorvikkeen tai jonkin muun eri-tyisravintovalmisteen tai kulutusmaidon tai sen raaka-aineen valmistamiseksi on puolestaan tunnusomaista, että tuotteen valmistuksessa proteiiniosana käytetään keksinnön 10 mukaista tai keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet tua oleellisesti insuliinitonta proteiinikoostumusta.

Keksintöä kuvataan lähemmin seuraavissa esimerkeissä .

Esimerkki 1 15 6000 ml:n tuoretta juustoheraa pH laskettiin 10 % HCltlla 5,4:ään. 300 ml vahvaa kationinvaihtohartsia (Am- berlite C-20, Rohm & Haas, Ranska) pakattiin 300 ml:n la- boratoriomitan pylvääseen ja regeneroitiin 600 ml:11a 17 %

NaCl:a, jonka jälkeen pylväs huuhdottiin 1000 ml :11a vet- 20 tä. Pylvään läpi ajettiin huoneenlämmössä 6000 ml juusto- heraa (20 pylvääntilavuutta (BV)) nopeudella 6 BV/h. Ennen käsittelyä hera sisälsi 343 ng/ml insuliinia eli 68 mg ‘ insuliinia/kg todellista proteiinia, käsittelyn jälkeen : " herasta ei todettu lainkaan insuliinia eli pitoisuus aleni « « ‘.’.‘25 käsittelyssä 100 %. Heran kokonaisproteiinipitoisuus ei *·*“ muuttunut merkittävästi käsittelyssä. Ennen käsittelyä • · j proteiinipitoisuus oli 0,87 %, käsittelyn jälkeen 0,86 %.

pH nostettiin 10 % NaOH:lla uudestaan 6,5:een, jonka jäi-keen hera ultrasuodatettiin 10 000 D cut-off -kalvoilla 30 ensin konsentrointisuhteella 10, sitten retentaatti lai- • · · mennetaan lähtötilavuuteen ja suodatetaan uudelleen suh- • « i • · · teella 12, jolloin kokonaiskonsentrointisuhteeksi tulee t · 120. Proteiinikonsentraatti pakkaskuivattiin 90 % proteii- nia sisältäväksi jauheeksi.

35 « · I I « I « < « 12 104457

Esimerkki 2 100 litraa 0,1 μιτι mikrosuodatuskalvojen läpi suodatettua juustoheraa ultrasuodatetaan 10 000 D cut-off -kalvoilla ensin konsentrointisuhteella 10, sitten reten-5 taatti laimennetaan lähtötilavuuteen ja suodatetaan uudel leen suhteella 12, jolloin kokonaiskonsentrointisuhteeksi tulee 120. Retentaatti sisälsi proteiinia 90 % kuiva-aineesta ja se sumutuskuivattiin jauheeksi (kuivauslämmöt 180/75 °C) . Käsittelemätön juustohera sisälsi insuliinia 10 electro spray -massaspektrometrianalyysin mukaan 343 ng/ml eli 68 mg/kg todellista proteiinia. Mikrosuodatettu hera sisälsi insuliinia 324 ng/ml eli 64 mg/kg todellista proteiinia. Ultra- ja diasuodatetussa heraproteiinikonsent-raatissa insuliinipitoisuus oli 21 mg/kg todellista prote-15 iinia massaspektrometrin mukaan eli pitoisuus aleni prote iiniin suhteutettuna n. 69 %. Perinteinen 70 - 80 % proteiinia sisältävä ultrasuodatettu heraproteiinijauhe sisältää insuliinia n. 60 mg/kg todellista proteiinia.

Esimerkki 3 20 100 litraa happokaseiinin valmistuksesta saatua happoheraa mikrosuodatettiin vastaavasti 0,1 μιη:η kalvojen , , läpi. Heran pH oli 4,5. Mikrosuodatettu hera ultra- ja

t 1 I

' ' diasuodatettiin vastaavasti kuin esimerkissä 1 siten, että i « r • · • " kokonaiskonsentrointisuhteeksi tuli 120. Proteiinipitoi- \\:25 suus oli tällöin noin 90 % kuiva-aineesta. Käsittelemätön *·’1· hera sisälsi insuliinia 320 ng/ml eli 48 mg/kg todellista : proteiinia, mikrosuodatettu 295 ng/ml eli 45 mg/kg todel- lista proteiinia ja ultra- ja diasuodatetussa heraprote-iinikonsentraatissa insuliinia oli 95 ng/ml eli 16 mg/kg 30 todellista proteiinia massaspektrometrin mukaan määritet- • · ♦ tynä. Siten insuliinipitoisuus aleni käsittelyssä n. 67 %.

• · ·

Esimerkki 4 • · 60 litraan 50-asteista vettä liuotettiin 5,040 kg esimerkissä 1 valmistettua heraproteiinijauhetta, 11,423 35 kg kasvirasvaseosta, 11,232 kg glukoosia, 12,260 kg malto- • · • · 13 104457 dekstriiniä (DE 21) , 135 g vitamiini- ja mineraaliesiseos-ta (sisältää A-, D-, E-, K-, Bl-, B2-, B6-, B12-vita- miinit, niasiinin, foolihapon, pantoteenihapon, biotiinin, askorbiinihapon, koliinin, inositolin, ferroglukonaatin, 5 sinkkisulfaatin, mangaanisulfaatin, natriumseleniitin, kupariglukonaatin) sekä 70 g kalsiumkloridia, 300 g kal-siumfosfaattia, 65 g magnesiumsulfaattia, 125 g natrium-kloridia ja 620 g kaliumsitraattia. Seoksen kuiva-ainepitoisuus oli n. 40 %. Näin saatu seos johdettiin homo-10 genisaattoriin (150/50 bar) ja kuivattiin jauheeksi sumu- tuskuivaimella, jossa kuivauslämmöt olivat 180/75 °C, lei-jupedillä 70/120/30 °C. Tuote oli koostumukseltaan, ulkonäöltään ja maultaan tavallisen äidinmaidonkorvike-jauheen kaltaista.

15 Esimerkki 5

Esimerkissä 1 esitetty heraproteiinikonsentraatti laimennettiin 5 % pitoisuuteen vedellä. Liuos pastöroitiin 65 °C:ssa 20 min ajan ja jäähdytettiin 50 °C:een. pH säädettiin 8,5:een 10 % Ca(OH)2:lla. Seokseen lisättiin 6 % 20 proteiinin määrästä pankreatiini (4 x USP, SPL, USA) - ja

Alcalase 0,6 L -entsyymejä (Novo Industri A/S; Tanska). Hydrolyysin aikana seoksen pH:ta pidettiin 7,0:ssa '· ' Ca (OH) 2-lisäysten avulla. Seoksen annettiin hydrolysoitua . " 8 tunnin ajan, jonka jälkeen seos lämpökäsiteltiin 5 min « · \:,:25 90 °C:ssa. Tämän jälkeen seos jäähdytettiin 50 °C:een ja *i**i ultrasuodatettiin 2000 D cut-off -kalvoilla ja permeaatti kerättiin talteen. Saatu permeaatti sumutuskuivattiin jau-heeksi. Hydrolysaatista ei ollut todettavissa insuliinia. Esimerkki 6 30 Esimerkissä 5 saatu hydrolysaatti liuotettiin 10 % « · « liuokseksi. 30 ml Amberlite XAD-16 -hartsia (Rohm & Haas) • · · • » ® *. pakattiin laboratoriomittakaavaiseen pylvääseen, joka re- • « generoitiin 60 ml :11a 4 % NaOH, huuhdeltiin 1000 ml :11a :**: vettä ja regeneroitiin 60 ml :11a 4 % HCl:a ja huuhdeltiin j 35 vedellä kunnes läpitulleen veden pH oli yli 5. Hydro- • · 1 il « • « 104457 14 lysaattiliuosta ajettiin 1700 ml hartsipylvään läpi, mikä vastasi 567 g hydrolysaattikuiva-ainetta/100 ml hartsia. Läpitullut liuos otettiin talteen ja pakkaskuivattiin jauheeksi. Hydrolysaatista ei ollut todettavissa insuliinia.

5 Hydrolysaatti käytettiin maitoallergikoille tarkoitetun erityisravintovalmisteen yksinomaisena proteiinilähteenä.

Esimerkki 7 60 litraan 50-asteista vettä liuotettiin 8,670 kg esimerkin 6 mukaisesti valmistettua heraproteiinihydro-10 lysaattijauhetta, 10,466 kg kasvirasvaseosta, 16,058 kg glukoosia, 5,233 kg maltodekstriiniä (DE 21), 135 g vitamiini- ja mineraaliesiseosta (sisältää A-, D-, E-, K-,

Bl-, B2-, B6-, B12-vitamiinit, niasiinin, foolihapon, pan-toteenihapon, biotiinin, askorbiinihapon, koliinin, 15 inositolin, ferroglukonaatin, sinkkisulfaatin, man- gaanisulfaatin, natriumseleniitin, kupariglukonaatin) sekä 10 g kalsiumkloridia, 320 g kalsiumfosfaattia, 70 g magnesiumsulfaattia, 165 g natriumkloridia ja 620 g kalium-sitraattia, 1 g L-tyrosiinia ja 2 g L-fenyylialaniinia. 20 Seoksen kuiva-ainepitoisuus oli n. 4 0 %. Näin saatu seos johdettiin homogenisaattoriin (150/50 bar) ja kuivattiin jauheeksi sumutuskuivaimella, jossa kuivauslämmöt olivat 180/75 °C, leijupedillä 70/120/30 °C. Tuote oli koostumukseltaan, ulkonäöltään ja maultaan tavallisen esim. maito-v 25 allergikoille tarkoitetun erityisravintovalmisteen kal- *:*: täistä.

·*·.. Esimerkki 8

Vahva kationinvaihtopylväs (30 ml hartsia) re-generoitiin kuten esimerkissä 1. 600 ml:n rasvatonta mai-30 toa pH säädettiin 5,4:ään. pH-säädetty maito ajettiin huo- • « i neenlämmössä pylvään läpi kuten esimerkissä 1, jolloin • « » * maidosta poistui osa kalsiumista, mutta myös huomattava : \j osa insuliinista. RIA-analyysin mukaan (massaspekrometri ei ollut käytettävissä maidolle) käsittelemätön maito si-' .35 sälsi naudan insuliinia 26 μΐυ/ml ja käsitelty 17 μΐυ/ml.

I « «tl • « • « < · « 104457 15

Insuliinipitoisuus aleni käsittelyssä n. 35 %. Käsittely ei ollut riittävä insuliinin täydelliseen poistamiseen maidosta, mutta esimerkki kuvaa, että menetelmä sopii myös muiden maitoraaka-aineiden kuin heran käsittelyyn.

5 Esimerkki 9

Kationinvaihtohartsi (30 ml) regeneroitiin kuten esimerkissä l. Natriumkaseinaatista valmistettiin 3 % liuos veteen. pH laskettiin 5,5 reen laimealla HClrlla. Ka-seinaattiliuos pumpattiin kationinvaihtohartsin läpi huo-10 neenlämmössä kuten maito esimerkissä 8. Ennen käsittelyä kaseinaattiliuos sisälsi insuliinia RIA-analyysin mukaan 26 μΐυ/ml ja käsitelty liuos 10 μΐϋ/ml. Insuliinipitoisuus aleni käsittelyssä n. 62 %.

• · • · • · * ·

» t I

• · · • · * • · · • * · • · · • · · • · · • · · • · · ( «

I I I

« I

• « • · · t · «

Claims (13)

104457

1. Oleellisesti insuliiniton proteiinikoostumus, joka on käyttökelpoinen erityisravintovalmisteen prote-5 iiniosana tai kulutusmaidon raaka-aineena, tunnet- t u siitä, että se on lehmänmaidosta peräisin oleva rasvaton proteiinipitoinen materiaali, kuten hera, rasvaton maito tai kaseiiniliuos, josta naudan insuliini on oleellisesti poistettu.

2. Menetelmä oleellisesti insuliinittoman prote- iinikoostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) lehmänmaidosta peräisin oleva nestemäinen rasvaton proteiinipitoinen materiaali johdetaan insuliininpois-15 tokäsittelyyn, jolloin se ensin mahdollisesti kirkastetaan ja sen jälkeen johdetaan pH-arvon ollessa 5,2 - 5,6, Na+ - tai K+-muotoon regeneroidulla vahvalla kationinvaihto-hartsilla täytetyn pylvään läpi, 20 b) vaiheessa a) saatu nestemäinen proteiinipitoinen materiaali konsentroidaan ultra- ja diasuodattamalla käyttäen kalvoja, jotka ovat 6 000 - 20 000 D cut-off -kalvoja, saatu proteiinikonsentraatti haihdutetaan ja 25 mahdollisesti kuivataan proteiinijauheeksi, ‘ c) mahdollisesti .. 1) vaiheessa b) saadusta proteiinikonsentraatista tai proteiini jauheesta muodostetaan veteen liuos, jonka • » t *·* * proteiinipitoisuus on 1 - 20 %, 30 2) vaiheessa cl) saatu proteiiniliuos hydrolysoi- • · · ; daan entsymaattisesti proteaaseilla ja :: : 3) vaiheessa c2) hydrolysoitu proteiiniliuos ult- rasuodatetaan, ja d) mahdollisesti johdetaan vaiheessa c) saatu pro-, 35 teiinihydrolysaatti hydrofobiseen kromatografiakäsittelyyn 17 104457 ja e) vaiheessa c) tai d) saatu liuos haihdutetaan ja kuivataan j auheeksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että vaiheessa a) nestemäisenä rasvattomana proteiinipitoisena materiaalina käytetään heraa, rasvatonta maitoa tai kaseiiniliuosta, edullisesti heraa.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että vaiheessa a) nestemäinen ras vaton proteiinipitoinen materiaali kirkastetaan ennen ka-tioninvaihtohartsikäsittelyä suodattamala se mikrosuoda-tuskalvojen läpi, jotka kalvot ovat 0,05 - 1,4 mikrometrin kalvoja, edullisesti 0,1 mikrometrin kalvoja.

5. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) nestemäinen rasvaton proteiinipitoinen materiaali kirkastetaan ennen ka-tioninvaihtohartsikäsittelyä käsittelemällä sitä ult-rasuodatuskalvoilla, jotka edullisesti ovat 50 000 -20 200 000 D cut-off -kalvoja.

6. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a) nestemäinen rasvaton proteiinipitoinen materiaali kirkastetaan ennen ka-tioninvaihtohartsikäsittelyä sentrifugoimalla se edul-25 lisesti nopeudella 1 000 - 10 000 kierrosta/min.

• · 7. Jonkin patenttivaatimuksista 2-6 mukainen me- ' ' netelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa b) uit- • · • *·· ra- ja diasuodatuksessa käytetään kalvoja, jotka ovat 10 • · · · 000 D cut-off -kalvoja.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 2-7 mukainen me- :*·*; netelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa b) ultra- ja diasuodatetusta proteiinikonsentraatista muodostetaan / # vesiliuos, jonka pitoisuus on 1 - 20%, edullisesti noin 5%, ja joka hydrolysoidaan entsymaattisesti proteaaseilla, ' ' 35 kuten pankreatiini- ja alkalaasientsyymeillä. 104457

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa c) saatu prote-iinihydrolysaatti johdetaan hydrofobiseen kromatografiakä-sittelyyn, jolloin sitä käsitellään aktiivihiilellä tai 5 edullisesti hydrofobisella polystyreenipohjaisella adsorp- tiohartsilla.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen tai jonkin patenttivaatimuksista 2-9 mukaisella menetelmällä valmistetun proteiinikoostumuksen käyttö äidinmaidonkorvikkeen 10 tai jonkin muun erityisravintovalmisteen proteiiniosana tai kulutusmaidon raaka-aineena.

11. Oleellisesti insuliiniton äidinmaidonkorvike, tunnettu siitä, että sen proteiiniosa on lehmän-maidosta peräisin oleva rasvaton proteiinipitoinen materi- 15 aali, kuten hera, rasvaton maito tai kaseiiniliuos, edul lisesti hera, josta naudan insuliini on oleellisesti poistettu .

12. Oleellisesti insuliiniton erityisravintovalmis-te, tunnettu siitä, että sen proteiiniosa on leh- 20 mänmaidosta peräisin oleva rasvaton proteiinipitoinen ma teriaali, kuten hera, rasvaton maito tai kaseiiniliuos, edullisesti hera, josta naudan insuliini on oleellisesti poistettu.

;·. 13. Menetelmä oleellisesti insuliinittoman äidin- ].·25 maidonkorvikkeen tai jonkin muun erityisravintovalmisteen • » » tai kulutusmaidon raaka-aineen valmistamiseksi, t u n - • · n e t t u siitä, että tuotteen valmistuksessa prote- « · • iiniosana käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaista tai *.* · jonkin patenttivaatimuksista 2-9 mukaisella menetelmällä 30 valmistettua oleellisesti insuliinitonta ptoteiinikoostu- • ·· : : : musta. • · · • « · • · · 19 104457